水稻种子抗性淀粉含量相关基因SSIIIb及其应用

水稻种子抗性淀粉含量相关基因ssiiib及其应用
技术领域：
：1.本发明属于植物功能基因领域，涉及水稻种子抗性淀粉含量相关基因ssiiib及其应用。
背景技术：
：：2.抗性淀粉(resistantstarch,rs)是一类无法被小肠吸收利用，但能在结肠中被微生物菌群发酵降解的淀粉。由于抗性淀粉具有不被小肠消化吸收和缓慢释放葡萄糖的营养特性，使其具有较低的血糖生成指数(glycemicindex,gi)，可以延缓餐后血糖浓度的剧烈增加。因此抗性淀粉在控制餐后血糖、预防结(直)肠癌、控制体重等方面发挥重要生理功能，是预防和控制糖尿病的优良功能型食物。抗性淀粉广泛存在于谷物、豆类和薯类中，但常规食物中的抗性淀粉含量一般低于3％。水稻(oryzasatival.)是最重要的粮食作物之一，为全世界一半以上的人口提供主粮。普通水稻品种的抗性淀粉含量普遍小于1％，若能将其改良成为高抗性淀粉功能型稻米，就可通过主食摄入满足人体对抗性淀粉摄入的膳食需求。3.目前对于抗性淀粉合成的功能基因研究主要集中在控制直链淀粉合成的wx，以及控制支链淀粉合成的ssiiia和beiib。控制直链淀粉合成的gbssi由wx基因编码，该基因不同的等位变异也导致了直链淀粉含量的变化。粳稻中为wxb，抗性淀粉含量一般小于1％；而籼稻中wxa，抗性淀粉含量一般可达2％。虽然从wxb到wxa对野生型稻米抗性淀粉含量的增高有限，但不同wx等位基因型基础上对其他抗性淀粉合成基因的突变会导致抗性淀粉含量的显著变化，所以wx对于水稻抗性淀粉含量的提高发挥基础作用。对抗性淀粉含量为6％的籼稻突变体b10的图位克隆研究发现，其高抗性淀粉的表型是由淀粉合成酶ssiiia的点突导致移码突变引起。b10中ssiiia的突变与籼稻背景wxa的高表达，使得水稻胚乳中的表观直链淀粉、总脂质和直链淀粉脂质复合物含量均显著提升、淀粉颗粒结构明显改变。淀粉分支酶beiib的突变也会导致种子抗性淀粉含量增高，且出现籽粒垩白的表型。然而现有研究结果对控制抗性淀粉合成功能基因的有限认知严重制约了优质高抗性淀粉水稻品种的创制与生产应用。4.近年来，育种学家们陆续获得一系列抗性淀粉含量显著提高的水稻突变体或品种，其中通过对籼稻材料r7954(抗性淀粉含量约为2％)进行物理诱变得到高抗性淀粉突变体rs4，其抗性淀粉含量约为11％。突变体rs4与r7954的回交获得高抗性淀粉突变体b10，其抗性淀粉含量约为6％，遗传分析表明rs4中有和b10一致的ssiiia突变位点。目前对于抗性淀粉合成的功能基因研究仍知之甚少，因而研究抗性淀粉合成的新基因具有重要的理论和现实意义。技术实现要素：5.本发明的目的是提供水稻种子抗性淀粉含量相关基因ssiiib及其应用。6.第一方面，本发明提供了ssiiib蛋白及其编码基因在调控植物种子抗性淀粉含量、直链淀粉含量和/或脂质含量中的应用；7.所述ssiiib蛋白为如下：8.1)由序列表中seqidno:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；9.2)将序列表中seqidno:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与植物抗性淀粉含量相关的由1)衍生的蛋白质。10.所述调控植物种子抗性淀粉含量、直链淀粉含量和/或脂质含量为降低植物种子中的抗性淀粉含量、直链淀粉含量和/或脂质含量；11.在本发明的实施例中，所述植物举例为突变体rs4；12.所述栽培稻r7954高抗性淀粉突变体rs4的突变方式为例，rs4突变后的核苷酸序列为如下：13.1)将ssiiia基因(genbank基因号：loc9268758，更新日期2022年5月15日)的第8402位的g替换为a得到序列(对应rs4突变后的ssiiia基因)；14.2)seqidno:3所示的dna分子(对应rs4突变后的ssiiib基因)。15.第二个方面，本发明提供了抑制ssiiib蛋白或其编码基因表达和抑制ssiiia蛋白或其编码基因表达的物质在如下任一中的应用：16.1)提高植物种子抗性淀粉含量；17.2)提高植物种子直链淀粉含量；18.3)提高植物种子脂质含量；19.4)改变植物种子淀粉颗粒结构；20.5)培育高抗性淀粉含量种子的植物；21.6)培育高直链淀粉含量种子的植物；22.7)培育高脂质含量种子的植物；23.8)培育种子淀粉颗粒结构改变的植物；24.所述ssiiib蛋白为如下任一种：25.1)由序列表中seqidno:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；26.2)将序列表中seqidno:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与植物抗性淀粉含量相关的由1)衍生的蛋白质。27.上文第二方面所述应用中，所述抑制ssiiib蛋白或其编码基因表达为敲除ssiiib蛋白或其编码基因，或，改变敲除ssiiib蛋白编码基因的编码区使其无法表达；28.所述抑制ssiiia蛋白或其编码基因表达为敲除ssiiia蛋白或其编码基因，或，改变敲除ssiiia蛋白编码基因的编码区使其无法表达。29.上文中，上述敲除或改变可以采用现有的方式实现，如pe定点删除、同源重组+基因编辑、物理或化学诱变等；只要能够敲除或改变水稻基因组ssiiia和/或ssiiib基因的编码区的任何物质和任何方式，使ssiiia和/或ssiiib基因无法正常表达蛋白即可。30.进一步地，上述改变为化学诱变r7954得到ssiiia和ssiiib基因突变无法正常表达蛋白的突变体rs4；31.上述改变为对水稻基因组ssiiia和ssiiib基因的编码区完全或部分删除、碱基替换改造、片段插入或以上几种方式的综合，使ssiiia和ssiiib基因突变无法正常表达蛋白，得到ssiiiacrssiiibcr-1和ssiiiacrssiiibcr-2。也可以在敲除或改变水稻基因组ssiiia编码区的基础上，再对ssiiib基因的编码区实现敲除或改变，使得ssiiia和ssiiib基因的功能丧失，得到目的水稻。32.可以构建敲除或改变系统，将该敲除或改变系统导入受体植物，具体可为：通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。33.所述ssiiib编码基因为如下任一种：34.1)seqidno:1所示的核苷酸序列；35.2)在严格条件下与1)所限定的dna分子杂交且具有相同功能的dna分子；36.3)与1)所限定的dna分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的dna分子。