SARS-CoV-2的检测试剂盒及SARS-CoV-2的检测方法

sars-cov-2的检测试剂盒及sars-cov-2的检测方法
技术领域
1.本发明涉及一种利用了检测信息的银扩增的sars-cov-2的检测试剂盒及sars-cov-2的检测方法。


背景技术：

2.在2020年引起流行的covid-19的原因病毒即sars(severe acute respir atory syndrome)-cov-2中，作为用于诊断的主要方法，例如，如非专利文献1所记载那样，广泛地市售了检测基因组rna的rt-pcr(反转录聚合酶链反应)。基于rt-pcr的检测为能够通过在使用反转录酶将少量的rna转换为cdna之后扩增到能够检测的浓度而检测少量的rna，并能够以高灵敏度进行确诊的检验方法。
3.另一方面，如非专利文献2所记载那样，开发了一种用于检测被认为具有基因组rna的保护功能的核衣壳蛋白(np)，并诊断covid-19的抗原检验试剂盒。抗原检验主要是检测与sars-新冠病毒的基因一起包含的蛋白的存在的检验方法，在这些检验方法中使用了基于能够简单地进行检验的免疫层析法的检测方法。
4.在专利文献1中记载了一种对2019-ncov(sars-cov-2)病毒的源自非人类动物的抗血清和/或源自非人类动物的免疫球蛋白。在专利文献2中记载了一种单克隆抗体，其为对新型新冠病毒或其衍生物的单克隆抗体，并且规定了抗原互补决定区域cdr1、cdr2及cdr3。
5.并且，在使用免疫反应进行测定的方法中，免疫层析法的操作简单且能够在短期内进行测定，因此通常被开业医生、诊所的医生更广泛利用。作为提高该免疫层析法的灵敏度的方法，在专利文献3中公开了一种技术，其中，通过使用含有银的化合物及用于银离子的还原剂增加标记粒子的尺寸，能够以高灵敏度进行检测。
6.现有技术文献
7.专利文献
8.专利文献1：中国专利公开cn111471103a号公报
9.专利文献2：中国专利公开cn111560070a号公报
10.专利文献3：日本专利第5091075号公报
11.非专利文献
12.非专利文献1：国立传染病研究所病原体检测手册2019-ncov ver.2.9.1
13.非专利文献2：医学和药学77卷6号使用了免疫层析法的新型新冠病毒sars-cov-2抗原检测试剂的开发sars-cov-2


技术实现要素：

14.发明要解决的技术课题
15.如上所述，基于作为检测基因组rna信息的方法的rt-pcr的检验与抗原检验相比灵敏度高且能够进行确诊，但是测定需要长时间而难以迅速获得结果。另一方面，通过抗原
检验的免疫层析法进行检测的方法为能够在短时间内进行测定的简单的简易检验方法，但是被指出与rt-pcr检验相比灵敏度低。
16.本发明应解决的课题在于提供一种能够简单地以更高灵敏度进行sars-co v-2的检测的、sars-cov-2的检测试剂盒及sars-cov-2的检测方法。
17.用于解决技术课题的手段
18.为了解决上述课题，本发明人等进行深入研究的结果，发现通过使用检测sars-cov-2核衣壳蛋白(np)的抗体，利用含有银的化合物及能够还原银离子的还原剂，对在上述抗体中检测的sars-cov-2核衣壳蛋白(np)的信息进行扩增，能够简单地进行高灵敏度的测定，从而完成了本发明。
19.即，根据本发明，提供以下发明。
20.＜1＞一种sars-cov-2的检测试剂盒，其包含与sars-cov-2核衣壳蛋白(np)特异性地进行反应的至少一种抗体，且特异性地检测生物试样中所包含的核衣壳蛋白(np)，其中，
21.上述抗体包含至少一种亚类为igg2b的抗体，
22.上述sars-cov-2的检测试剂盒包括：第一容器，容纳含有银的化合物；及第二容器，容纳能够还原银离子的还原剂。
23.＜2＞根据＜1＞所述的sars-cov-2的检测试剂盒，其中，
24.上述抗体为片段化抗体。
25.＜3＞根据＜2＞所述的sars-cov-2的检测试剂盒，其中，
26.上述片段化抗体为通过蛋白酶处理制作的抗体。
27.＜4＞根据＜1＞至＜3＞中任一项所述的sars-cov-2的检测试剂盒，其中，
28.上述抗体利用标记物质来标记，利用含有银的化合物和能够还原银离子的还原剂，对基于标记物质的信息进行扩增并进行检测。
29.＜5＞根据＜4＞所述的sars-cov-2的检测试剂盒，其中，
30.上述标记物质为金胶体。
31.＜6＞根据＜1＞至＜5＞中任一项所述的sars-cov-2的检测试剂盒，其中，
32.上述还原剂为fe
2+
的金属盐。
33.＜7＞根据＜1＞至＜6＞中任一项所述的sars-cov-2的检测试剂盒，其还包含不溶性载体。
34.＜8＞根据＜7＞所述的sars-cov-2的检测试剂盒，其中，
35.上述不溶性载体具有捕获被检物质的捕获区域和检测还原剂的显色区域。
36.＜9＞一种sars-cov-2的检测方法，其使用了与sars-cov-2核衣壳蛋白(np)特异性地进行反应的至少一种抗体，且特异性地检测生物试样中所包含的核衣壳蛋白(np)，其中，
37.作为上述抗体，使用至少一种亚类为igg2b的抗体，
38.上述检测的方法包括如下步骤：利用含有银的化合物和能够还原银离子的还原剂，对核衣壳蛋白(np)的检测信息进行扩增。
39.＜10＞根据＜9＞所述的sars-cov-2的检测方法，其中，
40.上述抗体为片段化抗体。
41.＜11＞根据＜10＞所述的sars-cov-2的检测方法，其中，
42.上述片段化抗体为通过蛋白酶处理制作的抗体。
43.＜12＞根据＜9＞至＜11＞中任一项所述的sars-cov-2的检测方法，其中，
44.上述抗体利用标记物质来标记，利用含有银的化合物和能够还原银离子的还原剂，对基于标记物质的信息进行扩增并进行检测。
45.＜13＞根据＜12＞所述的sars-cov-2的检测方法，其中，
46.上述标记物质为金胶体。
47.＜14＞根据＜9＞至＜13＞中任一项所述的sars-cov-2的检测方法，其中，
48.上述还原剂为fe
2+
的金属盐。
49.＜15＞根据＜9＞至＜14＞中任一项所述的sars-cov-2的检测方法，其中，
50.上述检测方法为免疫层析法。
51.发明效果
52.根据本发明的sars-cov-2的检测试剂盒及sars-cov-2的检测方法，能够简单地以高灵敏度检测sars-cov-2。
附图说明
53.图1是表示本发明的免疫层析试剂盒的一实施方式的方式的立体图。
54.图2是表示本发明的免疫层析试剂盒的一实施方式的方式的分解概略立体图。
55.图3是表示检验用试纸条、第1罐及第2罐的位置关系的示意侧视图。
具体实施方式
56.以下，对本发明的实施方式进行详细说明。
57.在本发明中，使用“～”来表示的数值范围是指将“～”的前后所记载的数值分别作为最小值及最大值而包含的范围。
58.(1)新冠病毒
59.在本发明中成为检测对象的新型新冠病毒属于网巢病毒目，且为具有囊膜和长度约为30kbp的大基因组的单股正链rna病毒。其名称为sars-cov-2，由who(世界卫生组织)将由该新型新冠病毒引起的感染症的正式名称命名为“covid-19”。作为构成该sars-cov-2的蛋白，已知包含纤突(s)蛋白、囊膜(e)蛋白、膜(m)蛋白、核衣壳(n)蛋白的至少4个结构蛋白。其中的核衣壳(n)蛋白具有将病毒的囊膜内的病毒rna基因组封装成称为衣壳的核糖核蛋白复合体的功能，且为免疫原性的磷酸蛋白，并具有序列的保存性和强免疫原性。
60.(2)抗原
61.上述4个结构蛋白能够用于抗原，但是在本发明中，作为免疫原性的磷酸蛋白，具有序列的保存性和强免疫原性，因此将核衣壳(n)蛋白用作检测对象的抗原。
62.(3)抗体
63.本发明中所使用的抗体为对核衣壳(n)蛋白的抗体。不限于该蛋白，通常抗体的亚类能够分类为iga、igd、ige、igm、igg这5个类别，其中，igg在血清中被认为最丰富的抗体类别中进一步分类为5种亚类(igg1、igg2a、ig g2b、igg3、igg4)。在这些亚类中，作为能够高灵敏度地检测成为抗原的核衣壳蛋白(以下，也称为np)的抗体，在本发明中使用至少一种
亚类为igg2b的抗np抗体。
64.(4)抗体的制造
65.作为抗体，可以使用由通过抗原(被检物质)免疫的动物的血清制备的抗血清或由抗血清纯化的免疫球蛋白分离。即，通过使实验动物免疫抗原，能够利用在血清中产生的多克隆抗体。
66.或者，也可以利用通过使从在腹腔内通过抗原免疫的动物的脾脏采集的b细胞或包含b细胞的细胞组与骨髓瘤细胞融合而获得的融合细胞(杂交瘤)所产生的单克隆抗体。或者，也可以利用通过将质粒导入到宿主细胞而由细胞产生的单克隆抗体。在本发明中，优选使用产生单克隆抗体的方法。
67.(5)抗体的片段化
68.也优选利用通过将如上所述那样获取的抗体进行片段化而获得的片段化抗体[例如，f(ab’)2、fab、fab’、或fv]。
[0069]
