具有适应性受体特异性的嵌合抗原受体系统的制作方法

具有适应性受体特异性的嵌合抗原受体系统
相关申请的交叉引用
1.本技术要求于2020年12月18日提交的美国临时专利申请号63/127,587的权益，该申请通过引用整体并入本文。
技术领域
2.本技术涉及嵌合抗原受体(car)，尤其涉及具有适应性受体特异性的car(arcar)以及它们在免疫疗法(例如过继细胞疗法)中的用途。电子方式提交的序列表的引用
3.本技术包含序列表，其为通过efs-web以电子方式提交的ascii格式序列表，文件名为“sequencelisting_st25.txt”，创建日期为2021年12月15日，大小为103,886字节。通过efs-web提交的该序列表是说明书的一部分，并通过引用整体并入本文。


背景技术：

4.过继细胞疗法(act)通常涉及从供体分离细胞，在体外培养和/或操作细胞，然后将细胞转移至患者以治疗疾病。为了使细胞能够靶向特定抗原，经常使用嵌合抗原受体(car)对细胞进行工程改造。传统car具有固定的设计，因此，一种类型的car t细胞通常只能靶向一种抗原表位。这种刻板设计限制了临床应用并造成了异常高的制造成本。虽然开关-car(switch-car)平台有多种方案，但这些抗原特异性car通常在定制的基础上产生。
5.因此，仍然需要一种改进的通用car平台，该通用car平台具有用于调节car的内置的(built-in)且方便的机制，以容易地调整car的特异性，从而改进使用过继细胞疗法治疗疾病的疗法和方法。


技术实现要素：

6.一方面，本文提供了一种通用的具有适应性受体特异性组分的嵌合抗原受体(arcar)系统，所述arcar系统包含：(i)具有嵌合抗原受体的免疫效应细胞，所述嵌合抗原受体包含第一多肽，所述第一多肽包含：(a)胞外标签结合结构域，(b)跨膜结构域，和(c)至少一个胞内信号传导结构域；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包含：(a)与靶细胞上的至少一种抗原结合的抗原结合结构域，和(b)被嵌合抗原受体的第一多肽的标签结合结构域识别的标签；其中：(i)所述标签包含抗体或抗体的抗原结合片段或替代性支架，所述标签结合结构域包含与标签结合的抗独特型(anti-idiotype)分子；或者(ii)所述标签包含与标签结合结构域结合的抗独特型分子，所述标签结合结构域包含抗体或抗体的抗原结合片段或替代性支架。
7.在一些实施方式中，抗独特型分子与抗体的至少一个抗原结合区、抗体的抗原结
合片段或替代性支架结合。在一些实施方式中，抗独特型分子与抗体或抗体的抗原结合片段的至少一个互补决定区(cdr)结合。
8.在一些实施方式中，第二多肽的抗原结合结构域包含抗体或抗体的抗原结合片段，或替代性支架。在一些实施方式中，抗独特型分子为抗独特型抗体或其抗原结合片段，或抗独特型替代性支架。
9.在一些实施方式中，抗原结合片段为fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、scfv片段、fv片段、dsfv双抗体、vhh、vnar、单域抗体(sdab)或纳米抗体、dab片段、fd'片段、fd片段、重链可变区、分离的互补决定区(cdr)、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)或十抗体(decabody)。
10.在一些实施方式中，胞外标签结合结构域、抗原结合结构域或标签中的至少一个包含单域抗体或纳米抗体。在一些实施方式中，胞外标签结合结构域、抗原结合结构域或标签中的至少一个包含vhh。在一些实施方式中，胞外标签结合结构域和标签各自包含vhh。在一些实施方式中，胞外标签结合结构域、标签和抗原结合结构域各自包含vhh。
11.在一些实施方式中，抗原结合片段、胞外标签结合结构域、抗原结合结构域和标签中的一种以上至少部分包含与选自seq id no：84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108和110至133的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽序列。
12.在一些实施方式中，胞外标签结合结构域、抗原结合结构域或标签中的至少一个包含scfv。
13.在一些实施方式中，替代性支架为affilin或centyrin。
14.在一些实施方式中，标签包含抗体或抗体的抗原结合片段，或替代性支架。在一些实施方式中，抗体或抗体的抗原结合片段或替代性支架与来自非人来源的多肽结合。在一些实施方式中，来自非人来源的多肽是呼吸道合胞病毒(rsv)f蛋白、李斯特菌内化素、眼镜蛇磷脂酶a2、埃博拉病毒核蛋白、单纯疱疹病毒(hsv)糖蛋白d、乳球菌噬菌体受体结合蛋白(rbp)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(geobacillus stearothermophilus)、蓖麻毒蛋白或鸡蛋清溶菌酶。
15.在一些实施方式中，抗原结合结构域与至少一种肿瘤抗原或自身免疫性抗原结合。在一些实施方式中，至少一种抗原与相同的肿瘤或自身免疫性疾病相关。在一些实施方式中，肿瘤抗原与胶质母细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、膀胱癌或血液恶性肿瘤相关。在一些实施方式中，与胶质母细胞瘤相关的肿瘤抗原为her2、egfrviii、egfr、cd133、pdgfra、fgfr1、fgfr3、met或il13rα2。在一些实施方式中，与卵巢癌相关的肿瘤抗原为folr1、fshr、muc16、muc1、间皮素、ca125、epcam、egfr、pdgfrα或b7h4。在一些实施方式中，与宫颈癌或头颈癌相关的肿瘤抗原为gd2、muc1、间皮素、her2或egfr。在一些实施方式中，与肝癌相关的肿瘤抗原为紧密连接蛋白18.2、gpc-3、epcam、cmet或afp。
16.在一些实施方式中，跨膜结构域还包含铰链结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域和/或铰链结构域来源于cd8或cd28。
17.在一些实施方式中，至少一个胞内信号传导结构域包含cd3ζ信号传导结构域。
18.在一些实施方式中，至少一个胞内信号传导结构域包含一个以上共刺激信号传导
结构域。在一些实施方式中，一个以上共刺激信号传导结构域来源于cd28、41bb、il2rb、cd40、ox40、cd80、cd86、cd27、icos、nkg2d、dap10、dap12或2b4(cd244)。
19.在各种实施方式中，第二多肽包含在n-末端的抗原结合结构域和在c-末端的标签。在一些实施方式中，第二多肽包含在c-末端的抗原结合结构域和在n-末端的标签。
20.在各种实施方式中，第二多肽为可溶性多肽。
21.在本文所述的arcar的各种实施方式中，免疫效应细胞为t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(til)、树突细胞或巨噬细胞。在一些实施方式中，免疫效应细胞来源于诱导性多能干细胞(ipsc)。在一些实施方式中，免疫效应细胞为来源于诱导性多能干细胞(ipsc)的t细胞或nk细胞。
22.在本文所述的arcar的各种实施方式中，arcar还包含一种以上多肽，所述一种以上多肽各自包含(a)与独特抗原结合的抗原结合结构域和(b)被第一多肽的标签结合结构域识别的标签。
23.另一方面，本文提供了一种arcar系统，所述arcar系统包含两种以上本文所述的arcar，其中，每种arcar包含一对独特的标签和标签结合结构域。
24.另一方面，本文提供了编码本文所述的arcar系统的第一多肽的多核苷酸。
25.另一方面，本文提供了编码本文所述的arcar系统的第二多肽的多核苷酸。
26.另一方面，本文提供了编码本文所述的arcar系统的第一多肽和第二多肽的多核苷酸。
27.在本文描述的多核苷酸的一些实施方式中，抗原结合片段、胞外标签结合结构域、抗原结合结构域和标签中的一种以上至少部分由多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列与选自seq id no：83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
28.另一方面，本文提供了重组载体，所述重组载体包含本文所述的多核苷酸。在一些实施方式中，载体为质粒。
29.另一方面，本文提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含表达本文所述的arcar系统的第一多肽的多核苷酸。
30.另一方面，本文提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含表达本文所述的arcar系统的第二多肽的多核苷酸。
31.另一方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的arcar系统的免疫效应细胞和药学上可接受的媒介物(carrier)和/或赋形剂。
32.另一方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的arcar系统的第二多肽和药学上可接受的媒介物和/或赋形剂。
33.另一方面，本文提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含如下组合：包含本文所述的arcar系统的免疫效应细胞的药物组合物和包含arcar系统的第二多肽的药物组合物。
34.另一方面，本文提供了制备包含表达第一多肽的多核苷酸的宿主细胞的方法，所述方法包括将编码arcar系统的第一多肽的多核苷酸或包含所述多核苷酸的重组载体引入细胞中。
35.另一方面，本文提供了制备包含表达第二多肽的多核苷酸的宿主细胞的方法，所述方法包括将编码arcar系统的第二多肽的多核苷酸或包含所述多核苷酸的重组载体引入
细胞中。
36.另一方面，本文提供了一种在有需要的受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如下：(i)包含嵌合抗原受体的免疫效应细胞，所述嵌合抗原受体包含本文所述的arcar的第一多肽，以及(ii)所述arcar的第二多肽，或编码所述第二多肽的多核苷酸，或包含所述第二多肽的宿主细胞。
37.在一些实施方式中，第二多肽在免疫效应细胞之前、之后施用或与免疫效应细胞一起施用。
38.另一方面，本文提供了一种在有需要的受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如下：(i)包含两种以上arcar的第一多肽的免疫效应细胞，其中，两种以上arcar各自包含一对独特的标签和标签结合结构域，和(ii)所述两种以上arcar的第二多肽，或编码所述第二多肽的一种以上多核苷酸，或包含所述第二多肽的一种以上宿主细胞。
39.在本文所述的治疗方法的一些实施方式中，免疫效应细胞为t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(til)、树突细胞或巨噬细胞。在一些实施方式中，免疫效应细胞来源于ipsc。在一些实施方式中，免疫效应细胞组成型地表达第一多肽。
40.在一些实施方式中，疾病为癌症或自身免疫性疾病。在一些实施方式中，癌症为胶质母细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、膀胱癌或血液恶性肿瘤。
41.在一些实施方式中免疫效应细胞和第二多肽被同时施用。在一些实施方式中，免疫效应细胞和第二多肽被依次施用。
42.在一些实施方式中，免疫效应细胞是自体细胞。在一些实施方式中，免疫效应细胞是同种异体细胞。
43.在一些实施方式中，受试者为哺乳动物。在一些实施方式中，受试者为人。
附图说明
44.图1描绘了本公开的示例性的具有适应性受体特异性的car(arcar)的示意图。car与可溶性药物上的“标签”结合。可溶性药物可以是抗体或抗体片段(例如，vhh、scfv、fab、mab)或替代性支架。可溶性药物驱动肿瘤特异性和car的激活。
45.图2a描绘了本公开的另一个示例性arcar的示意图。在可溶性药物的抗原结合结构域和标签中，以及arcar的标签结合结构域(α-标签)中均使用了vhh。
46.图2b显示了抗独特型mab的结构特征。
47.图2c显示了示例性vhh结构的结构特征。
48.图2d描绘了本公开的另一个示例性arcar的示意图。在可溶性药物和arcar的标签结合结构域中使用了非人灵长类动物(nhp)vhh和抗独特型nhp vhh。
49.图3a描绘了本公开的另一个示例性arcar的示意图。
50.图3b描绘了本公开的另一个示例性arcar的示意图。
51.图4a描绘了本公开的另一个示例性arcar的示意图。赫赛汀(herceptin)scfv与car融合，赫赛汀抗-id scfv与靶向egfr的vhh(9g8)融合。
52.图4b显示了与9g8-scfv69融合蛋白偶联的表达赫赛汀scfv car的t细胞能够靶向egfr
+
细胞。
53.图5描绘了用于递送本公开的car构建体的慢病毒载体的载体图谱。
54.图6a描绘了用于表达本公开的桥构建体的质粒的载体图谱。
55.图6b显示了证明桥蛋白纯度的凝胶电泳图。
56.图7a描绘了scfv69-car和桥蛋白的两种变体(9g8_赫赛汀scfv和赫赛汀scfv 9g8)的示意图。
57.图7b显示了scfv69-car与桥蛋白的结合。图中的样品按以下顺序显示：9g8_赫赛汀、赫赛汀_9g8。
58.图8a显示了egfr转导的cho细胞上的egfr表达。
59.图8b显示了t细胞中的car表达。
60.图9a至9b显示了通用car-t细胞在与正确的桥蛋白配对时表现出cd25的激活(图9a)，但在与错配的桥蛋白配对时没有表现出cd25的激活(图9b)。图中的样品按图例中指定的顺序呈现。
61.图10a至10b显示了通用car-t细胞在与正确的桥蛋白配对时表现出细胞毒性活性(图10a)，但在与错配的桥蛋白配对时没有表现出细胞毒性活性(图10b)。图中的样品按图例中指定的顺序呈现。
62.图11a描绘了用于递送本公开的vhh car的慢病毒载体的载体图谱。
63.图11b显示了jurkat细胞上的vhh car表达。
64.图11c显示了转导vhh car的jurkat细胞表面缺乏基底信号(tonic signaling)。
65.图11d显示了用于图11c中的cd69检测的fac门控策略。
66.图11e显示了抗鸡的鸡蛋溶菌酶-vhh car与来自鸡或人的溶菌酶的结合。
67.图11f显示了靶向嗜热脂肪地芽孢杆菌的vhh的氨基酸序列(seq id no：96)、靶向lyso_cw_p01_b11的vhh的氨基酸序列(seq id no：102)和靶向lyso_cw_p01_d04的vhh的氨基酸序列(seq id no：104)的比对。共有序列(seq id no：134)显示在比对序列的上方。
68.图12a-12k显示了用于arcar的构想验证(proof-of-concept)研究的质粒图谱p510、p511、p514、p515、p516、p517、p518、p519、p520、p521和p522。
69.图13显示了用包含人源化的b11(p1649)car和人源化的d04(p1648)car的慢病毒(lv)转导的nurkat细胞(jurkat细胞的nur77报告细胞系)的car表达和gfp表达，还显示了未经转导(utd)的nurkat细胞的结果。car表达通过来自genscript的多克隆抗骆驼科动物vhh混合物测量(例如，人源化版本的vhh和骆驼科动物版本的vhh之间有足够的同源性以进行稳健检测)。
70.图14显示了用链霉亲和素-apc通过流式细胞术检测的用生物素化hel染色的b11(p1649)car和d04(p1648)car nurkat细胞。utd是用作阴性对照的未经转导的nurkat细胞。
71.图15显示了噬菌体展示筛选方案的概述。将针对d04的抗独特型发现的方案显示为示例。类似地，对于针对b11的抗独特型的发现，两个vhh将在图中交换位置。
72.图16a-16d显示了每个cnty文库获得的克隆的周质提取物(ppe)的elisa结果(450nm处的吸光度)。黑色条代表针对b11蛋白的elisa反应，灰色条代表针对d04蛋白的反应。
73.图17a-17b显示了在没有基于igg的接头的情况下抗独特型vhh-fc融合构建体与表达b11 car的nurkat细胞的facs结合(图17a)，以及与表达d04 car的nurkat细胞的facs结合(图17b)。短线虚线框标识了在elisa中观察到与d04结合的选自表15的蛋白质。点虚线框标识了在elisa中观察到与b11结合的选自表16的蛋白质。每种蛋白质以从50nm到0.02pm的3倍稀释系列在两种细胞系上进行了测试(如图例中所示)。fc融合蛋白通过抗fc apc来检测，显示了该检测方法的呈阳性的细胞百分比。在稀释系列下显示出与其靶细胞系特异性结合的蛋白质的id下方加了星标。对照包括(i)不添加vhh-fc和(ii)抗vhh混合物检测试剂(最右侧)。图中显示的每种蛋白质的样品按图例中指定的顺序呈现。
74.图18显示了用链霉亲和素-apc通过facs检测的范例(lead)抗独特型生物素化的vhh-fc与靶car nurkat细胞和脱靶car nurkat细胞的结合。测试的细胞系包括b11细胞、d04细胞、p711细胞、p712细胞、p713细胞、p716细胞和亲本细胞。b11细胞和d04细胞分别是表达b11 vhh car和d04 vhh car的car nurkat细胞。p711细胞、p712细胞、p713细胞、p716细胞是脱靶car nurkat细胞。亲本细胞是未经转导的、不表达car的nurkat细胞。对照包括生物素化的蛋白a(非特异性地结合大多数vhh)、prot786(不相关的生物素化的vhh-fc蛋白)，并且没有添加生物素化的蛋白。图中显示的每种蛋白质的样品按图例中指定的顺序呈现。
75.图19a-19b显示了通过facs检测的用10nm抗独特型vhh fc融合物孵育的nurkat细胞的过夜刺激测定的结果(图19a)，b11 car nurkat细胞和d04 car nurkat细胞以及亲本nurkat细胞在与抗独特型fc融合蛋白共培养过夜后的gfp表达(图19b)。过夜孵育后通过链霉亲和素-apc检测生物素化的蛋白质。对照包括pma/离子霉素(tcr交联剂，可导致稳健的nurkat细胞激活)、生物素化的蛋白a和未添加蛋白质的样品。图中显示的每种蛋白质的样品按图例中指定的顺序呈现。
76.图20a-20b显示了相同的t细胞杀伤测试的结果，该测试中添加了5nm的桥蛋白amd109(图20a)或桥蛋白amd112(图20b)。显示了u87靶细胞或k562靶细胞的死亡靶标百分比。
具体实施方式
77.背景技术和说明书全文中引用或描述了各种出版物、文章和专利，这些参考文献各自通过引用整体并入本文。对本说明书中涉及的文件、行为、材料、装置、文章等的讨论是为了提供本发明的背景。此类讨论并不承认任何这些事项或所有这些事项构成与公开或要求保护的任何发明相关的现有技术的一部分。
78.除了其他方面，本技术提供了通用的具有适应性受体特异性组分的嵌合抗原受体(arcar)系统及其在免疫疗法(例如过继细胞疗法)中的用途。此arcar平台提供了一种内置且方便的机制，用于利用标签多肽亲和力调节受体，并允许细胞疗法中存在多种受体。此类arcar可以实现符合目的的细胞疗法。定义
79.如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“car”通常指包含胞外靶标结合结构域、跨膜结构域和胞质结构域的细胞表面受体，所述胞质结构域包含信号传导结构域和任选的至少一个共刺激信号传导结构域，所有这些构成不天然地一起存在于单一蛋白质上的组合。这尤其包括其中胞外结构域和胞质结构域不天然地一起存在于单一受体蛋白质上的受体。
80.如本文所用，术语“具有适应性受体特异性组分的嵌合抗原受体”或“arcar”指双组分car系统，其中，受体的胞外靶标结合结构域可以与各种不同的抗原结合部分偶联。除非另有说明，否则本文使用的术语“嵌合抗原受体”或“car”意在涵盖本文所述的“具有适应性受体特异性组分的嵌合抗原受体”或“arcar”。本公开的arcar系统可以与免疫效应细胞(例如淋巴细胞，包括t细胞和自然杀伤(nk)细胞)一起使用，这些免疫效应细胞可以来源于干细胞(例如诱导性多能干细胞(ipsc))。
81.如本文所用，术语“免疫效应细胞”指已经分化为能够调节或影响特定免疫反应的形式的细胞。此类细胞可以包括适合治疗的成熟淋巴细胞(包括但不限于细胞毒性t细胞、辅助性t细胞、自然杀伤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(til))，还可以包括树突细胞或巨噬细胞。
82.术语“抗体”在本文中以最广泛的意义使用，包括多克隆抗体和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括抗原结合片段(fab)片段、f(ab')2片段、fab'片段、fv片段、scfv片段、重组igg(rigg)片段、单链抗体片段(包括单链可变片段(scfv)，以及单域抗体(例如vhh、vnar、sdab、sdfv)片段或纳米抗体)、fd'片段、fd片段、重链可变区或分离的互补决定区(cdr)。该术语包括免疫球蛋白的基因工程化和/或其他修饰的形式，例如胞内抗体、肽体(peptibody)、嵌合抗体、全人源抗体、人源化抗体和异源偶联抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)、十抗体(decabody)、串联di-scfv和串联tri-scfv)。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为包括抗体的功能性抗体片段。该术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类或亚类的抗体，包括igg以及igg的亚类(例如igg1、igg2、igg3、igg4)、igm、igy、ige、iga和igd。