37.第三方面，本发明提供了抑制ssiiib蛋白或其编码基因表达的物质在如下任一中的应用：38.1)提高植物种子抗性淀粉含量；39.2)提高植物种子直链淀粉含量；40.3)提高植物种子脂质含量；41.4)改变植物种子淀粉颗粒结构；42.5)培育高抗性淀粉含量种子的植物；43.6)培育高直链淀粉含量种子的植物；44.7)培育高脂质含量种子的植物；45.8)培育种子淀粉颗粒结构改变的植物；46.上文第三方面所述应用中，所述种子淀粉颗粒结构改变为由大小一致、形状规则、有多面体棱角、排列紧密状颗粒改变为松散无序圆球状颗粒；47.所述ssiiib蛋白为如下任一种：48.1)由序列表中seqidno:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；49.2)将序列表中seqidno:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与植物抗性淀粉含量相关的由1)衍生的蛋白质；50.所述植物为基因组中ssiiia基因发生突变使其无法表达蛋白的植物。51.上文第三方面所述应用中，所述植物为ssiiia基因突变的植物，如物理诱变或者基因编辑实现ssiiia基因突变，在本发明的实施例中具体为ssiiiacr。52.所述抑制ssiiib蛋白或其编码基因表达为敲除ssiiib蛋白或其编码基因，或，改变敲除ssiiib蛋白编码基因的编码区使其无法表达。53.第四方面，本发明提供了一种制备种子性状改变目的植物的方法，包括如下步骤：54.1)抑制或敲除植物中ssiiia蛋白编码基因的表达，得到转基因植物a；55.和，抑制或敲除植物中ssiiib蛋白编码基因的表达，得到转基因植物b；56.2)将转基因植物a和转基因植物b杂交，得到后代，选择ssiiia蛋白编码基因和ssiiib蛋白编码基因均敲除或改变的植物，即为目的植物；57.所述目的植物的种子抗性淀粉含量、直链淀粉含量和/或脂质含量高于所述植物；58.或，所述目的植物的种子抗性淀粉含量、直链淀粉含量和/或脂质含量高于所述转基因植物a；59.或与所述植物相比，所述目的植物种子发生淀粉颗粒结构改变；60.所述ssiiib蛋白为如下任一种：61.1)由序列表中seqidno:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；62.2)将序列表中seqidno:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与植物抗性淀粉含量相关的由1)衍生的蛋白质。63.第五方面，本发明提供了一种制备种子性状改变目的植物的方法，包括如下步骤：64.1)对出发植物中ssiiib基因进行基因编辑，使出发植物中的ssiiib基因不表达，得到基因编辑植物b；65.和，对出发植物中ssiiia基因进行基因编辑，使出发植物中的ssiiia基因不表达，得到基因编辑植物a；66.2)将基因编辑植物a和基因编辑植物b杂交，得到后代，选择ssiiia蛋白编码基因和ssiiib蛋白编码基因均发生基因编辑且无法表达蛋白的植物，即为目的植物；67.所述目的植物的种子抗性淀粉含量、直链淀粉含量和/或脂质含量高于所述出发植物；68.或，所述目的植物的种子抗性淀粉含量、直链淀粉含量和/或脂质含量高于所述基因编辑植物a。69.上文所述方法中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；70.或，所述单子叶植物具体为水稻，进一步具体为水稻栽培种。71.第六方面，本发明提供了一种突变蛋白，为如下：72.1)由序列表中seqidno:3所示的核苷酸编码的蛋白质；73.2)将序列表中seqidno:3的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，得到的核酸序列编码与植物抗性淀粉含量相关的由1)衍生的蛋白质。74.上述种子淀粉颗粒结构改变为由大小一致、形状规则、有多面体棱角、排列紧密状颗粒改变为松散无序圆球状颗粒。75.在本发明的实施例中，所述水稻品种为r7954或中花11号。76.上述水稻可以为转基因编辑水稻，包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。77.实验证明本发明具有有益的技术效果：将ssiiib基因在ssiiia突变体的背景中失活或降低活性后，水稻种子的抗性淀粉含量显著升高，表明ssiiib基因能够控制水稻种子的抗性淀粉含量。因此，在ssiiia突变体的背景下ssiiib基因的缺失能够提升水稻种子抗性淀粉含量，对抗性淀粉的功能基因研究具有重要的理论意义和应用潜力。附图说明78.图1为高抗性淀粉突变体rs4的相关表型。79.图2为r7954、b10和rs4的ssiiia与wx基因的caps标记引物检测结果。80.图3为b10与rs4的f2群体的抗性淀粉含量分布。81.图4为rs4中ssiiib基因的定位。82.图5为ssiiib:gssiiib/rs4转基因突变体的基因型与表达量鉴定。83.图6为ssiiib:gssiiib/rs4转基因突变体的抗性淀粉含量与淀粉颗粒电镜扫描结果。84.图7为r7954、b10和rs4中ssiiia与ssiiib基因的caps标记引物检测结果。85.图8为rs4与r7954的f2群体ssiiib与ssiiia基因的caps标记引物检测结果。86.图9为r7954、b20、b10和rs4的抗性淀粉含量与淀粉颗粒电镜扫描结果。87.图10为r7954、b20、b10和rs4的直链淀粉与总脂质含量。88.图11为ssiiia与ssiiib的cripsr/cas9基因编辑相关突变体的结构模式图与突变位点。89.图12为ssiiiassiiib基因编辑双突变体的抗性淀粉含量与淀粉颗粒电镜扫描结果。90.图13为ssiiiassiiib基因编辑双突变体的直链淀粉与总脂质含量。具体实施方式91.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。92.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。93.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的生物化学、分子生物学、遗传学等相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如，本发明中使用的分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：sambrook，j.,fritsch，e.f.,maniatis，t.,molecularcloning:alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress:coldspringharbor,1989。其中，籼稻r7954、b10与rs4突变体可从本实验室获取。94.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本
