植物蛋白Nifu2在多途径防控病毒中的应用

植物蛋白nifu2在多途径防控病毒中的应用
技术领域
1.本发明属于基因工程领域，涉及植物叶绿体蛋白nifu2，特别是指植物蛋白nifu2在多途径防控病毒中的应用。


背景技术：

2.黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus, cgmmv)最早是1935年在英国发现并报道的，随后在世界范围内传播(ainsworth, 1935)，目前是一种严重危害葫芦科作物的重要种传病毒(dombrovskyet al., 2017)。cgmmv属于帚状病毒科(virgaviridae)，烟草花叶病毒属(tobamovirus)，为正单链rna病毒。cgmmv主要侵染葫芦、南瓜、丝瓜、瓠瓜、西瓜、黄瓜、甜瓜等葫芦科植物，同时也可以侵染模式植物本氏烟。cgmmv侵染导致植株叶片表现为黄斑、花叶、褪绿、泡状等症状，有的可能产生绿色的突起，使叶片表面凹凸不平，植株生长缓慢或矮化，严重的可导致不孕。影响果实品质，造成严重经济损失。
3.植物激素脱落酸(abscisic acid, aba)在植物生物和非生物胁迫中起着重要的作用，同时也参与植物对多种病毒的调控。aba处理植物可以诱导胞间连丝上胼胝质积累阻碍多种病毒在细胞间运动，例如烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, tmv) (whenham et al., 1985)、烟草坏死病毒(tobacconecrosis virus, tnv)(iriti and faoro, 2008)、竹子花叶病毒(bamboo mosaic virus, bmv)(alazem et al., 2014)和大豆花叶病毒(soybeanmosaic virus, smv)(li et al., 2012)等。aba也可以抑制茉莉酸途径并且调节活性氧水平促进水稻黑条矮缩病毒(rice black
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streaked dwarf virus, rbsdv)侵染水稻(xie et al., 2018)。
4.目前越来越多研究表明植物内源蛋白参与调控病毒侵染。常用的方法包括病毒介导的基因沉默技术，基因瞬时表达技术，农杆菌介导的遗传转化，crispr/cas9介导的基因敲除技术进行基因突变，对突变后植物材料进行病毒接种，用qpcr和western blot的方式检测，该基因突变后对病毒积累量的影响。文献touraineet al., 2004; yabeet al., 2004公开当在拟南芥上敲除nifu2时会使植株矮小，加速植物内水分丧失，同时导致aba水平下降(bergeret al., 2020)。而在农作物中nifu2会发挥什么样的作用，在培育优势抗病毒侵染的植物中又发挥怎样的作用，成为本课题组所要解决的技术问题。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提出一种植物蛋白nifu2在多途径防控病毒中的应用，解决了现有技术中黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染多种农作物造成果实品质下降，经济损失的技术问题。
6.本发明的技术方案是这样实现的：植物蛋白nifu2在防控病毒中的应用。
7.调控脱落酸途径在防控病毒中的应用，其中调控脱落酸途径是通过植物蛋白
nifu2或植物激素实现的。
8.上述植物激素为脱落酸。
9.与黄瓜绿斑驳花叶病毒的met结构域进行互作在防控病毒中的应用，其中与黄瓜绿斑驳花叶病毒的met结构域互作是通过植物蛋白nifu2实现的。
10.上述植物蛋白nifu2的氨基酸序列如seq id no.2所示。
11.上述病毒为黄瓜绿斑驳花叶病毒。
12.含有植物蛋白nifu2基因的表达载体在防控黄瓜绿斑驳花叶病毒中的应用。
13.上述植物蛋白nifu2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
14.上述的应用，步骤为：以植物蛋白nifu2基因为目标基因，与中间载体连接后制得含有植物蛋白nifu2基因的瞬时表达载体，在待防治植株叶片中进行瞬时表达，可以提高待防治植株对黄瓜绿斑驳花叶病毒的抗性。
15.本发明具有以下有益效果：1、本技术首次通过酵母文库筛选到一个与cgmmv met互作的植物内铁硫转运蛋白nifu2。推测并验证了met与nifu2互作影响aba合成途径，从而调控病毒致病。并利用trv介导的nifu2沉默植株，发现nifu2可以有效的抑制病毒侵染，通过过表达nifu2基因可以实现对病毒的防治；本技术首次鉴定了nifu2对cgmmv的抗性，有利于后续利用遗传转化技术进行抗病毒调控。
