含自由三磷酸基团的YTHDF2特异性siRNA及其应用的制作方法

含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna及其应用
技术领域
1.本发明涉及rna干扰技术领域以及生物与新医疗技术领域，尤其涉及含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna及其应用。


背景技术：

2.膀胱癌(bladder cancer,blca)是泌尿系统最常见的恶性疾病，在全球所有癌症中，其发病率排名第11位，死亡率排名第9位。针对blca，目前采用的治疗方法包括：(1)手术，包括经尿道膀胱肿瘤电切术、膀胱部分性切除术和根治性膀胱全切术；(2)膀胱灌注化疗。然而，由于术后极易复发和复发后易进展为更高级别的基层浸润型膀胱癌，给患者带来了很大的精神和经济压力。
3.由于对blca发生的了解有限，目前所采用的治疗方法只能一定程度上依赖于对其他肿瘤的研究中参考推导。因此，针对blca发生的分子机制，开发有效的blca靶向治疗药物/方案是一项紧迫且重大的医疗需求。
4.因此，现有技术还有待于改进和发展。


技术实现要素：

5.鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna及其应用，旨在解决目前针对blca发生的分子机制不清楚，缺乏有效的blca靶向治疗药物的问题。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna，其中，所述ythdf2特异性sirna的正义链和反义链的5'端修饰了自由三磷酸基团；所述ythdf2特异性sirna的正义链和反义链的核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
8.所述的ythdf2特异性sirna，其中，所述sirna特异性的抑制ythdf2的表达。
9.所述的ythdf2特异性sirna，其中，所述sirna引起ythdf2基因的转录后沉默。
10.所述的ythdf2特异性sirna，其中，所述sirna促进模式识别受体rig-i的mrna稳定性，提升模式识别受体rig-i的表达量。
11.所述的ythdf2特异性sirna，其中，所述sirna作为特异性配体激活rig-i信号通路，促进细胞因子的分泌，激活rig-i诱导的抗肿瘤免疫反应。
12.一种如上任一所述的含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna在制备用于抑制肿瘤细胞中ythdf2基因表达的药物中的应用。
13.一种如上任一所述的含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna在制备用于激活肿瘤细胞中rig-i信号通路的药物中的应用。
14.一种如上任一所述的含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
15.所述的应用，其中，所述肿瘤包括膀胱癌。
16.有益效果：本发明提供了一种含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna及其应用。本发明提供的含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna，可以通过一个分子实现多重抗肿瘤的功能：(1)所述sirna能特异性地抑制肿瘤进展促进分子ythdf2的表达，从而抑制肿瘤的进展；(2)所述sirna能通过抑制ythdf2的表达，促进模式识别受体rig-i的mrna稳定性，从而提升固有免疫中重要的模式识别受体rig-i的量；(3)所述sirna是一个含有三磷酸基团的双链rna分子，能够作为特异性配体激活rig-i信号通路，促进细胞因子的分泌，从而提升机体免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用。与一般的化学合成的sirna或者普通的随机序列双链rna分子相比，本发明的含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna具有更加显著的抗肿瘤优势，并且目前未观察到该小分子的分子毒性。因此，本发明的提供的sirna在制备肿瘤治疗的药物制剂方面具有良好的应用前景，尤其是具有很好的制备膀胱癌治疗药物的应用潜力。
附图说明
17.图1为本发明实施例中rt-pcr和western-blot检测ppp-siy2特异性沉默ythdf2的效率示意图。
18.图2为本发明实施例中ppp-siy2特异性沉默ythdf2后rig-i信号通路激活的影响示意图。
19.图3为本发明实施例中ppp-siy2在小鼠膀胱肿瘤模型中对肿瘤的抑制作用示意图。
20.图4为本发明实施例中ppp-siy2用于小鼠膀胱肿瘤模型后对血清ifn的影响结果示意图。
21.图5为本发明实施例中ppp-siy2用于小鼠膀胱肿瘤模型后对肿瘤环境中免疫细胞招募的影响结果示意图。
具体实施方式
22.本发明提供一种含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
23.前期研究表面，ythdf2(yth n6-methyladenosine rna binding protein 2，rna n6-甲基腺嘌呤修饰识别蛋白)通过促进模式识别受体rig-i的mrna衰变，在膀胱癌(bladder cancer,blca)发生中起着关键的致癌作用。rig-i作为blca的肿瘤抑制因子，可以促进抗肿瘤免疫应答。基于ythdf2-rig-i轴在blca肿瘤进展中的重要作用，ythdf2有望作为blca治疗的理想靶点。
24.基于此，本发明实施例提供了一种含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna，所述ythdf2特异性sirna的正义链和反义链的5'端修饰了自由三磷酸基团；所述ythdf2特异性sirna的正义链和反义链的核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
