长效脱氧核糖核酸酶的制作方法

长效脱氧核糖核酸酶1.相关应用2.本公开要求2020年10月7日提交的序列号为63/088,496的美国临时专利申请的优先权，其全部公开内容通过引用并入本文。3.序列表声明4.与本公开同时提交的、创建于2021年10月5日名为89420.txt的ascll文件包括16,384字节，该文件通过引用并入本文。5.
技术领域：
：和
背景技术：
：：6.本公开在其一些实施方式中涉及治疗，更具体地，但不排他地，涉及长效dnase(long-actingdnase)。7.基于它们的生化性质和酶活性，脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，dnase)蛋白被分为两种类型：dnasei和dnaseii。dnasei蛋白具有接近中性的最适ph，并且在dna水解时产生5'-磷酸核苷酸。8.人类dnasei(humandnasei)是哺乳动物dnasei家族(ec3.1.21.1)的成员。dnasei属于mg2+和ca2+依赖型核酸内切酶(dependentendonucleases)类，其水解活性取决于二价阳离子的存在。mg2+离子参与磷酸二酯键断裂的亲电催化，而ca2+保持最佳的酶构象。dnasei优先在在与嘧啶核苷酸相邻的磷酸二酯键处切割dna，产生在3'位具有游离羟基的5'-磷酸端的多核苷酸(5'-phosphate-terminatedpolynucleotides)，平均产生四核苷酸。dnasei作用于单链dna、双链dna和染色质。9.dnaseii(ec3.1.22.1)优先在磷酸二酯键处切割dna，从而产生具有3'-磷酸和5'-羟基末端的产物。dnaseii在酸性ph下功能最佳，通常在溶酶体中发现。10.人类dnase的主要治疗用途是通过水解存在于肺分泌物(包括粘液)中的高分子量dna，来降低肺炎和囊性纤维化(cysticfibrosis，cf)等疾病中肺分泌物的粘弹性，从而有助于呼吸道的清洁[shak等人，美国科学院院报(pnas)87:9188-9192(1990)]。粘液还增加慢性支气管炎、哮喘性支气管炎、支气管扩张、肺气肿、急性和慢性鼻窦炎，甚至普通感冒的发病率。患有此类疾病的人的肺分泌物是复杂的物质，包括粘液糖蛋白、粘多糖、蛋白酶、肌动蛋白和dna。dnase也被提议用于非肺部疾病，例如治疗男性不育症和子宫病症(参见美国专利申请公开us2007/0259367)，抑制转移性生长(参见美国专利us7,612,032)，以及局部应用于糖尿病伤口愈合。[0011]阿法链道酶(dornasealfa)是在中国仓鼠卵巢(chinesehamsterovary，cho)细胞中表达的重组人类脱氧核糖核酸酶(rhdnase)，用于治疗囊性纤维化，以商品名销售。[0012]国际专利申请公开wo2013/114374描述了植物表达的人类重组dnasei蛋白，及通过吸入dnasei治疗肺部和/或呼吸道疾病的用途。[0013]国际专利申请公开wo2016/108244描述了修饰的dnasei蛋白，与同源的未修饰的dnasei蛋白相比，其显示出提高的dna水解活性。已经进行临床试验的示例性修饰的dnasei蛋白被称为“阿立链道酶α(alidornasealfa)”。[0014]dwyer等人[生物化学杂志(jbiolchem)1999,274:9738-9743]描述了dnasei-fc融合蛋白的表达和纯化，产生二聚形式的dnasei。二聚体dnasei-fc融合蛋白在酶促dna消化测定中具有功能活性，尽管比单体dnasei低约10倍。[0015]国际专利申请公开wo2015/107176描述了用于治疗呼吸道疾病的治疗剂与一个或多个分子量大于12kda的peg部分(moiety)的聚乙二醇化。特别地，描述了具有一个与其n-末端缀合(conjugatedto)的peg部分(20kda至40kda)的阿法链道酶。[0016]俄罗斯专利ru2502803描述了将半胱氨酸残基引入dnase以与10kdapeg-马来酰亚胺缀合(conjugation)，从而产生聚乙二醇化的dnase，其表现出未修饰的dnase的10％至20％的酶活性。[0017]patel等人[应用纳米科学(applnanosci)2020,10:563-575]描述了负载有环丙沙星的dnase-1官能化的壳聚糖纳米颗粒，用于防止铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)生物膜形成。[0018]park等人[科学转化医学(scitranslmed)2016,8:361ra131]描述了用dnasei包被的纳米颗粒，用于抑制转移。