83.术语“抗独特型分子”指特异性识别、靶向和/或结合抗体(例如抗原结合片段)的独特位(idiotope)的分子(例如，肽、蛋白质、抗体或抗体片段、替代性支架)。抗体的独特位可以包括但不必限于抗体的一个以上互补决定区(cdr)、抗体的可变区和/或此类cdr和/或可变区的部分或一部分的部分和/或前述的任意组合内的残基。cdr可以为选自cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2和cdr-l中的一种以上。抗体的可变区可以为重链可变区、轻链可变区，或重链可变区和轻链可变区的组合。抗体的重链可变区和/或轻链可变区的部分片段或部分可以为包含2个以上、5个以上或10个以上连续氨基酸(例如，抗体的重链可变区或轻链可变区内的约2至约100个、约5至约100个、约10至约100个、约2至约50个、约5至约50个或约10至约50个连续氨基酸)的片段；独特位可以包含多个不相邻的氨基酸的段。抗体的重链可变区和轻链可变区的部分片段可以为包含2个以上、5个以上或10个以上连续氨基酸(例如，可变区内约2至约100个，约5至约100个、约10至约100个、约2至约50个、约5至约50个或约10至约50个连续氨基酸)的片段；在一些实施方式中，抗体的重链可变区和轻链可变区的部分片段可以包含一个以上cdr或cdr片段。cdr片段可以为cdr内连续或不连续的2个以上或5个以上氨基酸。因此，抗体的独特位可以为含有抗体的重链可变区或轻链可变区内的一个以上cdr或一个以上cdr片段的约2至约100个、约5至约100个、约10至约100个、约2至
约50个、约5至约50个、或约10至约50个连续氨基酸。在另一个实施方式中，独特位可以为位于抗体可变区(例如cdr位点)的单个氨基酸。
84.在一些实施方式中，独特位是抗体可变部分内的任意单个抗原决定簇或表位。在一些情况下，独特位可以与抗体的实际抗原结合位点重叠。在一些情况下，独特位可以包含抗体的抗原结合位点之外的可变区序列。在一些实施方式中，抗体的个体独特位的集合被称为该抗体的“独特型”。
85.如本文所用，术语“抗原”指能够被抗体或抗体片段、t细胞受体或替代性支架结合的任何试剂(例如，蛋白质、肽、多糖、糖蛋白、糖脂、核酸、它们的部分或它们的组合)分子。抗原还能够引起免疫反应。免疫反应的示例可以包括但不限于抗体的产生或特定免疫活性细胞的激活，或它们的组合。技术人员将理解抗原完全不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以通过合成产生或可以衍生自生物样品，或者可以是除多肽之外的大分子。此类生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物成分的流体、生物体、蛋白质/抗原的亚基、被杀伤的或失活的全细胞或裂解物。
86.术语“载体”、“表达载体”和“表达构建体”可互换使用，指可用于将感兴趣的核酸递送至细胞内部并介导该核酸在细胞内表达的物质的组合物。最常用的载体示例为自主复制质粒和病毒(例如，腺病毒载体、腺相关病毒载体(aav)、慢病毒载体、sindbis病毒载体等)。表达构建体可以在活细胞中复制，也可以通过合成制得。在一个实施方式中，表达载体包含可操作地连接至多核苷酸(例如，编码本文所述的arcar的第一多肽和/或第二多肽的多核苷酸)的启动子，该启动子控制rna聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。用于哺乳动物细胞表达的典型启动子包括例如sv40早期启动子、cmv即刻早期启动子(参见例如美国专利号5,168,062和5,385,839，它们均通过引用整体并入本文)、小鼠乳腺肿瘤病毒ltr启动子、腺病毒主要晚期启动子(ad mlp)、单纯疱疹病毒启动子、鼠金属硫蛋白基因启动子，以及u6 rna聚合酶iii启动子或h1 rna聚合酶iii启动子。可用于在本公开的方法中表达本文所述的arcar的第一多肽和/或第二多肽的启动子的非限制性示例包括：例如，突触蛋白启动子(神经元特异性)、camkiia启动子(兴奋性神经元特异性)、泛素启动子、cag启动子、cmv启动子和β-肌动蛋白启动子。这些启动子和其他启动子可以使用本领域熟知的技术从商购质粒获得。参见，例如sambrook等，如上。增强子元件可与启动子联合使用以增加载体的表达水平，示例包括sv40早期基因增强子(如“dijkema等，embo j.，(1985)4:761”中所述)，来源于劳氏肉瘤病毒长末端重复(ltr)的增强子/启动子(如“gorman等，proc.natl.acad.sci.usa(1982b)79:6777”所述，其通过引用整体并入本文)，以及来源于人cmv的元件(例如cmv内含子a序列中包含的元件)(如“boshart等，cell(1985)41:521”所述，其通过引用整体并入本文)。
87.表达载体中还可以有转录终止子/聚腺苷酸化信号。此类序列的示例包括但不限于来源于sv40的那些序列(如“sambrook等，如上”中所述)，以及牛生长激素终止子序列(参见例如美国专利号5,122,458，其通过引用整体并入本文)。此外，还可以将5'-utr序列置于编码序列的毗邻处，以增强编码序列的表达。此类序列包括utr，utr包括例如存在于小核糖核酸病毒(例如脑心肌炎病毒(emcv))的utr的前导序列中的内部核糖体进入位点(ires)(jang等，j.virol.(1989)63:1651-1660，其通过引用整体并入本文)。其他有用的小核糖核酸病毒utr序列包括：例如，脊髓灰质炎前导序列、甲型肝炎病毒前导序列和丙型肝炎病毒
ires。
88.术语“宿主细胞”指含有异源核酸的任何细胞。异源核酸可以是载体(例如，表达载体)。例如，宿主细胞可以是来自经任何方式的选择、修饰、转化、生长、使用或操作的任何生物体的细胞，用于由细胞产生物质，例如由该细胞表达基因、dna或rna序列、蛋白质或酶。合适的宿主能够被确定。例如，可以基于载体主链和期望的结果来选择宿主细胞。例如，可以将质粒或粘粒引入原核生物宿主细胞中以复制几种类型的载体。细菌细胞(例如，但不限于dh5α、jm109和kcb、这些感受态细胞和solopack gold细胞)可用作载体复制和/或表达的宿主细胞。此外，大肠杆菌le392等细菌细胞可用作噬菌体病毒的宿主细胞。可用作宿主细胞的真核细胞包括但不限于酵母(例如yph499、yph500和yph501)、昆虫和哺乳动物。用于载体复制和/或表达的哺乳动物真核宿主细胞的示例包括但不限于hela细胞、nih3t3细胞、jurkat细胞、293细胞、cos细胞、cho细胞、saos细胞和pc12细胞。
89.本公开的宿主细胞包括含有编码car的dna或rna序列和/或在细胞表面上表达car的t细胞和自然杀伤细胞。宿主细胞可用于增强t细胞活性、增强自然杀伤细胞活性、治疗癌症和治疗自身免疫性疾病。
90.术语“t细胞”和“t淋巴细胞”在本文中可互换以及同义使用。如本文所用，t细胞包括胸腺细胞、幼稚t淋巴细胞、未成熟t淋巴细胞、成熟t淋巴细胞、静息t淋巴细胞或激活的t淋巴细胞。t细胞可以是辅助性t(th)细胞，例如辅助性t细胞1(th1细胞)或辅助性t细胞2(th2细胞)。t细胞可以是辅助性t细胞(htl；cd4+t细胞)cd4+t细胞、细胞毒性t细胞(ctl；cd8+t细胞)、肿瘤浸润细胞毒性t细胞(til；cd8+t细胞)、cd4+cd8+t细胞或任何其他t细胞亚群。适用于特定实施方式的其他示例性t细胞群包括幼稚t细胞和记忆t细胞。还包括“nkt细胞”，nkt细胞指表达半不变(semi-invariant)αβt细胞受体的特殊t细胞群，但也表达通常与nk细胞相关的各种分子标志物(例如nk1.1)。nkt细胞包括nk1.1
+
细胞和nk1.1-细胞，以及cd4
+
细胞、cd4-细胞、cd8
+
细胞和cd8-细胞。nkt细胞上的tcr是独特的，因为它识别由mhc i样分子cd id呈递的糖脂抗原。鉴于nkt细胞能够产生促进炎症的细胞因子或促进免疫耐受的细胞因子，因而它们可以产生保护性作用或有害作用。还包括“γ-δt细胞(γδt细胞)”，γδt细胞指一种特殊的群体，即表面上具有独特tcr的小的t细胞亚群，与大多数t细胞的tcr由被称为α-tcr链和β-tcr链的两条糖蛋白链组成不同，γδt细胞中的tcr由γ链和δ链组成。γδt细胞可在免疫监视和免疫调节中发挥作用，并被发现是il-17的重要来源，可诱导稳健的cd8+细胞毒性t细胞反应。还包括“调节性t细胞”或“treg”，指抑制异常或过度免疫反应并在免疫耐受中发挥作用的t细胞。treg细胞通常为转录因子foxp3阳性的cd4
+
t细胞，也可以包括转录因子foxp3阴性的调节性t细胞(产生il-10的cd4
+
t细胞)。
91.术语“自然杀伤细胞”和“nk细胞”在本文中可互换使用以及同义使用。如本文所用，nk细胞指具有cd16
+
cd56
+
和/或cd57
+
tcr-表型的分化的淋巴细胞。nk细胞的特点是它们能够结合并通过激活特定的细胞溶解酶杀伤不能表达“自身”mhc/hla抗原的细胞，能够杀伤肿瘤细胞或其他表达nk激活性受体的配体的患病细胞，以及能够释放刺激或抑制免疫反应的、被称为细胞因子的蛋白质分子。
92.在本公开的某些实施方式中，包含本公开的核酸构建体的细胞可以通过使表达载体中含有标志物而在体外或体内鉴定。此类标志物将赋予细胞可识别的变化，从而能够容易地识别含有表达载体的细胞。通常含有药物选择标志物有助于克隆和选择转化体，例如，
赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、dhfr、gpt、博莱霉素(zeocin)和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标志物。或者，可以使用酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(cat)。也可以使用荧光标志物(例如绿色荧光蛋白(gfp)、egfp或dronpa)或免疫标志物。选择标志物的其他示例是本领域技术人员熟知的。
93.如本文所用，在蛋白质或多肽(例如，arcar多肽或arcar多肽的结构域)的上下文中，术语“变体”指：(a)与经变化形成该变体的多肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的多肽；(b)由与编码经变化形成该变体的多肽的核苷酸序列具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的核苷酸序列编码的多肽；(c)相对于经变化形成该变体的多肽的含有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个氨基酸突变(即添加、缺失和/或取代)的多肽；(d)由可以在高、中或典型的严格杂交条件下与编码经变化形成该变体的多肽的核酸杂交的核酸编码的多肽；(e)由可以在高、中或典型的严格杂交条件下与编码经变化形成该变体的多肽的片段的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的多肽，所述经变化形成该变体的多肽的片段为至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸、至少40个连续氨基酸、至少50个连续氨基酸、至少75个连续氨基酸、至少100个连续氨基酸、至少125个连续氨基酸或至少150个连续氨基酸；(f)经变化形成该变体的多肽的片段。
94.序列同一性百分比可以使用本领域技术人员已知的任何方法来确定。在一个特定实施方式中，使用sequence analysis software package(第10版；genetics computer group,inc.，威斯康辛大学生物技术中心，麦迪逊，威斯康辛)的“best fit”或“gap”程序确定同一性百分比。关于杂交条件(例如，高、中和典型严格条件)的信息已被描述，参见例如美国专利申请公开号us2005/0048549(例如第72-73段)。
95.在本公开的上下文中，就涉及本文所述的任何疾病状况而言，术语“治疗”、“处理”等指预防、缓解或减轻与此类病况相关的至少一种症状，或减缓或逆转此类病况的进展，或阻止、延迟发病(即疾病临床表现之前的时期)和/或降低疾病发展或恶化的风险。
96.如本文所用，适用于剂量或量的术语“治疗有效”指向有需要的受试者施用后，化合物或药物组合物的量足以产生所需的活性(例如，减轻与癌症或自身免疫性疾病相关的症状)。注意，当施用活性成分的组合时，该组合的有效量可以包括或不包括单独施用时有效的每种成分的量。所需的确切的量将因不同的受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄和总体状况、所治疗疾病的严重程度、所使用的特定药物、给药方式等。在任何个案中，合适的“有效”量可由本领域普通技术人员依据本文提供的信息通过常规实验来确定。
97.结合本公开的组合物使用的短语“药学上可接受的”指在生理学上是可耐受的以及当施用于哺乳动物(例如人)时通常不会产生不良反应的组合物的分子实体和其他成分。优选地，如本文所用，术语“药学上可接受的”指由联邦政府或州政府的监管机构批准或列在美国药典或其他公认的药典中用于哺乳动物(更特别是用于人)。
98.如本文所用，本公开的组合物和至少一种另外的治疗剂的“联合”指至少两种任意所需的联合药剂可以同时或依次递送。预期当用于治疗各种疾病时，本公开的组合物和方法可以与适用于相同或相似疾病的其他治疗方法/药剂一起使用。此类其他治疗方法/药剂可以共同施用(同时或依次)以产生叠加效应或协同效应。由于叠加作用或协同作用，每种
药剂的合适的治疗有效剂量可以降低。
99.术语“媒介物”指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或溶媒。此类药物媒介物可以为无菌液体，例如水和油，所述油包括来自石油、动物、植物或合成来源的那些油(例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)。优选使用水或盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液作为媒介物(特别是用于注射液)。或者，媒介物可以为固体剂型媒介物，包括但不限于粘合剂(用于压片)、助流剂、封装剂、食用香料和着色剂中的一种以上。合适的药物媒介物在e.w.martin的“remington’s pharmaceutical sciences”中有所描述。
100.如本文所用，“个体”或“受试者”或“动物”指人、兽医动物(例如，猫、狗、牛、马、羊、猪等)或疾病或病症(例如，癌症或自身免疫性疾病)的实验动物模型。在一个优选的实施方式中，受试者为人。
101.术语“与
……
相关”用于涵盖任何关联关系、共现关系以及任何因果关系。
102.术语“约”指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受的误差范围内，这将部分取决于该值如何测量或确定(即测量系统的限制)。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在可接受的标准偏差内。或者，“约”可以表示在给定值或范围的一个数量级以内，优选在50％以内，更优选在20％以内，进一步更优选在10％以内，特别更优选在5％以内，最优选在1％以内。或者，尤其是与生物系统或过程相关时，该术语可以表示在值的一个数量级以内，优选地在值的2倍以内。在申请和权利要求中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则隐含了术语“约”，在上下文中表示在特定值的可接受的误差范围内。
103.必须注意的是，如本说明书和所附权利要求中所使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非内容另有明确规定。
104.根据本公开，可以采用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组dna技术。此类技术在文献中有充分的解释。参见，例如，sambrook、fritsch和maniatis，molecular cloning:a laboratory manual，第2版，纽约州冷泉港：cold spring harbor laboratory press,1989(本文中为“sambrook等,1989”)；dna cloning:a practical approach,第i和ii卷(d.n.glover编辑，1985)；oligonucleotide synthesis(m.j.gait编辑，1984)；nucleic acid hybridization[b.d.hames和s.j.higgins编辑(1985)]；transcription and translation[b.d.hames和s.j.higgins编辑(1984)]；animal cell culture[r.i.freshney编辑(1986)]；immobilized cells and enzymes[irl press,(1986)]；b.perbal,a practical guide to molecular cloning(1984)；ausubel,f.m.等编辑，current protocols in molecular biology，john wiley&sons,inc.，1994。这些技术包括如下描述的定点诱变：“kunkel,proc.natl.acad.sci.usa 82:488-492(1985)”，美国专利号5,071,743，“fukuoka等，biochem.biophys.res.commun.263:357-360(1999)”；kim和maas，biotech.28:196-198(2000)；parikh和guengerich,biotech.24:4 28-431(1998)；ray和nickoloff,biotech.13:342-346(1992)；wang等，biotech.19:556-559(1995)；wang和malcolm，biotech.26:680-682(1999)；xu和gong，biotech.26:639-641(1999)，美国专利号5,789,166和5,932,419，hogrefe,strategies l4.3:74-75(2001)，美国专利号5,702,931、5,780,270和6,242,222，angag和schutz,biotech.30:486-488(2001)，wang和wilkinson，biotech.29:976-978(2000)，kang等，biotech.20:44-46(1996)，ogel和mcpherson,protein engineer.5:467-468(1992)，kirsch和joly,
nucl.acids.res.26:1848-1850(1998)，rhem和hancock,j.bacteriol.178:3346-3349(1996)，boles和miogsa,curr.genet.28:197-198(1995)，barrenttino等,nuc.acids.res.22:541-542(1993)，tessier和thomas,meths.molec.biol.57:229-237，以及pons等,meth.molec.biol.67:209-218。具有适应性受体特异性组分的嵌合抗原受体(arcar)
[0105]
一方面，本文提供了一种通用的具有适应性受体特异性组分的嵌合抗原受体(arcar)系统，所述arcar系统包含：(i)具有嵌合抗原受体的免疫效应细胞，所述嵌合抗原受体包含第一多肽，所述第一多肽包含：(a)胞外标签结合结构域，(b)跨膜结构域，和(c)至少一个胞内信号传导结构域；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包含：(d)与靶细胞上的至少一种抗原结合的抗原结合结构域，和(e)被嵌合抗原受体的第一多肽的标签结合结构域识别的标签；其中：(i)所述标签包含抗体或抗体的抗原结合片段或替代性支架，所述标签结合结构域包含与标签结合的抗独特型分子；或者(ii)所述标签包含与标签结合结构域结合的抗独特型分子，所述标签结合结构域包含抗体或抗体的抗原结合片段或替代性支架。
[0106]
在一些实施方式中，抗独特型分子与抗体或抗体的抗原结合片段的至少一个抗原结合区或非框架区结合。
[0107]
在一些实施方式中，标签包含与来源于非人来源的多肽结合的抗体或抗体的抗原结合片段，或替代性支架。或者，标签结合结构域包含与来源于非人来源的多肽结合的抗体或抗体的抗原结合片段，或替代性支架。
[0108]
在一些实施方式中，抗独特型分子与抗体或抗体的抗原结合片段的至少一个互补决定区(cdr)结合。
[0109]
在一些实施方式中，抗独特型分子为抗独特型抗体或抗体的抗原结合片段，或替代性支架。
[0110]
在一些实施方式中，第二多肽的抗原结合结构域包含抗体或抗体的抗原结合片段，或替代性支架。
[0111]
