鼻甲海神单胞菌及其应用的制作方法

1.本发明属于环境微生物和水产养殖技术领域，具体涉及一株鼻甲海神单胞菌及其应用。


背景技术：

2.随着水产养殖业的快速发展，水产养殖业对国民经济的发展越来越重要。根据2022年中国渔业统计年鉴显示，2021年全国水产品总产量同比增长了2.16％，但是捕捞产量同比下降2.18％，水产养殖面积却同比下降了0.38％，这数据明显表明了水产养殖业中，高密度养殖模式逐渐成为常态。然而，养殖户在追求高利益和高产量的同时，高密度的养殖会给养殖生物造成负担，比如残饵粪便的累积使得水体恶化，养殖水体中的氮、磷和硫等浓度升高，严重的还会发黑发臭。当水体中的污染物质超过其自净的能力时，容易引发养殖动物病害的爆发，为了防治病害往往会滥用抗生素等药物，这严重威胁着养殖产业的可持续发展和人类的身体健康与生态安全。
3.近年来，利用生物脱氮菌对养殖水体进行调节越来越被得到重视，因为生物脱氮菌具有安全和高效的特点，而且还容易成为养殖水体中的优势菌株，有研究表明，生物脱氮菌株还可以促进养殖动物的生长以及提高品质。
4.特别地，鉴于异养硝化-好氧反硝化的微生物高效脱氮菌株的脱氮率更高，适应性更强的诸多优点，得到了更多研究者的关注。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种
6.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
7.本发明实施例提供一株鼻甲海神单胞菌，该菌已于2022年9月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为gdmccno:62678。
8.进一步地，该菌命名为鼻甲海神单胞菌(neptunomonasconcharum)xy21，属于海神单胞菌属(neptunomonassp.)。
9.进一步地，该菌从广东海洋大学东海岛生物研究基地对虾养殖水体中分离获得。
10.进一步地，在水产养殖中的水质调节中的应用。
11.进一步地，具有异养硝化和好养反硝化功能的鼻甲海神单胞菌在降解水体中nh
4+-n和no
2-‑
n的应用。
12.与现有技术相比，本发明的一株鼻甲海神单胞菌安全性较高，脱氮效率好，适应性强，能用于水产养殖中的水质调节，有利于促进水产养殖业绿色健康的可持续发展。
附图说明
13.此处所说明的附图用来公开对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
14.图1为本发明实施例提供一株鼻甲海神单胞菌的外部形态示意图。
15.图2为本发明实施例提供一株鼻甲海神单胞菌的溶血实验结果图示意图。
16.图3为本发明实施例提供一株鼻甲海神单胞菌的安全性浸泡试验结果示意图。
17.图4为本发明实施例提供一株鼻甲海神单胞菌的16srdna基因序列的系统进化树示意图。
18.图5为本发明实施例提供一株鼻甲海神单胞菌的不同功能基因的pcr扩增结果示意图。
19.图6为本发明实施例提供一株鼻甲海神单胞菌在不同温度下的脱氮效果示意图。
具体实施方式
20.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
21.本发明实施例提供一株鼻甲海神单胞菌，该菌已于2022年9月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为gdmccno:62678。
22.该菌命名为鼻甲海神单胞菌(neptunomonasconcharum)xy21，属于海神单胞菌属(neptunomonassp.)。
23.该菌从广东海洋大学东海岛生物研究基地对虾养殖水体中分离获得。
24.该菌在水产养殖中的水质调节中的应用。
25.该菌具有异养硝化和好养反硝化功能的鼻甲海神单胞菌在降解水体中nh
4+-n和no
2-‑
n的应用。
26.所述水体为含氮废水。
27.去除nh
4+-n和no
2-‑
n较适温度为20～35℃。
28.所述鼻甲海神单胞菌不具溶血性，对凡纳滨对虾的存活不会造成危害，具有较高的安全性。
29.所述鼻甲海神单胞菌是在2216e液体培养基中培养获得。
30.本发明所用的培养基如下：
31.氨氮-硝化液体培养基(nm)包含以下成分(g/l)：c4h4o4na20.69g，(nh4)2so40.096g，k2hpo40.01g，kh2po40.01g，用0.22μm的滤膜过滤1l的无菌海水，培养基的最初盐度为30