16.2、本技术利用外源aba喷施控制了由于nifu2缺失所造成的病毒积累，验证了nifu2通过调控aba来防控病毒侵染，有利于后续利用植物激素aba来防控病毒。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1为nifu2全长的核酸电泳图。
19.图2为nifu2沉默后促进cgmmv侵染结果图，其中a为沉默nifu2植株接种cgmmv的植株和叶片症状；b为nifu2的沉默效率检测；c为western blot检测nifu2沉默后对cgmmv积累的影响；d为qpcr检测nifu2沉默后对cgmmv积累的影响。
20.图3为aba回补nifu2沉默造成的植物防御缺陷示意图，其中a为沉默nifu2后喷施aba对cgmmv积累的植株和叶片症状；b为western blot检测nifu2沉默后喷施aba对对cgmmv积累的影响；c为沉默nifu2后喷施aba对nifu2沉默效率的影响；d为沉默nifu2后喷施aba对植物内源aba1表达的影响；e为qpcr检测nifu2沉默后喷施aba对对cgmmv积累的影响。
21.图4为nbnifu2与cgmmv 129k蛋白结构域met互作图，其中a为酵母验证nifu2与cgmmv 129k结构域met互作；b为coip验证nifu2与cgmmv 129k结构域met互作；c为bifc验证nifu2与cgmmv 129k结构域met互作。
22.图5为nifu2过表达对cgmmv侵染的影响图。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.实施例1：本氏烟nifu2基因的克隆一、本氏烟总rna提取1) 用打孔器取本氏烟叶片0.2 g于2 ml eppendorf (ep)管中，液氮速冻后迅速震荡研磨; 2) 充分研磨后，在组织粉末中加入1.5 ml trizol震荡混匀，冰上静置5 min，4℃，13,200 rpm离心5 min； 3) 取上清于2 ml ep管中，加1/5体积的三氯甲烷，剧烈震荡30 s，冰上静置5 min，4℃，13,200 rpm离心15 min； 4) 取上层水相于2 ml ep管中，加入等体积的异丙醇，轻柔震荡30 s，室温静置10 min；4℃，13,200 rpm离心20 min； 5) 弃上清，加入1 ml75%乙醇，洗涤沉淀，4℃，13,200 rpm离心5 min； 6) 重复步骤 5； 7) 弃上清，小心吸除残留液体，室温干燥 5 min，加入适量rnase-free h2o溶解； 8) 紫外分光光度计测定 rna 浓度后，放置-80℃备用。
25.二、反转录合成cdna将提取后的rna反转录为cdna，操作参照takara prime scripttm rt regent kit with gdna eraser说明书：第一步：按照上述体系加入到 ep 管中，混合均匀， 42℃ 10 min，冰上 5 min；第二步：按照上述体系加入到ep管中，混合均匀。在pcr仪上按下列条件进行反转录反应：
反转录产物可放于-20℃长期保存。
26.三、rt-pcr扩增nifu2基因利用上述cdna模版，并且根据nifu2基因核酸序列设计引物，进行pcr扩增，反应体系如下：引物序列为：正向引物（5
’‑3’
）：atgctatcgaatcctttaactcct；反向引物（5
’‑3’
）：tgttctctgctgtaagtggtaac。
27.混匀后，按照如下条件进行pcr：pcr程序结束后直接进行琼脂糖凝胶电泳。得到目的条带后如图1所示，参照qiaquick gel extraction kit 说明书，进行核酸纯化，获得本氏烟nifu2基因的全长实施例2：trv介导的nifu2基因沉默对cgmmv侵染的影响一、构建trv-rna2-nifu2 vigs载体nifu2基因的系统沉默是利用trv侵染性克隆介导的vigs技术进行的。以本氏烟的cdna为扩增模版，利用sgn vigs tool(http://vigs.solgenomics.net)在基因上预测一段300bp的片段进行trv介导的vigs，并设计引物，通过pcr扩增出目的片段：引物序列为：正向引物（5
’‑3’
）：gggg acaagtttgtacaaaaaagcaggct tc atgctatcgaatcctttaactcct；
反向引物（5
’‑3’
）：gggg accactttgtacaagaaagctgggt c ctgcaaaagttgaactgcgg将nifu2-vigs片段利用gateway克隆技术与入门载体pdonr207进行连接，体系如下：混匀后，25℃ 1 h，将上述连接产物转化入dh5α感受态细胞；37℃培养过夜，挑取单克隆进行菌落pcr并测序。测序后提取质粒进行第二轮lr反应，将连有目的片段的pdonr207与处理过的表达载体进行lr反应，体系如下：混匀后，25℃ 1 h，将上述连接产物转化入dh5α；37℃培养过夜，挑取单克隆进行菌落pcr并提取质粒。