作为片段化抗体，能够使用通过蛋白酶处理制作的抗体。作为片段化抗体的制作方法，代表性方法为以下两种。首先，在用木瓜蛋白酶对抗体进行了处理的情况下，分解为2个fab片段和1个fc片段。并且，在用胃蛋白酶对抗体进行了处理的情况下，分解为2个fab片段结合的f(ab’)2和片段化的fc片段。而且，f(ab’)2也能够通过用2-巯基乙胺等还原剂进行处理而作为fa b’。除了这些以外，作为制作片段化抗体的酶，还有无花果蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶、v8蛋白酶、菠罗蛋白酶、梭菌蛋白酶、金属内肽酶、将木瓜蛋白酶进行了活化处理的活化木瓜蛋白酶等。在通过这些酶处理获得的fab片段和f(ab’)2片段及fab’片段有抗原结合部位，但是去除了不需要的fc片段。因此，通过在抗原检测中使用这些片段，非特异吸附减少且噪声也减少。本发明中所使用的片段化抗体不限定于通过上述方法来制作，只要是去除了fc片段的抗体，则均能够使用。
[0070]
(6)免疫层析法
[0071]
在本发明的一例中，能够在免疫层析法中扩增检测信息(检测信号)。通常，免疫层析法是指通过如下方法简便且迅速并且特异性地对被检物质进行判定、测定的方法，并且为使用标记物质的信息作为检测信息的方法。更具体而言，为以下所记载的方法。即，将具备包括至少1个具有能够与被检物质结合的结合物质(相当于能够与被检物质结合的第二结合物质或具有对下述第一结合物质的结合性的物质。具体而言，为抗体、抗原等)的检验区域的标记物质捕获区域的层析载体(不溶性载体的一部分)用作固定相。在该层析载体上，使包含由能够与被检物质结合的第一结合物质修饰的标记物质的液作为移动相进行层析移动。由此，被检物质与标记物质一边特异性地结合，一边到达具有检验区域的标记物质捕获区域。在标记物质捕获区域的检验区域中，被检物质和标记物质的复合体与固定的结合物质(第二结合物质或具有对第一结合物质的结合性的物质)特异性地结合，由此仅在被检试样中存在被检物质的情况下，在结合物质(第二结合物质或具有对第一结合物质的结合性的物质)中浓缩有标记物质。通过肉眼观察或使用适当的设备测定标记量，定性及定量地分析在被检试样中存在被检物质。
[0072]
在本发明中的免疫层析方法中，在标记物质捕获区域的检验区域中，被检物质和标记物质的复合体与固定的结合物质(第二结合物质或具有对第一结合物质的结合性的物质)特异性地结合之后，使用清洗液清洗反应部位，然后，使用扩增液对信号进行扩增。使用
为了对标记物质的信号进行扩增而使用的扩增试剂(优选为两种扩增试剂，例如优选为能够还原银离子的还原剂及含有银的化合物)，将与标记物质捕获区域上的固定化试剂结合的被检物质和标记物质的复合体作为核，通过扩增反应对信号进行扩增，其结果，能够实现高灵敏度化。根据本发明，能够通过迅速的高灵敏度层析实施测定。
[0073]
(7)被检试样
[0074]
作为本发明的检测试剂盒及检测方法中的被检试样，能够使用包含新型新冠病毒sars-cov-2的病毒的生物试样(例如，鼻水、鼻涕或唾液等)。作为被检物质，优选为能够检测新型新冠病毒sars-cov-2的物质，能够检测核蛋白即核衣壳蛋白(np)作为被检物质。已知在新冠病毒中包含纤突(s)蛋白、囊膜(e)蛋白、膜(m)蛋白、核衣壳(n)蛋白的至少4个结构蛋白，其中的核衣壳(n)蛋白为免疫原性的磷酸蛋白，与病毒基因组复制、细胞信号传递调节有关。核衣壳(n)蛋白因序列的保存性和强免疫原性而被选择为诊断的被检物质。
[0075]
(8)被检试样的预处理
[0076]
在本发明中，能够将被检试样原样使用、或者以使用适当的提取用溶剂提取被检试样而获得的提取液的形式、或者使用适当的稀释剂稀释提取液而获得的稀释液的形式、或者通过适当的方法浓缩提取液的形式使用。作为本发明中所使用的提取用溶剂，也能够使用一般的免疫学分析法中所使用的溶剂(例如，水、生理食盐水或缓冲液等)、或者通过使用该溶剂进行稀释而能够直接实施抗原抗体反应的水混和性有机溶剂。
[0077]
(9)结构
[0078]
在免疫层析方法中实施本发明时的免疫层析用试剂盒中，能够组装使用层析用试纸条。作为能够使用的层析用试纸条，只要是能够用于一般的免疫层析法的层析用试纸条，则并无特别限定。
[0079]
作为能够在本发明中使用的层析用试纸条，从包含被检物质的被检试样的展开方向的上游方向朝向下游方向，具有标记物质保持区域、标记物质捕获区域。例如，优选使用将试样添加垫、具有标记物质保持区域的标记物质保持垫(例如，金胶体抗体保持垫)、作为不溶性载体的结合物质固定化膜(例如，具有标记物质捕获区域的层析载体)及吸收垫依次配置于粘结片上的方式。作为固定有结合物质的层析载体(不溶性载体)，具备具有至少1个固定有与被检物质特异性地结合的抗体或抗原的反应部位即检验区域(也称为测试线)的区域即标记物质捕获区域，根据需要，还可以具备具有至少1个固定有控制用抗体或抗原的确认区域(也称为控制区域)的区域。而且，也可以在标记物质捕获区域的下游具有扩增指标区域。
[0080]
能够在本发明中使用的具有标记物质保持区域的标记物质保持垫能够通过如下方式来制备：制备包含标记物质的悬浊液，将该悬浊液涂布于适当的吸收垫(例如，玻璃纤维垫)之后，对其进行干燥。
[0081]
(9-1)标记物质
[0082]
作为本发明中所使用的标记物质(用于标记与被检物质(抗原)特异性地结合的第一结合物质的标记)，优选使用包含金属的标记物质。作为能够在本发明中使用的金属的种类，能够优选使用金、银、铂的贵金属、铁、铅、铜、镉、铋、锑、锡或汞，进一步优选为金、银、铂的贵金属。作为能够在本发明中使用的包含金属的标记物质的优选方式，能够使用金属胶体标记或金属硫化物标记。作为金属胶体标记，能够优选使用铂胶体、金胶体、银胶体、铁胶
体或氢氧化铝胶体等，作为金属硫化物标记，能够优选使用铁、银、铅、铜、镉、铋、锑、锡或汞的各硫化物。在本发明中，能够进一步优选使用铂胶体、金胶体、银胶体，能够最优选使用金胶体。在使用金胶体粒子作为金属胶体标记的情况下，可以使用市售的金胶体粒子。或者，能够通过常规方法、例如用柠檬酸钠还原氯金酸的方法(nature physical science，241(1973)20等)制备金胶体粒子。
[0083]
作为金属胶体的平均粒径，优选约1nm～500nm，进一步优选3～100nm，尤其优选5～60nm。本发明中所使用的金属胶体的平均粒径能够利用市售的粒度分布计等来测量。作为粒度分布的测定法，已知有光学显微镜法、共焦激光显微镜法、电子显微镜法、原子力显微镜法、静态光散射法、激光衍射法、动态光散射法、离心沉降法、电脉冲测量法、层析法、超声波衰减法等，与各原理对应的装置已有市售。
[0084]
从粒径范围及测定的容易度出发，在本发明中能够优选使用动态光散射法。作为使用了动态光散射的市售的测定装置，可举出nanotrac upa(nikkisoco.,ltd.)、动态光散射式粒径分布测定装置lb-550(horiba,ltd.)、浓厚系粒径分析仪fpar-1000(otsuka electronics co.,ltd)等，在本发明中，作为在25℃的测定温度下测定的中值粒径(d＝50)的值求出。
[0085]
在使用金属胶体标记或金属硫化物标记、其他金属合金标记(以下，有时称为金属系标记)或包含金属的聚合物粒子标记作为检测用标记物质的层析中，其特征在于，扩增金属系标记的信号。具体而言，若在形成被检物质与标记物质的复合体之后，使从无机银盐、有机银盐等含有银的化合物供给的银离子与能够还原银离子的还原剂接触，通过还原剂还原银离子而生成银粒子，则该银粒子将金属系标记作为核沉积在金属系标记上，因此金属系标记被扩增，能够高灵敏度地实施被检物质的分析。因此，在本发明的免疫层析方法中，除了使用通过还原剂对银离子的还原作用而产生的银粒子，实施沉积在免疫复合体的标记上的反应，并分析如此扩增的信号以外，除此以外的点能够直接应用以往公知的层析法。
[0086]
(9-2)结合物质
[0087]
标记物质由能够与被检物质结合的第一结合物质修饰。作为第一结合物质，只要是例如对被检物质(抗原)的抗体、对被检物质(抗体)的抗原、对被检物质(蛋白、低分子化合物等)的适体等、对被检物质具有亲和性的化合物，则能够使用，但是在本发明中优选使用与sars-cov-2核衣壳蛋白(np)特异性地进行反应的抗体。在本发明中，作为下述叙述的第二结合物质和第一结合物质中的至少一者，使用抗体的亚类为igg2b的抗体。
[0088]
本发明的检测试剂盒优选具有不溶性载体(层析载体)，在该试纸条中具有标记物质捕获区域。在该标记物质捕获区域中具备具有能够与被检物质结合的第二结合物质的检验区域，优选还具备包含具有对第一结合物质的结合性的结合物质的确认区域的方式。
[0089]
作为能够与被检物质结合的第二结合物质，只要是例如对被检物质(抗原)的抗体、对被检物质(抗体)的抗原、对被检物质(蛋白、低分子化合物等)的适体等、对被检物质具有亲和性的化合物，则能够使用，但是在本发明中优选使用与sars-cov-2核衣壳蛋白(np)特异性地进行反应的抗体。