技术领域：
：普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。95.实施例1、rs4中高抗性淀粉基因ssiiib的定位96.1、rs4的表型与遗传背景的鉴定97.浙恢7954，也被称作r7954，是水稻(oryzasatival.)常规籼稻的野生型栽培品种(品种权号：cna20010058.0)，通过对r7954分别进行航天诱变和60co辐照育种，得到抗性淀粉含量约为11％的高抗性淀粉突变体rs4(记载在如下文献：shu,x.,jia,l.,ye,h.,li,c.,&wu,d.(2009).slowdigestionpropertiesofricedifferentinresistantstarch.journalofagriculturalandfoodchemistry,57(16),7552-7559.，文献中该突变体名称为rs4)；其中rs4与r7954回交得到一个抗性淀粉含量介于两者之间，约为6％的突变体b10(记载在如下文献：zhou,h.,wang,l.,liu,g.,meng,x.,jing,y.,shu,x.,...&li,j.(2016).criticalrolesofsolublestarchsynthasessiiiaandgranule-boundstarchsynthasewaxyinsynthesizingresistantstarchinrice.proceedingsofthenationalacademyofsciences,113(45),12844-12849.，文献中该突变体名称为b10)。r7954、b10和rs4的抗性淀粉含量如图1a所示。rs4与b10籽粒中均出现垩白的表型(图1b)，但rs4、b10和r7954植株外观相似(图1c)。b10的图位克隆研究表明ssiiia的剪切位点处发生了一个g到a的点突变导致mrna剪切位点改变，从而发生移码突变导致蛋白功能丧失，并且由于籼稻背景下wxa的高表达，导致抗性淀粉含量显著增加，然而rs4的突变基因与ssiiia的关系尚不清楚。其中，ssiiia基因也被称为ss3a。98.为克隆rs4的高抗性淀粉基因，首先验证rs4与b10中ssiiia与wx的基因型。利用能够区分b10中ssiiia的g/a突变的caps引物对rs4与b10突变体进行基因型鉴定，其中ssiiia的caps扩增引物序列为seqidno:4和seqidno:5，鉴定结果显示rs4有和b10一致的ssiiia酶切带型(图2a)，即rs4与b10均带有同类型的ssiiia突变。同时，利用可以区别wxa与wxb第一内含子5’端第1个碱基g/t差异的wxcaps关联引物进行检测，其中wxcaps扩增引物序列为seqidno:6和seqidno:7，鉴定结果显示rs4有和b10一致的wx酶切带型，验证确认了rs4与b10均为籼稻中常见的wxa基因型(图2b)。99.表1为检测ssiiia与wx基因型的caps引物组合[0100][0101]2、使用混池测序的方法定位目的基因[0102]由于b10与rs4遗传背景一致，将两个突变体杂交并自交一代，获得b10与rs4的f2群体共208个单株，用于重测序鉴定突变位点。对f2群体进行抗性淀粉含量检测。[0103]首先，样品前处理过程为：将成熟种子收获并去除未完全成熟或感病种子，于室温贮藏40天以上，挑选成熟度相对一致的种子用于指标测定。筛选后的种子经托普云农小型砻谷机去壳得到糙米，再经中储粮小型碾米机磨成精米后，根据测定指标需求由retsch高速旋转碾磨仪粉碎成对应孔径大小的米粉。称取1g可完全通过1mm网筛的精米粉，均匀平铺在岛津水分测定仪的托盘上，关盖后于120℃条件下烘干样品至恒重，根据烘干前后样品重量计算样品的含水量。[0104]使用抗性淀粉检测试剂盒(megazyme，k-rstar)来测定b10与rs4的f2群体的抗性淀粉含量步骤为：称取完全通过1mm网筛米粉100±5mg倒入干燥的160mm带盖螺纹口玻璃试管中，轻敲管壁使样品沉落管底，加入180μl蒸馏水，旋紧试管盖后沸水加热20min至米粉可食。待样品冷却至室温后，倒入10mg/mlα-amylase胰淀粉酶(含3u/mlamg)1ml，并用玻璃棒将煮熟后米粉块碾碎至无结块大颗粒，再加入3ml上述胰淀粉酶拧紧试管盖，将样品放入37℃的震荡水浴锅中，用每分钟100次直线运动的速度线性震荡16h以进行酶解。其余测定方法参见产品说明书，参考美国分析化学家协会标准aoac2002.02和美国谷物化学师协会标准aacc32-40.01标准。[0105]对测定结果按照抗性淀粉含量从低至高排序，取每组组距为0.75％，分为12个小组，整体呈偏向低抗性淀粉含量的偏态分布(图3)。f2分离群体抗性淀粉含量呈双峰分布，以坡谷(10.25％)为断点临界值，抗性淀粉含量小于或等于10.25％的单株，总数为157；而抗性淀粉含量大于10.25％的单株，总数为51。对b10与rs4的f2群体抗性淀粉含量按照3:1分离比进行χ2检验，结果显示χ2＝0.0129，p＝0.90(表2)，表明b10与rs4的f2群体抗性淀粉含量分布符合3：1的分离比，说明该群体中抗性淀粉含量变化是由ssiiia和wx之外的一个隐性基因所控制。[0106]表2为b10与rs4的f2群体分离比χ2测验表[0107][0108]对该f2群体进行重测序，并结合抗性淀粉测定结果对rs4中控制抗性淀粉合成的新基因进行定位。测序策略为：对亲本r7954、b10和rs4分别进行全基因组重测序，将抗性淀粉极高的单株重测序结果与抗性淀粉极低的混池群体重测序结果进行snpindex比较后，发现snpindex在水稻基因组第4号染色体长臂区段有一个明显的峰(图4a)，表明抗性淀粉新基因可能位于这一区间内。对该1.1mbp区间范围内b10和rs4两个亲本之间的突变位点进行注释，结果显示该区段中存在7个候选的突变位置。[0109]为进一步克隆该基因，选取未进行重测序的极高抗性淀粉(rs为12-13％)单株与极低抗性淀粉(rs为6.7-7.5％)单株对该区段的7个候选位点分别进行pcr验证，鉴定结果显示仅第6个位点完全与抗性淀粉相关表型连锁(图4b)。