一种黄嘌呤氧化酶抑制肽及其改造方法和应用

1.本发明涉及一种多肽技术领域，尤其是涉及一种黄嘌呤氧化酶抑制肽及其改造方法和应用。


背景技术：

2.当人体中尿酸的合成增多或者排泄减少就会造成血尿酸浓度升高，形成高尿酸血症。高尿酸血症是全球第二大代谢疾病，其特征是血清尿酸浓度高，是痛风，肾功能损伤和代谢综合征的主要危险因素。治疗高尿酸血症主要从增加尿酸排泄和抑制尿酸生成两种途径开展。嘌呤代谢是人体尿酸的主要来源，嘌呤的来源有两种，一种是内源性的核苷酸代谢，另一种是外源性摄入的嘌呤食物在肠道中代谢成尿酸。内源性核苷酸(腺嘌呤核苷酸和鸟嘌呤核苷酸)经过一系列生化反应最终生成尿酸。腺嘌呤核苷酸经过核苷酸酶，核苷脱氨酶和核苷磷酸化酶的催化作用生成次黄嘌呤，再由黄嘌呤氧化酶经过两次催化最终生成尿酸。鸟嘌呤通过鸟嘌呤脱氨酶的催化作用生成黄嘌呤，再由黄嘌呤氧化酶催化生成尿酸。黄嘌呤氧化酶被视为尿酸生成途径中重要的抑制靶点。
3.生物活性肽是源于天然蛋白质的从二肽到多肽的多功能化合物。据报道，在天然活性蛋白中发现了很多具有缓解高尿酸血症的混合寡肽。利用discovery studio中的分子对接模块，将黄嘌呤氧化酶与寡肽进行对接，能够高效筛选混合肽中的有效成分肽。肽链结构和氨基酸序列均对黄嘌呤氧化酶的抑制效果有影响。现有的提高生物活性肽的黄嘌呤氧化酶抑制活性方式有从n端逐一切除氨基酸和从一端逐一加上氨基酸两种。但是改变肽链长度在一定程度上会影响生物活性肽的生物利用度，目前国内外还没有公开关于不改变肽链长度的情况下改变肽链氨基酸结构来提升黄嘌呤氧化酶抑制率的相关研究报道。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是提供一种具有抑制黄嘌呤氧化酶活性、降尿酸活性的黄嘌呤氧化酶抑制肽及其改造方法和应用，其改造方法在不改变活性肽链长、影响其生物利用度的前提下，能快速有效提升黄嘌呤氧化酶抑制活性。
5.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种黄嘌呤氧化酶抑制肽，所述的抑制肽的氨基酸序列为：keaker和/或knaknr。
6.上述黄嘌呤氧化酶抑制肽的改造方法，包括以下步骤：(1)将常见氨基酸按照两两组合的形式得到的所有二肽作为配体，将黄嘌呤氧化酶作为受体，利用discovery studio软件的分子对接模块进行二肽与黄嘌呤氧化酶的分子对接相互作用赋分；(2)以具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的天然活性肽作为模板，将步骤(1)中获得的赋分分值高的优势二肽替换掉天然活性肽中赋分分值低的劣势二肽，改造获得抑制活性提高的黄嘌呤氧化酶抑制肽。
7.进一步，所述的常见氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫
氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
8.上述黄嘌呤氧化酶抑制肽在制备黄嘌呤氧化酶活性抑制剂方面的应用。
9.上述黄嘌呤氧化酶抑制肽在制备降尿酸药物或者制备痛风疾病辅助治疗药物方面的应用。
10.与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种黄嘌呤氧化酶抑制肽及其改造方法和应用，过软件预测、体外酶活抑制实验、细胞建模实验以及动物模型实验，快速准确筛选评价不同二肽单元的黄嘌呤氧化酶抑制活性，用筛选出的优势二肽元件替换原始活性肽中的劣势二肽元件，成功提高活性肽的黄嘌呤氧化酶抑制活性，在不改变活性肽链长、影响其生物利用度的前提下，能快速有效提升生物活性肽对靶标蛋白的活性抑制或者活性增强作用、能够应用于天然活性肽的靶向改造。
附图说明