28.二、nifu2沉默植株沉默效率鉴定将trv2-nifu2和trv1共注射到本氏烟在nifu2沉默10天后，利用rt-qpcr检测其沉默效率。
29.将上述试剂依次加入rnase-free ep管中，混匀后，分装到384孔定量板上，在实时荧光定量pcr仪中进行反应：预变性 95℃ 3 min；94℃ 15 s、60℃ 15 s、72℃ 15 s，进行40个循环。
30.结果由图2b可知，nifu2进行vigs后沉默效率达到98%。
31.ubc定量引物序列为：正向引物（5
’‑3’
）：tttcggtcctgatgatactccc；反向引物（5
’‑3’
）：cacagagcaaagactggattganifu2定量引物序列为：正向引物（5
’‑3’
）：aaactccaaggagcatgtgg；反向引物（5
’‑3’
）：tgcggctatagctggaattt三、nifu2沉默和瞬时表达对cgmmv侵染的影响
确定nifu2沉默效率后，对沉默10 dpi的植株接种cgmmv，接种后7天利用rt-qpcr检测病毒积累量。
32.由图2c可知，nifu2沉默可以有效促进cgmmv cp转录水平的增强，即促进cgmmv的侵染。
33.cgmmv cp定量引物序列为：正向引物（5
’‑3’
）：acaaggtaccgctttccaga；反向引物（5
’‑3’
）：tacgacagacgagggtaacg并利用western blot检测cgmmv病毒积累量的变化，本氏烟总蛋白提取方法如下：选取适量的面积相同的本氏烟叶片组织，液氮速冻并研磨；由蛋白组织裂解液(100 mm tris-hcl ph 8.8; 60% sds; 2% β-巯基乙醇)裂解，冰上静置30 min；13200 rmp 4℃ 离心10 min，取上清；加入5
ꢀ×ꢀ
loading buffer，100℃变性10 min。取相同体积的已变性的蛋白样品，进行sds-page垂直电泳，电压80 ｖ 30 min，调节电压120 v 1.5 h；半干法转膜，300ma 25 min；加入适量封闭液(5%的脱脂牛奶)对nc膜进行封闭，室温 1 h；加入anti-cgmmv cp一抗稀释液，室温孵育1-2 h；二抗为羊抗兔抗体，室温孵育1-2 h；最后用ecl显色液进行显色。结果如图2c所示，由图2d可知nifu2沉默后可以有效增加cgmmv cp蛋白积累量，即nifu2沉默促进cgmmv侵染。
34.构建nbnifu2基因瞬时表达载体nifu2-gfp，对瞬时过表达nifu2植株接种cgmmv，接种后7天利用western blot检测病毒积累量。如图5所示过表达nifu2-gfp后降低了cgmmv cp的积累，即nifu2过表达可以有效抑制cgmmv侵染。
35.实施例3：aba回补nifu2沉默造成的植物防御缺陷在nifu2沉默9天的植株上外源喷施100 μm aba，第二天接种cgmmv，两天后再次喷施aba，并使用0.2%的乙醇做对照；观察并记录植株发病时间，在接种后7天利用qpcr和western blot检测病毒积累量。结果如图3所示，由图3a可知nifu2沉默后喷施aba和其对照乙醇后接种cgmmv，植株和叶片上cgmmv侵染症状；图3b可知喷施aba或者乙醇对nifu2的沉默效率没有影响，nifu2都可以有效沉默；图3c可知，trv:nifu2内aba1表达明显下降，说明nifu2沉默降低了植物内激素aba含量，而喷施aba后，无论trv:00还是trv:nifu2中的aba1的表达量都升高了，说明aba喷施后缺失增加了植物内aba含量；图3d和3e可知trv:nifu2可以有效促进cgmmv的侵染，但是与对照相比对trv:nifu2喷施aba后显著抑制cgmmv的侵染，说明施用aba可以回补nifu2沉默所造成的防御缺陷。
36.实施例4：nifu2与cgmmv病毒的结合机理一、酵母验证nifu2与met结构域互作构建ad-nifu2、ad-csnifu2、bk-met、bk-ir、bk-hel，进行酵母双杂交。图4a可知nifu2与129k蛋白结构域met两两互作关系。
37.引物：adnifu2f：atcgaattcatgctatcgaatcctttaactcctadnifu2r：tcaggatccctactgcaaaagttgaactgcgbkmetf：atcgaattcatggcaaacattaatgaacabkmetr：tcaggatccttactcgatctgtaccttcct二、bifc验证nifu2与met互作构建pyfpn-nifu2、pyfpc-nifu2、pyfpn-met、pyfpc-met载体，gv3101农杆菌转化，