[0090]
在本发明中，作为上述的第一结合物质和第二结合物质中的至少一者，使用抗体的亚类为igg2b的抗体。并且，第二结合物质与第一结合物质可以不同，也可以相同。具有对第一结合物质的结合性的物质可以是被检物质其本身，也可以是具有第一结合物质识别的
部位的化合物，例如可举出如使被检物质的衍生物与蛋白(例如，bsa(bovine serum albumin(牛血清白蛋白)等)结合的化合物等。
[0091]
优选第一结合物质为抗体和/或第二结合物质为抗体。更优选，第一结合物质为与sars-cov-2核衣壳蛋白(np)特异性地进行反应的抗体，第二结合物质为与sars-cov-2核衣壳蛋白(np)特异性地进行反应的抗体。
[0092]
并且，也优选在本发明的不溶性载体的标记物质捕获区域中具有扩增指标区域的方式。扩增指标区域为判定与后述的扩增试剂进行反应并显色或颜色改变而扩增试剂的展开到达扩增指标区域的区域。扩增指标区域优选为检测还原剂的显色区域。例如，在使用硝酸铁水溶液和柠檬酸(fujifilm wako pure chemical corporation制造，038-06925)的混合水溶液作为第2扩增液的情况下，优选由将溴甲酚绿(fujifilm wako pure chemical corporation制造)固定为线状的显色试剂固定线构成扩增指标区域的方式。此时，若第2扩增液到达扩增指标区域，则区域从绿色改变为橙色。该变色能够作为扩增指标区域及展开到该扩增指标区域的区域被第2扩增液充分填充的指标而获取。
[0093]
在本发明中，作为使用第一结合物质修饰标记物质的方法中的、例如使金属胶体与特异结合物质结合的方法，可举出以下所记载的以往公知的方法(例如the journal of histochemistry and cytochemistry，30,7,(1982)691-696)。作为具体例，将金属胶体与特异结合物质(例如抗体)在适当的缓冲液中在室温下混合5分钟以上。反应之后，使通过离心分离获得的沉淀分散于包含聚乙二醇等分散剂的溶液中，由此能够获得目标物质。
[0094]
(9-3)不溶性载体
[0095]
作为能够在本发明中使用的不溶性载体，优选多孔性载体。尤其，优选硝酸纤维素膜、纤维素膜、乙酰纤维素膜、聚砜膜、聚醚砜膜、尼龙膜、玻璃纤维、无纺布、布或线等，更优选硝酸纤维素膜。
[0096]
在本发明中，优选在不溶性载体的标记物质捕获区域中具有能够与被检物质结合的第二结合物质，具备固定有具有对第一结合物质的结合性的物质的确认区域。能够与被检物质结合的第二结合物质或具有对第一结合物质的结合性的物质可以通过物理或化学结合直接固定于不溶性载体的一部分而形成标记物质捕获区域，或者也可以与胶乳粒子等微粒物理或化学结合，使该微粒捕获在不溶性载体的一部分并进行固定，而形成标记物质捕获区域。另外，不溶性载体优选在固定第二结合物质或具有对第一结合物质的结合性的物质之后，通过基于非活性蛋白的处理等实施非特异性吸附防止处理来使用。本发明的不溶性载体也能够优选使用具有多种检验区域的方式，而且作为标记物质捕获区域的一部分，根据需要，也可以具有上述确认区域。
[0097]
(9-4)标记物质保持垫
[0098]
不溶性载体优选组装使用具有标记物质保持区域的标记物质保持垫。作为标记物质保持垫，可举出保持金胶体的垫。作为标记物质保持垫的材料，例如，能够优选使用纤维素滤纸、玻璃纤维及无纺布等。关于标记物质保持垫，能够在上述材料中含浸一定量的如前述那样制备的标记物质，接着使其干燥来制作。
[0099]
(9-5)试样添加垫
[0100]
不溶性载体优选进一步组装使用试样添加垫。试样添加垫优选不仅接收包含所添加的被检物质的试样(被检试样)，还兼具过滤试样中的不溶物粒子等的功能的方式。作为
试样添加垫的材质，可举出纤维素滤纸、玻璃纤维、聚氨酯、聚乙酸酯、乙酸纤维素、尼龙及棉布等具有均匀的特性的材质。并且，在分析时，为了防止试样中的被检物质非特异性地吸附于试样添加垫的材质，降低分析的精度，构成试样添加部的材质也能够预先进行非特异性吸附防止处理来使用。在本发明中，试样添加垫也可以兼作在(9-4)中叙述的具有标记物质保持区域的标记物质保持垫。
[0101]
(9-6)吸收垫
[0102]
在本发明中，能够将吸收垫优选组装到不溶性载体来使用。吸收垫是物理吸收层析移动的、所添加的被检试样，并且吸收去除未捕获在层析载体的反应部位的标记物质等的部位，可使用纤维素滤纸、无纺布、布、乙酸纤维素等吸水性材料。所添加的被检试样层析移动并到达吸收垫之后的层析移动的速度根据吸收垫的材质、大小等而不同，因此能够通过其选定设定与被检物质的测定匹配的速度。
[0103]
(10)清洗液(第2扩增液)
[0104]
在本发明中，清洗液为具有清洗除特异性结合反应以外在不溶性载体中残留的(即，非特异性地残留的)标记物质的功能的液，为了提高清洗效果，可以调整其ph、或者使用加入了表面活性剂成分、bsa等蛋白等高分子化合物的清洗液。在本发明中，作为清洗液，优选使用以下说明的含有能够还原银离子的还原剂的液。此时，所使用的两种扩增液(将在后面叙述)中的一种扩增液也起到作为清洗液的作用。
[0105]
清洗液在展开中途一边清洗非特异性地残留的标记物质一边展开，因此一边包含标记化物质一边被展开，但是为了提高清洗效果，展开之前的清洗液优选使用不含标记物质的液。
[0106]
清洗液在展开被检试样(被检体液)之后，添加到不溶性载体中，清洗残留于不溶性载体中的、除了通过特异性结合反应结合的标记物质以外的标记物质。作为清洗液的送液方法，可以是如下方法：在展开被检体液之后直接添加到试样滴加部中；预先将用于输送清洗液的送液用不溶性载体(清洗液添加垫)、吸收用不溶性载体(吸水垫)附着于不溶性载体，添加到该送液用不溶性载体中并向吸收用不溶性载体方向送液；预先在不溶性载体具备清洗液的添加部位，在展开被检体液之后在该清洗液的添加部位添加清洗液；或在不溶性载体上展开被检体液之后将用于输送清洗液的送液用不溶性载体、吸收用不溶性载体附着于不溶性载体。
[0107]
在本发明中，被检试样(被检体液)的展开方向与清洗液的展开方向所形成的角度并无特别限定，能够在0度至180度内进行，但是优选在0度至90度内进行。对于送液用不溶性载体，只要能够添加清洗液，则并无特别限制，能够使用玻璃纤维垫、纤维素膜、硝酸纤维素膜等。对于吸收用不溶性载体，只要是能够吸水的物质，则并无特别限制，能够使用纤维素、硝酸纤维素、玻璃纤维、它们的混合物等。
[0108]
(11)免疫检验的方法
[0109]
以下，关于免疫层析方法，对作为其具体实施方式的夹心法进行说明。
[0110]
在夹心法中，并无特别限定，但是例如能够通过以下步骤实施被检物质的分析。首先，通过上述叙述的方法预先制备对被检物质(抗原)具有特异性的第一结合物质(例如，第1抗体)及第二结合物质(例如，第2抗体)。并且，利用第一结合物质预先修饰标记物质。若将第二结合物质固定于适当的不溶性载体(例如，硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜、尼龙膜、或纤维
素膜等)上而作为标记物质捕获区域的检测区域，使其与有可能包含被检物质(抗原)的被检试样(或其提取液)接触，则在该被检试样中存在被检物质的情况下，引起与第二结合物质的结合(例如，与第二抗体的抗原抗体反应)。若在被检物质和第二结合物质结合的同时或结合之后，进一步使由第一结合物质修饰的标记物质过量接触，则在被检试样中存在被检物质的情况下，形成包含固定的第二结合物质、被检物质(抗原)及由第一结合物质修饰的标记物质的复合体。
[0111]
在夹心法中，在固定的第二结合物质与被检物质(抗原)及被检物质与修饰有标记物质的第一结合物质的反应结束之后，去除未形成免疫复合体的标记物质，接着，例如能够直接观察不溶性载体的标记物质捕获区域，检测或定量该标记物质，判定在被检试样中有无被检物质或测定其量。在本发明中，例如，通过供给还原剂及含银离子化合物，对来自形成该复合体的标记物质的信号进行扩增并检测。
[0112]
(12)扩增液
[0113]
本发明中所使用的扩增液为含有扩增试剂的液。扩增试剂为通过标记物质或被检物质的作用来进行催化反应，由此能够产生着色的化合物、发光等并引起信号的扩增的试剂，能够以含有试剂的溶液的状态即作为扩增液来使用。例如，可举出在金属标记上通过物理显影引起金属银的析出的银离子溶液、通过过氧化物酶标记与过氧化氢的作用成为色素的、苯二胺化合物与萘酚化合物的溶液等。
[0114]
详细而言，能够将如记载于照片化学领域中的一般书籍(例如，“修订照片工学的基础-银盐照片编
‑”
(日本照片学会编、corona publishing co.,ltd.)、“照片的化学”(笹井明，照片工业出版社)、“最新处方手册”(菊池真一他，amiko publishing co.,ltd.))中的所谓的显影液用作含有扩增试剂的扩增液。即，只要是在液中包含银离子，液中的银离子以如成为显影的核的金属胶体等为中心被还原的、所谓的物理显影液，则能够并无特别限定地用作扩增液。