11.图1为基于分子对接的二肽与黄嘌呤氧化酶相互作用预测和体外酶活抑制功能实验验证。a.基于discovery studio软件利用分子对接模块模拟二肽与黄嘌呤氧化酶的相互作用；b.400种二肽与黄嘌呤氧化酶相互作用的定量赋分；c.10种二肽的体外黄嘌呤氧化酶活抑制结果；d.基于软件的定量赋分预测与实际体外酶活抑制能力的相关性分析；图2为细胞水平的二肽降尿酸功能评价。a.别嘌呤醇对细胞存活率的影响；b.别嘌呤醇在细胞水平的降尿酸活性；c.二肽对细胞存活率的影响；d.二肽在细胞水平的降尿酸活性；图3为二肽在细胞水平对尿酸代谢途径相关蛋白表达的影响。a.细胞水平尿酸合成途径相关蛋白表达情况；b.细胞水平尿酸排泄和重吸收途径相关蛋白表达情况；图4为小鼠水平的二肽降尿酸功能评价。a.血清尿酸浓度；b.血清黄嘌呤氧化酶活性；图5为活性肽的定向改造及其效果评价。a.六肽gpagpr的定向改造策略示意图；b.改造前后活性肽(40mg/ml)体外xod酶活抑制活性的比较。
具体实施方式
12.以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
13.具体实施例一选择常见的20种氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，按照两两组合的形式，一共得到400种二肽(氨基酸处于c端和n端是不同的二肽)作为配体。选择尿酸生成途径中的重要的靶标黄嘌呤氧化酶(xod，pdb数据库编号：1fiq)作为受体，进行基于分子对接的相互作用赋分。如图1a所示，基于discovery studio软件利用分子对接模块模拟二肽与黄嘌呤氧化酶的相互作用，具体步骤如下：1、配体二肽的序列结构优化将二肽序列分别输入到discovery studio软件，得到400个二肽序列的三维结构，随后通过charmm力场进行能量优化，得到可用于分子对接的配体文件；
2、受体xod的处理从pdb数据库中分别下载xod晶体结构，编号为1fiq。对结构文件进行预处理，去水加氢使其为质子化状态，随后定义蛋白的活性位点，保存为pdbqt格式用于高通量分子对接筛选；3、分子对接预测利用分子对接(molecular docking)中的半柔性对接模式cdocker运行对接程序。分子对接结果以cdocker能量得分、cdocker相互作用能量得分、相互作用位点和相互作用力类型表征。其中，配体和受体的空间契合度越高则系统赋分越高，说明两者相互作用越强，即可能存在较强的受体抑制活性。结果如图1b所示，400种二肽有不同程度的赋分，随机选择不同赋分的二肽进行下一步体外验证实验。
14.具体实施例二体外黄嘌呤氧化酶活体系的建立及二肽的抑制效果评价室温下分别取20μl不同二肽的浓度梯度0、10、20、30、40、50、60mg/ml与20μl，0.05u/ml的黄嘌呤氧化酶进行预反应3分钟，然后加入60μl，0.4mmol/l黄嘌呤在37℃下反应25分钟；最后加入32μl 1mol/l盐酸溶液，反应体系经0.22μm滤膜过滤，利用hplc对其中尿酸含量进行分析。hplc检测条件为：安捷伦1200系列高效液相色谱；zorbax original phenyl色谱柱(5μm,4.6
×
250mm)；流动相a为水相，其中包含终浓度0.52mm 1-戊烷磺酸钠和0.20m磷酸氢二钾，流动相a用磷酸溶液将ph调至4.0；流动相b为色谱纯乙腈；流动相a:流动相b＝85:15(v/v)；流速为1.0ml/min；检测波长290nm；进样量为10μl。
15.如图1c所示，在60mg/ml的浓度下，dk，ag，ke，yi，ce和kn的黄嘌呤氧化酶抑制率分别达到了82.21％，76.29％，67.01％，43.92％，43.38％和33.58％。在40mg/ml的浓度下，dk、ag、ke、yi、ce和kn的抑制率分别为57.86％、52.86％、48.95％、38.53％、29.90％、29.6％。其他的二肽vm、ki、km和gp在40mg/ml下的抑制率分别为24.32％、13.32％、9.51％和6.04％。如图1d所示，将不同二肽的软件赋分结果与实际检测的体外酶活抑制率数据，进行pearson相关性分析，发现两者的相关性系数r＝0.8684，证明软件赋分结果与实际体外酶活抑制率具有强正相关性，说明用软件赋分预测二肽的体外酶活抑制率具有可行性。
16.具体实施例三一、实验材料人肾皮质近曲小管上皮细胞hk-2购于武汉普诺赛生命科技有限公司；cck-8试剂(货号k1018)购于艾普拜生物公司；gibco系列特级胎牛血清(货号10099)、青霉素(货号11593027)和链霉素(货号11860038)购于赛默飞公司；gibco系列dmem/f-12细胞培养基(货号11330032)购于赛默飞公司；dmem/f-12细胞培养基是一种应用广泛的基础培养基，用于促进许多不同哺乳动物细胞的生长，采用dmem与ham's f-12的1：1混合物。