在各种实施方式中，适用于本公开的arcar系统的抗体或抗体片段包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、多肽-fc融合物、单链fv(scfv)、单链抗体、fab片段、f(ab')片段、二硫键连接的fv(sdfv)、掩蔽抗体(例如)、小模块免疫药物(“smipstm”)、胞内抗体、微型抗体、单域抗体可变结构域、纳米抗体、vhh、双抗体、串联双抗体以及任何上述物质的表位结合片段。抗体和/或抗体片段可以来源于鼠抗体、兔抗体、人抗体、完全人源化抗体、骆驼科动物抗体可变结构域和人源化版本、鲨鱼抗体可变结构域和人源化版本以及骆驼化抗体可变结构域。
[0112]
在一些实施方式中，抗原结合片段为fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、scfv片段、fv片段、dsfv双抗体、vhh、vnar、单域抗体(sdab)或纳米抗体、dab片段、fd'片段、fd片段、重链可变区、分离的互补决定区(cdr)、双抗体、三抗体或十抗体。在一些实施方式中，抗原结合片段为scfv片段。在一些实施方式中，抗原结合片段为vhh。
[0113]
在一些实施方式中，胞外标签结合结构域、抗原结合结构域或标签中的至少一个包含单域抗体或纳米抗体。
[0114]
在一些实施方式中，胞外标签结合结构域、抗原结合结构域或标签中的至少一个包含vhh。
[0115]
在一些实施方式中，胞外标签结合结构域和标签各自包含vhh。
[0116]
在一些实施方式中，胞外标签结合结构域、标签和抗原结合结构域各自包含vhh。
[0117]
在一些实施方式中，胞外标签结合结构域、抗原结合结构域或标签中的至少一个包含scfv。
[0118]
在一些实施方式中，胞外标签结合结构域和标签各自包含scfv。
[0119]
在一些实施方式中，胞外标签结合结构域、标签和抗原结合结构域各自包含scfv。
[0120]
在一些实施方式中，本文使用的抗体或抗原结合片段(例如，vhh、scfv)为人源化的。人源化的蛋白质具有降低免疫原性风险的潜力。
[0121]
显示相似功能特性(例如靶标生物分子的高亲和力和特异性结合)的免疫球蛋白结构域的替代性支架也可用于本公开的arcar。已证明此类支架产生具有改进特性(例如更高的稳定性或更低的免疫原性)的分子。可用于本公开的arcar系统的替代性支架的非限制性示例包括工程化的、腱生蛋白(tenascin)衍生的腱生蛋白iii型结构域(例如centyrin
tm
)；工程化的、γ-b晶体蛋白衍生的支架，或工程化的、泛素衍生的支架(例如affilins)；工程化的、纤连蛋白衍生的第10纤连蛋白iii型(10fn3)结构域(例如单抗体、adnectins
tm
或adnexins
tm
)；工程化的含有多肽的锚蛋白重复基序(例如darpins
tm
)；工程化的、低密度脂蛋白受体衍生的a结构域(ldlr-a)(例如avimers
tm
)；脂质运载蛋白(例如抗运载蛋白(anticalin))；工程化的、蛋白酶抑制剂衍生的kunitz结构域(例如eeti-ii/agrp、bpti/laci-d1/iti-d2)；工程化的、a蛋白衍生的z结构域(affibodies
tm
)；sac7d衍生的多肽(例如或affitins)；工程化的、fyn衍生的sh2结构域(例如)；ctld3(例如四连蛋白(tetranectin))；硫氧还蛋白(例如肽适体)；β-三明治(β-sandwich)(例如imab)；微型蛋白质；c型凝集素样结构域支架；工程化的抗体模拟物；以及保留了结合功能的前述物质的任何基因操作的对应物(a,pluckthun a,j mol biol 305:989-1010(2001)；xu l等,chem biol 9:933-42(2002)；wikman m等,protein eng des sel 17:455-62(2004)；binz h等,nat biolechnol 23:1257-68(2005)；hey t等,trends biotechnol 23:514-522(2005)；holliger p,hudson p,nat biotechnol 23:1126-36(2005)；gill d,damle n,curr opin biotech 17:653-8(2006)；koide a,koide s,methods mol biol 352:95-109(2007)；skerra,current opin.in biotech.,2007 18:295-304；byla p等,j biol chem 285:12096(2010)；zoller f等,molecules16:2467-85(2011)，其中的每一个都通过引用整体并入)。
[0122]
在一些实施方式中，替代性支架为affilin或centyrin。
[0123]
来源于非人来源的分子可以来源于任何非人生物体，包括但不限于病毒、细菌、酵母、真菌、植物和非人动物。
[0124]
在一些实施方式中，来源于非人来源的分子是多肽。在一些实施方式中，蛋白质的来源来自不具有人同源物的非人多肽。
[0125]
在一些实施方式中，来源于非人来源的多肽是呼吸道合胞病毒(rsv)f蛋白、李斯
特菌内化素、眼镜蛇磷脂酶a2、埃博拉病毒核蛋白、单纯疱疹病毒(hsv)糖蛋白d、乳球菌噬菌体受体结合蛋白(rbp)、嗜热脂肪地芽孢杆菌、蓖麻毒蛋白或鸡蛋清溶菌酶。
[0126]
在一些实施方式中，本公开的arcar的第一多肽包含前导序列。前导序列可以位于胞外标签结合结构域的n-末端。在car的细胞加工以及定位到细胞膜期间，前导序列可以任选地从胞外标签结合结构域剪切掉。本领域技术人员已知的各种前导序列中的任一种都可以用作前导序列。可衍生出前导序列的肽的非限制性示例包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gmcsf)、fcεr、人免疫球蛋白(igg)重链(hc)可变区、cd8α、小鼠ig-κ信号肽、或t细胞分泌的各种其他蛋白质中的任一种。在各种实施方式中，前导序列与t细胞的分泌途径兼容。在某些实施方式中，前导序列来源于人免疫球蛋白重链(hc)。
[0127]
在一些实施方式中，前导序列源自gmcsf。在一个实施方式中，gmcsf前导序列包含seq id no：1所示的氨基酸序列或与seq id no：1具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0128]
在一些实施方式中，前导序列来源于小鼠ig-κ信号肽。在一个实施方式中，小鼠ig-κ信号肽包含seq id no：61所示的氨基酸序列或与seq id no：61具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0129]
在一些实施方式中，本公开的arcar的第一多肽包含跨膜结构域，该跨膜结构域融合在胞外标签结合结构域和胞质结构域之间的框架中。
[0130]
跨膜结构域可来源于对胞外标签结合结构域有贡献的蛋白质、对信号传导结构域或共信号传导结构域有贡献的蛋白质，或来源于完全不同的蛋白质。在一些情况下，可以通过氨基酸取代、缺失或插入来选择或修饰跨膜结构域，以最大程度地减少与arcar复合物的其他成员的相互作用。在一些情况下，可以通过氨基酸取代、缺失或插入来选择或修饰跨膜结构域，以避免与跨膜结构域天然相关蛋白质的结合。在某些实施方式中，跨膜结构域包含额外的氨基酸以允许连接到跨膜结构域的结构域之间的灵活性和/或最佳距离。
[0131]
跨膜结构域可以来源于天然来源或合成来源。在天然来源的情况下，结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本公开中特别使用的跨膜结构域的非限制性示例可以来源于(即至少包含跨膜区域)t细胞受体(tcr)的α、β或ζ链、nkg2d、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd40、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137或cd154。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下它将主要包含疏水性残基(例如亮氨酸和缬氨酸)。例如，可以在合成跨膜结构域的每一端存在苯丙氨酸、色氨酸和/或缬氨酸的三联体。
[0132]
在一些实施方式中，将需要使用含有能够形成二硫键的半胱氨酸残基的ζ、η或fcεr1γ链的跨膜结构域，使得所得嵌合蛋白将能够与其自身或与ζ链、η链或fcεr1γ链或相关蛋白的未修饰形式形成二硫键连接的二聚体。在一些情况下，将通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最大限程度地减少与受体复合物其他成员的相互作用。在其他情况下，将需要使用ζ、η或fcεr1γ和β、mb1(igα.)、b29或cd3-γ、ζ或η的跨膜结构域，以保持与受体复合体其他成员的物理结合。
[0133]
在一些实施方式中，跨膜结构域来源于cd8或cd28。在一个实施方式中，cd8跨膜结构域包含seq id no：23所示的氨基酸序列或与seq id no：23具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。在一个实施方式中，cd28跨膜结构域包含seq id no：24中所示的氨基酸序列或与seq id no：24具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0134]
在一些实施方式中，本公开的arcar系统的第一多肽包含在胞外标签结合结构域和跨膜结构域之间的间隔区，其中标签结合结构域、接头和跨膜结构域彼此在框架内。
[0135]
如本文所用，术语“间隔区”通常指具有将标签结合结构域连接至跨膜结构域的作用的任何寡肽或多肽。间隔区可用于为标签结合结构域提供更大的灵活性和可接近性。间隔区可包含至多300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。间隔区可以来源于天然存在的分子的全部或部分，例如来源于cd8、cd4或cd28的胞外区的全部或部分，或来源于抗体恒定区的全部或部分。或者，间隔区可以为与天然存在的间隔区序列对应的合成序列，或者可以为完全合成的间隔区序列。可用于本公开的间隔区的非限制性示例包括人cd8α链的一部分、cd28的部分胞外结构域、fcγriiia受体、igg、igm、iga、igd、ige、ig铰链或它们的功能片段。在一些实施方式中，额外的连接氨基酸被添加到间隔区以确保抗原结合结构域与跨膜结构域的最佳距离。在一些实施方式中，当间隔区来源于ig时，可以对间隔区进行突变以防止fc受体结合。
[0136]
在一些实施方式中，间隔区包含铰链结构域。铰链结构域可以来源于cd8α、cd28或免疫球蛋白(igg)。例如，igg铰链可以来自igg1、igg2、igg3、igg4、igm1、igm2、iga1、iga2、igd、ige或它们的嵌合体。
[0137]
在某些实施方式中，铰链结构域包含免疫球蛋白igg铰链或它的功能片段。在某些实施方式中，igg铰链来自igg1、igg2、igg3、igg4、igm1、igm2、iga1、iga2、i gd、ige或它们的嵌合体。在某些实施方式中，铰链结构域包含免疫球蛋白的ch1、ch2、ch3和/或铰链区。在某些实施方式中，铰链结构域包含免疫球蛋白的核心铰链区。术语“核心铰链”可以与术语“短铰链”(又名“sh”)互换使用。合适的铰链结构域的非限制性示例为核心免疫球蛋白铰链区，包括来自igg1的epkscdkthtcppcp(seq id no：57)、来自igg2的erkccvecppcp(seq id no：58)、来自igg3的elktplgdtthtcp rcp(epkscdtpppcprcp)3(seq id no：59)和来自igg4的eskygppcpscp(seq id no：60)(还参见wypych等，jbc 2008 283(23):16194-16205，出于所有目的其通过引用整体并入本文)。在某些实施方式中，铰链结构域为免疫球蛋白铰链的片段。
[0138]
在一些实施方式中，铰链结构域来源于cd8或cd28。在一个实施方式中，cd8铰链结构域包含seq id no：21所示的氨基酸序列或与seq id no：21具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。在一个实施方式中，cd28铰链结构域包含seq id no：22所示的氨基酸序列或与seq id no：22具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0139]
在一些实施方式中，跨膜结构域和/或铰链结构域来源于cd8或cd28。在一些实施方式中，跨膜结构域和铰链结构域均来源于cd8。在一些实施方式中，跨膜结构域和铰链结构域均来源于cd28。
[0140]
在某些方面，本公开的arcar的第一多肽包含胞质结构域，所述胞质结构域包含至少一个胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，胞质结构域还包含一个以上共刺激信号传导结构域。
[0141]
胞质结构域负责激活已放入arcar的宿主细胞(例如，t细胞)的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”指细胞的特定功能。例如，t细胞的效应子功能可以为细胞溶解活性或包括分泌细胞因子的辅助活性。因此，术语“信号传导结构域”指转导效应子功能信号并指导细胞执行特定功能的蛋白质的部分。虽然通常存在整个信号传导结构域，但在许多情况下没有必要使用整个链。就胞内信号传导结构域的截短部分的使用而言，可以使用此类截短部分代替完整链，只要它能够转导效应子功能信号。因此，术语“胞内信号传导结构域”意在包括足以转导效应子功能信号的信号传导结构域的任何截短部分。
[0142]
可用于本公开的arcar的信号传导结构域的非限制性示例包括例如来源于如下的信号传导结构域：dap10、dap12、fcε受体iγ链(fcer1g)、fcrβ、nkg2d、cd3δ、cd3ε、cd3γ、cd3ζ、cd5、cd22、cd226、cd66d、cd79a或cd79b。
[0143]
在一些实施方式中，胞质结构域包含cd3ζ信号传导结构域。在一个实施方式中，cd3ζ信号传导结构域包含seq id no：6所示的氨基酸序列或与seq id no：6具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0144]
在一些实施方式中，胞质结构域还包含一个以上共刺激信号传导结构域。在一些实施方式中，一个以上共刺激信号传导结构域来源于cd28、41bb、il2rb、cd40、ox40(cd134)、cd80、cd86、cd27、icos、nkg2d、dap10、dap12、2b4(cd244)、btla、cd30、gitr、cd226、cd79a或hvem。
[0145]
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于41bb。在一个实施方式中，41bb共刺激信号传导结构域包含seq id no：8所示的氨基酸序列或与seq id no：8具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0146]
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于il2rb。在一个实施方式中，il2rb共刺激信号传导结构域包含seq id no：9所示的氨基酸序列，或与seq id no：9具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0147]
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于cd40。在一个实施方式中，cd40共刺激信号传导结构域包含seq id no：10所示的氨基酸序列，或与seq id no：10具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0148]
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于ox40。在一个实施方式中，ox40共刺激信号传导结构域包含seq id no：11所示的氨基酸序列，或与seq id no：11具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、
至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0149]
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于cd80。在一个实施方式中，cd80共刺激信号传导结构域包含seq id no：12所示的氨基酸序列，或与seq id no：12具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0150]
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于cd86。在一个实施方式中，cd86共刺激信号传导结构域包含seq id no：13所示的氨基酸序列，或与seq id no：13具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0151]
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于cd27。在一个实施方式中，cd27共刺激信号传导结构域包含seq id no：14所示的氨基酸序列，或与seq id no：14具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0152]
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于icos。在一个实施方式中，icos共刺激信号传导结构域包含seq id no：15所示的氨基酸序列，或与seq id no：15具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0153]
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于nkg2d。在一个实施方式中，nkg2d共刺激信号域包含seq id no：16中所示的氨基酸序列，或与seq id no：16具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0154]
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于dap10。在一个实施方式中，dap10共刺激信号传导结构域包含seq id no：17所示的氨基酸序列，或与seq id no：17具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0155]
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于dap12。在一个实施方式中，dap12共刺激信号传导结构域包含seq id no：18所示的氨基酸序列，或与seq id no：18具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0156]
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于2b4(cd244)。在一个实施方式中，2b4(cd244)共刺激信号传导结构域包含seq id no：19所示的氨基酸序列，或与seq id no：19具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0157]
在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于cd28。在一个实施方式中，cd28共刺激信号传导结构域包含seq id no：20所示的氨基酸序列或与seq id no：20具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0158]
在一些实施方式中，本公开的arcar包含一个共刺激信号传导结构域。在一些实施
方式中，本公开的arcar包含两个以上共刺激信号传导结构域。在某些实施方式中，本公开的arcar包含两个、三个、四个、五个、六个或更多个共刺激信号传导结构域。
[0159]
在一些实施方式中，信号传导结构域和共刺激信号传导结构域可以以任何顺序设置。在一些实施方式中，信号传导结构域在共刺激信号传导结构域的上游。在一些实施方式中，信号传导结构域在共刺激信号传导结构域的下游。在包含两个以上共刺激结构域的情况下，可以切换共刺激信号传导结构域的顺序。
[0160]
表1中提供了非限制性的示例性car区域和序列。表1
[0161]
在一些实施方式中，第二多肽的抗原结合结构域与抗原结合。第二多肽的抗原结合结构域可以结合超过一种抗原或抗原中的超过一个表位。例如，第二多肽的抗原结合结构域可以结合两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或更多种抗原。作为另一个示例，第二多肽的抗原结合结构域可以结合同一抗原中的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个表位。