第6个位点处的基因称为ssiiib，也被称为ss3b(genbank基因号：loc4337056，更新日期2022年8月26日)。ssiiib基因的核苷酸序列为序列表中seqidno:1，其编码蛋白ssiiib的氨基酸序列为序列表中seqidno:2。[0110]经过测序，rs4突变体与浙恢7954相比，ssiiib基因和ssiiia基因均发生突变，rs4突变体中含有ssiiib突变基因和ssiiia突变基因，浙恢7954中含有ssiiib基因和ssiiia基因，具体如下：[0111]rs4突变体中ssiiib突变的位置处于该基因第15个外显子区域，两个碱基cg的缺失导致rs4中ssiiib基因的编码蛋白的移码与提前终止(图4c)。[0112]rs4突变体中ssiiib突变基因的核苷酸序列为seqidno:3，其与ssiiib基因相比，为将seqidno:1序列的第7185-7186位的cg缺失得到的序列。[0113]rs4突变体中ssiiia突变基因的核苷酸序列为将ssiiia基因(genbank基因号：loc9268758，更新日期2022年5月15日)的第8402位的g替换为a得到的序列。[0114]实施例2、籼稻背景中ssiiib基因的功能验证[0115]一、转基因互补验证[0116]为验证定位基因的正确性，构建了使用ssiiib基因全长的ssiiib:gssiiib互补质粒并转入rs4突变体中。[0117]具体如下：[0118]1、互补质粒的制备[0119]ssiiib:gssiiib互补质粒为将seqidno:1所示的ssiiib基因(全长共计8627bp)插入pcambia1300载体(abcam，ab275754)的ecori和hindiii位点得到的质粒。[0120]2、转基因突变体的制备[0121]将ssiiib:gssiiib互补质粒用根癌农杆菌介导法转化籼稻rs4突变体的愈伤组织，具体实验细节参考(hiei,y.,ohta,s.,komari,t.,&kumashiro,t.(1994).efficienttransformationofrice(oryzasatival.)mediatedbyagrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofthet-dna.theplantjournal,6(2),271-282；zhang,y.,li,j.,&gao,c.(2016).generationofstabletransgenicrice(oryzasatival.)byagrobacterium-mediatedtransformation.currentprotocolsinplantbiology,1(2),235-246.)，共获得22个ssiiib:gssiiib/rs4转基因转化株系t0代。[0122]3、转基因突变体的鉴定[0123]采用ctab法从ssiiib:gssiiib/rs4转基因转化株系t0代苗的叶片中提取基因组dna作为模板，利用位于ssiiib:gssiiib载体上的引物1300-ecori-f(序号为seqidno:8)和位于ssiiib片段上的引物ssiiib-1300-r(序号为seqidno:9)通过聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,pcr)扩增ssiiib:gssiiib/rs4转基因突变体中插入的dna片段。[0124]表3为ssiiib:gssiiib/rs4的检测引物信息表[0125]序号引物名称引物序列seqidno:81300-ecori-fgttgtgtggaattgtgagcggseqidno:9ssiiib-1300-rgaacgtaggccgtaaagtagc[0126]按照pcr酶kodfx(toyobo，kfx-101)的产品说明书配制pcr体系(20μl)，其中得到523bp扩增片段的材料为t0代阳性转化水稻株系，其中20个为阳性(图5a)。选取10个t0代阳性转化水稻植株继续种植下一代，每个株系种植10株，得到t1代ssiiib:gssiiib/rs4转基因水稻。[0127]将r7954、b10和rs4以及3个t1代ssiiib:gssiiib/rs4转基因水稻开花后15天的胚乳，使用多糖多酚植物rna快速提取试剂盒(迪宁，dp230-01)提取rna，具体方法参照产品说明书进行。再使用maximatmhminuscdnasynthesismastermixwithdsdnase试剂盒(thermo,m1681)去除总rna中残留的dna，并反转录为cdna。[0128]以cdna为模板，使用ssofastsupermix(bio-rad，1725201)依照产品说明书配制荧光定量pcr反应体系10μl。使用实时荧光定量pcr仪(bio-rad，cfx96)进行pcr反应。pcr反应程序为：98℃，30s；(98℃，5s→60℃，5s→信息采集)，40个循环；60-95℃，0.5℃/5s，信息采集/5s。程序运行完毕后通过bio-radcfxmanager软件对数据进行分析。[0129]实时荧光定量pcr使用的引物如下：用于检测ssiiib表达水平的引物q-ssiiib-f(序号为seqidno:10)和q-ssiiib-r(序号为seqidno:11)，以及用于检测actin内参基因(genbank基因号：loc4333919，更新日期2022年8月29日)表达水平的引物q-actin-f(序号为seqidno:12)和q-actin-r(序号为seqidno:13)。[0130]表4为ssiiib的qrt检测引物信息表[0131]序号引物名称引物序列seqidno:10q-ssiiib-fattccgctcgcaagaactgaseqidno:11q-ssiiib-rcaaccgcaggataacggaaaseqidno:12q-actin-fcttcataggaatggaagctgcgggtaseqidno:13q-actin-rcgaccaccttgatcttcatgctgcta[0132]结果如图5b所示，gssiiib-1、gssiiib-2、gssiiib-3分别代表t1代ssiiib:gssiiib/rs4转基因水稻3个不同植株，经过rt-pcr检测发现，gssiiib-1、gssiiib-2、gssiiib-3中ssiiib的表达量均高于rs4，所检测材料的第2个和第3个t1代ssiiib:gssiiib/rs4转基因水稻(gssiiib-2、gssiiib-3)中ssiiib的表达量超过野生型籼稻r7954的水平(图5b)，表明在这两个ssiiib:gssiiib/rs4突变体中ssiiib的表达水平得到恢复。