[0019]meng等人[药物递送和配方的最新专利(recentpatdrugdelivformul)2018,12:212-222]描述了dnasei或促红细胞生成素的聚唾液酸化(polysialylation)，以提高对蛋白酶和热应激的稳定性，但酶活性略有降低。[0020]美国专利us7,846,445描述了包含至少40个连续氨基酸的非结构化重组聚合物(unstructuredrecombinantpolymer，urp)，其可以延长血清排泄半衰期和/或增加掺入urp的蛋白质的溶解度。[0021]xl-proteingmbh公司报道了通过在dnase的n-末端掺入无序多肽链来产生半衰期延长的重组人类dnasei[www.rentschler-biopharma.com/filegmin/user_upload/scientific-poster/rentschler_poster_esact_2019_pasylated_human_dnase_i_final_screen]。[0022]中性粒细胞胞外陷阱(neutrophilextracellulartraps，nets)是细胞外纤维的网络，主要由来自中性粒细胞的dna组成，其结合病原体。net激活和释放(netactivationandrelease)(也称为“netosis”)可能涉及中性粒细胞死亡(自杀式netosis)或不导致中性粒细胞死亡(活性的netosis(vitalnetosis))的胞吐作用(exocytosis)。中性粒细胞胞外陷阱可以通过结合微生物和防止病原体的传播而有助于先天免疫，但会导致血栓形成和内皮和其它组织损伤的增加[mai等人，休克(shock)2015,44:166-172；mcdonald等人，细胞宿主与微生物(cellhostmicrobe)2012,12:324-333；papayannopoulos,自然免疫学评论(cellhostmicrobe)2018,18:134-147]。[0023]czaikoski等人[公共科学图书馆期刊(plosone)2016,11:e0148142]报道了系统性重组人类脱氧核糖核酸酶治疗(systemicrecombinanthumandnasetreatment)降低脓毒病(septic)小鼠的血清nets，并增加细菌负荷；而脱氧核糖核酸酶治疗加抗生素可减轻器官损伤，提高存活率。[0024]美国专利申请公开us2020/0024585描述了用于治疗以中性粒细胞胞外陷阱(net)积聚和/或释放为特征的病症(例如涉及net的血管闭塞)的工程化dnase蛋白。[0025]其他
背景技术：
：包括dwivedi等人[重症监护(critcare)2012；16:r151]；ehrlich[0042]通式i[0043]其中：[0044]l1和l2各自独立地是烃部分或不存在l1和l2；[0045]r1是氢或烃部分；[0046]m是2至10范围内的整数；并且[0047]n是在2至1000范围内的整数。[0048]根据本公开的任何一些实施方式，所述聚(亚烷基二醇)部分的至少一个或每一个具有通式i’：[0049]-ch2-l1-[o-(ch2)m]n-o-r1[0050]通式i’[0051]其中：[0052]l1是烃部分或不存在l1；[0053]r1是氢或烃部分；[0054]m是2至10范围内的整数；和[0055]n是2至1000范围内的整数。[0056]根据本公开的任何一些相应实施方式，n在20至200的范围内，任选地在30至150的范围内。[0057]根据本公开的任何一些相应实施方式，l1是未取代的亚烷基。[0058]根据本公开的任何一些相应实施方式，l1长度为1至6个碳原子，任选地长度为两个碳原子。[0059]根据本公开的任何一些实施方式，所述聚(亚烷基二醇)部分的至少一个或每一个是聚乙二醇部分。[0060]根据本公开的任何一些实施方式，所述多肽是重组多肽。[0061]根据本公开的任何一些实施方式，所述多肽是植物重组多肽。[0062]根据本公开的任何一些实施方式，所述dnase蛋白是dnasei蛋白。[0063]根据本公开的任何一些相应实施方式，所述dnasei蛋白与人类dnasei蛋白具有至少80％的同源性。[0064]根据本公开的任何一些相应实施方式，所述dnasei蛋白包含或具有seqidno:2所示的氨基酸序列。[0065]根据本公开的任何一些相应实施方式，所述dnasei蛋白包含或具有seqidno:1所示的氨基酸序列。[0066]根据本公开的任何一些相应实施方式，根据本文描述的任一相应实施方式的组合物或修饰的dnase蛋白用于治疗其中dnase活性有益于治疗的疾病或病症。[0067]根据本公开的任何一些相应实施方式，根据本文描述的任一相应实施方式的组合物或修饰的dnase蛋白用于治疗与有需要的对象的流体、分泌物或组织中的过量细胞外dna相关的疾病或病症。[0068]根据本公开的任何一些相应实施方式，所述疾病或病症与中性粒细胞胞外陷阱(nets)有关。