[0162]
抗原结合结构域的选择可以取决于定义靶细胞表面的抗原的类型和数量。例如，可以选择抗原结合结构域以识别作为与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的抗原。在某些实施方式中，可以对本公开的arcar进行基因修饰以通过工程化特异性结合抗原(例如在肿瘤细胞上)的所需抗原结合结构域来靶向感兴趣的肿瘤抗原。可以用作本公开的arcar中抗原结合结构域的靶标的细胞表面标志物的非限制性示例包括与肿瘤细胞或自身免疫性疾病相关的那些。
[0163]
在一些实施方式中，抗原结合结构域结合至少一种肿瘤抗原或自身免疫性抗原。
[0164]
在一些实施方式中，抗原结合结构域结合至少一种肿瘤抗原。在一些实施方式中，抗原结合结构域结合两种以上肿瘤抗原。在一些实施方式中，两种以上肿瘤抗原与相同的肿瘤相关。在一些实施方式中，两种以上肿瘤抗原与不同的肿瘤相关。
[0165]
在一些实施方式中，抗原结合结构域结合至少一种自身免疫性抗原。在一些实施方式中，抗原结合结构域结合两种以上自身免疫性抗原。在一些实施方式中，两种以上自身
免疫性抗原与相同的自身免疫性疾病相关。在一些实施方式中，两种以上自身免疫性抗原与不同的自身免疫性疾病相关。
[0166]
在一些实施方式中，肿瘤抗原与胶质母细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、膀胱癌或血液恶性肿瘤相关。与胶质母细胞瘤相关的肿瘤抗原的非限制性示例包括her2、egfrviii、egfr、cd133、pdgfra、fgfr1、fgfr3、met、cd70、robo1和il13rα2。与卵巢癌相关的肿瘤抗原的非限制性示例包括folr1、fshr、muc16、muc1、间皮素、ca125、epcam、egfr、pdgfrα、结合素4(nectin-4)和b7h4。与宫颈癌或头颈癌相关的肿瘤抗原的非限制性示例包括gd2、muc1、间皮素、her2和egfr。与肝癌相关的肿瘤抗原的非限制性实例包括紧密连接蛋白18.2、gpc-3、epcam、cmet和afp。与血液恶性肿瘤相关的肿瘤抗原的非限制性示例包括cd19、cd22、cd79、bcma、gprc5d、slam f7、cd33、cll1、cd123和cd70。与膀胱癌相关的肿瘤抗原的非限制性示例包括结合素4和slitrk6。与肾癌相关的肿瘤抗原的非限制性示例包括cd70和folr1。
[0167]
抗原结合结构域可以靶向的抗原的其他示例包括但不限于甲胎蛋白、a3、a33抗体特异性抗原、ba733、bre3-抗原、碳酸酐酶ex、cdl、cd1a、cd3、cd5、cd15、cd16、cd19、cd20、cd21、cd22、cd23、cd25、cd30、cd33、cd38、cd45、cd74、cd79a、cd80、cd123、cd138、结肠特异性抗原p(csap)、cea(ceacam5)、ceacam6、csap、egfr、egp-i、egp-2、ep-cam、epha1、epha2、epha3、epha4、epha5、epha6、epha7、epha8、epha10、ephb1、ephb2、ephb3、ephb4、ephb6、fit-i、flt-3、叶酸受体、hla-dr、人绒毛膜促性腺激素(hcg)及hcg的亚基、缺氧诱导因子(hif-i)、ia、il-2、il-6、il-8、胰岛素生长因子1(igf-i)、kc4抗原、ks-1抗原、ks1-4、le-y、巨噬细胞抑制因子(mif)、mage、muc2、muc3、muc4、nca66、nca95、nca90、pam-4抗体特异性抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、psa、psma、rs5、s100、tac、tag-72、腱生蛋白、trail受体、tn抗原、thomson-friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、vegf、ed-b纤连蛋白、17-1a抗原、血管生成标志物、致癌基因标志物或致癌基因产物。
[0168]
在一个实施方式中，抗原结合结构域靶向的抗原为cd19。在一个实施方式中，抗原结合结构域包含抗cd19 scfv。在一个实施方式中，抗cd19 scfv包含重链可变区(vh)，所述重链可变区包含seq id no：2所示的氨基酸序列，或与seq id no：2具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。在一个实施方式中，抗cd19 scfv包含轻链可变区(vl)，所述轻链可变区包含seq id no：4中所示的氨基酸序列，或与seq id no：4具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。在一个实施方式中，抗cd19 scfv包含seq id no：7中所示的氨基酸序列，或与seq id no：7具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0169]
在一些实施方式中，抗原与自身免疫性疾病或病症相关。此类抗原可以来源于细胞受体和产生“自体”定向抗体的细胞。在一些实施方式中，抗原与例如如下的自身免疫性疾病或病症相关：类风湿性关节炎(ra)、多发性硬化症(ms)、干燥综合征、系统性红斑狼疮、结节病、1型糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病(iddm)、自身免疫性甲状腺炎、反应性关节炎、强
直性脊柱炎、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、银屑病、血管炎、韦格纳肉芽肿、重症肌无力、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病(graves'disease)、慢性炎症性脱髓鞘多发性神经病、吉兰-巴雷综合征(guillain-barre syndrome)、克罗恩病或溃疡性结肠炎。
[0170]
在一些实施方式中，本文公开的arcar靶向的自身免疫性抗原包括但不限于血小板抗原、髓磷脂蛋白抗原、snrnp中的sm抗原、胰岛细胞抗原、类风湿因子、抗瓜氨酸化蛋白、瓜氨酸化蛋白和肽(例如ccp-1、ccp-2(环瓜氨酸化肽))、纤维蛋白原、纤维蛋白、波形蛋白、丝聚蛋白、胶原蛋白i和ii肽、α-烯醇化酶、翻译起始因子4g1、核周因子、角蛋白、sa(细胞骨架蛋白波形蛋白)、关节软骨的成分(例如胶原蛋白ii、ix和xi)、循环血清蛋白(例如rf(igg、igm))、纤维蛋白原、纤溶酶原、铁蛋白、核组分(例如ra33/hnrnp a2、sm、真核翻译延伸因子1α1)、应激蛋白(例如hsp-65、hsp-70、hsp-90)、bip、炎症/免疫因子(例如b7-h1、il-1α和il-8)、酶(例如钙蛋白酶抑制蛋白、α-烯醇化酶、醛缩酶-a、二肽基肽酶)、骨桥蛋白、葡萄糖-6-磷酸异构酶、受体(例如脂皮质素1)、中性粒细胞核蛋白(例如乳铁蛋白和25-35kd的核蛋白)、颗粒蛋白(例如杀菌性通透性增加蛋白(bpi))、弹性蛋白酶、组织蛋白酶g、髓过氧化物酶、蛋白酶3、血小板抗原、髓磷脂蛋白抗原、胰岛细胞抗原、类风湿因子、组蛋白、核糖体p蛋白、心磷脂、波形蛋白、核酸(例如dsdna、ssdna、rna)、核糖核颗粒和蛋白质(例如sm抗原(包括但不限于smd's和smb'/b))、u1rnp、a2/b1 hnrnp、ro(ssa)以及la(ssb)抗原。
[0171]
表2至4中提供了非限制性的示例性抗原靶标。表2：抗原结合结构域可以包含vh序列、vl序列和/或它们的cdr，例如在引用的出版物中描述的那些，出于所有目的，每个出版物的内容均通过引用整体并入本文。
表3：抗原结合结构域可以包含来源于结合抗原靶标的抗体或抗体片段的scfv，例如引用的出版物中描述的那些，出于所有目的，每个出版物的内容均通过引用整体并入本文。
表4：抗原结合结构域可以包含来源于结合抗原靶标的car的抗原结合结构域，例如引用的出版物中描述的那些，出于所有目的，每个出版物的内容均通过引用整体并入本文。
[0172]
在各种实施方式中，本公开的arcar系统中使用的scfv片段可以包括vh结构域和vl结构域之间的接头。接头可以是肽接头，并且可以包含任何天然存在的氨基酸。接头中可以包含的示例性氨基酸为gly、ser、pro、thr、glu、lys、arg、ile、leu、his和the。接头的长度应当足以连接vh和vl以使它们形成相对于彼此的正确构象，从而使它们保留所需的活性(例如与抗原的结合)。接头的长度可以为约5至50个氨基酸。在一些实施方式中，接头的长度为约10至40个氨基酸。在一些实施方式中，接头的长度为约10至35个氨基酸。在一些实施方式中，接头的长度为约10至30个氨基酸。在一些实施方式中，接头的长度为约10至25个氨基酸。在一些实施方式中，接头的长度为约10至20个氨基酸。在一些实施方式中，接头的长度为约15至20个氨基酸。可以使用的示例性接头为富含gly的接头、包含gly和ser的接头、包含gly和ala的接头、包含ala和ser的接头以及其他柔性接头。
[0173]
在一个实施方式中，接头为whitlow接头。在一个实施方式中，whitlow接头包含seq id no：3所示的氨基酸序列，或与seq id no：3具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。在另一个实施方式中，接头是(g4s)3接头。在一个实施方式中，(g4s)3接头包含seq id no：25所示的氨基酸序列，或与seq id no：25具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。
[0174]
其他接头序列可以包括来源于任何免疫球蛋白重链或轻链同种型的免疫球蛋白铰链区、cl或ch1的部分。可以使用的示例性接头包括表1中的seq id no：26至56的任意序列。另外的接头描述于例如国际专利申请公开号wo2019/060695，其通过引用整体并入本文。
[0175]
在一些实施方式中，第二多肽包含在n-末端的抗原结合结构域和在c-末端的标签。在一些实施方式中，第二多肽包含在c-末端的抗原结合结构域和在n-末端的标签。
[0176]
在一些实施方式中，第二多肽是可溶性多肽。
[0177]
在一些实施方式中，arcar系统还包含一种以上额外的多肽，所述一种以上额外的多肽各自包含(a)与独特抗原结合的抗原结合结构域和(b)被第一多肽的标签结合结构域识别的标签。
[0178]
在另一方面，本文提供了包含两种以上本文描述的arcar的arcar系统，其中，每种arcar包含一对独特的标签和标签结合结构域。
[0179]
在另外的方面，本文提供了本文描述的arcar的多肽。一方面，本文提供了本文描述的arcar的第一多肽。一方面，本文提供了本文描述的arcar的第二多肽。
[0180]
不希望被理论束缚，本公开的arcar系统可具有多种优点，包括：
·
抗id分子/抗体片段(特别是为了抗体特异性而与非人蛋白靶标的组合)最大程度地减少脱靶相互作用的高度特异性。
·
标签上结合环(binding loop)的特异性避免了与相似框架/支架蛋白的不良相互作用。也可以使用中和与靶标的结合的真实id(true-id)。
·
开发一系列亲和力以优化和调节“标签”多肽和car相互作用的内在能力。
·
该系统在可能的配对方面是没有限制的，因此可以开发大量优化的car/“标签”多肽对，它们各自具有独特的特异性以实现符合目的的治疗，包括结合亲和力的调节、逻辑门控、每个细胞的多特异性以及每次治疗的多种可溶性药物。
·
该方法是“平台无关的(platform agnostic)”，如果对一种支架产生免疫原性或其他限制，则允许并入不同的支架(例如，用vhh替换scfv)。多核苷酸和载体
[0181]
另一方面，本文提供了编码本公开的arcar系统中的一种以上多肽的多核苷酸。
[0182]
在一些实施方式中，本文提供了编码本公开的arcar系统的第一多肽的多核苷酸。在一些实施方式中，本文提供了编码本公开的两种以上arcar系统的第一多肽的多核苷酸。在一些实施方式中，两种以上arcar系统各自包含一对独特的标签和标签结合结构域。
[0183]
在一些实施方式中，本文提供了编码本公开的arcar系统的第二多肽的多核苷酸。在一些实施方式中，本文提供了编码本公开的两种以上arcar系统的第二多肽的多核苷酸。在一些实施方式中，两种以上arcar系统各自包含一对独特的标签和标签结合结构域。
[0184]
在一些实施方式中，本文提供了编码本公开的arcar系统的两种多肽的多核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸编码本公开的两种以上arcar系统的两种多肽。在一些实施方式中，两种以上arcar系统各自包含一对独特的标签和标签结合结构域。
[0185]
多核苷酸可以包含任何类型的核苷酸(包括但不限于dna和rna)，它们可以是单链的或双链的、合成的或部分从天然来源获得的，可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸。多核苷酸可以包含天然存在的或非天然存在的核苷酸间连接，或同时包含两种类型的连接。
[0186]
在一些实施方式中，本文所述的多核苷酸是dna分子。在各种实施方式中，本文所述的多核苷酸是rna分子。
[0187]
一方面，本公开提供了包含本文所述的多核苷酸的重组载体。
[0188]
在一些实施方式中，重组载体包含编码本公开的arcar系统的第一多肽的多核苷酸。在一些实施方式中，重组载体包含编码本公开的两种以上arcar的第一多肽的多核苷酸。在一些实施方式中，两种以上arcar各自包含一对独特的标签和标签结合结构域。
[0189]
在一些实施方式中，重组载体包含编码本公开的arcar系统的第二多肽的多核苷酸。在一些实施方式中，重组载体包含编码本公开的两种以上arcar的第二多肽的多核苷酸。在一些实施方式中，两种以上arcar各自包含一对独特的标签和标签结合结构域。
[0190]
在一些实施方式中，重组载体包含编码本公开的arcar系统的两种多肽的多核苷酸。在一些实施方式中，重组载体包含编码本公开的两种以上arcar的两种多肽的多核苷酸。在一些实施方式中，两种以上arcar各自包含一对独特的标签和标签结合结构域。
[0191]
重组载体可以是任何合适的重组表达载体。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增、或用于表达、或用于繁殖和扩增以及表达的载体(例如质粒和病毒)。例如，载体可以选自puc系列(fermentas life sciences，格伦伯尼，马里兰州)、pbluescript系列(stratagene，拉荷亚，加利福尼亚州)、pet系列(novagen，麦迪逊，威斯康星州)、pgex系列(pharmacia biotech，乌普萨拉，瑞典)和pex系列(clontech，帕洛阿尔托，加利福尼亚州)。也可以使用噬菌体载体(例如λgt10、λgt11、λzapii(stratagene)、λembl4和λnm1149)。在本公开的上下文中有用的植物表达载体的示例包括pbi01、pbi101.2、pbi101.3、pbi121和pbin19(clontech)。在本公开的上下文中有用的动物表达载体的示例包括pcdna、peuk-cl、pmam和pmamneo(clontech)。在一些实施方式中，双顺反子ires载体(例如来自clontech)可用于包含编码本文所述arcar系统的第一多肽和第二多肽的多核苷酸。
[0192]
在一些实施方式中，重组载体为非病毒载体。非病毒载体可以为质粒或转座子(例如piggybac或睡美人(sleeping beauty)转座子)。在一个实施方式中，载体为质粒。
[0193]
在一些实施方式中，重组载体为病毒载体。合适的病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、甲病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(aav)、疱疹病毒载体、疫苗载体和禽痘病毒载体。在一些实施方式中，病毒载体具有转化宿主细胞(例如t细胞)的天然能力或经工程化改造的能力。
[0194]
重组载体可以使用标准重组dna技术来制备，描述于例如sambrook等，molecular cloning:a laboratory manual，第3版；cold spring harbor press，冷泉港，纽约，2001；以及ausubel等，current protocols in molecular biology，greene publishing associates和john wiley&sons，纽约，1994。环形或线性的表达载体的构建体可以制备成含有在原核生物或真核生物宿主细胞中发挥功能的复制系统。复制系统可以来源于例如cole1、2μ质粒、λ、sv40、牛乳头瘤病毒等。
[0195]
重组载体可以包含一个以上标志基因，其允许对转化或转染的宿主进行选择。标志基因包括杀生物剂(biocide)抗性(例如对抗生素、重金属等的抗性)基因、在营养缺陷型宿主中的互补以提供原营养的基因等。用于重组表达载体的合适的标志基因包括例如新霉素/g418抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
[0196]
在本公开的上下文中有用的载体可以为“裸露的”核酸载体(即，具有极少或没有包裹它们的蛋白质、糖和/或脂质的载体)，或与其他分子复合的载体。可以与载体适当组合的其他分子包括但不限于病毒衣壳、阳离子脂质、脂质体、多胺、金颗粒和靶向部分(例如配
体、受体或靶向细胞分子的抗体)。
[0197]
可以通过常规的转化或转染技术将载体dna引入宿主细胞(例如免疫效应细胞)。如本文所用，术语“转化”和“转染”意在指用于将外来核酸(例如dna)引入细胞的各种本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、deae-葡聚糖介导的转染、脂转染、基因枪或电穿孔。
[0198]
在各种实施方式中，编码arcar多肽(例如，第一多肽或第二多肽)的多核苷酸可操作地连接到至少一个调节元件。调节元件能够介导宿主细胞中arcar多肽(例如，第一多肽或第二多肽)的表达。调控元件包括但不限于启动子、增强子、起始位点、聚腺苷酸化(polya)尾巴、ires元件、响应元件和终止信号。在某些实施方式中，调节元件调节arcar多肽表达。在某些实施方式中，调节元件增加arcar多肽(例如，第一多肽或第二多肽)的表达。在某些实施方式中，一旦宿主细胞被激活，调节元件将会增加arcar多肽(例如，第一多肽或第二多肽)的表达。在某些实施方式中，调节元件降低arcar多肽(例如，第一多肽或第二多肽)的表达。在某些实施方式中，一旦宿主细胞被激活，调节元件将会降低arcar多肽(例如，第一多肽或第二多肽)的表达。经修饰的宿主细胞
[0199]
一方面，本文提供经修饰以表达本公开arcar的一种以上多肽的宿主细胞。
[0200]
在一些实施方式中，本文提供了宿主细胞，该宿主细胞为包含本公开的arcar系统的第一多肽的免疫效应细胞。在一些实施方式中，本文提供包含本公开的两种以上arcar的第一多肽的宿主细胞。在一些实施方式中，两种以上arcar各自包含一对独特的标签和标签结合结构域。
[0201]
在一些实施方式中，本文提供了包含本公开的arcar的第二多肽的宿主细胞。在一些实施方式中，本文提供了包含本公开的两种以上arcar的第二多肽的宿主细胞。在一些实施方式中，两种以上arcar各自包含一对独特的标签和标签结合结构域。
[0202]
在一些实施方式中，本文提供了包含本公开的arcar的第一多肽和第二多肽的宿主细胞。
[0203]
在一些实施方式中，本文提供了包含本文所述的多核苷酸或重组载体的宿主细胞。
[0204]
在各种实施方式中，具有包含第一多肽的嵌合抗原受体的细胞为免疫效应细胞。在一些实施方式中，细胞为t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、树突细胞或巨噬细胞。
[0205]
在一些实施方式中，免疫效应细胞来源于干细胞。在一些实施方式中，细胞为诱导性多能干细胞(ipsc)、造血干细胞(hsc)或胚胎干细胞(esc)。在一些实施方式中，细胞为ipsc。在一个实施方式中，细胞为来源于ipsc的t细胞。在一个实施方式中，细胞为来源于ipsc的nk细胞。
[0206]
一方面，本文提供了制备本文所述的经修饰的宿主细胞的方法。
[0207]
在一个实施方式中，制备经修饰的宿主细胞的方法包括将编码本公开的arcar的第一多肽的多核苷酸或包含该多核苷酸的重组载体引入细胞中。
[0208]
在一个实施方式中，制备经修饰的宿主细胞的方法包括将编码本公开的arcar的第二多肽的多核苷酸或包含该多核苷酸的重组载体引入细胞中。
[0209]
在一个实施方式中，制备经修饰的宿主细胞的方法包括将编码本公开的arcar的第一多肽和第二多肽的多核苷酸或包含该多核苷酸的重组载体引入细胞中。
[0210]
在各种实施方式中，经修饰的细胞组成型地表达本文所述的arcar的第一多肽。在各种实施方式中，经修饰的细胞诱导型地表达本文所述的arcar的第一多肽。
[0211]
在各种实施方式中，经修饰的细胞组成型地表达本文所述的arcar的第二多肽。在各种实施方式中，经修饰的细胞诱导型地表达本文所述的arcar的第二多肽。