17.二、二肽细胞毒性的检测首先检测二肽对人肾皮质近曲小管上皮细胞hk-2的细胞毒性。将细胞按照5000个/孔接种于96孔板中，加入dmem/f12完全培养基(在dmem/f12培养基基础上加入10％的胎牛血清，100μg/ml链霉素和100units/ml青霉素)，在37℃，5％ co2的环境中培养24小时使
细胞完全贴壁。
18.在细胞培养体系中加入10μl不同浓度的别嘌呤醇(0.1-0.5mm)用于检测别嘌呤醇对细胞的毒性，相同培养环境培养24小时后，接着按照cck8试剂盒的操作步骤验证处理物对细胞活性的影响程度。如图2a所示，不同浓度别嘌呤醇的添加对细胞存活率均无显著性影响，证明在测试浓度(0.1-0.5mm)范围内，别嘌呤醇不存在细胞毒性。
19.在细胞培养体系中加入10μl不同浓度的二肽(0.25-010mm)用于检测二肽对细胞的毒性，相同培养环境培养24小时后，接着按照cck8试剂盒的操作步骤验证处理物对细胞活性的影响程度。如图2c所示，不同浓度二肽添加对细胞存活率均无显著性影响，证明在测试浓度(0.25-010mm)范围内，所有测试二肽均不存在细胞毒性。
20.三、二肽在细胞水平的降尿酸活性检测基于腺苷诱导的原理利用hk-2细胞建立高尿酸血症细胞模型。
21.将细胞按照1*106个/孔接种于6孔板中，用dmem/f12完全培养基(在dmem/f12培养基基础上加入10％的胎牛血清，100μg/ml链霉素和100units/ml青霉素)培养48小时使细胞完全贴壁。随后按照实验目的分成对照组、模型组、阳性药组和二肽处理组。分别进行如下操作：对照组：更换新鲜的dmem/f12完全培养基继续培养24h，用pbs缓冲液清洗细胞去除完全培养基残留，加入dmem/f12培养基(其中含有100μg/ml链霉素和100units/ml青霉素)培养30h后，加入0.005u/mg黄嘌呤氧化酶继续培养8h，收集上清液经0.22μm滤膜过滤，利用hplc定量分析其中的尿酸浓度。
22.模型组：更换新鲜的dmem/f12完全培养基继续培养24h，用pbs缓冲液清洗细胞去除完全培养基残留，加入dmem/f12培养基(其中含有100μg/ml链霉素和100units/ml青霉素)，同时加入终浓度2.5mmol/l腺苷溶液，培养30h后，加入0.005u/mg黄嘌呤氧化酶继续培养8h，收集上清液经0.22μm滤膜过滤，利用hplc定量分析其中的尿酸浓度。
23.阳性药组(低剂量组)：更换新鲜的dmem/f12完全培养基，同时加入终浓度100μm别嘌呤醇，继续培养24h，用pbs缓冲液清洗细胞去除完全培养基残留，加入dmem/f12培养基(其中含有100μg/ml链霉素和100units/ml青霉素)，加入终浓度2.5mmol/l腺苷溶液和100μm别嘌呤醇，培养30h后，加入0.005u/mg黄嘌呤氧化酶继续培养8h，收集上清液经0.22μm滤膜过滤，利用hplc定量分析其中的尿酸浓度。
24.阳性药组(高剂量组)：更换新鲜的dmem/f12完全培养基，同时加入终浓度500μm别嘌呤醇，继续培养24h，用pbs缓冲液清洗细胞去除完全培养基残留，加入dmem/f12培养基(其中含有100μg/ml链霉素和100units/ml青霉素)，加入终浓度2.5mmol/l腺苷溶液和500μm别嘌呤醇，培养30h后，加入0.005u/mg黄嘌呤氧化酶继续培养8h，收集上清液经0.22μm滤膜过滤，利用hplc定量分析其中的尿酸浓度。
25.二肽处理组(低剂量组)：更换新鲜的dmem/f12完全培养基，同时加入终浓度2.5mm二肽，继续培养24h，用pbs缓冲液清洗细胞去除完全培养基残留，加入dmem/f12培养基(其中含有100μg/ml链霉素和100units/ml青霉素)，加入终浓度2.5mmol/l腺苷溶液和2.5mm二肽，培养30h后，加入0.005u/mg黄嘌呤氧化酶继续培养8h，收集上清液经0.22μm滤膜过滤，利用hplc定量分析其中的尿酸浓度。
26.二肽处理组(中剂量组)：更换新鲜的dmem/f12完全培养基，同时加入终浓度5mm二