[0069]根据本公开的任何一些相应实施方式，所述疾病或病症选自由血栓形成；血管闭塞；炎性疾病或病症；自身免疫性疾病或病症；支气管肺病(bronchopulmonarydisease)；心血管疾病；代谢疾病；癌症；神经退行性疾病或病症；与感染、肝损伤、纤维化和导管闭塞有关的疾病或病症所组成的组。[0070]根据本公开的任何一些相应实施方式，所述疾病(disease)或病症(disorder)选自由急性冠脉综合征；急性肾损伤；急性肺损伤；急性呼吸窘迫综合征；过敏(allergies)；阿尔茨海默病；肌萎缩性侧索硬化症；关节炎；气喘；肺膨胀不全(atelectasis)；动脉粥样硬化；特应性皮炎；双相型障碍；支气管扩张；毛细支气管炎；支气管炎和气管支气管炎；胆管炎；慢性肾病；慢性中性粒细胞增多症(chronicneutrophilia)；慢性阻塞性肺疾病；慢性化脓性肺病结膜炎(chronicsuppurativelungdiseaseconjunctivitis)；普通感冒；囊性纤维化；深静脉血栓形成；糖尿病；弥散性血管内凝血；干眼症；脓胸(empyema)；心内膜炎；女性不育症；痛风；移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease)；血肿；血胸(hemothorax)；肝素诱导的血小板减少症；肝肾综合征；亨廷顿病；炎症性肠病；胆道内血栓(intrabiliarybloodclots)；缺血-再灌注损伤；卡塔格内氏综合征(kartegener’ssyndrome)；白血病；白细胞淤积症；肝硬化；狼疮性肾炎；男性不育症；乳腺炎；心肌梗塞；嗜中性白血球减少症(neutropenia)；中性粒细胞聚集(neutrophilaggregation)；输精管阻塞(obstructionofthevasdeferens)；胰腺炎；帕金森病；肺炎(pneumonia)；气动后贫血(post-pneumaticanemia)；原发性纤毛运动不良症(primaryciliarydyskinesia)；银屑病；横纹肌溶解症；结节病(sarcoidosis)；精神分裂症；脓毒病(sepsis)；镰状细胞病；鼻窦炎；修格兰氏症候群(sjogren’ssyndrome)；烟雾诱导的肺损伤(smoke-inducedlunginjury)；实体瘤和/或肿瘤转移；中风；手术粘连(surgicaladhesions)；手术和/或创伤性组织损伤；全身炎症反应综合征；系统性红斑狼疮；系统性硬化症；血栓性微血管病；与放疗和/或化疗相关的组织损伤(tissuedamageassociatedwithirradiationand/orchemotherapytreatment)；输血诱导的肺损伤(transfusion-inducedlunginjury)；结核病；血管炎(vasculitis)；静脉血栓栓塞症；病毒、细菌、真菌和/或原虫感染；以及伤口或溃疡所组成的组。[0071]根据本公开的任何一些相应实施方式，所述疾病或病症是脓毒病。[0072]根据本公开涉及方法的任何一些相应实施方式，所述还原剂选自由甲基吡啶硼烷复合物(picolineboranecomplex)和氰基硼氢化钠所组成的组。[0073]根据本公开涉及方法的任何一些相应实施方式，所述试剂具有通式ii：[0074]hc(＝o)-l1-[o-(ch2)m]n-o-r1[0075]通式ii[0076]其中：[0077]l1是烃部分；[0078]r1是氢或烃部分；[0079]m是2至10范围内的整数；并且[0080]n是2至1000范围内的整数。[0081]根据本公开涉及方法的任何一些相应实施方式，所述试剂与所述多肽的摩尔比在10:1至2,000:1的范围内。[0082]根据本公开涉及方法的任何一些相应实施方式，使所述缀合物与所述还原剂的接curve))(“高”表示每个蛋白质约4个peg部分，“低”表示每个蛋白质约3个peg部分)。[0095]图9a和9b示出了死亡率曲线(图9a)和柱状图(图9b)，柱状图显示了进行clp(盲肠结扎和穿刺(cecalligationandpuncture))，以及在clp后1小时(3s)或4小时(4s)用10mg/kg的5000dapeg修饰的长效(long-acting)(la)prhdnasei、在clp后1小时(1s)或4小时(4s)用10mg/kg未修饰的prhdnasei或盐水(5s)处理的小鼠(mice)的平均死亡时间；使用威尔科克森(wilcoxonmethod)法对每对应用非参数比较进行统计分析(*p≤0.05,**p≤0.01；每组中的n＝5)。