后续实验选择已检测表达水平的第3个突变体gssiiib-3，作为ssiiib:gssiiib/rs4进行后续实验。[0133]4、测定互补转基因材料的相关表型[0134]将t1代ssiiib:gssiiib/rs4转基因水稻gssiiib-3、b10、rs4突变体和野生型r7954的精米粉测定抗性淀粉含量，方法同前。抗性淀粉测定结果如图6a所示，t1代ssiiib:gssiiib/rs4转基因水稻gssiiib-3(图中记作ssiiib:gssiiib/rs4)的籽粒中抗性淀粉含量比rs4突变体降低，且恢复到了b10的水平，约为6％。[0135]使用电镜观察上述材料的淀粉颗粒结构：室温自然干燥的糙米在背腹茎最大处用刀片轻轻敲断，使其自然断面朝上，用导电胶固定于铜台上。将样品用离子溅射仪(hitachi，e-1010ionsputter)喷金后，使用扫描电子显微镜(hitachi，s-3000n)观察样品。在电镜下观察到野生型r7954的淀粉颗粒结构大小一致、形状规则、有多面体棱角、排列紧密，b10和rs4突变体的淀粉颗粒大小不均、棱角不明显、呈现圆球和无规则状、排列松散无序状，而互补突变体ssiiib:gssiiib/rs4籽粒的淀粉颗粒结构也呈现出疏松排布的圆球状颗粒(图6b)。[0136]此外，为确认b10突变体ssiiia和ssiiib的基因型，选取能够区分rs4与r7954中ssiiia基因的caps引物ssiiia-caps-f和ssiiia-caps-r(同seqidno:4和seqidno:5)，ssiiib基因的caps引物ssiiib-caps-f和ssiiib-caps-r(具体信息见表5，seqidno:14和seqidno:15)。检测结果显示b10在ssiiia检测位点上有和rs4相同的caps酶切带型，在ssiiib检测位点上有和r7954相同的caps酶切带型(图7)，这表明b10突变体仅在ssiiia检测位置有突变，而在ssiiib检测位置无突变。[0137]表5为检测ssiiib基因型的caps引物组合[0138][0139]上述结果表明ssiiib基因能够部分互补rs4中高抗性淀粉的表型，证明ssiiib是rs4中控制高抗性淀粉表型的新基因。[0140]二、ssiiib基因对抗性淀粉含量的影响[0141]为进一步验证ssiiib基因功能，通过将rs4与r7954进行回交，检测回交的f2代材料的基因组dna。其中使用ssiiibcaps扩增引物ssiiib-caps-f和ssiiib-caps-r(seqidno:14和seqidno:15)检测ssiiib的基因型，同时使用ssiiiacaps扩增引物ssiiia-caps-f和ssiiia-caps-r(seqidno:4和seqidno:5)检测ssiiia的基因型。选择其中ssiiib基因与rs4有相同酶切带型(图8a)，且ssiiia基因与r7954有相同酶切带型的材料(图8b)，图中编号为4的材料符合鉴定需求，即为籼稻背景下纯合的ssiiib的单突变体(ssiiia基因不突变)，命名为b20。[0142]对所获得的b20、b10、rs4突变体及野生型r7954的种子，测定抗性淀粉含量。测定结果如图9a所示，b20抗性淀粉含量为1.7％，表明b20与r7954抗性淀粉含量无显著差异。电镜扫描种子横切面的结果如图9b所示，b20种子的扫描电镜结果呈现排列紧密、结构大小一致、形状规则、有多面体棱角的淀粉颗粒形态，该结果与野生型相近。所以b20籽粒外观和淀粉颗粒结构没有明显变化，这表明ssiiib的单独突变不会影响抗性淀粉含量与淀粉颗粒相关表型。[0143]三、ssiiib基因对其他理化特性的影响[0144]为进一步研究高抗性淀粉突变体的其他理化指标，使用r7954、b20、b10和rs4的精米粉，根据ny/t2639-2014测定直链淀粉含量。将精米粉磨碎成可完全通过0.2mm网筛的米粉，经100目网筛筛选后称取100±0.5mg米粉倒入干燥的160mm带盖螺纹口玻璃试管中，轻敲管壁使样品沉落管底。加入1ml95％(v/v)乙醇溶液，将粘在管壁上的试样冲下，轻轻振荡。样品充分湿润分散后加入9ml1mnaoh溶液，加盖旋紧并轻轻混匀，随后将加好试剂的玻璃试管在沸水浴中加热10min充分分散淀粉。从沸水浴中取出待测样品快速冷却至室温，吸取500μl待测样品液于装有50ml蒸馏水的100ml容量瓶中，再加入1ml1m乙酸溶液和2ml的i2-ki试剂，蒸馏水定容，混匀后室温静置20min，620nm波长测定淀粉溶液吸光度值。将4个参比样品(表观直链淀粉含量分别为1.5％、10.4％、16.2％和26.5％)的直链淀粉含量为纵坐标，以其吸光度值为横坐标作出标准曲线，由作出的标准曲线可计算得到各个待测样品的表观直链淀粉含量。[0145]测定出的直链淀粉含量结果如图10a所示，b20与r7954的直链淀粉含量无差异，b10单突变体的直链淀粉含量较r7954显著升高达到32％，而rs4突变体的直链淀粉含量比b10单突变体有进一步增加达到39％。[0146]采用ny/t4-1982粗脂肪测定方法，对r7954、b20、b10和rs4的精米粉的总脂质含量进行测定。测定结果如图10b所示，b20与r7954总脂质含量相近，b10的总脂质含量显著高于r7954达1.6％，rs4则增高至2.2％。[0147]这表明在这4个材料中，伴随抗性淀粉含量的增高，直链淀粉和总脂质含量也会显著增高。[0148]实施例3、粳稻背景中ssiiia和ssiiib双基因编辑水稻突变体的创制[0149]1、ssiiia基因编辑载体的构建[0150]为通过基因编辑的方法创制ssiiia突变体，选择ssiiia编码区的第1个外显子区域设计适于crispr-cas9的编辑位点，设计的靶点除具有所使用的cas9蛋白要求具有的pam序列(在本例中为ngg和nag)外，还要具有较高的序列特异性，以避免脱靶效应，此处设计2个靶点(表6)。将ssiiia-sgrna-1-f/r和ssiiia-sgrna-2-f/r分别退火，得到ssiiia-sgrna-1和ssiiia-sgrna-2，再分别通过t4连接酶(promega，m1808)连入经bspqi酶切的vk005-1载体中，分别获得基因编辑载体vector1(含有ssiiia-sgrna-1)与vector2(含有ssiiia-sgrna-2)，载体构建按照植物cas9/grna质粒构建试剂盒(唯尚立德生物科技有限公司，货号vk005-1)的方法完成。