[0115]
在本发明中，能够使用两种扩增试剂。优选在为了对在标记物质捕获区域中捕获的标记物质的信号进行扩增而使用的两种扩增试剂中，在第1扩增液中含有第1扩增试剂，在第2扩增液中含有第2扩增试剂，并通过依次添加第2扩增液及第1扩增液来进行扩增。
[0116]
作为扩增液的具体例，能够使用包含能够还原银离子的还原剂的第2扩增液及包含含有银的化合物的第1扩增液的组合。
[0117]
以下，对第2扩增液中所包含的能够还原银离子的还原剂和第1扩增液中所包含的含有银的化合物等进行说明。
[0118]
(12-1)含有银的化合物
[0119]
作为含有银的化合物，能够使用含银离子化合物、例如有机银盐、无机银盐或者银络合物。优选为对水等溶剂溶解度高的含银离子化合物，可举出硝酸银、乙酸银、乳酸银、丁酸银、硫代硫酸银等。尤其优选为硝酸银。作为银络合物，优选在具有羟基、砜基等水溶性基团的配体上配位的银络合物，可举出羟基硫醚银等。
[0120]
优选无机银盐或者银络合物作为银通常含有0.001摩尔/m2～0.2摩尔/m2、优选为0.01摩尔/m2～0.05摩尔/m2。
[0121]
(12-2)能够还原银离子的还原剂
[0122]
能够还原银离子的还原剂只要能够将银离子还原为银，则能够使用无机/有机的
任何材料或其混合物。
[0123]
作为无机还原剂，能够优选举出通过fe
2+
、v
2+
、ti
3+
等金属离子能够改变原子价的还原性金属盐、还原性金属络合物盐。在使用无机还原剂时，需要将被氧化的离子进行络合形成或进行还原而去除或使其无害。例如，在使用fe
2+
作为还原剂的体系中，能够使用柠檬酸、edta形成作为氧化物的fe
3+
的络合物，使其无害。在本体系中，优选使用这种无机还原剂，更优选fe
2+
的金属盐。
[0124]
另外，也能够使用在湿式卤化银照相感光材料中所使用的显影主剂(例如没食子酸甲酯盐、氢醌、取代氢醌、3-吡唑烷酮类、对氨基苯酚类、对苯二胺类、受阻酚类、偕胺肟类、吖嗪类、邻苯二酚类、邻苯三酚类、抗坏血酸(或其衍生物)及无色色素类)及对于本领域的技术人员来说显而易见的其他材料、例如在美国专利第6,020,117号中记载的材料。
[0125]
作为还原剂，也优选抗坏血酸还原剂。有用的抗坏血酸还原剂包含抗坏血酸和类似物、异构体和其衍生物，例如，能够优选举出d-或l-抗坏血酸和其糖衍生物(例如γ-乳糖酸抗坏血酸、葡糖酸抗坏血酸、藻酸抗坏血酸、葡庚糖酸抗坏血酸、麦芽糖酸抗坏血酸)、抗坏血酸的钠盐、抗坏血酸的钾盐、异抗坏血酸(或l-红霉素抗坏血酸)、其盐(例如碱金属盐、铵盐或该技术领域中已知的盐)、烯二醇型抗坏血酸、烯胺醇型抗坏血酸、硫醇烯醇型抗坏血酸等，尤其优选d、l或d，l-抗坏血酸(和其碱金属盐)或异抗坏血酸(或其碱金属盐)，钠盐为优选的盐。根据需要，能够使用这些还原剂的混合物。
[0126]
(13)其他助剂
[0127]
作为扩增液的其他助剂，有时包含缓冲剂、防腐剂(例如抗氧化剂或有机稳定剂)、速度调节剂。作为缓冲剂，例如能够使用乙酸、柠檬酸、氢氧化钠或它们中的某一种盐或使用了三(羟甲基)氨基甲烷的缓冲剂、其他一般的化学实验中所使用的缓冲剂。适当使用这些缓冲剂，能够调整至最适合该扩增液的ph。并且，作为防雾剂，能够使用烷基胺作为添加剂，尤其优选为十二烷基胺。并且，为了提高这些添加剂的溶解性，能够使用表面活性剂，尤其优选为c9h
19-c6h
4-o-(ch2ch2o)
50
h。
[0128]
作为将扩增试剂点加于免疫层析用试剂盒的方法，优选在用于输送还原剂溶液的垫上点加作为第2扩增液的还原剂溶液并将还原剂溶液输送到标记物质捕获区域，将作为第1扩增液的银离子溶液从不溶性载体的上部点加于包括标记物质捕获区域的区域，使银离子溶液在不溶性载体的厚度方向上浸润的方法。
[0129]
作为将两种扩增试剂内置于免疫层析用试剂盒的方法，可举出将包含还原剂溶液的第2扩增液储存罐(第二容器)、第1扩增液储存罐(第一容器)作为包含各扩增试剂的罐(容器)配置于点加各扩增试剂的部位的上部的方法。可举出如下方式：将包含还原剂溶液的第2扩增液储存罐(第二容器)放置于用于输送还原剂溶液的垫的上部，将包含银离子溶液(第1扩增液)的第1扩增液储存罐(第一容器)设置于银离子溶液填充孔的正上部。关于更详细的添加方法，能够通过如日本专利第5276568号公报的图1中所记载的器件那样配置，通过按压各罐而使液流动，点加于规定的部位。
[0130]
作为将扩增试剂点加于免疫层析用试剂盒的另一种方法，将包含还原剂溶液的第2扩增液储存罐相对于试样添加垫设置于相当于成为与标记物质捕获区域相反的一侧的不溶性载体的端部的部分，通过将还原剂溶液供给到不溶性载体，使其在与被检试样的展开方向相同的方向上迟于被检试样而展开。可举出如下方式：在用还原剂液填充标记物质捕
获区域之后，将作为第1扩增液的银离子溶液从不溶性载体的上部点加于标记物质捕获区域并使其在不溶性载体的厚度方向上浸润。关于更详细的添加方法，能够通过如日本专利第6570652号公报的图1～图8中所记载的器件那样配置，通过按压各凸状变形部而使液流动，点加于规定的位置。
[0131]
(14)免疫层析用试剂盒
[0132]
本发明的检测方法能够使用免疫层析用试剂盒来实施，该免疫层析用试剂盒具备：标记物质，由能够与被检物质结合的第一结合物质修饰；及不溶性载体，包含能够与被检物质结合的第二结合物质或具有对能够与被检物质结合的第一结合物质的结合性的物质。此时，免疫层析用试剂盒可以预先在不溶性载体上具备由能够与被检物质结合的第一结合物质修饰的标记物质。或者，也可以与不溶性载体分开具备由能够与被检物质结合的第一结合物质修饰的标记物质。此时，能够通过在将与不溶性载体分开具备的标记物质与被检试样进行混合之后在不溶性载体上展开等方法进行测定。本发明的免疫层析用试剂盒具备清洗液及扩增液，能够优选具备：第1扩增液，包含含有银的化合物；及第2扩增液，兼具作为包含能够还原银离子的还原剂的清洗液的功能。构成免疫层析用试剂盒的各材料的例子、优选范围能够优选使用免疫层析方法等中所记载的例子、范围。
[0133]
根据以下实施例对本发明进一步具体地进行说明，但是本发明不受实施例的限定。
[0134]
实施例
[0135]
实施例的免疫层析试剂盒为用以检测np抗原的sars-cov-2抗原检测用免疫层析试剂盒。
[0136]
实验a
[0137]
＜1＞抗np单克隆抗体的制备
[0138]
(1)小鼠的免疫及杂交瘤细胞的制作
[0139]
将纯化完毕的300μg抗原蛋白(具有序列号1中所记载的氨基酸序列的蛋白)与弗氏佐剂进行混合并使其乳化，对balb/c小鼠皮下注射多次(每一次给药300μg的抗原蛋白)而免疫。在1个月后从免疫的小鼠回收b细胞，并使用聚乙二醇溶液与骨髓瘤细胞进行了融合。将融合的杂交瘤细胞与选择培养基一起播种到96孔微孔板上。
[0140]
(2)杂交瘤细胞的筛选和克隆
[0141]
接着，通过elisa(酶联免疫吸附测定)法和蛋白质印迹法调查了各杂交瘤所产生的单克隆抗体对sars-cov-2np的反应性。在elisa法中，首先，将加成有his-tag的重组sars-cov-2np蛋白5μg固定于elisa板上。将板粘连之后，在板中添加杂交瘤的培养上清液100μl并进行反应之后，添加经过氧化物酶标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体并进行了反应。然后，加入过氧化物酶基质溶液而使其显色，测定了其吸光度。在蛋白印迹法中，首先将加成有his-tag的重组sars-cov-2np蛋白1μg与2
×
sds样品缓冲液(125mm tris-hcl、4％sds、20％甘油、0.01％溴酚蓝、10％2-巯基乙醇)进行混合并进行热处理，供于聚丙烯酰胺凝胶并进行了电泳。将电泳后的凝胶转印到pvdf膜。在用2％脱脂乳溶液将膜进行粘连之后，添加杂交瘤的培养上清液5ml而进行反应，并与经过氧化物酶标记的抗小鼠免疫球蛋白抗体进行了反应。然后，加入过氧化物酶基质溶液而使其发光并进行了检测。通过对在这些筛选中确定的杂交瘤进行克隆，获得了产生对抗原蛋白显示高反应性的单克隆抗体的杂交
瘤细胞。
[0142]
(3)单克隆抗体的制备
[0143]
将各杂交瘤在无血清/无蛋白培养液中进行培养，并回收了培养上清液。从所回收的培养上清液中，使用蛋白a柱对各杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体进行了纯化。首先，将培养上清液120ml用平衡/清洗缓冲液(1.5mol/l glycine，3mol/l nacl，ph8.9)稀释为2倍，添加到用平衡/清洗缓冲液进行了平衡的蛋白a柱(容积为1.04ml)而使抗体捕获在蛋白a载体，用平衡/清洗缓冲液10ml冲洗了非特异性地吸附于载体的成分。接着，用洗脱缓冲液(100mmol/l柠檬酸钠，ph3.0)10ml洗脱了吸附于柱上的抗体。对于所回收的洗脱液，使用amicon ultra(merck millipore corporation)进行了浓缩。对于所获得的纯化抗体的浓度，通过280nm的uv吸收法进行了定量。