[0212]
在各种实施方式中，宿主细胞可以是自体的/自生的(“自身”)或非自体的(“非自身”，例如同种异体的、同基因的或异基因的)。在一些实施方式中，宿主细胞从哺乳动物受试者中获得。在一些实施方式中，宿主细胞从灵长类动物受试者中获得。在一些实施方式中，宿主细胞从人受试者中获得。
[0213]
在某些实施方式中，使用免疫细胞(例如淋巴细胞)。淋巴细胞可以从如下来源获得，例如但不限于外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。淋巴细胞也可以通过干细胞的分化产生。在某些实施方式中，淋巴细胞可以使用技术人员公知的技术(例如沉降，例如ficoll
tm
分离)从收集自受试者的血液中获得。
[0214]
在某些实施方式中，来自受试者的循环血液的免疫细胞通过单采血液成分法(apheresis)获得。单采血液成分法装置通常含有淋巴细胞，包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在某些实施方式中，可以洗涤通过单采血液成分法收集的细胞以去除血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理。可以用pbs或另一种合适的不含钙、镁和大多数(如果不是所有其他)其他二价阳离子的溶液洗涤细胞。洗涤步骤可通过本领域技术人员已知的方法完成，例如但不限于使用半自动流通式离心机(例如，cobe 2991细胞处理器或baxter cytomate)。洗涤之后，可以将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液、细胞培养基或其他含或不含缓冲剂的盐水溶液。
[0215]
在某些实施方式中，可以通过裂解红细胞和去除单核细胞从外周血单核细胞(pbmc)中分离t淋巴细胞。例如，可以通过percoll
tm
梯度离心对细胞进行分选。在某些实施方式中，在pbmc的分离之后，可以将细胞毒性t淋巴细胞和辅助性t淋巴细胞在激活、扩增和/或基因修饰之前或之后分类为幼稚t细胞亚群、记忆t细胞亚群和效应t细胞亚群。
[0216]
在某些实施方式中，可以富集t淋巴细胞。例如，使用正选择或负选择技术富集表达一种以上的如下标志物的特定t淋巴细胞亚群，例如但不限于cd3、cd4、cd8、cd14、cd15、cd16、cd19、cd27、cd28、cd34、cd36、cd45ra、cd45ro、cd56、cd62、cd62l、cd122、cd123、cd127、cd235a、ccr7、hla-dr或它们的组合。在某些实施方式中，用于本公开的组合物的t淋巴细胞不表达或基本上不表达一种以上的如下标志物：cd57、cd244、cd160、pd-1、ctla4、tim3和lag3。
[0217]
在某些实施方式中，可以富集nk细胞。例如，使用正选择或负选择技术富集表达一种以上的如下标志物的特定t淋巴细胞亚群，例如但不限于cd2、cd16、cd56、cd57、cd94、cd122或它们的组合。
[0218]
在某些实施方式中，使用多能干细胞(psc)(例如诱导性多能干细胞(ipsc)和胚胎干细胞(esc))产生宿主细胞(例如nk细胞或t淋巴细胞)。人ipsc和人esc可以通过本领域已知的各种方法产生。可以用本公开的arcar对psc(例如，ipsc或esc)进行修饰，例如，通过使
细胞与编码arcar的多肽的多核苷酸或重组载体接触。工程化的psc可以用于生产或生成包含本公开的arcar的免疫细胞(例如t细胞)。
[0219]
ipsc可以直接从成体细胞(例如体细胞)产生。可以通过将一组特定的多能性相关基因或“重编程因子”引入给定的细胞类型来产生ipsc或衍生出ipsc。重编程因子包括但不限于oct4(也称为“pou5fl”)、sox2、cmyc和klf4，它们也被称为yamanaka因子(参见takahashi,k；yamanaka,s(2006).cell 126(4):663-76)。每个重编程因子都可以被相关的转录因子、mirna、小分子，甚至是不相关的基因(例如细胞谱系特异性分子)功能性替换。引入重编程因子后，细胞开始形成类似于psc的集落，可以根据这些集落的形态、为它们的生长选择的条件或通过表面标志物或报告基因的表达对它们进行分离。在某些实施方式中，本发明方法中使用的psc是受试者特异性的。
[0220]
存在通过使用yamanaka因子(oct4、sox2、klf4和cmyc)的重编程由各种类型的体细胞产生psc的已知技术。例如，对于鼠b细胞(hanna等,(2008)cell,133,pp.250-264；wada等,(2011)int.immunol.,23,pp.65-74)、鼠t细胞和成熟nk t细胞(watarai等,(2010)j.clin.invest.,120,pp.2610-2618)以及人t细胞(loh等,(2010)cell stem cell,7,pp.15-19；seki等,(2010)cell stem cell,7,pp.11-14)，已完成将成熟淋巴细胞重编程为ipsc。可以通过使用全外周单核细胞(pbmc)或cd3
+
细胞作为来源细胞群从人t细胞中产生ipsc(loh等，(2010)cell stem cell,7,pp.15-19；seki等,(2010)cell stem cell,7,pp.11-14；staerk等(2010)cell stem cell,7,pp.20-24；brown等,(2010)plos one 5,e11373)。
[0221]
为了达到宿主细胞组合物的足够治疗剂量，宿主细胞通常经历一轮以上刺激/激活。在某些实施方式中，生产用于向受试者施用的宿主细胞的方法包括在存在一种以上刺激信号或试剂(例如，化合物、小分子(例如有机小分子)、核酸、多肽或它们的片段、异构体、变体、类似物或衍生物)的情况下刺激宿主细胞以使其活化。在某些实施方式中，生产用于向受试者施用的宿主细胞的方法包括在存在一种以上刺激信号或试剂的情况下刺激宿主细胞以使其活化和增殖。
[0222]
免疫细胞(例如t淋巴细胞和nk细胞)可以通过诱导它们的生物学状态的变化而被激活，由此细胞表达激活标志物、产生细胞因子、增殖和/或变得对靶细胞具有细胞毒性。所有这些变化都可以由初级刺激信号产生。共刺激信号放大初级信号的强度并抑制初始刺激后的细胞死亡，从而获得更持久的激活状态，更高的细胞毒性能力。
[0223]
t细胞通常可以使用例如以下中描述的方法激活：美国专利6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514和6,867,041，它们各自通过引用整体并入本文。在某些实施方式中，t细胞通过与激活cd3ζ的试剂结合而被激活。
[0224]
在一些实施方式中，可以使用cd2结合剂以向t细胞提供初级刺激信号。例如但不限于，cd2试剂包括但不限于cd2配体和抗cd2抗体，例如，tl 1.3抗体与tl 1.1抗体或tl 1.2抗体的组合(meuer,s.c.等(1984)cell 36:897-906)以及9.6抗体(识别与ti 1.1相同的表位)与9-1抗体的组合(yang,s.y.等，(1986)j.immunol.137:1097-1100)。也可以使用与任何上述抗体的相同表位结合的其他抗体。
[0225]
在一些实施方式中，通过施用佛波醇豆蔻酸酯乙酸酯(pma)和离子霉素来激活免
2、il-21。
[0234]
在某些实施方式中，nk激活剂的浓度可以为约0.1至约10μg/ml。在某些实施方式中，nk激活剂的浓度可以为约0.2μg/ml至约9μg/ml、约0.3μg/ml至约8μg/ml、约0.4μg/ml至约7μg/ml、约0.5μg/ml至约6μg/ml、约0.6μg/ml至约5μg/ml、约0.7μg/ml至约4μg/ml、约0.8μg/ml至约3μg/ml、或约0.9μg/ml至约2μg/ml。在某些实施方式中，nk激活剂以约0.1μg/ml、约0.2μg/ml、约0.3μg/ml、约0.4μg/ml、约0.5μg/ml、约0.6μg/ml、约0.7μg/ml、约0.8μm、约0.9μg/ml、约1μg/ml、约2μg/ml、约3μg/ml、约4μm、约5μg/ml、约6μg/ml、约7μg/ml、约8μg/ml、约9μg/ml或约10μg/ml的浓度施用。在某些实施方式中，nk激活剂的浓度可以为1μg/ml。
[0235]
在某些实施方式中，激活剂附着于固体支持物(例如但不限于珠子、存在于培养板或孔中的吸收性聚合物、或其他基质(例如但不限于琼脂糖或玻璃))；激活剂可以通过本领域技术人员已知的方式在天然或重组细胞系的细胞表面上表达(例如以天然形式或重组形式)。
[0236]
在某些实施方式中，可以在刺激/激活后对宿主细胞进行基因修饰。在某些实施方式中，在刺激/激活后12小时、16小时、24小时、36小时或48小时内对宿主细胞进行修饰。在某些实施方式中，在刺激/激活后16至24小时内对细胞进行修饰。在某些实施方式中，在24小时内对宿主细胞进行修饰。在某些实施方式中，可以在刺激/激活前对宿主细胞进行基因修饰。
[0237]
为了对宿主细胞进行基因修饰以表达本公开的arcar，必须将arcar多核苷酸或重组载体转移到宿主细胞中。多核苷酸转移可以通过病毒或非病毒递送方法进行。适合与本技术方法一起使用的多核苷酸递送方法包括本领域技术人员已知的任何方法，由此可以将多核苷酸引入细胞器、细胞、组织或生物体中。
[0238]
在各种实施方式中，基因修饰是离体进行的。多种方法可用于通过离体修饰对从受试者中取出的细胞和组织进行转染。例如，体外逆转录病毒基因转移可用于对从受试者中取出的细胞进行基因修饰，将细胞转移回受试者体内。参见例如，wilson等，science,244:1344-1346,1989和science,244(4910):1342-1344,1989，两者均通过引用整体并入本文。在某些实施方式中，可从受试者中取出宿主细胞并使用本公开的多核苷酸或重组载体进行离体转染。在某些实施方式中，可以用本公开的多核苷酸或重组载体转染或转导从受试者中获得的宿主细胞，然后施用回给受试者。
[0239]
在一些实施方式中，可以通过逆转录病毒转导对宿主细胞进行转导。描述基因的逆转录病毒转导的参考文献为anderson等，美国专利号5,399,346；mann等，cell 33:153(1983)；temin等，美国专利号4,650,764；temin等，美国专利号4,980,289；markowitz等，j.virol.62:1120(1988)；temin等，美国专利号5,124,263；国际专利公开号wo95/07358；以及kuo等，blood 82:845(1993)，它们各自通过引用整体并入本文。
[0240]
另一种合适的基因转移方法包括注射。在某些实施方式中，可通过一次以上注射(例如针注射)将多核苷酸或重组载体递送至细胞、组织或生物体。非限制性的注射方法包括注射组合物(例如基于盐水的组合物)。也可以通过直接显微注射引入多核苷酸或重组载体。非限制性的注射部位包括皮下、皮内、肌内、结内(允许将抗原直接递送至淋巴组织)、静脉内、前列腺内(intraprotatic)、肿瘤内、淋巴管内(允许直接施用dc)和腹膜内。可以理解，正确的注射部位准备是必要的(例如，对注射部位进行备皮以观察正确的针头放置)。
[0241]
电穿孔为另一种合适的基因转移方法。参见例如potter等，(1984)proc.nat'l acad.sci.usa,81,7161-7165和tur-kaspa等，(1986)mol.cell biol.,6,716-718，出于所有目的两者均整体并入本文。电穿孔涉及将细胞和dna的悬浮液暴露于高压放电。在某些实施方式中，细胞壁降解酶(例如果胶降解酶)可用于使宿主细胞比未处理的细胞更易于通过电穿孔进行基因修饰。参见例如美国专利号5,384,253，出于所有目的，其通过引用整体并入本文。
[0242]
用于本公开的电穿孔方法包括，例如，sardesai,n.y.和weiner,d.b.,current opinion in immunotherapy 23:421-9(2011)以及ferraro,b.等，human vaccines 7:120-127(2011)，出于所有目的，二者通过引用整体并入本文。
[0243]
可以使用核酸疫苗将arcar多核苷酸或载体转移到宿主细胞中。此类疫苗包括但不限于非病毒载体、“裸露的”dna和rna以及病毒载体。用这些疫苗对细胞进行基因修饰以及优化这些疫苗中所含基因的表达的方法是本领域技术人员已知的。
[0244]
基因转移的其他方法包括脂质体介导的转染(例如，包埋在悬浮于过量水溶液中的脂质复合物中的多核苷酸，参见例如，ghosh和bachhawat，(1991)in:liver diseases,targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands.pp.87-104)。还考虑与lipofectamine或superfect复合的多核苷酸、deae-葡聚糖(例如，使用deae-葡聚糖然后使用聚乙二醇将多核苷酸输送到细胞中，参见例如gopal,t.v.,mol cell biol.1985may；5(5):1188-90)、磷酸钙(例如，使用磷酸钙沉淀将多核苷酸引入细胞中，参见例如graham和van der eb,(1973)virology,52,456-467；chen和okayama,mol.cell biol.,7(8):2745-2752,1987；以及rippe等，mol.cell biol.,10:689-695,1990)、声波装载(通过直接声波装载引入多核苷酸，参见例如fechheimer等，(1987)proc.nat'l acad.sci.usa,84,8463-8467)、基因枪法(例如，可以用至少一种多核苷酸包被一种以上颗粒并通过推进力递送到细胞中，参见例如美国专利号5,550,318；美国专利号5,538,880；美国专利号5,610,042；和pct申请wo 94/09699；klein等，nature,327,70-73；yang等,(1990)proc.nat'l acad.sci.usa,87,9568-9572)，以及受体介导的转染(例如，利用各种受体的细胞类型特异性分布，将在靶细胞中发生的通过受体介导的内吞作用选择性摄取大分子，参见例如wu和wu，(1987)j.biol.chem.,262,4429-4432；wagner等，proc.natl.acad.sci.usa,87(9):3410-3414,1990；perales等，proc.natl.acad.sci.usa,91:4086-4090,1994；myers,epo0273085；wu和wu,adv.drug delivery rev.,12:159-167,1993；nicolau等，(1987)methods enzymol.,149,157-176)，出于所有目的，此处引用的每篇参考文献均通过引用整体并入。
[0245]
在进一步的实施方式中，使用同源定向修复(hdr)的基因编辑对宿主细胞进行基因修饰。同源定向修复(hdr)是细胞用来修复双链dna断裂的机制。在hdr中，与双链dna断裂位点具有同源性的供体多核苷酸被用作模板来修复经切割的dna序列，导致基因信息从供体多核苷酸转移到dna。如此，可以将新的核酸材料插入或复制到靶dna的切割位点。宿主细胞中的双链dna断裂可以由位点特异性核酸酶诱导。如本文所用，术语“位点特异性核酸酶”指能够特异性识别和切割核酸(dna或rna)序列的核酸酶。用于本公开的合适的位点特异性核酸酶包括但不限于rna引导的核酸内切酶(例如crispr相关(cas)蛋白)、锌指核酸酶、talen核酸酶或mega-talen核酸酶。例如，可以将能够在靶dna序列中诱导双链断裂的位点
特异性核酸酶(例如，cas9+向导rna)和编码本公开的arcar的多肽的供体多核苷酸一起引入宿主细胞。
[0246]
宿主细胞被激活和转导后，培养细胞以进行增殖。
[0247]
t细胞可以培养至少1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天、至少2周、至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月以上，其中进行1轮、2轮、3轮、4轮、5轮、6轮、7轮、8轮、9轮或10轮以上扩增。
[0248]
可用于t细胞扩增的试剂可以包括白介素(例如il-2、il-7、il-15或il-21)(参见例如cornish等，2006,blood.108(2):600-8；bazdar和sieg，2007,journal of virology,2007,81(22):12670-12674；battalia等，2013,immunology,139(1):109-120)。可用于t细胞扩增的试剂的其他说明性示例为结合cd8、cd45或cd90的试剂(例如αcd8抗体、αcd45抗体或αcd90抗体)。t细胞群的说明性示例包括抗原特异性t细胞、辅助性t细胞、细胞毒性t细胞、记忆t细胞(记忆t细胞的说明性示例为cd62l|cd8|特异性中枢记忆t细胞)或调节性t细胞(treg的说明性示例为cd4
+
cd25
+
cd45ra
+
treg细胞)。
[0249]
可用于扩增t细胞的其他试剂包括描述于例如以下中的方法：美国专利6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514和6,867,041，它们各自通过引用整体并入本文。
[0250]
在某些实施方式中，用于扩增的试剂(例如il-2)以约20u/ml至约200u/ml施用。在某些实施方式中，用于扩增的试剂(例如il-2)以约25u/ml至约190u/ml、约30u/ml至约180u/ml、约35u/ml至约170u/ml、约40u/ml至约160u/ml、约45u/ml至约150u/ml、约50u/ml至约140u/ml、约55u/ml至约130u/ml、约60u/ml至约120u/ml、约65u/ml至约110u/ml、约70u/ml至约100u/ml、约75u/ml至约95u/ml或约80u/ml至约90u/ml施用。在某些实施方式中，用于扩增的试剂(例如il-2)以约20u/ml、约25u/ml、约30u/ml、35u/ml、40u/ml、45u/ml、约50u/ml、约55u/ml、约60u/ml、约65u/ml、约70u/ml、约75u/ml、约80u/ml、约85u/ml、约90u/ml、约95u/ml、约100u/ml、约105u/ml、约110u/ml约115u/ml、约120u/ml、约125u/ml、约130u/ml、约135u/ml、约140u/ml、约145u/ml、约150u/ml、约155u/ml、约160u/ml、约165u/ml、约170u/ml、约175u/ml、约180u/ml、约185u/ml、约190u/ml、约195u/ml或约200u/ml施用。在某些实施方式中，用于扩增的试剂(例如il-2)以约5mg/ml至约10ng/ml施用。在某些实施方式中，用于扩增的试剂(例如il-2)以约5.5ng/ml至约9.5ng/ml、约6ng/ml至约9ng/ml、约6.5ng/ml ml至约8.5ng/ml或约7ng/ml至约8ng/ml施用。在某些实施方式中，用于扩增的试剂(例如il-2)以约5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml或10ng/ml施用。
[0251]
nk细胞可以培养至少1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天、至少2周、至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月以上，其中进行1轮、2轮、3轮、4轮、5轮、6轮、7轮、8轮、9轮或10轮以上扩增。
[0252]
可用于nk细胞扩增的试剂可以包括结合cd16或cd56的试剂(例如αcd16抗体或αcd56抗体)。在某些实施方式中，结合剂包括抗体(参见例如hoshino等，blood.1991dec.15；78(12):3232-40)。可用于nk细胞扩增的其他试剂可以为il-15(参见例如vitale等，2002.the anatomical record.266:87-92，出于所有目的其通过引用整体并入本文)。
[0253]
适用于t细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，添加了氨基酸、丙酮酸钠和维
生素的无血清或补充了足以进行生长扩增的适量血清(或血浆)或一组确定的激素和/或一定量的细胞因子的最小必需培养基(mem)、rpmi培养基1640、lonza rpmi 1640、advanced rpmi、clicks、aim-v、dmem、a-mem、f-12、texmacs、x-vivo 15和x-vivo20、optimizer)。
[0254]
用于宿主细胞扩增的其他添加剂的示例包括但不限于表面活性剂、血浆制品(piasmanate)、ph缓冲剂(例如hepes)以及还原剂(例如n-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇)、抗生素(例如青霉素和链霉素)，这些添加剂的示例仅包含在实验培养物中，而不包含在要注入受试者体内的细胞培养物中。靶细胞被保持在支持生长所必需的条件(例如适当的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％ co2))下。
[0255]