[0151]表6为ssiiia的crispr编辑载体及对应的引物信息[0152][0153]2、ssiiia单基因编辑突变体的鉴定[0154]将上述得到的2个基因编辑的crispr载体vector1与vector2分别转化农杆菌eha105菌株，得到2种含有不同编辑载体的农杆菌。将2种含有不同编辑载体的农杆菌菌株依照如下方法(hiei,y.,ohta,s.,komari,t.,&kumashiro,t.(1994).efficienttransformationofrice(oryzasatival.)mediatedbyagrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofthet-dna.theplantjournal,6(2),271-282；zhang,y.,li,j.,&gao,c.(2016).generationofstabletransgenicrice(oryzasatival.)byagrobacterium-mediatedtransformation.currentprotocolsinplantbiology,1(2),235-246.)分别对水稻栽培种中花11号进行转化，每个载体的转化分别获得约20个转化株系。[0155]根据sgrna对应靶点在水稻基因组的位置，设计对应sgrna位置的引物检测水稻株系基因编辑情况，由于ssiiia的两个靶点相近，所以设计1对引物检测，检测引物分别为seqidno:20和seqidno:21(表7)。[0156]表7为ssiiia相应编辑位点的特异性检测引物[0157]序号引物名称引物序列(5’‑3’)检测区域seqidno:20ssiiia-seq-fggttctcagtgtggtgtttgtcssiiia的2个靶点seqidno:21ssiiia-seq-rgcaagagcagccggaatcatssiiia的2个靶点[0158]将扩增序列进行测序，与水稻8号染色体上ssiiia编码区基因组序列(genbank基因号：loc9268758，更新日期2022年5月15日)进行比对，从中鉴定基因组受到编辑的株型，其中在vector1转化的20个t0转基因材料中，8个有ssiiia编码区的基因编辑；在vector2转化的20个t0转基因材料中，12个有ssiiia编码区的基因编辑。[0159]将上述得到的ssiiia编码区有基因编辑的株系继续种植下一代，每个株系种植10株，鉴定t1代ssiiia编码区有基因编辑的纯合株系。为防止t-dna中cas9持续高表达可能造成的非特异性编辑，对t1代纯合植株的种子进行潮霉素抗性筛选，鉴定转基因已经分离出去的植株，方法为：将纯合的t1代植株种子浸种萌发后，播种至含有(1：1000)潮霉素琼脂固体培养基上，筛选全部不长根的材料即为转基因已经分离出去的编辑株系，用于表型鉴定。[0160]根据测序与抗性筛选的分析结果，得到ssiiia纯合基因编辑的材料，信息如下：[0161]纯合编辑的株系ssiiiacr-1：与野生型水稻栽培种中花11号的8号染色体参考基因组中的ssiiia基因(genbank基因号：loc9268758，更新日期2022年5月15日)相比，该基因编码区第35-36位缺失2个碱基，其他碱基不变，使ssiiia基因发生移码突变，编码蛋白提前终止(图11a)，其他基因不变。[0162]纯合编辑的株系ssiiiacr-2：与野生型水稻栽培种中花11号的8号染色体参考基因组中的ssiiia基因(genbank基因号：loc9268758，更新日期2022年5月15日)相比，该基因编码区第25位缺失a，其他碱基不变，使ssiiia基因发生移码突变，编码蛋白提前终止(图11b)，其他基因不变。[0163]3、ssiiib基因编辑载体构建[0164]为创制ssiiib的基因编辑突变体，选择该基因编码区的前1-3个外显子区域设计适于crispr-cas9的编辑位点，设计的靶点除具有所使用的cas9蛋白要求具有的pam序列(在本例中为ngg和nag)外，还要具有较高的序列特异性，以避免脱靶效应，本发明共设计2个靶点ssiiib-sgrna-1与ssiiib-sgrna-2(表8)。[0165]表8为ssiiib的crispr编辑载体及对应的引物信息[0166][0167]将ssiiib-sgrna-1-f/r和ssiiib-sgrna-1-f/r分别退火，得到ssiiib-sgrna-1和ssiiib-sgrna-2；再分别通过t4连接酶(promega，m1808)连入经bspqi酶切的vk005-1载体中，分别获得基因编辑载体vector3(含有ssiiib-sgrna-1)与vector4(含有ssiiib-sgrna-2)，载体构建按照植物cas9/grna质粒构建试剂盒(唯尚立德生物科技有限公司，货号vk005-1)的方法完成。[0168]4、ssiiib单基因编辑突变体的鉴定[0169]将上述得到的2个基因编辑crispr载体vector3和vector4分别转化农杆菌eha105菌株，得到2种含有不同编辑载体的农杆菌。将2种含有不同ssiiib基因编辑载体的农杆菌的菌株依照如下方法(hiei,y.,ohta,s.,komari,t.,&kumashiro,t.(1994).efficienttransformationofrice(oryzasatival.)mediatedbyagrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofthet-dna.theplantjournal,6(2),271-282；zhang,y.,li,j.,&gao,c.(2016).generationofstabletransgenicrice(oryzasatival.)byagrobacterium-mediatedtransformation.currentprotocolsinplantbiology,1(2),235-246.)分别对水稻栽培种中花11(zh11)进行转化，每个转化，分别获得约20个转化株系。[0170]根据sgrna对应靶点在水稻基因组的位置，设计对应sgrna位置的引物检测水稻株系基因编辑情况，引物为seqidno:26-seqidno:29(表9)，用于检测ssiiib的两个靶点。将扩增序列进行测序，与4号染色体上ssiiib编码区基因组序列(genbank基因号：loc4337056)进行比对，从中鉴定基因组受到编辑的株型，其中在vector3转化的20个t0转基因材料中，有10个有ssiiib编码区的基因编辑；在vector4转化的20个t0转基因材料中，有13个有ssiiib编码区的基因编辑。