[0144]
(4)亚类的确定
[0145]
使用iso-gold快速抗体分型试剂盒(rapid isotyping kit)来鉴定了亚类。将所纯化的抗体用样品稀释液(sample diluent buffer)进行了100倍稀释。将该溶液150μl添加到侧向流动试剂盒(lateral flow kit)中，静放了5分钟。读取所检测出的线，鉴定了亚类。关于抗体，制作了多种。
[0146]
如上所述，获得了igg2b(no1)、igg2b(no2)、igg1(no1)及igg1(no2)这4种抗体。
[0147]
＜2＞免疫层析试剂盒的制作
[0148]
＜实施例1＞
[0149]
(2-1)作为修饰有能够与被检物质结合的第1物质的标记物质的抗np抗体修饰金胶体的制作
[0150]
在含有直径为50nm的金胶体的溶液(商品编号：em.gc50，bbi公司制造)9ml中加入50mmol/l的kh2po4缓冲液(ph8.0)1ml而调整ph，然后，加入含有20μg/ml的抗np单克隆抗体(亚类为igg2b(no1)的抗体)的溶液1ml并搅拌了10分钟。然后，静放10分钟之后，加入含有1质量％的聚乙二醇(peg(polyethylene glycol)；重均分子量(mw.)：20000，商品编号：168-11285，fujifilm wako pure chemical corporation制造)的水溶液550μl并搅拌10分钟，接着加入10质量％牛血清白蛋白(bsa(bovine serum al bumin)；fractionv，商品编号：a-7906，sigma corporation制造)的水溶液1.1ml并搅拌了10分钟。对于该溶液，使用离心分离装置(himaccf16rx，hitachi,ltd.制造)，在8000
×
g、4℃的条件下进行了30分钟离心分离。在容器底部留下1ml并去除上清液，利用超声波清洗机对残留于容器底部的1ml液中所包含的金胶体进行了再分散。然后，分散于20ml的金胶体保存液(20mmol/l tris-hcl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)缓冲液(ph8.2)、0.05％peg(mw.20000)、150mmol/l nacl、1％bsa)中，再次使用相同的离心分离装置在相同条件下进行离心分离，去除上清液，进行超声波分散之后，分散于金胶体保存液中，从而获得了抗体修饰金胶体(50nm)溶液。
[0151]
(2-2)作为标记保持垫的抗np抗体修饰金胶体保持垫的制作
[0152]
用水稀释在(2-1)中制作的抗np抗体修饰金胶体，以使tris-hcl缓冲液(ph8.2)的浓度成为20mmol/l、peg(mw.20000)的浓度成为0.05质量％、蔗糖的浓度成为5质量％、并且光路长度设为10mm时的金胶体的520nm的光学浓度成为0.1，从而作为金胶体涂布液。将该涂布液分别均匀地涂布1ml于每一个切成5mm
×
300mm的玻璃纤维垫(glassfiber conjugate pad，millipore公司)，并进行24小时减压干燥，由此获得了抗np抗体修饰金胶
体保持垫。
[0153]
(2-3)层析载体的制作
[0154]
作为不溶性载体，使用切割成60mm
×
300mm的硝酸纤维素膜(有塑料内衬，hiflow plus hf135(毛细管流量＝135秒/cm)，millipore公司)，在该膜上，通过如下方法，形成以下3个区域即检测区域、确认区域及扩增指标区域作为捕获区域而制作了层析载体。
[0155]
在硝酸纤维素膜的60mm短边中的距离下游侧15mm的位置，以成为1.5mg/ml的方式以线状涂布所制备的抗np单克隆抗体(亚类为igg2b(no2)的抗体)溶液而作为检验区域。而且，在60mm短边中的距离下游侧11mm的位置，以成为0.5mg/ml的方式以线状涂布所制备的抗小鼠igg抗体溶液而作为确认区域。而且，在60mm短边中的距离下游侧9mm的位置，以线状涂布制备成30mmol/l的溴甲酚绿(fujifilm wako pure chemical corporation制造)而作为扩增指标区域。在分别涂布之后，用暖风式干燥机在50℃下对硝酸纤维素膜进行了30分钟干燥。在干燥结束之后，在装有粘连液(含有0.5质量％酪蛋白(源自乳液，商品编号030-01505，fujifilm wako pure chemical corp oration制造)的50mmol/l的硼酸缓冲液(ph8.5))500ml的大桶中，将如上所述那样进行干燥的硝酸纤维素膜浸渍并在该状态下静放了30分钟。然后，取出硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜浸渍于在另一大桶中准备的清洗/稳定液(包含0.5质量％蔗糖及0.05质量％胆酸钠的50mmol/l tris-hcl(ph7.5)缓冲液)500ml中，并在该状态下静放了30分钟。然后，将硝酸纤维素膜从液中取出，在25℃的环境下进行了24小时干燥。固定了抗np抗体的部分相当于包含与被检物质结合的第2物质的检验区域，固定了抗小鼠igg抗体的部分相当于包含能够与第1物质结合的物质的确认区域，固定了溴甲酚绿的部分相当于包含与第1扩增液进行反应的物质的扩增指标区域。将这些3个区域统称为捕获区域。
[0156]
(2-4)检验用试纸条的制作
[0157]
在背面粘结片(60mm
×
300mm(adhesives research公司制造))贴附了在(2-3)中制作的层析载体。接着，在层析载体的短边中的距离下游侧26mm的位置固定了宽度为3mm的双面胶带(nitto denko corporation)。然后，将金胶体保持垫固定于层析载体，以使双面胶带的下游端与切成8mm
×
300mm的玻璃纤维垫(glassfiber conjugate pad，millipore公司)的下游端重叠。将送液用垫(切成25mm
×
300mm的玻璃纤维垫(glass fiber conjugate pad，millipore公司))贴附于层析载体的上游侧，以使送液用垫与层析载体重叠7mm。将如此制作的部件以相对于与300mm长边垂直的方向平行且宽度成为5mm的方式，用铡刀式切割机(guillotine cutter)(cm4000，nippn tech nocluster inc.制造)进行切割，制作了60个检验用试纸条(其中，不包括吸收垫。)。
[0158]
(2-5)扩增液的制作
[0159]
(2-5-1)封入第2罐中的扩增液(还原剂溶液)的制作
[0160]
在水290g中溶解了将硝酸铁(iii)九水合物(fujifilm wako pure che mical corporation制造，095-00995)溶解于水中而制作的1mol/l的硝酸铁水溶液23.6ml、柠檬酸(fujifilm wako pure chemical corporation制造，038-06925)13.1g。完全溶解之后，利用搅拌器一边搅拌一边加入硝酸(10重量％)溶液36ml，并加入了硫酸铵铁(ii)六水合物(fujifilm wako pure chemi cal corporation制造，091-00855)60.8g。将如此制备的溶液作为封入第2罐中的第2扩增液即还原剂溶液。
[0161]
(2-5-2)封入第1罐中的扩增液(银离子溶液)的制作
[0162]
在水66g中加入了硝酸银溶液8ml(包含10g硝酸银)和1mol/l的硝酸铁水溶液24ml。而且，将该溶液与预先将硝酸(10重量％)5.9ml、十二烷基胺(fujifilm wako pure chemical corporation制造，123-00246)0.1g、表面活性剂c
12h25-c6h
4-o-(ch2ch2o)
50
h 0.1g溶解于47.6g水中而成的溶液进行混合，将其作为封入第1罐中的第1扩增液即银离子溶液。
[0163]
(2-6)吸收垫的制作
[0164]
准备60个切成12mm
×
10mm的玻璃纤维垫(玻璃滤纸，advantech co.,lt d.制造)，作为吸收垫。
[0165]
(2-7)免疫层析试剂盒组件的制作
[0166]
将聚丙烯作为材料，通过注射成型分别制作了如图1及图2所示的构成免疫层析试剂盒100的下部壳体20、上部壳体10、中间部件30及第1罐40、第2罐45。关于上部壳体，将含有50质量％的sumitomo chemical co.,ltd.制造的烯烃系弹性体即toughcellen(注册商标)的聚丙烯作为材料，通过注射成型来制作。另外，上部壳体10具备2个能够变形的部位(第1凸状变形部和第2凸状变形部)，该2个变形部没有与上部壳体10分离的部分，在所有边界部作为上部壳体10的一部分通过注射成型来制作。