‰
，ph为7.5；在亚硝酸盐-反硝化液体(dm)培养基中用0.1gnano2代替(nh4)2so4，其他成分与氨氮-硝化液体培养基相同；固体的氨氮-硝化培养基(亚硝酸盐-反硝化培养基)是在对应液体中每升添加16g的琼脂配成。
32.2216e液体培养基(g/l)：蛋白胨5.0g，酵母浸粉1.0g，fec6h5o70.1g，nacl19.45g，mgcl25.98g，na2so43.24g，cacl21.8g，kcl0.55g，na2co30.16g，kbr0.08g，srcl20.034g，h3bo30.022g。36.4g的粉状培养基溶于1l纯水配制而成；2216e固体培养基是在其液体培养基中加入20g/l的琼脂粉。
33.为更清楚起见，下面通过以下实施例进行详细说明。
34.实施例1
35.菌株的分离与筛选
36.本发明筛选得到的鼻甲海神单胞菌xy21来自广东海洋大学东海岛生物研究基地对虾养殖水体中分离得到的，其步骤如下：
37.富集培养：取水体样品10ml分别加入含有90ml的nm和dm的250ml的锥形瓶中，每个样品设有三个平行组，培养条件为28℃、180rpm，培养2-3天，每天更换一半新鲜灭菌的富集培养液体。
38.分离纯化：分别取1ml富集后nm和dm中的菌液到9ml的无菌pbs中混匀，再按照10-1
倍的梯度把菌液依次稀释成10-2-10-7
倍。之后取100μl稀释液分别涂布在固体氨氮-硝化和亚硝酸盐-反硝化培养基上，在有氧条件下，28℃倒置培养至长出菌落，借助放大镜挑选形态特征不一的菌落在固体氨氮-硝化和亚硝酸盐-反硝化培养基上划线纯化，筛选出单个菌落，最后将菌落加入在甘油中，保存于-80℃超低温冰箱中。
39.脱氮性能复筛：取保种的活化后菌株接种到nm和dm中，以不加菌株的为对照组，每组设置三个重复，在恒温摇床28℃、180rpm培养48h。分别于0，8，16，24，32，40和48h测定菌株对nh
4+-n和no
2-‑
n的脱氮性能，在相对于时间培养结束后，取适量的菌液10000rpm离心5min，将得到的上清液用于测定nh
4+-n和no
2-‑
n浓度，其中nh
4+-n的测定方法为纳氏试剂分光光度法，no
2-‑
n的测定方法为重氮-偶氮法；最后挑选出具有良好脱氮效果的生物脱氮菌，经数据分析后，挑选出来的菌株为鼻甲海神单胞菌xy21，结果如表1所示。
40.表1鼻甲海神单胞菌xy21的脱氮效果
[0041][0042]
实施例2
[0043]
菌株的鉴定
[0044]
(1)形态鉴定
[0045]
本发明经过上述的分离筛选得到一株鼻甲海神单胞菌xy21，该菌株在固体2216e平板上的菌落为白色，表面光滑，凸起，易挑起，圆形，湿润(如图1所示)。
[0046]
(2)生理生化鉴定
[0047]
将鼻甲海神单胞菌xy21活化后，每组设置三个重复，对菌株进行生理生化测定，结果见表2。
[0048]
表2鼻甲海神单胞菌生理生化特性鉴定结果
[0049][0050]
注：“+”为阳性，“－”为阴性
[0051]
(3)分子生物学鉴定
[0052]
根据制造商的说明，使用天根细菌基因组dna试剂盒获得鼻甲海神单胞菌xy21的基因组；将得到的菌株dna使用通用引物27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’)和1492r(5
’‑
tacggctaccttgttacgactt-3’)进行pcr扩增，以获得菌株xy21的16srdna序列。
[0053]
(4)鼻甲海神单胞菌xy21的鉴定及系统发育树的构建
[0054]
将得到菌株的16srdna序列在
[0055]
ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)上进行blast比对分析，选取与鼻甲海神单胞菌xy21相似的菌株进行比较分析，并使用mega5.0软件中的的基于1000次bootstrap重复算法的neighbor-joining方法构建系统进化树。
[0056]
结果显示，菌株xy21与neptunomonasconcharumpc6的同源性高达99.51％(如图4所示)，所以菌株xy21被认定是鼻甲海神单胞菌(neptunomonas concharum)。
[0057]
菌株xy21的序列如下(1447bp):
[0058]