25.seq id no.1：5'-cuagagaacaacgagaauatt-3'
26.seq id no.2：5'-uauucucguuguucucuaggc-3'
27.在一些实施方式中，所述ythdf2特异性sirna的正义链和反义链的5'端均为鸟嘌
呤核苷，所述鸟嘌呤核苷的戊糖3'位点上修饰了自由三磷酸基团。
28.本发明提供的含三磷酸基团的rna n6-甲基腺嘌呤(n6-methyladenosine,m6a)修饰识别蛋白ythdf2(yth n6-methyladenosine rna binding protein 2)的特异性sirna，其正义链和反义链序列的5'端的鸟嘌呤核苷的戊糖3'位点上修饰了自由三磷酸基团。本发明中含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna具有双重抗肿瘤功能：一方面可以特异性沉默ythdf2这个促癌基因，也促进细胞中有效模式识别受体rig-i的储存量；另一方面可以有效地激活rig-i诱导的抗肿瘤免疫反应，两者相结合，可以显著地提高治疗肿瘤的效果。本发明提供的含三磷酸基团的ythdf2特异性sirna与之前公开的单纯针对促肿瘤蛋白的敲低设计的sirna相比，具有更多重的功能，其显著性效果表现为：(1)能特异性地抑制肿瘤进展促进分子ythdf2的表达，从而抑制肿瘤的进展；(2)能通过抑制ythdf2的表达，促进模式识别受体rig-i的mrna稳定性，从而提升固有免疫中重要的模式识别受体rig-i的量；(3)所述sirna是一个含有三磷酸基团的双链rna分子，能够作为特异性配体激活rig-i信号通路，促进细胞因子的分泌，从而提升机体免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用。本发明综合上述效果的所述sirna分子具有很好的发挥抑制肿瘤进展的作用，因而也具有极大的制备肿瘤尤其是膀胱癌治疗药物的应用潜力。
29.在一些实施方式中，所述sirna特异性的抑制ythdf2的表达。
30.具体的，所述sirna能够引起ythdf2基因的转录后沉默。
31.本发明提供的含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna，通过引起ythdf2基因的转录后沉默，对肿瘤进展促进分子ythdf2有特异性基因沉默的功能。
32.在一些实施方式中，所述sirna能够促进模式识别受体rig-i的mrna稳定性，提升模式识别受体rig-i的表达量。这是因为，通过抑制ythdf2的表达，ythdf2对rig-i mrna的降解也被所述sirna分子抑制，这就使得机体有足够的rig-i受体来参与机体免疫应答。
33.在一些实施方式中，所述sirna作为特异性配体激活rig-i信号通路，促进细胞因子的分泌，激活rig-i诱导的抗肿瘤免疫反应。本发明提供的含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna是一个含有三磷酸基团的双链rna分子，其可以激活rig-i信号通路促进抗肿瘤免疫应答，很好的发挥抑制肿瘤进展的作用。
34.本发明提供的含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna(命名为ppp-siy2)，可以通过一个分子实现多重抗肿瘤的功能，包括：(1)本发明的ppp-siy2能特异性地抑制肿瘤进展促进分子ythdf2的表达，从而抑制肿瘤的进展；(2)本发明的ppp-siy2能通过抑制ythdf2的表达，促进模式识别受体rig-i的mrna稳定性，从而提升固有免疫中重要的模式识别受体rig-i的量；(3)本发明的ppp-siy2分子是一个含有三磷酸基团的双链rna分子，能够作为特异性配体激活rig-i信号通路，促进细胞因子的分泌，从而提升机体免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用。以上关键点使ppp-siy2分子与一般的化学合成的sirna(分子末端为-oh键，而不是三磷酸基团)，或者普通的随机序列双链rna分子来说具有更加显著的抗肿瘤优势，并且目前未观察到该小分子的分子毒性。因此本发明ppp-siy2分子可应用在肿瘤治疗方案特别是膀胱癌的治疗方案中，且具有很好的开发制备肿瘤尤其是膀胱癌治疗药物的应用潜力。
35.在一些实施方式中，还可以针对ythdf2分子的其他序列靶标，设计针对ythdf2特异性的含自由三磷酸基团的sirna(ppp-sirna)分子，ppp-sirna的衍生物或针对ythdf2设计的类似三磷酸基团sirna。上述变形方案与本发明设计思路类似，均属于本发明的保护范
no.5-8，相应的对照(命名为ppp-sinc)模板为序列seq id no.9-12。利用t7聚合酶启动子体外合成和纯化的方法按照试剂盒vazyme-t7 rnai transcription kit_tr102-使用说明书-v21.1操作。最终获得的纯化的sirna用电泳和nanodrop进行浓度和纯度测定。
51.seq id no.5:5'-gatcactaatacgactcactatagggctagagaacaacgagaatatt-3'
52.seq id no.6:5'-aatattctcgttgttctctagccctatagtgagtcgtattagtgatc-3'
53.seq id no.7:5'-gatcactaatacgactcactatagggtattctcgttgttctctagtt-3'
54.seq id no.8:5'-aactagagaacaacgagaataccctatagtgagtcgtattagtgatc-3'
55.seq id no.9:5'-gatcactaatacgactcactatagggttctccgaacgtgtcacgttt-3'