[0167]
另外，实施例的上部壳体设为如下结构：图1及图2所示的第1凸状变形部12具有2个突起部，第2凸状变形部14具有1个突起部。
[0168]
(2-8-1)实施例1的免疫层析试剂盒的制作
[0169]
如图1及图2所示，固定了下部壳体20、在(1-4)中制作的检验用试纸条1和在(1-6)中制作的吸收垫6。接着，如图3所示，在第1罐40、第2罐45中分别填充在(1-5-2)、(1-5-1)中制作的封入第1罐40中的第一扩增液41、封入第2罐45中的第2扩增液46，用作为片材部件48的铝箔密封罐45，用作为片材部件43的铝箔密封罐40，如图1及图2所示，将第2罐45以片材部件48设于上方的方式安装于下部壳体20，将第1罐40以片材部件43设于下方的方式安装于中间部件30。然后，在将上部壳体10与下部壳体20以外周彼此接触的方式嵌合的状态下，通过超声波焊接接合了上部壳体与下部壳体的接触部。此时，确认到焊接部位为密闭状态且均匀地在所有部位被焊接。如此制作了免疫层析试剂盒。
[0170]
＜实施例2＞
[0171]
在实施例1的(2-1)中所记载的抗np抗体修饰金胶体的制作中，使用了亚类为igg2b(no2)的抗体来代替亚类为igg2b(no1)的抗体、及在实施例1的(2-3)中所记载的层析载体的制作中，使用了亚类为igg2b(no1)的抗体来代替亚类为igg2b(no2)的抗体，除此以外，全部以与实施例1相同的方式，制作了实施例2的金的层析试剂盒。
[0172]
＜实施例3＞
[0173]
在实施例1的(2-3)中所记载的层析载体的制作中，使用了亚类为igg1(no2)的抗体来代替亚类为igg2b(no2)的抗体，除此以外，全部以与实施例1相同的方式，制作了实施例3的金的层析试剂盒。
[0174]
＜比较例1＞
[0175]
在实施例1的(2-1)中所记载的抗np抗体修饰金胶体的制作中，使用了亚类为igg1(no1)的抗体来代替亚类为igg2b(no1)的抗体、及在(2-3)中所记载的层析载体的制作中，
使用了亚类为igg1(no2)的抗体来代替亚类为igg2b(no2)的抗体，除此以外，全部以与实施例1相同的方式，制作了比较例1的金的层析试剂盒。
[0176]
＜比较例2＞
[0177]
在实施例1的(2-1)中所记载的抗np抗体修饰金胶体的制作中，使用了亚类为igg1(no2)的抗体来代替亚类为igg2b(no1)的抗体、及在(2-3)中所记载的层析载体的制作中，使用了亚类为igg1(no1)的抗体来代替亚类为igg2b(no2)的抗体，除此以外，全部以与实施例1相同的方式，制作了比较例2的金的层析试剂盒。
[0178]
＜3＞检测灵敏度的评价
[0179]
(3-1)评价液
[0180]
将tween(注册商标)80(4g)添加到超纯水3280ml中并进行了溶解。添加了三羟基二甲基甲烷120g和酪蛋白4g、edta-na(乙二胺四乙酸钠)60g。在调整为ph7.7之后，定容为4l。
[0181]
(3-2)被检体调制
[0182]
在如上所述那样制备的评价液中添加在上述(1)制备的sars-cov-2重组np，调制了各浓度的被检体。
[0183]
(3-3)使用了实施例及比较例的免疫层析试剂盒的测定
[0184]
将如上所述那样调制的被检体24μl点加于试剂盒中。
[0185]
通过在被检体的点加之后，立即按下第2凸状变形部14，使密封封入第2罐45中的第二扩增液46的片材部件48的铝箔破裂，将送液用垫4浸渍于第2罐45中，由此利用毛细管现象将第2扩增液46供给到不溶性载体2。
[0186]
在扩增指标区域l3从绿色变为橙色之后，按下第1凸状变形部12而使第1罐40向中间部件30的第1罐容纳部32的断裂部34移动，由此通过断裂部34压破密封第1罐40的片材部件43的铝箔，将作为第1扩增液41的银离子溶液从中间部件30的开口部供给到不溶性载体2，进行了银扩增反应。银扩增反应在数十秒内完成。
[0187]
在银扩增反应结束之后，通过肉眼观察判定了阳性或阴性。关于判定，用las4000(general electric company制造)对捕获量与其np量成比例地增减的抗np抗体涂布线黑色的显色程度进行拍摄并计算出信号。
[0188]
根据以下标准进行了评价。
[0189]
a：信号浓度超过0.1，能够充分地确认被检体的存在。
[0190]
b：信号浓度为0.05～0.1，能够检测浓度上升，可确认被检体的存在。
[0191]
c：信号浓度为0.03～0.05，勉强地检测出被检体。
[0192]
d：信号浓度为0.03以下。没有被检体、或者无法检测。
[0193]
将结果示于表1。
[0194]
[表1]
[0195][0196]
已知使用至少1种igg2b的抗体作为免疫层析试剂盒的抗np单克隆抗体时的检测灵敏度高。
[0197]
已知，fujirebio inc.制造的sars-cov-2抗原检测用试剂“espline sa rs-cov-2”的包装说明书中所记载的最小检测灵敏度记载为25pg/ml，有可能相对于该检测灵敏度，能够实现显著高灵敏度。
[0198]
实验b
[0199]
＜1＞抗体的片段化
[0200]
将磷酸二钠溶解于纯水中，使用1mol/l盐酸调整为ph7.8，作为消化液。使用脱盐柱(zeba
tm
脱盐离心柱(spin desalting columns),7k mwco)，将抗体的缓冲液替换为消化液。将蛋白内切酶(endoproteinase)glu-c(v8蛋白酶(v8 protease))(sigma-aldrich co.llc.制造或fujifilm wako pure chemical corporation制造)称取2.0mg，添加消化液300μl，制作了酶液。相对于抗体(igg2b(no1))2mg，添加酶液150μl，在37℃下进行了20小时反应。反应之后，用amicon ultra(merck公司)进行超滤，使用monospin proa(gl sciences inc.制造)去除完全抗体，进行了片段化抗体的纯化。
[0201]
＜2＞免疫层析试剂盒的制作
[0202]
＜实施例4＞
[0203]
(2-1)作为修饰有能够与被检物质结合的第1物质的标记物质的抗np片段化抗体修饰金胶体的制作
[0204]
在含有直径为50nm的金胶体的溶液(商品编号：em.gc50，bbi公司制造)9ml中加入50mmol/l的kh2po4缓冲液(ph8.0)1ml而调整ph，然后，加入在(1)中制备的20μg/ml的片段化抗np单克隆抗体(含有溶液1ml)并搅拌了10分钟。然后，静放10分钟之后，加入含有1质量％的聚乙二醇(peg(polyethylene glycol)；重均分子量(mw.)：20000，商品编号：168-11285，fujifilm wako pure chemical corporation制造)的水溶液550μl并搅拌10分钟，接着加入10质量％牛血清白蛋白(bsa(bovine serum albumin)；fractionv，商品编号：a-7906，sigma corporation制造)的水溶液1.1ml并搅拌了10分钟。对于该溶液，使用离心分离装置(himaccf16rx，hitachi,lt d.制造)，在8000
×
g、4℃的条件下进行了30分钟离心分离。在容器底部留下1ml并去除上清液，利用超声波清洗机对残留于容器底部的1ml液中所包含的金胶体进行了再分散。然后，分散于20ml的金胶体保存液(20mmol/l tris-hcl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)缓冲液(ph8.2)、0.05％peg(mw.20000)、150mmol/l nacl、1％bsa)中，再次使用相同的离心分离装置在相同条件下进行离心分离，去除上清液，进行超声波分散之后，分散于金胶体保存液中，从而获得了片段化的抗np抗体修饰金胶体(50nm)溶液。
[0205]
(2-2)作为标记保持垫的抗np抗体修饰金胶体保持垫的制作
[0206]
用水稀释在(2-1)中制作的抗np抗体修饰金胶体，以使tris-hcl缓冲液(ph8.2)的
浓度成为20mmol/l、peg(mw.20000)的浓度成为0.05质量％、蔗糖的浓度成为5质量％、并且光路长度设为10mm时的金胶体的520nm的光学浓度成为0.1，从而作为金胶体涂布液。将该涂布液分别均匀地涂布1ml于每一个切成5mm
×
300mm的玻璃纤维垫(glassfiber conjugate pad，millipore公司)，并进行24小时减压干燥，由此获得了抗np抗体修饰金胶体保持垫。
[0207]
(2-3)层析载体的制作
[0208]
作为不溶性载体，使用切割成60mm
×
300mm的硝酸纤维素膜(有塑料内衬，hiflow plus h135(毛细管流量＝135秒/cm)，millipore公司)，在该膜上，通过如下方法，形成检验区域、确认区域及扩增指标区域而制作了层析载体。