tgcccgtggggggcgggctacacatgcagtcgagcggtaacaggaattagcttgctaatttgctgacgagcggcggacgggtgagtaacgcgtaggaatctaccgagtagtgggggatagcccagagaaatttggattaataccgcatacgccctacgggggaaaggaggggatcttcggacctttcgctattcgatgagcctgcgtaagattagctagttggtgaggtaaaggctcaccaaggcgacgatctttagctgttctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggggcaaccctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagatgtgaggaaagggtaatggttaatacccgttatctgtgacgttagcatcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggcggctaagtcagtcagatgtgaaagccccgggctcaacctgggaattgcacctgatactgcttagctagagtacagaagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacatcagtggcgaaggcggccacctggactgatactgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaactagccgttggggtacttgatactttagtggcgcagctaacgcgataagttgaccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgg
gttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttatttgccagcacttcgggtgggaactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggctgcgaacctgcgagggtaagctaatctcataaaaccgatcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcaaatcagaatgttgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtggattgcaccagaagtagttagtctaaccttcgggaggacgataccacggttgtcctgg。
[0059]
实施例3
[0060]
鼻甲海神单胞菌xy21的安全性评价
[0061]
(1)溶血试验：取活化好的100μl鼻甲海神单胞菌xy21加到含5％羊血平板上，置于恒温培养箱28℃培养1-2天，观察平板上是否有溶血圈的出现，若有溶血圈，则说明该菌株有致病性，反之亦然。
[0062]
(2)安全性浸泡试验
[0063]
选取健康的凡纳滨对虾(0.86
±
0.19g)，将180尾对虾随机分成3组饲养于60l的白桶中，每桶20尾对虾，每组设置3个重复。实验开始前先暂养一周，并按对虾体重5％的比例投喂商品饲料，每天更换的海水量超过90％；实验正式开始，取活化好的鼻甲海神单胞菌xy21于10000rpm离心5min，倒掉上清液收集菌体，用灭菌pbs冲洗3次，使用浊度法将菌液浓度稀释成1.0
×
105cfu/ml和1.0
×
106cfu/ml，不添加菌株的则是对照组，实验过程中的培养条件与暂养相同，每天观察对虾的症状及健康情况并进行记录，实验周期为14天。
[0064]
(3)药敏试验：药敏试验采用的是k-b纸片法，将鼻甲海神单胞菌xy21用2216e液体培养基过夜培养好，取100μl菌液均匀涂布于mha培养基上，当平板上的菌液被琼脂完全吸收后将29种药敏片贴于培养基表面，每种药敏纸片设置3重复，28℃倒置培养24-48h，之后用直尺测量抑菌圈的直径，判断菌株xy21对抗生素的敏感程度。
[0065]
(4)结果
[0066]
溶血平板的结果显示，在平板上没有出现溶血圈，说明鼻甲海神单胞菌xy21没有溶血性(如图2所示)。
[0067]
如图3所示，鼻甲海神单胞菌xy21的两个浓度菌对凡纳滨对虾的成活率没有造成不良后果，存活率高达96.67％。
[0068]