56.seq id no.10:5'-aaacgtgacacgttcggagaaccctatagtgagtcgtattagtgatc-3'
57.seq id no.11:5'-gatcactaatacgactcactatagggacgtgacacgttcggagaatt-3'
58.seq id no.12:5'-aattctccgaacgtgtcacgtccctatagtgagtcgtattagtgatc-3'
59.实施例2rt-pcr和western-blot检测ppp-siy2特异性沉默ythdf2的效率
60.将各sirna分子分别转染至人膀胱癌细胞系sw780中，转染方案：细胞按105个/孔均匀铺在12孔板中，过夜。每孔用lipofectamine rnaimax试剂3μl包裹1μg sirna,按照rnaimax使用说明书进行转染。36h后提取细胞总rna或者总蛋白，用qrt-pcr和western-blot分别检测ppp-siy2特异性沉默ythdf2的效率。
61.图1所示为rt-pcr和western-blot检测ppp-siy2特异性沉默ythdf2的效率图。其中图1a为rt-pcr检测ppp-siy2转染sw780细胞后，ythdf2 mrna的相对定量；图1b为western-blot检测ppp-siy2转染sw780细胞后，ythdf2的蛋白量。由结果可知：ppp-siy2和siy2都可以有效降低ythdf2的量，并且如设计原理所期望的，模式识别受体rig-i(基因ddx58)的表达也都上调。
62.实施例3ppp-siy2特异性沉默ythdf2后rig-i信号通路激活情况
63.将各sirna分子分别转染至人膀胱癌细胞系sw780中，转染方案：细胞按105个/孔均匀铺在12孔板中，过夜。每孔用lipofectamine rnaimax试剂3μl包裹1μg sirna,按照rnaimax使用说明书进行转染。36h后提取细胞总rna或者总蛋白，用qrt-pcr分别检测ppp-siy2特异性沉默ythdf2后rig-i信号通路激活的下游分子isg15、ifnβ和cxcl10的mrna相对定量，并用western-blot确定sirna分子的敲低情况。
64.图2所示为ppp-siy2特异性沉默ythdf2后rig-i信号通路激活的影响图。其中图2a为rt-pcr检测ppp-siy2转染sw780细胞后对isg15、ifnβ和cxcl10的影响；图2b为western-blot检测ppp-siy2转染sw780细胞后，ythdf2的蛋白量。由结果可知：ppp-siy2和siy2都可以有效降低ythdf2的量，并促进rig-i信号通路激活。并且，ppp-siy2分子促进激活的程度更明显。
65.实施例4ppp-siy2在小鼠膀胱肿瘤模型中对肿瘤的抑制作用
66.将100μl的mbt-2细胞(1
×
105个)和15％的基质胶(
67.)充分混合后接种到c57bl/6j小鼠，分别在接种后的第3、6和9天，将50μg上述sirna分子包被于in vivo-jetpei试剂，并溶于5％葡萄糖溶液中，静脉注射每只小鼠。第11天取小鼠肿瘤细胞拍照并测量大小和体重。
68.图3所示为ppp-siy2在小鼠膀胱肿瘤模型中对肿瘤的抑制作用图。其中图3a为ppp-siy2用于小鼠皮下膀胱肿瘤模型的给药策略；图3b为各组肿瘤大小展示图；图3c为肿
瘤大小统计图；图3d为肿瘤重量。由结果可知：ppp-siy2和siy2都可以有效降低肿瘤的大小和重量，并且ppp-siy2显示更强的治疗效果。
69.实施例5ppp-siy2在小鼠膀胱肿瘤模型中对血清ifn的影响
70.按照实施例4所述方法处理小鼠，并在第11天从心脏取血后分离血清，按照elisa kit的说明测定血清ifn的量。
71.图4所示为ppp-siy2用于小鼠膀胱肿瘤模型后，对血清ifn的影响。由结果可知：ppp-siy2和siy2都可以有效促进血清ifn，并且ppp-siy2显示更强的促进效果。
72.实施例6ppp-siy2在小鼠膀胱肿瘤模型中对肿瘤环境中免疫细胞招募的影响。
73.按照实施例4所述方法获得的小鼠肿瘤切片，并用multiplex immunofluorescence(mihc)staining分别标记ythdf2、cd8、cd11b和dapi。
74.图5所示为ppp-siy2用于小鼠膀胱肿瘤模型后，对肿瘤环境中免疫细胞招募的影响。由结果可知：ppp-siy2和siy2都抑制ythdf2的蛋白量，且可以有效促进cd8
+
,cd11b
+
细胞的招募。
75.综上所述，本发明提供了一种含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna及其应用。本发明提供的含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna，可以通过一个分子实现多重抗肿瘤的功能：(1)所述sirna能特异性地抑制肿瘤进展促进分子ythdf2的表达，从而抑制肿瘤的进展；(2)所述sirna能通过抑制ythdf2的表达，促进模式识别受体rig-i的mrna稳定性，从而提升固有免疫中重要的模式识别受体rig-i的量；(3)所述sirna是一个含有三磷酸基团的双链rna分子，能够作为特异性配体激活rig-i信号通路，促进细胞因子的分泌，从而提升机体免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用。与一般的化学合成的sirna或者普通的随机序列双链rna分子相比，本发明的含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna具有更加显著的抗肿瘤优势，并且目前未观察到该小分子的分子毒性。因此，本发明的提供的sirna在制备肿瘤治疗的药物制剂方面具有良好的应用前景，尤其是具有很好的制备膀胱癌治疗药物的应用潜力。
76.应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