[0209]
在硝酸纤维素膜的60mm短边中的距离下游侧15mm的位置，以成为1.5mg/ml的方式以线状涂布所制备的抗np单克隆抗体(igg1(no2))溶液而作为检验区域。而且，在60mm短边中的距离下游侧11mm的位置，以成为0.5mg/ml的方式以线状涂布所制备的抗小鼠igg抗体溶液而作为确认区域。而且，在60mm短边中的距离下游侧9mm的位置，以线状涂布制备成30mmol/l的溴甲酚绿(fujifilm wako pure chemical corporation制造)而作为扩增指标区域。在分别涂布之后，用暖风式干燥机在50℃下对硝酸纤维素膜进行了30分钟干燥。在干燥结束之后，在装有粘连液(含有0.5质量％酪蛋白(源自乳液，商品编号030-01505，fujifilm wako pure chemical corporation制造)的50mmol/l的硼酸缓冲液(ph8.5))500ml的大桶中，将如上所述那样进行干燥的硝酸纤维素膜浸渍并在该状态下静放了30分钟。然后，取出硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜浸渍于在另一大桶中准备的清洗/稳定液(包含0.5质量％蔗糖及0.05质量％胆酸钠的50mmol/l tris-hcl(ph7.5)缓冲液)500ml中，并在该状态下静放了30分钟。然后，将硝酸纤维素膜从液中取出，在25℃的环境下进行了24小时干燥。固定了抗np抗体的部分相当于包含与被检物质结合的第2物质的检验区域，固定了抗小鼠igg抗体的部分相当于包含能够与第1物质结合的物质的确认区域，固定了溴甲酚绿的部分相当于包含与第1扩增液进行反应的物质的扩增指标区域。
[0210]
(2-4)检验用试纸条的制作
[0211]
在背面粘结片(60mm
×
300mm(adhesives research公司制造))贴附了在(2-3)中制作的层析载体。接着，在层析载体的短边中的距离下游侧26mm的位置固定了宽度为3mm的双面胶带(nitto denko corporation)。然后，将在(2-2)中制作的金胶体保持垫固定于层析载体，以使双面胶带的下游端与切成8mm
×
300mm的玻璃纤维垫(glassfiber conjugate pad，millipore公司)的下游端重叠。将送液用垫(切成25mm
×
300mm的玻璃纤维垫(glass fiber conjugate pad，millipore公司))贴附于层析载体的上游侧，以使送液用垫与层析载体重叠7mm。将如此制作的部件以相对于与300mm长边垂直的方向平行且宽度成为5mm的方式，用铡刀式切割机(guillotine cutter)(cm4000，nippn technocluster inc.制造)进行切割，制作了60个检验用试纸条(其中，不包括吸收垫。)。
[0212]
(2-5)扩增液的制作
[0213]
(2-5-1)封入第2罐中的扩增液(还原剂溶液)的制作
[0214]
在水290g中溶解了将硝酸铁(iii)九水合物(fujifilm wako pure che mical corporation制造，095-00995)溶解于水中而制作的1mol/l的硝酸铁水溶液23.6ml、柠檬酸(fujifilm wako pure chemical corporation制造，038-06925)13.1g。完全溶解之后，利
用搅拌器一边搅拌一边加入硝酸(10重量％)溶液36ml，并加入了硫酸铵铁(ii)六水合物(fujifilm wako pure chemi cal corporation制造，091-00855)60.8g。将如此制备的溶液作为封入第2罐中的第2扩增液即还原剂溶液。
[0215]
(2-5-2)封入第1罐中的扩增液(银离子溶液)的制作
[0216]
在水66g中加入了硝酸银溶液8ml(包含10g硝酸银)和1mol/l的硝酸铁水溶液24ml。而且，将该溶液与预先将硝酸(10重量％)5.9ml、十二烷基胺(fujifilm wako pure chemical corporation制造，123-00246)0.1g、表面活性剂c
12h25-c6h
4-o-(ch2ch2o)
50
h 0.1g溶解于47.6g水中而成的溶液进行混合，将其作为封入第1罐中的第1扩增液即银离子溶液。
[0217]
(2-6)吸收垫的制作
[0218]
准备60个切成12mm
×
10mm的玻璃纤维垫(玻璃滤纸，advantech co.,lt d.制造)，作为吸收垫。
[0219]
(2-7)免疫层析试剂盒组件的制作
[0220]
将聚丙烯作为材料，通过注射成型分别制作了如图1及图2所示的构成免疫层析试剂盒100的下部壳体20、上部壳体10、中间部件30及第1罐40、第2罐45。关于上部壳体，将含有50质量％的sumitomo chemical co.,ltd.制造的烯烃系弹性体即toughcellen(注册商标)的聚丙烯作为材料，通过注射成型来制作。另外，上部壳体10具备2个能够变形的部位(第1凸状变形部和第2凸状变形部)，该2个变形部没有与上部壳体10分离的部分，在所有边界部作为上部壳体10的一部分通过注射成型来制作。
[0221]
另外，实施例的上部壳体设为如下结构：图1及图2所示的第1凸状变形部12具有2个突起部，第2凸状变形部14具有1个突起部。
[0222]
(2-8)实施例的免疫层析试剂盒的制作
[0223]
如图1及图2所示，固定了下部壳体20、在(2-4)中制作的检验用试纸条1和在(2-6)中制作的吸收垫6。接着，如图3所示，在第1罐40、第2罐45中分别填充在(1-5-2)、(1-5-1)中制作的封入第1罐40中的第1扩增液41、封入第2罐45中的第2扩增液46，用作为片材部件48的铝箔密封第2罐45，用作为片材部件43的铝箔密封第1罐40，如图1及图2所示，将第2罐45以片材部件48设于上方的方式安装于下部壳体20，将第1罐40以片材部件43设于下方的方式安装于中间部件30。然后，在将上部壳体10与下部壳体20以外周彼此接触的方式嵌合的状态下，通过超声波焊接接合了上部壳体与下部壳体的接触部。此时，确认到焊接部位为密闭状态且均匀地在所有部位被焊接。如此制作了免疫层析试剂盒。
[0224]
＜实施例5＞
[0225]
在实施例4中，变更为下述表2中所记载的抗体，除此以外，以与实施例4相同的方式，制作了实施例5的免疫层析试剂盒。
[0226]
＜3＞检测灵敏度的评价
[0227]
(3-1)评价液
[0228]
将tween(注册商标)80(4g)添加到超纯水3280ml中并进行了溶解。添加了三羟基二甲基甲烷120g、酪蛋白4g及edta-na 60g。在调整为ph7.7之后，定容为4l。
[0229]
(3-2)被检体调制
[0230]
在评价液中添加sars-cov-2重组np，调制了各浓度的被检体。
[0231]
将如上所述那样调制的被检体24μl点加于试剂盒中。
[0232]
通过在被检体的点加之后，立即按下第2凸状变形部14，使密封封入第2罐45中的第2扩增液46的片材部件48的铝箔破裂，将送液用垫4浸渍于第2罐45中，由此利用毛细管现象将第2扩增液46供给到不溶性载体2。
[0233]
在扩增指标区域l3从绿色变为橙色之后，按下第1凸状变形部12而使第1罐40向中间部件30的第1罐容纳部32的断裂部34移动，由此通过断裂部34压破密封第1罐40的片材部件43的铝箔，将作为第1扩增液41的银离子溶液从中间部件30的开口部供给到不溶性载体2，进行了银扩增反应。银扩增反应在数十秒内完成。
[0234]
在银扩增反应结束之后，通过肉眼观察判定了阳性或阴性。关于判定，用las4000(general electric company制造)对捕获量与其np量成比例地增减的抗np抗体涂布线黑色的显色程度进行拍摄并计算出信号。
[0235]
根据以下标准进行了评价。
[0236]
e：信号浓度为0.045以上，能够以充分高浓度检测。
[0237]
f：信号浓度为0.025～0.045，能够检测浓度上升，可确认被检体的存在。
[0238]
g：信号浓度为0.015～0.025，稍微判别出浓度。
[0239]
h：信号浓度为0.010～0.015，能够勉强地判别出浓度。
[0240]
i：信号浓度为0.010以下。无法检测浓度。
[0241]
将结果示于表2。
[0242]
[表2]
[0243][0244]
已知，将金胶体抗体进行了片段化的抗体的实施例4与金胶体抗体、膜抗体均为未片段化抗体的实施例5相比，在评价液中不含sars-cov-2的试样(np浓度为0pg/ml)的信号浓度低，不易发生假阳性。而且已知，即使进行片段化，也有可能相对于fujirebio inc.制造的sars-cov-2抗原检测用试剂“espline sars-cov-2”的检测灵敏度，能够实现显著高灵敏度。
[0245]