[0171]表9为ssiiib编码区特异性引物[0172]序列引物名称引物序列(5’‑3’)检测区域seqidno:26ssiiib-seq-f1gctgatttgctccacgcattssiiib-sgrna-1seqidno:27ssiiib-seq-r1gatcaaagaagtaccacataaagassiiib-sgrna-1seqidno:28ssiiib-seq-f2agtacgattagttcaggaaaggtssiiib-sgrna-2seqidno:29ssiiib-seq-r2tgacaccactacttggctggssiiib-sgrna-2[0173]将上述得到的ssiiib编码区有基因编辑的株系继续种植下一代，每个株系种植10株，鉴定t1代ssiiib编码区有基因编辑的纯合株系。为防止t-dna中的cas9持续高表达可能造成的非特异性编辑，对t1代纯合植株的种子进行潮霉素抗性筛选，鉴定转基因已经分离出去的植株，方法为：将纯合的t1代植株种子浸种萌发后，播种至含有(1：1000)潮霉素琼脂固体培养基上，筛选全部不长根的材料即为转基因已经分离出去的编辑株系，用于表型鉴定。[0174]根据测序与抗性筛选的分析结果，用于表型鉴定的基因编辑的材料如下：[0175]ssiiib编码区纯合编辑的株系ssiiibcr-1：与野生型水稻栽培种中花11号的4号染色体参考基因组中的ssiiib基因(genbank基因号：loc4337056，或seqidno:1)相比，该基因编码区第112位插入t，其他碱基不变，使ssiiib基因发生移码突变，编码蛋白提前终止(图11c)，其他基因不变。[0176]ssiiib编码区纯合编辑的株系ssiiibcr-2：与野生型水稻栽培种中花11号的4号染色体参考基因组中的ssiiib基因(genbank基因号：loc4337056，或seqidno:1)相比，编码区第597位删除t，其他碱基不变，使ssiiib基因发生移码突变，编码蛋白提前终止(图11c)，其他基因不变。[0177]5、ssiiia和ssiiib双基因编辑水稻突变体的创制[0178]将上述突变体中的ssiiiacr-1和ssiiibcr-1材料进行杂交，杂交f0种子自交两代后使用seqidno:20和21检测ssiiia的第1个靶点，seqidno:26和27检测ssiiib的第1个靶点。将在ssiiia与ssiiib编码区均有纯合编辑材料命名为ssiiiacr[0179]ssiiibcr-1。[0180]ssiiiacrssiiibcr-1：与野生型水稻栽培种中花11号的4号染色体参考基因组中的ssiiib基因(genbank基因号：loc4337056，或seqidno:1)相比，编码区第112位插入t，其他碱基不变，使ssiiib基因发生移码突变，编码蛋白提前终止；且与野生型水稻栽培种中花11号的8号染色体参考基因组中的ssiiia基因(genbank基因号：loc9268758，更新日期2022年5月15日)相比，该基因编码区第35-36位缺失2个碱基，其他碱基不变，使ssiiia基因发生移码突变，编码蛋白提前终止；其他基因不变。[0181]将其中的ssiiiacr-2和ssiiibcr-2材料进行杂交，杂交f0种子自交两代后使用seqidno:20和21检测ssiiia的第1个靶点，seqidno:28和29检测ssiiib的第2个靶点。将在ssiiia与ssiiib编码区均有纯合编辑材料命名为ssiiiacrssiiibcr-2。[0182]ssiiiacrssiiibcr-2：与野生型水稻栽培种中花11号的4号染色体参考基因组中的ssiiib基因(genbank基因号：loc4337056，更新日期2022年8月26日，或seqidno:1)相比，编码区第597位删除t，其他碱基不变，使ssiiib基因发生移码突变，编码蛋白提前终止；且与野生型水稻栽培种中花11号的8号染色体参考基因组中的ssiiia基因(genbank基因号：loc9268758，更新日期2022年5月15日)相比，该基因编码区第25位缺失a，其他碱基不变，使ssiiia基因发生移码突变，编码蛋白提前终止；其他基因不变。[0183]6、ssiiia、ssiiib单突变体与双突变体抗性淀粉含量等表型测定[0184]选取野生型zh11、单突变体ssiiiacr-1、ssiiiacr-2、ssiiibcr-1、ssiiibcr-2和双突变体ssiiiacrssiiibcr-1、ssiiiacrssiiibcr-2纯合株系的成熟种子，干燥脱壳后磨成精米粉。按照米水质量比1:1.8蒸煮20min后，使用megazyme抗性淀粉检测试剂盒k-rstar，参考aoac2002.02和aacc32-40.01标准对抗性淀粉含量进行检测。[0185]测定结果表明ssiiibcr-1与ssiiibcr-2相较野生型zh11不影响抗性淀粉含量，ssiiiacr-1与ssiiiacr-2抗性淀粉含量均高于4％，ssiiiacrssiiibcr-1与ssiiiacrssiiibcr-2抗性淀粉含量继续增加至8％(图12a)。[0186]将上述纯合株系糙米的横断面在日立e-1010ionsputter上喷金后，使用扫描电子显微镜日立s-3000n观察样品。[0187]籽粒外观与淀粉颗粒扫描电镜结果显示ssiiiacrssiiibcr(ssiiiacrssiiibcr-1和siiiacrssiiibcr-2)与ssiiiacr(ssiiiacr-1与ssiiiacr-2)籽粒呈现垩白，淀粉颗粒大小不均、棱角不明显、呈现圆球和无规则状、排列松散无序的表型。而ssiiibcr(ssiiibcr-1与ssiiibcr-2)的籽粒外观透明，淀粉颗粒结构大小一致、形状规则、有多面体棱角、排列紧密(图12b)。这表明ssiiib单基因突变(ssiiibcr-1和ssiiibcr-2)对抗性淀粉含量无影响，而ssiiia和ssiiib的共同突变(ssiiiacrssiiibcr-1和ssiiiacrssiiibr-2)可以使其抗性淀粉含量相较ssiiia单突变体(ssiiiacr-1和ssiiiacr-2)有显著提升。同时，因ssiiiacr-1与ssiiiacr-2、ssiiibcr-1与ssiiibcr-2、ssiiiacrssiiibcr-1与ssiiiacrssiiibcr-2抗性淀粉含量和淀粉颗粒表型相似，所以后续实验仅选取ssiiiacr-1、ssiiibcr-1和ssiiiacrssiiibcr-1来代表粳稻突变体进行其它理化指标的测定。[0188]使用上述纯合株系的精米粉根据ny/t2639-2014测定直链淀粉含量，ssiiibcr-1与zh11的直链淀粉含量无差异，ssiiiacr-1单突变体的直链淀粉含量较对应野生型显著升高，而ssiiiacrssiiibcr-1双突变体的直链淀粉含量比ssiiiacr-1单突变体有进一步增加(图13a)。