技术特征：
1.一种含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna，其特征在于，所述ythdf2特异性sirna的正义链和反义链的5'端修饰了自由三磷酸基团；所述ythdf2特异性sirna的正义链和反义链的核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。2.根据权利要求1所述的ythdf2特异性sirna，其特征在于，所述sirna特异性的抑制ythdf2的表达。3.根据权利要求2所述的ythdf2特异性sirna，其特征在于，所述sirna引起ythdf2基因的转录后沉默。4.根据权利要求1所述的ythdf2特异性sirna，其特征在于，所述sirna促进模式识别受体rig-i的mrna稳定性，提升模式识别受体rig-i的表达量。5.根据权利要求1所述的ythdf2特异性sirna，其特征在于，所述sirna作为特异性配体激活rig-i信号通路，促进细胞因子的分泌，激活rig-i诱导的抗肿瘤免疫反应。6.一种如权利要求1-5任一所述的含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna在制备用于抑制肿瘤细胞中ythdf2基因表达的药物中的应用。7.一种如权利要求1-5任一所述的含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna在制备用于激活肿瘤细胞中rig-i信号通路的药物中的应用。8.一种如权利要求1-5任一所述的含自由三磷酸基团的ythdf2特异性sirna在制备治疗肿瘤的药物中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括膀胱癌。

技术总结
本发明提供了含自由三磷酸基团的YTHDF2特异性siRNA及其应用，所述siRNA可以通过一个分子实现多重抗肿瘤的功能：第一，对肿瘤进展促进分子YTHDF2有特异性基因沉默功能；第二，含三磷酸基团的双链RNA分子可以激活RIG-I信号通路促进抗肿瘤免疫应答；第三，YTHDF2对RIG-I的降解也被siRNA分子抑制，使得机体有足够的RIG-I受体来参与机体免疫应答。本发明的含自由三磷酸基团的YTHDF2特异性siRNA具有十分显著的抗肿瘤优势，并且目前未观察到该小分子的分子毒性。因此，本发明的提供的siRNA在制备肿瘤治疗的药物制剂尤其是制备膀胱癌治疗药物方面具有良好的应用前景。药物方面具有良好的应用前景。药物方面具有良好的应用前景。


技术研发人员：吴松 周伶俐 张磊 周厚宏 李宇清
受保护的技术使用者：深圳市罗湖区人民医院
技术研发日：2023.03.31
技术公布日：2023/8/24