(实施例6)
[0246]
使用在实施例1中制备的、亚类为igg1、igg2b的抗np单克隆抗体，根据日本专利第5430995号公报中所记载的实施例1制作检验器件而进行评价并进行与实施例1相同的浓度测定时，与实施例1同样地确认到本发明的效果。
[0247]
符号说明
[0248]1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
检验用试纸条
[0249]2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
不溶性载体
[0250]3ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
标记保持垫
[0251]4ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
送液用垫
[0252]6ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
吸收垫
[0253]7ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
背面粘结片
[0254]9ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
外壳
[0255]
10
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
上部壳体
[0256]
12
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
第1凸状变形部
[0257]
14
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
第2凸状变形部
[0258]
16
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
试样液滴加用开孔
[0259]
18
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
观察窗
[0260]
20
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
下部壳体
[0261]
21
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
不溶性载体容纳部
[0262]
22
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
吸收垫容纳部
[0263]
24
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
第2罐容纳部
[0264]
30
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
中间部件
[0265]
32
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
第1罐容纳部
[0266]
34
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
断裂部
[0267]
35
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
流路形成部
[0268]
36
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
流路形成部35的背面
[0269]
40
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
第1罐
[0270]
41
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
第1扩增液
[0271]
42
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
罐容器
[0272]
43
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
片材部件
[0273]
45
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
第2罐
[0274]
46
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
第2扩增液
[0275]
47
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
罐容器
[0276]
48
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
片材部件
[0277]
100
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
免疫层析试剂盒
[0278]
l1
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
检验区域
[0279]
l2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
确认区域
[0280]
l3
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
扩增指标区域

技术特征：
1.一种sars-cov-2的检测试剂盒，其包含与sars-cov-2核衣壳蛋白特异性地进行反应的至少一种抗体，且特异性地检测生物试样中所包含的核衣壳蛋白，其中，所述抗体包含至少一种亚类为igg2b的抗体，所述sars-cov-2的检测试剂盒包括：第一容器，容纳含有银的化合物；及第二容器，容纳能够还原银离子的还原剂。2.根据权利要求1所述的sars-cov-2的检测试剂盒，其中，所述抗体为片段化抗体。3.根据权利要求2所述的sars-cov-2的检测试剂盒，其中，所述片段化抗体为通过蛋白酶处理制作的抗体。4.根据权利要求1至3中任一项所述的sars-cov-2的检测试剂盒，其中，所述抗体利用标记物质来标记，利用含有银的化合物和能够还原银离子的还原剂，对基于标记物质的信息进行扩增并进行检测。5.根据权利要求4所述的sars-cov-2的检测试剂盒，其中，所述标记物质为金胶体。6.根据权利要求1至5中任一项所述的sars-cov-2的检测试剂盒，其中，所述还原剂为fe
2+
的金属盐。7.根据权利要求1至6中任一项所述的sars-cov-2的检测试剂盒，其还包含不溶性载体。8.根据权利要求7所述的sars-cov-2的检测试剂盒，其中，所述不溶性载体具有捕获被检物质的捕获区域和检测还原剂的显色区域。9.一种sars-cov-2的检测方法，其使用了与sars-cov-2核衣壳蛋白特异性地进行反应的至少一种抗体，且特异性地检测生物试样中所包含的核衣壳蛋白，其中，作为所述抗体，使用至少一种亚类为igg2b的抗体，所述检测的方法包括如下步骤：利用含有银的化合物和能够还原银离子的还原剂，对核衣壳蛋白的检测信息进行扩增。10.根据权利要求9所述的sars-cov-2的检测方法，其中，所述抗体为片段化抗体。11.根据权利要求10所述的sars-cov-2的检测方法，其中，所述片段化抗体为通过蛋白酶处理制作的抗体。12.根据权利要求9至11中任一项所述的sars-cov-2的检测方法，其中，所述抗体利用标记物质来标记，利用含有银的化合物和能够还原银离子的还原剂，对基于标记物质的信息进行扩增并进行检测。13.根据权利要求12所述的sars-cov-2的检测方法，其中，所述标记物质为金胶体。14.根据权利要求9至13中任一项所述的sars-cov-2的检测方法，其中，所述还原剂为fe
2+
的金属盐。15.根据权利要求9至14中任一项所述的sars-cov-2的检测方法，其中，所述检测方法为免疫层析法。

技术总结
本发明的课题在于提供一种能够简单地以更高灵敏度进行SARS-CoV-2的检测的、SARS-CoV-2的检测试剂盒及SARS-CoV-2的检测方法。根据本发明，提供一种SARS-CoV-2的检测试剂盒，其包含与SARS-CoV-2核衣壳蛋白(NP)特异性地进行反应的至少一种抗体，且特异性地检测生物试样中所包含的核衣壳蛋白(NP)，其中，上述抗体包含至少一种亚类为IgG2b的抗体，上述SA RS-CoV-2的检测试剂盒包括：第一容器，容纳含有银的化合物；及第二容器，容纳能够还原银离子的还原剂。子的还原剂。子的还原剂。


技术研发人员：氏原大 片田顺一 梁明秀
受保护的技术使用者：公立大学法人横滨市立大学
技术研发日：2021.11.16
技术公布日：2023/8/24