在将psc(例如，ipsc或esc)用作起始细胞群的某些实施方式中，方法还可以包括将psc分化成免疫细胞(例如t细胞)。适用于获得ipsc衍生的造血细胞谱系的分化方法和组合物包括本领域中描述的那些(例如国际专利公开号wo2017078807和wo2019112899，它们的公开内容通过引用并入本文)。ipsc衍生的造血谱系细胞可以包括但不限于永久造血内皮细胞、造血多能祖细胞、造血干细胞和造血祖细胞、t细胞祖细胞、nk细胞祖细胞、t细胞、nk细胞、nkt细胞、b细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。
[0256]
在一些实施方式中，本公开还提供了纯化本公开的arcar的多肽的方法。在一些实施方式中，方法包括从经修饰以表达arcar的第二多肽的宿主细胞中纯化arcar的第二多肽。在一些实施方式中，arcar的第二多肽为可溶性蛋白质。药物组合物
[0257]
一方面，如本文所公开，组合物包含本文所述的arcar的一种以上多肽、多核苷酸、包含其的载体以及细胞组合物。在一些实施方式中，本公开的组合物包括但不限于药物组合物。
[0258]
一方面，本公开提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文所述的arcar的多肽，以及药学上可接受的媒介物和/或赋形剂。在一些实施方式中，药物组合物包含本文所述的arcar的第二多肽，以及药学上可接受的媒介物和/或赋形剂。在一些实施方式中，药物组合物包含两种以上本文所述的arcar的第二多肽，以及药学上可接受的媒介物和/或赋形剂。
[0259]
另一方面，本公开提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文所述的多核苷酸或重组载体，以及药学上可接受的媒介物和/或赋形剂。在一些实施方式中，药物组合物包含编码本文所述的arcar的第二多肽的多核苷酸，以及药学上可接受的媒介物和/或赋形剂。在一些实施方式中，药物组合物包含编码两种以上本文所述的arcar的第二多肽的多核苷酸，以及药学上可接受的媒介物和/或赋形剂。在一些实施方式中，药物组合物包含两种以上多核苷酸以及药学上可接受的媒介物和/或赋形剂，所述两种以上多核苷酸各自编码本文所述的arcar的第二多肽。在一些实施方式中，药物组合物包含重组载体和药学上可接受的媒介物和/或赋形剂，所述重组载体包含编码本文所述的arcar的第二多肽的多核苷酸。在一些实施方式中，药物组合物包含重组载体和药学上可接受的媒介物和/或赋形剂，所述重组载体包含编码两种以上本文所述的arcar的第二多肽的多核苷酸。在各种实施方式中，两种以上arcar各自包含一对独特的标签和标签结合结构域。
[0260]
另一方面，本公开提供了药物组合物，该药物组合物包含本文所述的经修饰的宿主细胞和药学上可接受的媒介物和/或赋形剂。
[0261]
药物媒介物的示例包括但不限于无菌液体，例如水和油，油包括来自石油、动物、植物或合成来源的那些油(例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)。优选使用水或盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液作为媒介物(特别是用于可注射溶液)。
[0262]
包含本文公开的经修饰的宿主细胞的组合物可以包含缓冲液(例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇)、蛋白质、多肽或氨基酸(例如甘氨酸)、抗氧化剂、螯合剂(例如edta或谷胱甘肽)、佐剂(例如氢氧化铝)以及防腐剂。
[0263]
包含本文公开的经修饰的宿主细胞的组合物可以包含如下中的一种以上：无菌稀释剂(例如注射用水、盐水溶液，优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠)、不挥发性油(例如合成单甘油酯或双甘油酯(可以作为溶剂或悬浮介质)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂)、抗菌剂(例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯)、抗氧化剂(例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠)、螯合剂(乙二胺四乙酸)、缓冲剂(例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐)，以及用于调节张力的试剂(例如氯化钠或葡萄糖)。
[0264]
在一些实施方式中，组合物被配制成用于肠胃外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)施用、腹膜内施用、肿瘤内施用、心室内施用、胸膜内施用或肌内施用。肠胃外制剂可以被封装在由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。可注射药物组合物优选为无菌的。在一些实施方式中，组合物在施用前由冻干制剂复原。
[0265]
在一些实施方式中，经修饰的宿主细胞可以在它们的施用之前与粘附或渗透的物质(例如但不限于纳米颗粒)混合。治疗方法
[0266]
在一些方面，本文提供了使用本公开的arcar治疗疾病的方法。
[0267]
一方面，本文提供了一种在有需要的受试者中治疗疾病的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的如下：(i)包含嵌合抗原受体的免疫效应细胞，所述嵌合抗原受体包含本文所述的arcar的第一多肽，以及(ii)所述arcar的第二多肽，或编码所述第二多肽的多核苷酸，或包含所述第二多肽的宿主细胞。
[0268]
在一些实施方式中，该方法还包括施用一种以上额外的多肽，所述一种以上额外的多肽各自包含(a)与独特抗原结合的抗原结合结构域和(b)被第一多肽的标签结合结构域识别的标签。
[0269]
另一方面，本文提供了一种在有需要的受试者中治疗疾病的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的如下：(i)包含嵌合抗原受体的免疫效应细胞，所述嵌合抗原受体包含两种以上arcar的第一多肽，其中，所述两种以上arcar选自本文所述的arcar系统，以及(ii)所述两种以上arcar的第二多肽，或编码所述第二多肽的一种以上多核苷酸，或包含所述第二多肽的一种以上宿主细胞。
[0270]
在本文所述的治疗方法的各种实施方式中，细胞为免疫效应细胞。在一些实施方式中，细胞为t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(til)。在一些实施方式中，细胞为t细胞。在一些实施方式中，细胞来源于ipsc。
在各种实施方式中，细胞组成型地表达第一多肽。
[0271]
在本文所述的治疗方法的各种实施方式中，宿主细胞和/或多肽作为药物组合物施用，所述药物组合物还包含如本文所述的药学上可接受的媒介物和/或赋形剂。
[0272]
在本文所述的治疗方法的各种实施方式中，疾病为癌症。术语“癌症”、“恶性肿瘤”、“赘生物”、“肿瘤”和“癌”在本文中可互换使用，它们指表现出相对异常的、不受控制的和/或自主生长的细胞，因此它们表现出以细胞增殖的显著失控为特征的异常生长表型。通常，本技术中治疗的感兴趣的细胞包括癌前(例如，良性)、恶性、转移前、转移和非转移的细胞。本公开的教导可以与任何癌症和所有癌症相关。在一些实施方式中，仅举一些非限制性的示例，本公开的教导适用于一种以上癌症，例如，造血系统癌症，包括白血病、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、骨髓瘤和骨髓增生性疾病，肉瘤，黑色素瘤，腺瘤，实体组织癌，口腔、咽喉、喉和肺的鳞状细胞癌，肝癌，泌尿生殖系统癌症(例如前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、子宫癌和子宫内膜癌以及肾细胞癌)，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，皮肤或眼内黑色素瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，头颈癌，乳腺癌，胃肠癌和神经系统癌，良性病变(例如乳头状瘤)等。在一些实施方式中，通过本公开的方法治疗的癌症为实体瘤。在一些实施方式中，通过本公开的方法治疗的癌症为血液恶性肿瘤。
[0273]
在一些实施方式中，通过本公开的方法治疗的癌症为胶质母细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、膀胱癌或血液恶性肿瘤。在一些实施方式中，血液恶性肿瘤为白血病(例如，急性淋巴细胞白血病(all)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性髓性白血病(aml)、慢性髓性白血病(cml))、骨髓瘤或淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤(nhl))。
[0274]
在本文所述的治疗方法的各种实施方式中，疾病为自身免疫性疾病或病症。在一些实施方式中，自身免疫性疾病或病症为类风湿性关节炎(ra)、多发性硬化症(ms)、干燥综合征、系统性红斑狼疮、结节病、1型糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病(iddm)、自身免疫性甲状腺炎、反应性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、银屑病、血管炎、韦格纳肉芽肿、重症肌无力、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、慢性炎症性脱髓鞘多发性神经病、吉兰-巴雷综合征、克罗恩病或溃疡性结肠炎。
[0275]
当施用超过一种具有独特抗原结合特异性的多肽时，该方法可用于靶向同一疾病(例如肿瘤或自身免疫性疾病)中的多种抗原(或同一抗原中的多个表位)，或不同疾病(例如肿瘤或自身免疫性疾病)中的多种抗原。
[0276]
在一些实施方式中，经修饰的免疫效应细胞与第二多肽或编码所述第二多肽的多核苷酸或包含所述第二多肽的宿主细胞同时施用。
[0277]
在一些实施方式中，经修饰的免疫效应细胞与第二多肽或编码所述第二多肽的多核苷酸或包含所述第二多肽的宿主细胞依次施用。例如，第二多肽或编码所述第二多肽的多核苷酸或包含所述第二多肽的宿主细胞，可以在施用经修饰的宿主细胞之前或之后施用。
[0278]
在一些实施方式中，免疫效应细胞为相对于接受治疗的受试者的自体细胞。在一些实施方式中，免疫效应细胞为相对于接受治疗的受试者的同种异体细胞。当从供体分离免疫效应细胞时，该方法还可以包括预防移植物抗宿主病(gvhd)和宿主细胞排斥的方法。
[0279]
在一些实施方式中，可以在向受试者施用之前进行额外的步骤。例如，在使免疫效
应细胞与本文所述的多核苷酸或重组载体(例如编码arcar的第一多肽的多核苷酸或重组载体)接触(例如转导或转染)之后、但在向受试者施用之前，可以在体外扩增免疫效应细胞。在向受试者施用之前，体外扩增可以进行1天以上，例如，2天以上、3天以上、4天以上、6天以上或8天以上。替代地或附加地，在向受试者施用之前，体外扩增可以进行21天以下，例如18天以下、16天以下、14天以下、10天以下、7天以下或5天以下。例如，在向受试者施用之前，体外扩增可以进行1至7天、2至10天、3至5天或8至14天。
[0280]
在一些实施方式中，在体外扩增期间，可以用抗原(例如tcr抗原)刺激免疫效应宿主细胞。抗原特异性扩增可选地可以补充有在非特异性刺激淋巴细胞增殖的条件下(例如抗cd3抗体、抗tac抗体、抗cd28抗体或植物凝集素(pha))的扩增。扩增的宿主细胞可以直接施用于受试者，或者可以被冷冻以备将来使用，即用于后续施用于受试者。
[0281]
在一些实施方式中，免疫效应宿主细胞在输注到受试者之前用白细胞介素-2(il-2)离体处理，和/或在输注之后用il-2治疗受试者。此外，在一些实施方式中，患者可以在施用经修饰的宿主细胞之前进行预备淋巴细胞耗竭——免疫系统的临时清除。il-2处理和预备淋巴细胞耗竭的组合可以增强经修饰的宿主细胞的持久性。
[0282]
在一些实施方式中，用编码细胞因子的核酸转导或转染免疫效应宿主细胞，该核酸可以被工程化以提供组成型、可调节或时间控制的细胞因子表达。合适的细胞因子包括例如在收缩期起到增强t淋巴细胞存活的作用、可以促进记忆t淋巴细胞的形成和存活的细胞因子。
[0283]
在一些实施方式中，本公开的组合物(例如，宿主细胞或多肽)以治疗有效量施用。取决于受试者的身体参数、施用频率、施用方式、清除率等，在本公开的方法中施用的组合物的剂量将广泛变化。初始剂量可以较大，随后可以是较小的维持剂量。剂量可以每周或每两周地不频繁地施用，或者分成更小的剂量并且每天、每半周地施用等，以维持有效剂量水平。预期多种剂量将有效实现经修饰的宿主细胞的体内持久性。还预期多种剂量将有效改善经修饰的宿主细胞的体内效应功能。
[0284]
在一些实施方式中，包含通过本文所述的方法制备的经修饰的宿主细胞的组合物可以以如下剂量施用：102至10
10
个细胞/kg体重、105至109个细胞/kg体重、105至108个细胞/kg体重、105至107个细胞/kg体重、107至109个细胞/kg体重或107至108个细胞/kg体重，包括这些范围内的所有整数值。经修饰的宿主细胞的数量将取决于组合物预期的治疗用途。
[0285]
经修饰的宿主细胞可以以上面列出的剂量多次施用。经修饰的宿主细胞对于经历治疗的患者可以为同种异体的、同基因的、异基因的或自体的。
[0286]
还预期当用于治疗各种疾病/病症时，本公开的组合物和方法可以与适用于相同或相似疾病/病症的其他治疗方法/药剂一起使用。此类其他治疗方法/药剂可以共同施用(同时或依次)以产生叠加效应或协同效应。由于叠加作用或协同作用，每种药剂的合适的治疗有效剂量可以降低。
[0287]
在某些实施方式中，本公开的组合物(例如，宿主细胞或多肽)在施用另外的治疗剂(例如癌症治疗剂)之前或之后施用，或与另外的治疗剂(例如癌症治疗剂)基本上同时施用。另外的癌症治疗剂可以为例如化疗剂、生物剂、手术、基因治疗或放射治疗。在一些实施方式中，接受组合物的受试者未被施用足以引起免疫细胞耗竭的治疗(例如淋巴细胞耗竭化疗或放疗)。
[0288]
在任何上述治疗方法的一些实施方式中，该方法还包括向受试者施用选自如下的一种以上另外的化合物：免疫抑制剂、生物制品、益生菌、益生元和细胞因子(例如ifn或il-2)。
[0289]
在一些实施方式中，本公开的方法和组合物可以与阻断炎症(例如，通过阻断il1、infα/β、il6、tnf、il23等)的其他疗法联合。
[0290]
本公开的方法和组合物可以与其他免疫调节治疗(例如，治疗性疫苗(包括但不限于gvax、基于dc的疫苗等)、检查点抑制剂(包括但不限于阻断ctla4、pd1、lag3、tim3等的药剂)或激活剂(包括但不限于增强4-1bb、ox40等的药剂))联合。本公开的方法还可以与能够调节nkt的功能或稳定性的其他治疗(包括但不限于cd1d、cd1d-融合蛋白、cd1d二聚体或者未加载抗原或加载抗原的cd1d的更大聚合物、cd1d-嵌合抗原受体(cd1d-car)，或人中存在的五种已知cd1异构体中的任何其他异构体(cd1a、cd1b、cd1c、cd1e))联合。本公开的方法还可以与其他治疗(例如米哚妥林(midostaurin)、恩西地平(enasidenib)或它们的组合)联合。
[0291]
本公开的治疗方法还可以与另外的免疫疗法和疗法联合。例如，当用于治疗肿瘤时，本公开的组合物可以与常规疗法(例如手术、放疗、化疗或它们的组合)联合使用，这取决于肿瘤的类型、患者状况、其他健康问题以及多种因素。在某些方面，可用于与本公开的抑制剂联合治疗肿瘤的其他治疗剂包括抗血管生成剂。许多抗血管生成剂已被鉴定并且是本领域已知的，包括例如tnp-470、血小板因子4、血小板反应蛋白-1、金属蛋白酶组织抑制剂(timp1和timp2)、催乳素(16-kd片段)、血管抑制素(纤溶酶原的38-kd片段)、内皮抑素、bfgf可溶性受体、转化生长因子β、干扰素α、可溶性kdr和flt-1受体、胎盘增殖素相关蛋白，以及“carmeliet和jain(2000)”列出的那些。在一个实施方式中，本公开的经修饰的宿主细胞可以与vegf拮抗剂或vegf受体拮抗剂联合使用，所述vegf拮抗剂或vegf受体拮抗剂为例如抗vegf抗体、vegf变体、可溶性vegf受体片段、能够阻断vegf或vegfr的适体、中和抗vegfr抗体、vegfr酪氨酸激酶的抑制剂以及它们的任意组合(例如，抗hvegf抗体a4.6.1、贝伐珠单抗(bevacizumab)或雷珠单抗(ranibizumab))。
[0292]
可用于本公开的联合治疗的化疗化合物的非限制性实例包括，例如，氨鲁米特(aminoglutethimide)、安吖啶(amsacrine)、阿那曲唑(anastrozole)、天冬酰胺酶、阿扎胞苷(azacitidine)、bcg、比卡鲁胺(bicalutamide)、博来霉素(bleomycin)、布舍瑞林(buserelin)、白消安(busulfan)、喜树碱、卡培他滨(capecitabine)、卡铂、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chloranbucil)、顺铂、克拉屈滨(cladribine)、氯膦酸盐、秋水仙碱、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、放线菌素d(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地西他滨(decitabine)、二烯雌酚(dienestrol)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、多西紫杉醇(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、雌二醇、雌莫司汀(estramnustine)、依托泊苷(etoposide)、依西美坦(exemestane)、非格司亭(filgrastim)、氟达拉滨(fludarabine)、氟氢可的松(fludrocortisone)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、氟他胺(flutamide)、吉西他滨(gemcitabine)、染料木素(genistein)、戈舍瑞林(goserelin)、羟基脲(hydroxyurea)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、干扰素、伊立替康(irinotecan)、伊罗替康(ironotecan)、来曲唑
(letrozole)、亚叶酸(leucovorin)、亮丙瑞林(leuprolide)、左旋咪唑(levamisole)、洛莫司汀(lomustine)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑(melphalan)、巯嘌呤(mercaptopurine)、美司钠(mesna)、甲氨蝶呤、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、尼鲁米特(nilutamide)、诺考达唑(nocodazole)、奥曲肽(octreotide)、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸盐(pamidronate)、喷司他丁(pentostatin)、普卡霉素(plicamycin)、卟菲尔(porfimer)、丙卡巴肼(procarbazine)、雷替曲塞(raltitrexed)、利妥昔单抗(rituximab)、链佐星(streptozocin)、苏拉明、他莫昔芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide)、睾酮、硫鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、二氯二茂钛(titanocene dichloride)、拓扑替康(topotecan)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维甲酸(tretinoin)、长春碱、长春新碱、长春地辛(vindesine)和长春瑞滨(vinorelbine)。
[0293]