同时，ssiiibcr-1与zh11总脂质含量相近，ssiiiacr-1的总脂质含量显著高于zh11达1.4％，ssiiiacrssiiibcr-1则增高至1.5％(图13b)。这表明在抗性淀粉增高的材料中，直链淀粉和总脂质含量也会显著增高。[0189]在籼稻背景下使用物理诱变或者在粳稻背景下使用基因编辑的方法共同突变ssiiia和ssiiib基因能够使得水稻种子中抗性淀粉含量增高至7-11％的水平，较ssiiia突变体与野生型都有显著增加。ssiiiassiiib双突变体均导致种子抗性淀粉、直链淀粉和总脂质含量的增加。这表明ssiiib基因在ssiiia突变体的背景下对抗性淀粉合成发挥重要作用。[0190]以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.ssiiib蛋白及其编码基因在调控植物种子抗性淀粉含量、直链淀粉含量和/或脂质含量中的应用；所述ssiiib蛋白为如下：1)由序列表中seq id no:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中seq id no:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与植物抗性淀粉含量相关的由1)衍生的蛋白质。2.抑制ssiiib蛋白或其编码基因表达和抑制ssiiia蛋白或其编码基因表达的物质在如下任一中的应用：1)提高植物种子抗性淀粉含量；2)提高植物种子直链淀粉含量；3)提高植物种子脂质含量；4)改变植物种子淀粉颗粒结构；5)培育高抗性淀粉含量种子的植物；6)培育高直链淀粉含量种子的植物；7)培育高脂质含量种子的植物；8)培育种子淀粉颗粒结构改变的植物；所述ssiiib蛋白为如下任一种：1)由序列表中seq id no:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中seq id no:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与植物抗性淀粉含量相关的由1)衍生的蛋白质。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抑制ssiiib蛋白或其编码基因表达为敲除ssiiib蛋白或其编码基因，或，改变敲除ssiiib蛋白编码基因的编码区使其无法表达；所述抑制ssiiia蛋白或其编码基因表达为敲除ssiiia蛋白或其编码基因，或，改变敲除ssiiia蛋白编码基因的编码区使其无法表达。4.抑制ssiiib蛋白或其编码基因表达的物质在如下任一中的应用：1)提高植物种子抗性淀粉含量；2)提高植物种子直链淀粉含量；3)提高植物种子脂质含量；4)改变植物种子淀粉颗粒结构；5)培育高抗性淀粉含量种子的植物；6)培育高直链淀粉含量种子的植物；7)培育高脂质含量种子的植物；8)培育种子淀粉颗粒结构改变的植物；所述ssiiib蛋白为如下任一种：1)由序列表中seq id no:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中seq id no:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与植物抗性淀粉含量相关的由1)衍生的蛋白质；所述植物为基因组中ssiiia基因发生突变使其无法表达蛋白的植物。5.一种制备种子性状改变目的植物的方法，包括如下步骤：
1)抑制或敲除植物中ssiiia蛋白编码基因的表达，得到转基因植物a；和，抑制或敲除植物中ssiiib蛋白编码基因的表达，得到转基因植物b；2)将转基因植物a和转基因植物b杂交，得到后代，选择ssiiia蛋白编码基因和ssiiib蛋白编码基因均敲除或改变的植物，即为目的植物；所述目的植物的种子抗性淀粉含量、直链淀粉含量和/或脂质含量高于所述植物；或，所述目的植物的种子抗性淀粉含量、直链淀粉含量和/或脂质含量高于所述转基因植物a；或与所述植物相比，所述目的植物种子发生淀粉颗粒结构改变；所述ssiiib蛋白为如下任一种：1)由序列表中seq id no:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中seq id no:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与植物抗性淀粉含量相关的由1)衍生的蛋白质。6.一种制备种子性状改变目的植物的方法，包括如下步骤：1)对出发植物中ssiiib基因进行基因编辑，使出发植物中的ssiiib基因不表达，得到基因编辑植物b；和，对出发植物中ssiiia基因进行基因编辑，使出发植物中的ssiiia基因不表达，得到基因编辑植物a；2)将基因编辑植物a和基因编辑植物b杂交，得到后代，选择ssiiia蛋白编码基因和ssiiib蛋白编码基因均发生基因编辑且无法表达蛋白的植物，即为目的植物；所述目的植物的种子抗性淀粉含量、直链淀粉含量和/或脂质含量高于所述出发植物；或，所述目的植物的种子抗性淀粉含量、直链淀粉含量和/或脂质含量高于所述基因编辑植物a。7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物；或，所述单子叶植物具体为水稻，进一步具体为水稻栽培种。8.一种突变蛋白，为如下：1)由序列表中seq id no:3所示的核苷酸编码的蛋白质；2)将序列表中seq id no:3的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，得到的核酸序列编码与植物抗性淀粉含量相关的由1)衍生的蛋白质。

技术总结
本发明公开了水稻种子抗性淀粉含量相关基因SSIIIb及其应用。本发明提供了SSIIIb蛋白及其编码基因在调控植物种子抗性淀粉含量、直链淀粉含量和/或脂质含量中的应用。本发明将SSIIIb基因在籼稻或者粳稻ssIIIa突变体的背景中失活或降低活性后，水稻种子的抗性淀粉含量显著升高，表明SSIIIb基因能够控制水稻种子的抗性淀粉含量。因此，在ssIIIa突变体的背景下SSIIIb基因的缺失能够提升水稻种子抗性淀粉含量，对抗性淀粉的功能基因研究具有重要的理论意义和应用潜力。理论意义和应用潜力。


技术研发人员：李家洋 余泓 汪安祺 吴殿星 荆彦辉 成桥 孟祥兵 寇立泉 陈明江 舒小丽 刘贵富
受保护的技术使用者：中国科学院遗传与发育生物学研究所
技术研发日：2023.03.29
技术公布日：2023/8/24