肽，继续培养24h，用pbs缓冲液清洗细胞去除完全培养基残留，加入dmem/f12培养基(其中含有100μg/ml链霉素和100units/ml青霉素)，加入终浓度2.5mmol/l腺苷溶液和5mm二肽，培养30h后，加入0.005u/mg黄嘌呤氧化酶继续培养8h，收集上清液经0.22μm滤膜过滤，利用hplc定量分析其中的尿酸浓度。
27.二肽处理组(高剂量组)：更换新鲜的dmem/f12完全培养基，同时加入终浓度10mm二肽，继续培养24h，用pbs缓冲液清洗细胞去除完全培养基残留，加入dmem/f12培养基(其中含有100μg/ml链霉素和100units/ml青霉素)，加入终浓度2.5mmol/l腺苷溶液和10mm二肽，培养30h后，加入0.005u/mg黄嘌呤氧化酶继续培养8h，收集上清液经0.22μm滤膜过滤，利用hplc定量分析其中的尿酸浓度。
28.图2b说明在别嘌呤醇浓度分别为100和500μm时，细胞上清液中的尿酸浓度相比于模型组分别降低13.64％和87.95％，高剂量别嘌呤醇在细胞水平具有更好的降尿酸活性。
29.图2d说明随着二肽浓度的上升，其细胞上清液中的尿酸含量逐渐减低，降尿酸活性逐步提升。10mm浓度下，二肽ke、yi、kn、ce、dk和ag处理组细胞上清液中的尿酸含量相比于模型组分别降低38.37％，32.90％，27.55％，25.61％，18.71％和5.12％，其中二肽ke、yi和kn是所有测试的二肽中，在细胞水平降尿酸最好的三个。
30.四、二肽对细胞中关键基因表达的影响鉴于ke、yi和kn相比于其他测试二肽，具有更好的降尿酸活性，所以对其蛋白水平的基因表达进行检测。利用蛋白提取试剂盒，提取对照组、模型组和高剂量二肽处理组(10mm组)的总蛋白，进行western blot蛋白印迹实验。
31.图3a是蛋白ada(腺苷脱氨酶)和xod(黄嘌呤氧化酶)的表达水平检测。ada和xod是参与合成尿酸的关键蛋白。结果发现，与对照组相比，模型组中ada蛋白表达水平显著上升，而ke、yi和kn处理对ada的蛋白表达均有抑制作用；另外，无论是建模处理还是二肽处理，对xod的蛋白表达均不产生显著性影响。
32.图3b是蛋白abcg2(多药物转运蛋白2)和glut9(葡萄糖转运蛋白9)的表达水平检测。其中，abcg2负责尿酸的外排，而glut9负责尿酸的重吸收。结果发现，与对照组相比，模型组增加了abcg2的蛋白表达，而肽ke、yi和kn的处理抑制了abcg2的蛋白表达，但是组间均不存在显著性差异。同时，与对照组相比，模型组降低了glut9的蛋白表达，而肽ke、yi和kn的处理进一步抑制了glut9的蛋白表达，但是组间均不存在显著性差异。说明腺苷诱导的建模以及二肽的干预主要是靶向作用于尿酸合成途径。
33.具体实施例四二肽在小鼠模型中的降尿酸效果icr小鼠是hauschka用swiss小鼠群以多产为目标进行选育，以后美国癌症研究所(institute of cancer research)分送各国饲养实验，各国称之为icr小鼠。
34.购买4-6周的icr小鼠，给予一周自由饮食，使其适应环境。随后，将小鼠随机分为对照组，模型组，别嘌呤醇组和ke、kn和yi治疗组。实验步骤如下：对照组：生理盐水灌胃3天；从第4天开始，在生理盐水灌胃后1h，腹腔注射0.25％羧甲基纤维素钠，持续到第14天。第14天，在接受完腹腔注射30min后，小鼠眼球取血并处死。
35.模型组：生理盐水灌胃3天；从第4天开始，在生理盐水灌胃后1h，腹腔注射250mg/
kg氧嗪酸钾和150mg/kg次黄嘌呤(溶解于0.25％羧甲基纤维素钠中)，持续到第14天。第14天，在接受完腹腔注射30min后，小鼠眼球取血并处死。
36.阳性药组：10mg/kg别嘌呤醇灌胃3天；从第4天开始，在10mg/kg别嘌呤醇灌胃后1h，腹腔注射250mg/kg氧嗪酸钾和150mg/kg次黄嘌呤(溶解于0.25％羧甲基纤维素钠中)，持续到第14天。第14天，在接受完腹腔注射30min后，小鼠眼球取血并处死。
37.多肽处理组：15mg/kg二肽灌胃3天；从第4天开始，在15mg/kg二肽灌胃后1h，腹腔注射250mg/kg氧嗪酸钾和150mg/kg次黄嘌呤(溶解于0.25％羧甲基纤维素钠中)，持续到第14天。第14天，在接受完腹腔注射30min后，小鼠眼球取血并处死。