yfpn和yfpc两两组合浸润本氏烟，浸润烟草48-72h后，在共聚焦显微镜下观察浸润的烟草组织荧光。由图4b可知，nifu2与met在植物细胞叶绿体中互作。
38.引物：pnc-nifu2-f：agtggtctctgtccagtcctatgctatcgaatcctttaactcctpnc-nifu2-r：ggtctcagcagaccacaagtctgcaaaagttgaactgcggpnc-met-f：agtggtctctgtccagtcctatggcaaacattaatgaapnc-met-r：ggtctcagcagaccacaagtctcgatctgtaccttcct三、coip验证nifu2与met互作构建载体nifu2-gfp和met-flag，电转农杆菌gv3101，用瞬时转染液调节农杆菌菌液od
600
=1.0，等体积混合并注射本氏烟，3天后取样用于后续的coip实验。本实验中使用chromotek公司的gfp磁珠进行互作蛋白的富集，随后进行westernblotting来进行验证互作结果。由图4c可知，nifu2与met在植物体内互作。
39.引物：pnc-nifu2-f：agtggtctctgtccagtcctatgctatcgaatcctttaactcctpnc-nifu2-r：ggtctcagcagaccacaagtctgcaaaagttgaactgcggmet-flag-f：aactgcagatggcaaacattaatgaacamet-flag-r：cgggatccttactcgatctgtaccttcct我们确定了nifu2与cgmmv病毒在植物细胞体内外互作机理。植物叶绿体蛋白nifu2可以通过与cgmmv129k蛋白结构域met互作参与植物抗病毒过程；通过nifu2蛋白沉默后影响了植物内源激素aba，通过外源回补aba后可以有效缓解nifu2缺失所造成的防御缺陷，推测nifu2通过调整植物内源激素aba参与植物抗病毒过程。
40.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.植物蛋白nifu2在防控病毒中的应用。2.调控脱落酸途径在防控病毒中的应用，其中调控脱落酸途径是通过植物蛋白nifu2或植物激素实现的。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物激素为脱落酸。4.与黄瓜绿斑驳花叶病毒的met结构域进行互作在防控病毒中的应用，其中与黄瓜绿斑驳花叶病毒的met结构域互作是通过植物蛋白nifu2实现的。5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于：所述植物蛋白nifu2的氨基酸序列如seq id no.2所示。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述病毒为黄瓜绿斑驳花叶病毒。7.含有植物蛋白nifu2基因的表达载体在防控黄瓜绿斑驳花叶病毒中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述植物蛋白nifu2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤为：以植物蛋白nifu2基因为目标基因，与中间载体连接后制得含有植物蛋白nifu2基因的瞬时表达载体，在待防治植株叶片中进行瞬时表达，可以提高待防治植株对黄瓜绿斑驳花叶病毒的抗性。

技术总结
本发明属于基因工程领域，涉及植物叶绿体蛋白Nifu2，特别是指植物蛋白Nifu2在多途径防控病毒中的应用。本发明提出一种植物蛋白Nifu2在多途径防控病毒中的应用，解决了现有技术中黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染多种农作物造成果实品质下降，经济损失的技术问题。其中植物蛋白Nifu2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。Nifu2参与黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染过程，并与植物激素脱落酸相关，外源喷施ABA后可以回补由于Nifu2缺失所造成的植株防御缺陷。本申请首次鉴定了Nifu2对CGMMV的抗性，有利于后续利用遗传转化技术进行抗病毒调控。用遗传转化技术进行抗病毒调控。用遗传转化技术进行抗病毒调控。


技术研发人员：杨雪 施艳 李庆伦 李洪连
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：2022.12.30
技术公布日：2023/8/24