例如，这些化疗化合物可以根据它们的作用机制分为以下组：抗代谢物/抗肿瘤剂，例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷(floxuridine)、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)和嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖/抗有丝分裂剂，包括长春花生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)等天然产物、微管干扰剂(例如紫杉烷(紫杉醇、多西紫杉醇)、长春花新碱、长春花碱、诺考达唑、埃博霉素(epothilone)和诺维滨(navelbine)、表鬼臼毒素(epidipodophyllotoxin)(依托泊苷、替尼泊苷)；dna损伤剂(放线菌素(actinomycin)、安吖啶、蒽环类、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环磷酰胺(cytoxan)、放线菌素d、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、六甲基蜜胺奥沙利铂(hexamethyhnelamineoxaliplatin)、异环磷酰胺(iphosphamide)、美法仑、二氯甲基二乙胺(merchlorehtamine)、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲(nitrosourea)、普卡霉素、丙卡巴肼、他克唑(taxol)、泰索帝(taxotere)、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramid)和依托泊苷(vp16))；抗生素，例如放线菌素d、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星、蒽环类、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素；酶(l-天冬酰胺酶，其系统性地代谢l-天冬酰胺并剥夺没有能力合成自身天冬酰胺的细胞)；抗血小板剂；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂，例如氮芥类(二氯甲基二乙胺、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、亚乙基亚胺和甲基蜜胺(methylmelamine)(六甲基蜜胺(hexamethylmelamine)和塞替派)、烷基磺酸酯-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀(bcnu)和类似物、链佐星)、三氮烯类-达卡巴嗪(trazenes-dacarbazinine)(dtic)；抗增殖/抗有丝分裂的抗代谢物，例如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位络合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦、氨鲁米特；激素、激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝剂(肝素、合成肝素盐和其他凝血酶的抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(例如组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗；抗迁移剂；抗分泌剂(布雷菲德菌素(breveldin))；免疫抑制剂(环孢菌素、他克莫司(fk-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、咪唑硫嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(例如，tnp-470、染料木素、贝伐珠单抗)和生长因子抑制剂(例如，成纤维细胞生长因子(fgf)抑制剂)；血管紧张素受体阻滞剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mtor抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星
(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、放线菌素d、依尼泊苷、表柔比星、依托泊苷、伊达比星和米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康)、皮质类固醇(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、强的松和泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂和半胱天冬酶激活剂；以及染色质破坏剂。
[0294]
在本文描述的方法的各种实施方式中，受试者为哺乳动物。在一些实施方式中，受试者为人。受试者可以是任何年龄或性别的未成年人或成年人。实施例
[0295]
提供以下实施例以进一步描述本文公开的一些实施方式。这些实施例旨在说明所公开的实施方式。然而，应当理解，本技术不限于以下所示的示例性实施方式。实施例1：使用新型vhh标签开发arcar
[0296]
使用噬菌体展示技术或通过免疫来鉴定对非人蛋白具有特异性的新型vhh。选择候选vhh用于生产和质量控制分析。进一步测试候选vhh的特异性和交叉反应性。使用范例vhh生产抗vhh。
[0297]
使用噬菌体展示技术鉴定或通过在美洲驼或其他骆驼科动物中的免疫来产生对范例标签vhh具有特异性的抗vhh。可以使用几种市售噬菌体产品，包括tungsten、vhh和superhuman，以及scfv。选择与标签vhh的cdr或其他非框架区域结合的候选抗vhh。
[0298]
可溶性标签vhh在cho细胞中表达和产生。可溶性标签vhh通过蛋白a色谱纯化。抗vhh作为胞外标签结合结构域并入car构建体中。用慢病毒构建体转导t细胞以表达含有抗vhh结构域的car。还测试了抗vhh的特异性和交叉反应性。
[0299]
建立体外测定以通过分别评估细胞因子产生和细胞毒性来评估通过可溶性标签vhh和抗标签car的t细胞激活。选择范例arcar构建体进行进一步分析。实施例2：使用预先存在的vhh标签开发arcar
[0300]
选择结合非人蛋白的预先存在的vhh。可用于构建本公开的arcar的vhh的非限制性示例包括靶向rsv f蛋白、李斯特菌内化素、眼镜蛇磷脂酶a2、埃博拉病毒核蛋白、hsv糖蛋白d、乳球菌噬菌体rbp、嗜热脂肪地芽孢杆菌、蓖麻毒蛋白(例如v5e4)和鸡蛋清溶菌酶的vhh。vhh还可以被工程设计为通过争夺cdr来消除结合。选择候选vhh进行生产和质量控制分析。所选vhh被用于生产抗vhh。
[0301]
使用噬菌体展示技术或通过在美洲驼中的免疫来鉴定对范例标签vhh具有特异性的抗vhh。可以使用几种市售噬菌体产品，包括tungsten、vhh和superhuman，以及scfv。选择与标签vhh的cdr或其他非框架区域结合的候选抗vhh。
[0302]
可溶性标签vhh在cho细胞中表达和产生。可溶性标签vhh通过蛋白a色谱纯化。抗vhh作为胞外标签结合结构域并入慢病毒car构建体中。用慢病毒构建体转导t细胞以表达含有抗vhh结构域的car。还测试了抗vhh的特异性和交叉反应性。
[0303]
建立体外测定以通过分别评估细胞因子产生和细胞毒性来评估通过可溶性标签vhh和抗标签car的t细胞的激活。选择范例arcar构建体进行进一步分析。实施例3：具有bcma/抗bcma vhh的arcar
[0304]
为了测试arcar构想，使用了如下所列的几种方法。
[0305]
测试蛋白质的初始构想：arcar平台中的蛋白质相互作用，将抗bcma抗体与肿瘤靶向结构域抗体融合。将bcma与car的跨膜结构域融合。图3a中显示了包含bcma/抗bcma抗体
的示例性arcar。
[0306]
在另一组实验中，开发了来源于赫赛汀mab序列的scfv。鉴定的抗赫赛汀独特型mab的序列被转换为scfv形式。这些已知序列被工程改造到arcar平台中以证明该构想。将赫赛汀scfv与car融合，将赫赛汀抗id scfv与可溶性肿瘤靶向结构域抗体(例如，抗cd19 scfv或vhh)融合。图3b显示了包含赫赛汀/赫赛汀scfv的示例性arcar。在体外测试了arcar的潜在细胞毒性。
[0307]
文献中已经鉴定了几种对非人蛋白具有特异性的抗体。此类示例包括h6dyx、hp3-3、hanti-z、hhsv gd、hlp rbp、hvhh4、hsbsb和hv5e4。这些被构建成scfv或vhh形式以用于表征。根据生物物理特性选择候选物。然后针对这些结合物进行抗id活动以开发多样化的亲和力系列，从而实现围绕调节arcar亲和力的优势的构想验证。实施例4：具有赫赛汀/抗赫赛汀scfv的arcar
[0308]
在构想验证研究中，开发了来源于赫赛汀(曲妥珠单抗)mab的scfv。从抗赫赛汀独特型mab开发了另一种scfv(scfv69)。将这些序列组装成不同的car表达构建体(表5)，它们各自被包装到慢病毒载体中，并通过病毒转导在jurkat细胞或原代t细胞中表达。通过流式细胞仪以及与egfr可溶性蛋白的结合来检测car的表达。将表达car的细胞与过表达egfr的cho细胞或细胞表面天然表达egfr的细胞系结合使用，以证明egfr特异性的细胞毒性。图4a显示了示例性arcar，其中，赫赛汀scfv与car融合，赫赛汀抗-id scfv与靶向egfr的vhh(9g8)融合。图4b显示，与9g8-scfv69融合蛋白偶联的表达赫赛汀scfv car的t细胞能够靶向egfr
+
细胞。
[0309]
表5显示了产生的car表达构建体，其包含赫赛汀scfv或抗赫赛汀独特型scfv69作为胞外标签结合结构域。图5显示了用于递送car构建体的慢病毒载体的载体图谱。表6显示了赫赛汀scfv和scfv69(赫赛汀抗id)。
[0310]
用携带表5中描述的car构建体的慢病毒载体转导jurkat细胞以评估car表达和cd69激活。为了测量cd69的调节以作为激活的读数，将表达car的jurkat细胞与egfr阳性细胞共培养24和48小时。共培养后，使用抗人cd69-bv421抗体对细胞进行cd69水平的染色，并在intellicyte流式细胞仪上进行测量。还在t细胞中表达car构建体以评估细胞毒性。为了进行该测定，根据制造商的说明，使用pan t细胞分离试剂盒(miltenyi，目录号130-096-535)分离t细胞。将细胞重悬于rpmi(30u/ml的il2，10％的fbs)中，用dynabeads
tm
人t-激活剂cd3/cd28(thermofisher，目录号11132d)激活过夜。第二天，使用transdux
tm max慢病毒转导试剂(sbi，目录号lv860a-1)，用含有car表达盒的慢病毒质粒转导t细胞(图12a至12k)。将t细胞扩增7天，在第7天进行细胞毒性测定。将car阳性t细胞与用recon cell trace violet标记的靶细胞以不同比率共培养24或48小时。48小时后，在intellicyte流式细胞仪上检查细胞的活力。表5：car表达构建体car设计抗体质粒长铰链，cd28 tm 4-1bb，cd3z赫赛汀p518长铰链，cd28 tm 4-1bb，cd3zscfv69p517中等铰链，cd28 tm 4-1bb，cd3z赫赛汀p511中等铰链，cd28 tm 4-1bb，cd3zscfv69p516
长铰链，cd28 tm 4-1bb，cd3z赫赛汀p514长铰链，cd28 tm 4-1bb，cd3zscfv69p515短铰链，cd28 tm 4-1bb，cd3zscfv69p510 9g8 表6：赫赛汀、scfv69和9g8 car相关序列
[0311]
组装了四个融合蛋白(或桥蛋白)构建体(表7)，该构建体包含通过(g4s)3接头(seq id no：25)与赫赛汀scfv或抗赫赛汀独特型scfv69融合的9g8 vhh(表6)。图6a显示了用于克隆表7中描述的桥构建体的质粒的载体图谱。
[0312]
根据制造商的说明，使用expifectamine用携带表6中描述的桥构建体的质粒转染expi-293细胞，以进行蛋白质表达。纯化可溶性桥蛋白。澄清的上清液以1ml/min的速度加载到1ml的hitrap mabselect sure柱上。用20个柱体积的pbs洗柱子以去除未结合的蛋白质。用10cv的naacetate(0.1m，ph 3.5)洗脱柱子，用tris(2.5m，ph 6.5)中和样品。通过sec对蛋白质样品进行处理(polish)以去除高分子量物质。图6b显示了凝胶电泳图像，其证明了从每个构建体纯化的桥蛋白的纯度。表7：桥蛋白构建体桥设计质粒9g8-赫赛汀p522赫赛汀-9g8p5219g8-scfv69p519
scfv69-9g8p520
[0313]
进行桥蛋白与car转导的jurkat细胞结合的结合测定，以检测用scfv69-car转导的jurkat细胞与桥蛋白的两种变体(9g8_赫赛汀scfv和赫赛汀scfv 9g8)之间的结合，如图7a所示。在细胞染色测定孵育后，在intellicyte上如下检测桥蛋白结合。将car转导的jurkat细胞与桥蛋白一起孵育30分钟。孵育后，洗涤细胞，然后将细胞与生物素化的egfr一起孵育30分钟。在洗涤步骤之后，将pe标记的链霉亲和素与细胞一起孵育。桥蛋白与car转导的jurkat细胞的结合通过流式细胞术进行测定：9g8_赫赛汀scfv为65％阳性，赫赛汀scfv 9g8为45％阳性(图7b)。还反向检测了桥蛋白结合：具有scfv69_9g8桥的赫赛汀car和具有9g8_scfv69桥的赫赛汀car(数据未显示)。
[0314]
在靶细胞和表达car的t细胞之间评估细胞毒性活性。如通过流式细胞术所评估的，在egfr转导的cho细胞中检测到egfr的表达(图8a)。还在t细胞中评估了car的表达。在具有长ig-铰链设计的car(her-car(p514)和scfv69-car(p515))中观察到最高表达(图8b)。
[0315]
为了建立细胞毒性活性测定，将靶细胞(egfr转导的cho细胞和亲本cho细胞)以10,000个细胞/孔铺板，用celltrace
tm violet(ctv)标记。将car t细胞以100,000个细胞/孔铺板，car+效应细胞与靶细胞的比率(e：t)为约5：1。将car-t细胞与cho-egfr+细胞一起共培养48小时。测定中使用的对照如表8所示。使用10nm、1nm、0.1nm和0nm的桥蛋白9g8-赫赛汀(p522)和9g8-scfv69(p519)。表8：细胞毒性活性测定对照
[0316]
通用car-t细胞在与正确的桥蛋白配对时表现出cd25激活，但在与错配的桥蛋白配对时则没有(图9a、9b)。此外，通用car-t细胞在与正确的桥蛋白配对时表现出细胞毒性活性，但在与错配的桥蛋白配对时则没有(图10a、10b)。实施例5：通用car平台的vhh的鉴定
[0317]
选择vhh结合物作为发现抗独特型的潜在靶标以形成特异性的和独特的结合对，该结合对可互换地充当“标签”和“抗标签”。鉴定了已知与非人蛋白结合的一系列vhh。还获得了与鸡蛋溶菌酶(hel)结合的其他vhh。表9中提供了这些vhh和生成的质粒，表10中提供了序列(带下划线的序列表示cdr的位置)。表9：候选vhh
非人蛋白靶标质粒相应的候选vvh多肽rsv f蛋白p243seq id no：94李斯特菌内化素p279seq id no：84眼镜蛇磷脂酶a2p247seq id no：86埃博拉病毒核蛋白p246seq id no：88hsv糖蛋白dp249seq id no：90乳球菌噬菌体rbpp251seq id no：92嗜热脂肪地芽孢杆菌p250seq id no：96蓖麻毒蛋白(v5e4)p252seq id no：98lyso_cw_p01_b10p245seq id no：100lyso_cw_p01_b11p242seq id no：102lyso_cw_p01_d04p244seq id no：104lyso_cw_p01_f11p248seq id no：106lyso_cw_p01_f09p278seq id no：108lyso_cw_p01_c04p253seq id no：110表10：候选vhh序列
[0318]
组装包含表9中描述的vhh的慢病毒car表达构建体。图11a显示了用于递送vhh car的慢病毒载体的载体图谱。然后使用慢病毒载体转导jurkat细胞。在jurkat细胞上观察到10/14vhh car的稳健car表达(图11b)。所有候选vhh都作为car在jurkat细胞中以非常高的水平表达。为了确定car上存在这些vhh时是否存在任何基底信号或非特异性激活，将转导的jurkat细胞与人胚肾细胞(hek)一起孵育过夜，在第二天评估t细胞激活标志物cd69。对于所有vhhcar构建体，均没有观察到jurkat细胞的非特异性激活或只观察到jurkat细胞的低的非特异性激活(图11c、11d)，这表明在没有靶标驱动激活的情况下，car的信号很少或没有。三种抗溶菌酶vhh car与鸡溶菌酶结合并且与人无交叉反应(图11e)，证明了针对鸡的蛋白的特异性。
[0319]
基于这些数据，选择lyso_cw_p01_b11(b11)vhh和lyso_cw_p01_d04(d04)vhh用于进一步的考察，这是因为它们作为car的高表达、低基底信号和非特异性活性至无基底信号和非特异性活性，以及理想的生物物理特性(表现为它们作为可溶性蛋白的强表达)。这些vhh在car或桥蛋白中具有良好的表达。表11：b11和d04的纯化数据
[0320]
图11f显示了靶向嗜热脂肪地芽孢杆菌的vhh、靶向lyso_cw_p01_b11的vhh和靶向lyso_cw_p01_d04的vhh的氨基酸序列的比对。基于比对的序列生成共有序列。
[0321]
作为这些vhh的特异性的最终表征，测试了用b11 vhh和d04 vhh转导的car jurkat细胞，以及候选物系列的其他抗hel vhh用于与生物素化的鸡溶菌酶和人溶菌酶的结合以确保不与人溶菌酶蛋白结合。b11(p242)vhh和d04(p244)vhh均显示与鸡溶菌酶的结合，并且与人溶菌酶蛋白没有交叉反应性(图11e)。实施例6：b11 vhh和d04 vhh的人源化
[0322]
b11和d04蛋白来源于distributed bio(旧金山，加利福尼亚州)的骆驼科动物vhh噬菌体展示文库。为了限制这些vhh可能的免疫原性，它们的vhh框架区域被人源化。从本实施例开始，对b11和d04的引用是指人源化的vhh。表12：原始骆驼科vhh b11和d04的人源化版本b11和d04的人源化版本
[0323]
人源化的b11和d04经历了与骆驼科版本相似的表征步骤，以确保框架区域的人源化不会损害它们的生物物理特性、作为car的表达能力或它们存在于car上时的特性。表13：人源化b11和d04的纯化数据
[0324]
如前所述，将每个vhh car转导到jurkat细胞中。此外，将每个vhh car转导到nurkat细胞中，即jurkat细胞的nur77报告细胞系(nurkat)。该细胞系包含响应于nur77的
gfp报告基因，nur77由cd3z刺激激活并作为car激活的报告基因的转录因子。因此，在nurkat细胞中通过car的激活会导致细胞表达gfp。图13显示了用含有人源化的b11(p1649)和d04(p1648)car的慢病毒转导的nurkat细胞的car和gfp的表达。utd细胞是未经转导nurkat细胞。使用多克隆抗骆驼科动物vhh混合物(genscript)测量car的表达。这些结果表明b11和d04 vhh作为car的表达不受它们的序列人源化的影响。此外，这些car nurkat细胞中缺乏gfp表达表明人源化版本的car介导的基底信号非常少。
[0325]
为了确保每个vhh的结合特性没有因人源化而发生变化，我们测试了这些人源化的vhh car是否仍然与hel结合。图14显示了b11(p1649)和d04(p1648)car nurkat细胞用生物素化的hel染色并通过流式细胞术用链霉亲和素-apc检测的测定结果。utd是未经转导的nurkat细胞作为阴性对照。b11和d04在人源化后都保留了结合hel的能力。实施例7：针对b11和d04的抗独特型vhh的噬菌体展示筛选
[0326]
使用人源化的b11 vhh和d04 vhh进行噬菌体文库筛选，以鉴定特异性地针对每个的特异性抗-id vhh。合成的vhh噬菌体文库由四个子文库组成，主要根据它们的cdr3序列的长度进行区分，文库1(cnty1)的cdr长度最短，文库3和4(cnty3和cnty4)的cdr长度最长。
[0327]
图15显示了使用的一种筛选模式。在该方法中，通过首先耗尽针对b11-fc蛋白的文库来发现针对d04的抗独特型vhh。这样做是为了去除任何与vhh框架区和蛋白fc部分结合的噬菌体。然后将该经耗尽的噬菌体产物在生物素化的d04-fc蛋白上进行筛选。可以通过链霉亲和素分离具有任何噬菌体结合物的生物素化的d04。产生的噬菌体在细菌中被扩增，并用于具有越来越严格的筛选条件的更多轮筛选。或者，可以通过elisa测试噬菌体展示的vhh与d04或b11蛋白的结合，测序并克隆到表达载体中以进行更严格的测试。该噬菌体文库筛选方法用于鉴定d04和b11的vhh结合物。
[0328]
将该筛选模式重复4次，逐渐降低靶抗原浓度以选择高亲和力的结合物(第一轮和第二轮200nm，第三轮50nm，第四轮10nm)。最后一轮筛选的噬菌体产物用于转化细菌以得到单菌落，它们在针对靶vhh和脱靶vhh的elisa中作为周质提取物(ppe)被筛选(图16)。
[0329]
选择对它们的靶蛋白表现出特异性反应并且对脱靶蛋白几乎没有反应的ppe样品进行额外表征。鉴定出了6种独特的b11结合物和18种独特的d04结合物。这些独特的序列被克隆到fc融合物表达载体中用于进一步测试。这些蛋白的序列和序列识别号显示在表14中。表14：表达为igg1-fc融合的抗独特型
实施例8：抗独特型vhh的特异性和亲和力测试
[0330]
为了确定抗独特型的特异性和结合，通过facs针对表达b11或d04 vhh car的nurkat细胞测试fc融合蛋白。
[0331]