38.利用hplc检测血清中的尿酸含量；利用试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司，货号a002-1-1)检测血清中黄嘌呤氧化酶活性。
39.血尿酸含量如图4a所示，与对照组相比，氧嗪酸钾和次黄嘌呤腹腔注射将模型组的血尿酸含量增加了31.5倍，而别嘌呤醇和二肽处理均可以降低血尿酸含量。与模型组相比，阳性药组血尿酸含量降低了95.0％，效果要优于测试的3种二肽。二肽中，kn降尿酸最好，与模型组相比尿酸含量降低了82.1％；其次是ke，与模型组相比尿酸含量降低了57.0％。
40.血清黄嘌呤氧化酶活性如图4b所示。与对照组相比，模型组血清黄嘌呤氧化酶活性增加53.2％；与模型组相比，别嘌呤醇、ke、kn和yi组小鼠血清黄嘌呤氧化酶活性抑制率分别为38.9％、50.0％、43.1％和41.7％。
41.具体实施例五挑选上述体内、体外均显示较高抑制活性的二肽ke和kn作为替换元件，以已报道具有降尿酸活性的六肽gpagpr作为模板，进行活性肽定向改造，改造后的活性肽序列为keaker和knaknr(图5a)。
42.在40mg/ml的肽浓度下，降尿酸肽模板gpagpr的体外黄嘌呤氧化酶抑制率为37.3％，二肽元件gp的抑制率为6.0％，二肽元件kn的抑制率为29.6％，将模板中的gp替代为kn后得到的活性肽knaknr抑制率为48.3％；二肽元件ke的抑制率为49.0％，将模板中的gp替代为ke后得到的活性肽keaker抑制率为66.4％(图5b)。
43.上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种黄嘌呤氧化酶抑制肽，其特征在于所述的抑制肽的氨基酸序列为：keaker和/或knaknr。2.一种权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽的改造方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将常见氨基酸按照两两组合的形式得到的所有二肽作为配体，将黄嘌呤氧化酶作为受体，利用discovery studio软件的分子对接模块进行二肽与黄嘌呤氧化酶的分子对接相互作用赋分；(2)以具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的天然活性肽作为模板，将步骤(1)中获得的赋分分值高的优势二肽替换掉天然活性肽中赋分分值低的劣势二肽，改造获得抑制活性提高的黄嘌呤氧化酶抑制肽。3.根据权利要求2所述的一种黄嘌呤氧化酶抑制肽的改造方法，其特征在于：步骤(1)中所述的常见氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。4.一种权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽在制备黄嘌呤氧化酶活性抑制剂方面的应用。5.一种权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制肽在制备降尿酸药物或者制备痛风疾病辅助治疗药物方面的应用。

技术总结
本发明公开了一种黄嘌呤氧化酶抑制肽及其改造方法和应用，特点是该抑制肽的氨基酸序列为：KEAKER和/或KNAKNR，改造方法包括以下步骤：(1)将常见氨基酸按照两两组合的形式得到的所有二肽作为配体，将黄嘌呤氧化酶作为受体，利用Discovery Studio软件的分子对接模块进行二肽与黄嘌呤氧化酶的分子对接相互作用赋分；(2)以具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的天然活性肽作为模板，将赋分分值高的优势二肽替换掉天然活性肽中赋分分值低的劣势二肽，改造获得抑制活性提高的黄嘌呤氧化酶抑制肽；优点是在不改变活性肽链长、影响其生物利用度的前提下，能快速有效提升黄嘌呤氧化酶抑制活性。能快速有效提升黄嘌呤氧化酶抑制活性。能快速有效提升黄嘌呤氧化酶抑制活性。


技术研发人员：芦晨阳 黄玉蒙 王焱鑫 范思情 马明霞
受保护的技术使用者：宁波大学
技术研发日：2023.04.10
技术公布日：2023/8/24