在药敏试验中，鼻甲海神单胞菌xy21对四环素耐药，对红霉素、环丙沙星、左氟沙星、氨曲南、氧氟沙星、卡那霉素和哌拉西林中度敏感，对其他21种抗生素敏感。
[0069]
以上的结果都说明了鼻甲海神单胞菌xy21具有较高的安全性，在水产养殖中具有良好的应用前景。
[0070]
表3鼻甲海神单胞菌xy21的药敏实验结果
[0071][0072]
注：敏感(susceptible,s)、中介(intermediate,i)、耐药(resistant,r)
[0073]
实施例4鼻甲海神单胞菌xy21脱氮菌脱氮基因的pcr扩增
[0074]
使用primer5.0软件设计引物，对鼻甲海神单胞菌xy21进行功能基因的pcr扩增实验，进一步研究其脱氮机制。
[0075]
基因引物信息如表4所示。
[0076]
表4鼻甲海神单胞菌xy21的脱氮基因引物
[0077][0078]
单胞菌xy21的dna；pcr反应条件为：94℃变性5min；35个循环：94℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min；72℃扩展7min。其中各脱氮功能基因的退火温度为：amoa40℃，hao54℃，nxrb58℃，nasa55℃，napa56℃和napb60℃，pcr产物在1％琼脂凝胶上进行电泳实验，使用凝胶成像系统拍照并保存图像。
[0079]
如图5所示，顺序为：1:amoa,2:hao,3:nxrb,4:nasa,5:napa,6:napb；鼻甲海神单胞菌xy21扩增出了amoa和napa两种基因片段，其中amoa是硝化过程关键的脱氮功能基因，napa被认为是好氧反硝化细菌的生物标志物，这结果说明了鼻甲海神单胞菌xy21有硝化和反硝化的途径。
[0080]
实施例5
[0081]
鼻甲海神单胞菌xy21在不同温度下的脱氮效果
[0082]
为了验证温度对鼻甲海神单胞菌xy21的脱氮效果，确定最优的脱氮温度，分别设置了15，20，25，30，35和40℃共6个不同温度，每个温度三个平行，温度通过控温培养箱控制，实验步骤参考脱氮性能复筛部分。
[0083]
实验结果如图6所示，在15～40的温度范围内，菌株的脱氮效果维持在59.97％以上，温度在20-35℃时降解nh
4+-n效果明显，以在25℃时效率达到最高(81.71％)。对于no
2-‑
n的去除效果，呈现了先上升后下降的趋势，并在30℃时，菌株xy21表现出最高的脱氮效果，no
2-‑
n降解率达到84.77％，当温度继续升高时，降解效率有所下降，但是整体的降氮效率均在62.84％以上。
[0084]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。

技术特征：
1.一株鼻甲海神单胞菌，其特征在于，该菌已于2022年9月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为gdmccno:62678。2.根据权利要求1所述的鼻甲海神单胞菌，其特征在于，该菌命名为鼻甲海神单胞菌(neptunomonasconcharum)xy21，属于海神单胞菌属(neptunomonassp.)。3.根据权利要求1或2所述的鼻甲海神单胞菌，其特征在于，该菌从广东海洋大学东海岛生物研究基地对虾养殖水体中分离获得。4.根据权利要求3所述的鼻甲海神单胞菌在水产养殖中的水质调节中的应用。5.根据权利要求4所述的鼻甲海神单胞菌具有异养硝化和好养反硝化功能的鼻甲海神单胞菌在降解水体中nh
4+-n和no
2-‑
n的应用。

技术总结
本发明公开了一株鼻甲海神单胞菌及其应用，属于环境微生物和水产养殖技术领域。所述鼻甲海神单胞菌(Neptunomonas concharum)XY21为海神单胞菌属(Neptunomonas sp.)，于2022年9月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为保藏编号为GDMCC No:62678。所述菌株是从广东海洋大学东海岛生物研究基地对虾养殖水体中分离和筛选得到的，具有异养硝化和好养反硝化的功能，能够有效地降解养殖水环境中的NH


技术研发人员：孙成波 薛媛 周佳宁 侯丹清 杨文杰 代霖欣 陈国良 高珊 宋宏斌 周腾 罗国玲
受保护的技术使用者：海茂种业科技集团有限公司 徐闻海茂水产种业科技有限公司
技术研发日：2023.02.21
技术公布日：2023/8/24