如图17a至17b所示，显示出几种抗独特型在一定浓度范围内与car上的vhh稳健地且特异性地结合，而与脱靶car的结合可忽略不计(例如，amd 71(结合b11)和amd 69、amd 77、amd 82、amd 84、amd 87和amd88(结合d04))。还注意到显示出非特异性结合的一些结合物，这通过与两个细胞系(amd72和amd74)结合表明。其中，选择amd 71、amd 77、amd 82、amd 84、amd 87和amd 88用于进一步的特异性测试。将生物素化的抗独特型vhh-fc融合蛋白与多种其他vhh car-nurkat进行排列，随后通过facs检测与这些细胞系的任何结合。
[0332]
图18显示了通过facs用链霉亲和素-apc检测的范例抗独特型生物素化的vhh-fc与靶car nurkat细胞和脱靶car nurkat细胞的结合。测试的细胞系包括b11、d04、p711、p712、p713、p716和亲本细胞。b11和d04细胞是分别表达b11 vhh car和d04 vhh car的car nurkat细胞。p711、712、713、716细胞是脱靶car nurkat细胞。亲本细胞是未经转导的、不表达car的nurkat细胞。对照包括非特异性地结合大多数vhh的生物素化的蛋白a、不相关的生物素化vhh-fc蛋白prot786，以及不添加生物素化蛋白。证明了范例vhh与脱靶vhh car和亲本nurkat的结合可忽略不计，同时仍与靶vhh稳健结合。
[0333]
在一些情况下，形成通用car的“标签”和“抗-标签”相互作用的基础的特定结合事件是平台安全特性的一个重要方面。此外，单独的溶菌酶vhh和抗独特型的结合事件应当不足以引起car诱导的激活。为了确定在没有使肿瘤抗原靶向vhh与可溶性蛋白融合的情况下，b11或d04与它们的可溶性抗独特型的结合是否会导致car诱导的激活，进行了过夜刺激测定，其中范例可溶性抗独特型fc融合蛋白与它们的靶car nurkat和脱靶car nurkat以及亲本nurkat一起孵育。图19a至19b显示了用10nm抗独特型vhh fc融合物孵育的nurkat细胞的过夜刺激测定结果(通过facs)。图19a显示了b11和d04car nurkat细胞以及亲本nurkat细胞在与抗独特型fc融合蛋白共培养过夜后的gfp表达。图19b显示了在过夜孵育后通过链霉亲和素-apc检测生物素化的蛋白质。对照包括pma/离子霉素(tcr交联剂，可以引起稳健的nurkat细胞激活)、生物素化蛋白a和不添加蛋白质的样品。与pma/离子霉素诱导相比，通过测量gfp表达，没有抗独特型范例在nurkat中引起可观察到的激活。过夜孵育后仍可以检
测到抗独特型，这表明，如果抗独特型确实触发了car激活，则测定中使用的抗原浓度足以在整个实验过程中引起可观察到的激活。
[0334]
通过octet获得抗id结合物与b11-his标记的vhh和d04-his标记的vhh的亲和力测量。表15：针对b11 his标签蛋白测试的抗独特型vhh fc融合蛋白的octet结果样品idkd(m)k
on
(1/ms)k
dis
(1/s)反应amd71《1.0e-122.16e+03《1.0e-070.0062amd772.08e-096.96e+051.45e-030.497amd821.25e-076.97e+058.68e-020.1718amd873.69e-061.76e+046.49e-020.1306amd887.23e-085.88e+054.25e-020.2893amd841.85e-077.90e+051.47e-010.0991prot253nanana-0.05显示的是亲和力值(kd)、结合率(k
on
)、解离率(k
dis
)以及抗独特型vhh fc融合蛋白针对b11-his蛋白的反应。表16：针对d04 his标签蛋白测试的抗独特型vhh fc融合蛋白的octet结果fc融合蛋白的octet结果显示的是亲和力值(kd)、结合率(k
on
)、解离率(k
dis
)和抗独特型vhh fc融合蛋白针对b11-his蛋白的反应。
[0335]
抗独特型蛋白表现出从2nm(amd77与d04)至3.7μm(amd87与d04)的一系列亲和力。为了通过octet验证两种最高亲和力结合物amd77(2nm)和amd88(72nm)的特异性，我们测试了每种蛋白与自身、靶vhh、脱靶vhh、来自血清的总人igg和fc-y片段的结合。表17：抗独特型amd77和amd88的octet特异性分析样品id分析物反应amd77lysod04.his0.3374amd77amd770.0493amd77amd880.2773amd77igg-0.0155amd77fc-0.009amd77prot939-0.0053amd77lysod04.fc2.6741
amd88lysod04.his0.0923amd88amd770.0229amd88amd880.1492amd88igg-0.0338amd88fc-0.0261amd88prot939-0.024amd88lysod04.fc2.1784
[0336]
针对分析物d04-his、amd77、amd88、来自血清的igg、fc-y片段、prot939(可溶性脱靶vhh-fc)和d04-fc，测试了每个样品(amd77或amd88)。表17中显示了反应值。amd77和amd88均显示出对人igg、fc和脱靶vhh-fc prot939的最小反应，同时保持对d04-his和d04-fc的强反应。amd88确实显示了对自身和amd77的反应。amd77不与自身相关。实施例9：桥蛋白设计
[0337]
桥蛋白含有vhh arcar结合物和靶向肿瘤的vhh，本实施例中具体为抗cd70和抗egfr。这些在有和没有fc结构域的情况下构建，该fc结构域将在体内作为半衰期延长剂发挥作用。为了实现通用car的特异性，桥蛋白被设计为包含选定的与d04 car配对的针对d04的抗独特型，或者d04在可溶性桥蛋白上，可溶性桥蛋白与作为car的针对d04的抗id配对。表18：没有fc的桥蛋白：vhh1-接头-vhh2
表19：具有vhh1-whitlow-vhh2-igg1 fc构建体的桥蛋白蛋白idvhh1vhh2肿瘤靶标amd99hud04_cnty1_a11cd70w_db02_g08cd70amd100hud04_cnty1_b12cd70w_db02_g08cd70amd101hud04_cnty1_d10cd70w_db02_g08cd70amd102cd70w_db02_g08hud04_cnty1_a11cd70amd103cd70w_db02_g08hud04_cnty1_b12cd70amd104cd70w_db02_g08hud04_cnty1_d10cd70amd105hulysod04cd70w_db02_g08cd70amd106cd70w_db02_g08hulysod04cd70amd107hud04_cnty1_a119g8egframd108hud04_cnty1_b129g8egframd109hud04_cnty1_d109g8egframd1109g8hud04_cnty1_a11egframd1119g8hud04_cnty1_b12egframd1129g8hud04_cnty1_d10egframd113hulysod049g8egframd1149g8hulysod04egfr表20：具有vhh-igg1 fc-(g4s)
1-vhh构建体的桥蛋白
实施例10：具有d04 car和hud04_cnty1_d10桥的t细胞细胞毒性
[0338]
为了确定通用平台是否可以通过t细胞介导细胞毒性，我们创建了桥蛋白，该桥蛋白由通过whitlow接头串联连接到靶向egfr的vhh 9g8、与igg1 fc片段融合的来自amd88蛋白的vhh(hud04_cnty1_d10)组成(表19)。用表达d04 car的原代t细胞在t细胞细胞毒性测定中测试了每种桥蛋白。表21：amd109和amd112桥蛋白的蛋白质浓度和单体百分比dna id浓度(mg/ml)单体％amd1090.3597.40amd1120.4697.34
[0339]
通过将car t细胞与用celltrace violet标记的egfr阳性细胞以1:2的效应细胞与靶细胞的比例(调整了t细胞的car阳性百分比)共培养48小时来进行杀伤测定。桥amd109(图20a)或amd112(图20b)为5nm。
[0340]
如图20a至20b所示，当桥和car“匹配”时(例如，抗独特型vhh在桥蛋白上，而它的靶vhh在car上)，在表达p1650 car的t细胞的情况下观察到egfr阳性细胞的稳健细胞毒性，其中，表达p1650 car的t细胞的car上有d04(可溶性桥蛋白上有d04的抗独特型hud04_cnty1_d10)。该细胞毒性活性与9g8 car相当。当car和桥错配时，例如使用car amd94或nons f12 car，未观察到细胞毒性。
[0341]
本发明的范围不受本文描述的具体实施方式的限制。事实上，除了本文所描述的那些之外，对本领域技术人员而言，对本发明的各种修改将基于前面的描述变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。
[0342]
本文引用的所有专利、专利申请、出版物、测试方法、文献和其他材料均通过引用整体并入本文，如同实际存在于本说明书中。

技术特征：
1.一种通用的具有适应性受体特异性组分的嵌合抗原受体(arcar)系统，所述arcar系统包含：(i)具有嵌合抗原受体的免疫效应细胞，所述嵌合抗原受体包含第一多肽，所述第一多肽包含：(a)胞外标签结合结构域，(b)跨膜结构域，和(c)至少一个胞内信号传导结构域；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包含：(a)与靶细胞上的至少一种抗原结合的抗原结合结构域，和(b)被标签结合结构域识别的标签；其中：(i)所述标签包含抗体、抗体的抗原结合片段或替代性支架，并且所述标签结合结构域包含与标签结合的抗独特型分子；或者(ii)所述标签包含与标签结合结构域结合的抗独特型分子，并且所述标签结合结构域包含抗体或抗体的抗原结合片段或替代性支架。2.根据权利要求1所述的arcar系统，其中，所述抗独特型分子与所述抗体、抗体的抗原结合片段或替代性支架的至少一个抗原结合区结合。3.根据权利要求1或2所述的arcar系统，其中，所述抗独特型分子与所述抗体或抗体的抗原结合片段的至少一个互补决定区(cdr)结合。4.根据权利要求1至3中任一项所述的arcar系统，其中，所述第二多肽的抗原结合结构域包含抗体或抗体的抗原结合片段或替代性支架。5.根据权利要求1至4中任一项所述的arcar系统，其中，所述抗独特型分子为抗独特型抗体或抗独特型抗体的抗原结合片段，或抗独特型替代性支架。6.根据权利要求1至5中任一项所述的arcar系统，其中，所述抗原结合片段为fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、scfv片段、fv片段、dsfv双抗体、vhh、vnar、单域抗体(sdab)或纳米抗体、dab片段、fd'片段、fd片段、重链可变区、分离的互补决定区(cdr)、双抗体、三抗体或十抗体。7.根据权利要求1至6中任一项所述的arcar系统，其中，所述胞外标签结合结构域、所述抗原结合结构域和所述标签中的至少一个包含单域抗体或纳米抗体。8.根据权利要求1至7中任一项所述的arcar系统，其中，所述胞外标签结合结构域、所述抗原结合结构域和所述标签中的至少一个包含vhh。9.根据权利要求1至8中任一项所述的arcar系统，其中，所述胞外标签结合结构域和所述标签各自包含vhh。10.根据权利要求1至9中任一项所述的arcar系统，其中，所述胞外标签结合结构域、所述标签和所述抗原结合结构域各自包含vhh。11.根据权利要求6至10中任一项所述的arcar系统，其中，所述抗原结合片段、所述胞外标签结合结构域、所述抗原结合结构域和所述标签中的一种以上包含与选自seq id no：84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108和110至133的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽序列。
12.根据权利要求1至6中任一项所述的arcar系统，其中，所述胞外标签结合结构域、所述抗原结合结构域和所述标签中的至少一个包含scfv。13.根据权利要求1至12中任一项所述的arcar系统，其中，所述替代性支架为affilin或centyrin。14.根据权利要求1至13中任一项所述的arcar系统，其中，所述标签包含抗体或抗体的抗原结合片段或替代性支架。15.根据权利要求14所述的arcar系统，其中，所述抗体或抗体的抗原结合片段或替代性支架与来自非人来源的多肽结合。16.根据权利要求15所述的arcar系统，其中，所述来自非人来源的多肽为呼吸道合胞病毒(rsv)f蛋白、李斯特菌内化素、眼镜蛇磷脂酶a2、埃博拉病毒核蛋白、单纯疱疹病毒(hsv)糖蛋白d、乳球菌噬菌体受体结合蛋白(rbp)、嗜热脂肪地芽孢杆菌、蓖麻毒蛋白或鸡蛋清溶菌酶。17.根据权利要求1至16中任一项所述的arcar系统，其中，所述抗原结合结构域与至少一种肿瘤抗原或自身免疫性抗原结合。18.根据权利要求17所述的arcar系统，其中，所述至少一种抗原与相同的肿瘤或自身免疫性疾病相关。19.根据权利要求17或18所述的arcar系统，其中，所述肿瘤抗原与胶质母细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、膀胱癌或血液恶性肿瘤相关。20.根据权利要求19所述的arcar系统，其中，与胶质母细胞瘤相关的肿瘤抗原为her2、egfrviii、egfr、cd133、pdgfra、fgfr1、fgfr3、met或il13rα2。21.根据权利要求19所述的arcar系统，其中，与卵巢癌相关的肿瘤抗原为folr1、fshr、muc16、muc1、间皮素、ca125、epcam、egfr、pdgfrα或b7h4。22.根据权利要求19所述的arcar系统，其中，与宫颈癌或头颈癌相关的肿瘤抗原为gd2、muc1、间皮素、her2或egfr。23.根据权利要求19所述的arcar系统，其中，与肝癌相关的肿瘤抗原为紧密连接蛋白18.2、gpc-3、epcam、cmet或afp。24.根据权利要求1至23中任一项所述的arcar系统，其中，所述抗独特型分子、所述抗体和/或抗体片段是人源化的。25.根据权利要求1至24中任一项所述的arcar系统，其中，所述跨膜结构域还包含铰链结构域。26.根据权利要求25所述的arcar系统，其中，所述跨膜结构域和/或铰链结构域来源于cd8或cd28。27.根据权利要求1至26中任一项所述的arcar系统，其中，所述至少一个胞内信号传导结构域包含cd3ζ信号传导结构域。28.根据权利要求1至27中任一项所述的arcar系统，其中，所述至少一个胞内信号传导结构域包含一个以上共刺激信号传导结构域。29.根据权利要求28所述的arcar系统，其中所述一个以上共刺激信号传导结构域来源于cd28、41bb、il2rb、cd40、ox40、cd80、cd86、cd27、icos、nkg2d、dap10、dap12或2b4(cd244)。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的arcar系统，其中，所述第二多肽包含在n-末端的抗原结合结构域和在c-末端的标签。31.根据权利要求1至29中任一项所述的arcar系统，其中，所述第二多肽包含在c-末端的抗原结合结构域和在n-末端的标签。32.根据权利要求1至31中任一项所述的arcar系统，其中，所述第二多肽为可溶性多肽。33.根据权利要求1至32中任一项所述的arcar系统，其中，所述免疫效应细胞为t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(til)、树突细胞或巨噬细胞。34.根据权利要求33所述的arcar系统，其中，所述免疫效应细胞来源于诱导性多能干细胞(ipsc)。35.根据权利要求34所述的arcar系统，其中，所述免疫效应细胞为来源于诱导性多能干细胞(ipsc)的t细胞或nk细胞。36.根据权利要求1至35中任一项所述的arcar系统，其中，所述arcar还包含一种以上多肽，所述一种以上多肽各自包含(a)与独特抗原结合的抗原结合结构域和(b)被所述第一多肽的标签结合结构域识别的标签。37.一种arcar系统，所述arcar系统包含两种以上权利要求1至36中任一项所述的arcar，其中，每种arcar包含一对独特的标签和标签结合结构域。38.一种编码权利要求1至36中任一项所述的arcar系统的第一多肽的多核苷酸。39.一种编码权利要求1至36中任一项所述的arcar系统的第二多肽的多核苷酸。40.一种编码权利要求1至36中任一项所述的arcar的第一多肽和第二多肽的多核苷酸。41.根据权利要求38至40中任一项所述的多核苷酸，其中，所述抗原结合片段、所述胞外标签结合结构域、所述抗原结合结构域和所述标签中的一种以上至少部分由多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列与选自seq id no：83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。42.一种重组载体，所述重组载体包含权利要求38至41中任一项所述的多核苷酸。43.根据权利要求42所述的重组载体，其中，所述载体为质粒。44.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含表达权利要求1至37中任一项所述的第一多肽的多核苷酸。45.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含表达权利要求1至37中任一项所述的第二多肽的多核苷酸。46.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至37中任一项所述的免疫效应细胞和药学上可接受的媒介物和/或赋形剂。47.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至37中任一项所述的第二多肽和药学上可接受的媒介物和/或赋形剂。48.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求46所述的药物组合物和权利要求47所述的药物组合物的组合。
49.一种制备权利要求44所述的宿主细胞的方法，所述方法包括将权利要求38所述的多核苷酸或包含所述多核苷酸的重组载体引入细胞中。50.一种制备权利要求45所述的宿主细胞的方法，所述方法包括将权利要求39所述的多核苷酸或包含所述多核苷酸的重组载体引入细胞中。51.一种在有需要的受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如下：(i)包含嵌合抗原受体的免疫效应细胞，所述嵌合抗原受体包含权利要求1至36中任一项所述的arcar的第一多肽，以及(ii)所述arcar的第二多肽、编码所述第二多肽的多核苷酸或包含所述第二多肽的宿主细胞。52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述第二多肽在所述免疫效应细胞之前、之后施用或与所述免疫效应细胞一起施用。53.一种在有需要的受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如下：(i)包含两种以上arcar的第一多肽的免疫效应细胞，其中，所述两种以上arcar选自权利要求37所述的arcar系统，以及(ii)所述两种以上arcar的第二多肽，或编码所述第二多肽的一种以上多核苷酸，或包含所述第二多肽的一种以上宿主细胞。54.根据权利要求51至53中任一项所述的方法，其中，所述免疫效应细胞为t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(til)、树突细胞或巨噬细胞。55.根据权利要求51至53中任一项所述的方法，其中，所述免疫效应细胞来源于ipsc。56.根据权利要求51至55中任一项所述的方法，其中，所述免疫效应细胞组成型地表达所述第一多肽。57.根据权利要求51至56中任一项所述的方法，其中，所述疾病为癌症或自身免疫性疾病。58.根据权利要求57所述的方法，其中，所述癌症为成胶质母细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、膀胱癌或恶性血液肿瘤。59.根据权利要求51至58中任一项所述的方法，其中，所述免疫效应细胞和所述第二多肽被同时施用。60.根据权利要求51至58中任一项所述的方法，其中，所述免疫效应细胞和所述第二多肽被依次施用。61.根据权利要求51至60中任一项所述的方法，其中，所述免疫效应细胞为自体细胞。62.根据权利要求51至60中任一项所述的方法，其中，所述免疫效应细胞为同种异体细胞。63.根据权利要求51至62中任一项所述的方法，其中，所述受试者为人。

技术总结
本公开提供了嵌合抗原受体(CAR)，特别是具有适应性受体特异性的CAR(arCAR)。还提供了CAR的多肽和其他相关分子、多核苷酸、载体和包含它们的细胞组合物。还提供了包含本公开的多肽、多核苷酸、载体或细胞的药物组合物，以及它们在治疗受试者的疾病中的用途。们在治疗受试者的疾病中的用途。们在治疗受试者的疾病中的用途。


技术研发人员：J
受保护的技术使用者：世纪治疗股份有限公司
技术研发日：2021.12.17
技术公布日：2023/8/24