[0096]图10a和10b示出了死亡率曲线(图10a)和柱状图，柱状图显示了进行clp，以及在clp后4小时用10mg/kg的5000dapeg修饰的长效(la)prhdnasei或用盐水处理的小鼠的平均死亡时间(图10b)；使用威尔科克森法对每对应用非参数比较进行统计分析(*p≤0.05；每组中的n＝5；为了计算，7天后仍然存活的两只小鼠被认为在7天后死亡)。[0097]图11a和11b示出了死亡率曲线(图11a)和柱状图，柱状图显示了进行clp，以及在clp后8小时用10mg/kg的5000dapeg修饰的长效(la)prhdnasei或用盐水处理的小鼠的平均死亡时间(图11b)；使用威尔科克森法对每对应用非参数比较进行统计分析(*p≤0.05；每组中的n＝3-5；为了计算，7天后仍然存活的两只小鼠被认为在7天后死亡)。[0098]图12a和12b示出了死亡率曲线死亡率曲线(图12a)和柱状图，柱状图显示了进行clp，以及在clp后4小时用0.1mg/kg、1mg/kg、5mg/kg或10mg/kg的5000dapeg修饰的长效(la)prhdnasei或用盐水处理的小鼠的平均死亡时间(图12b)；使用威尔科克森法对每对应用非参数比较进行统计分析(*p≤0.05，**p≤0.01；每组中的n＝5；为了计算，7天后小鼠仍然存活被认为在7天后死亡)。具体实施方式[0099]本公开在其一些实施方式中涉及治疗，更具体地，但不排他地，涉及长效脱氧核糖核酸酶。[0100]在详细解释本公开的至少一个实施方式之前，应当理解的是，本公开在其应用中不一定局限于在下面的描述中阐述的或者由实施例示出的细节。本公开能够有其他实施方式，或者能够以各种方式实践或执行。[0101]本发明人已经发现，用多个聚(亚烷基二醇)部分修饰dnase蛋白可以在相当大的程度上提高dnase的体内(invivo)半衰期，从而提高其功效，并且可以通过控制修饰的程度容易地控制半衰期。[0102]在将本公开的具体实施方式付诸实践的同时，本发明人已经表明，包含2kda至5kda的聚乙二醇的示例性修饰的dnase在通过还原性胺化修饰时比通过酰胺化修饰时具有更高的酶活性，还原性胺化对于实现修饰比酰胺化更有效，并且修饰的dnase在脓毒病模型中具有治疗效果。[0103]现在参考附图，图1-3示出了由聚乙二醇部分不同程度修饰的示例性dnase蛋白的制备。[0104]图4示出了示例性修饰的dnase蛋白在大鼠中的半衰期为约10小时(相比之下，相应的未修饰的dnase蛋白的半衰期约为7分钟)。图6a-7示出了示例性修饰的dnase蛋白在大鼠中的半衰期为约4小时至12.5小时，这取决于修饰的程度(相比之下，相应的未修饰的dnase蛋白为几分钟)。图8示出了修饰的dnase蛋白半衰期的显著增加与auc(曲线下面积)的显著增加相关。[0105]图9a-12b示出了示例性修饰的dnase蛋白在患有脓毒病的小鼠中显示出治疗效果。图9a和9b示出了修饰的dnase蛋白比相应的未修饰的dnase蛋白更有效。图12a和12b示出了修饰的dnase蛋白的治疗效果是剂量依赖性的。[0106]修饰的dnase蛋白：[0107]根据本公开的一些实施方式的一个方面，提供了一种修饰的dnase蛋白，其包含与至少两个聚(亚烷基二醇)部分连接的dnase多肽。[0108]根据本公开的任何一些实施方式，所述多肽连接到2至7个聚(亚烷基二醇)部分；任选地，2至6个聚(亚烷基二醇)部分；任选地，2至5个聚(亚烷基二醇)部分；任选地，2至4个聚(亚烷基二醇)部分；任选地，2至3个聚(亚烷基二醇)部分。[0109]在本公开的任何一些实施方式中，所述多肽连接到至少三个聚(亚烷基二醇)部分；任选地，3至7个聚(亚烷基二醇)部分；任选地，3至6个聚(亚烷基二醇)部分；任选地，3至5个聚(亚烷基二醇)部分；任选地，3至4个聚(亚烷基二醇)部分。[0110]在本公开的任何一些实施方式中，所述多肽连接到至少4个聚(亚烷基二醇)部分；任选地，4至7个聚(亚烷基二醇)部分；任选地，4至6个聚(亚烷基二醇)部分；任选地，4至5个聚(亚烷基二醇)部分。[0111]在本公开的任何一些相应实施方式中，在所述dnase多肽中，由赖氨酸残基侧链和/或n-末端组成的所述胺基的至少10％，连接到聚(亚烷基二醇)部分(例如，根据本文所述的任何实施方式，连接到赖氨酸残基侧链的聚(亚烷基二醇)部分)，并且任选地，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，甚至约100％的赖氨酸残基侧链和n-末端胺基基团(n-terminusgaminegroups)连接到聚(亚烷基二醇)部分。[0112]在本文中，修饰的dnase蛋白包括修饰的dnase蛋白的群体(population)，并且连接到多肽的聚(亚烷基二醇)部分的数量(根据本文所述的任一实施方式)和/或连接到聚(亚烷基二醇)部分的胺基的百分比是指群体中的平均(average或mean)数量和/或百分比。[0113]在本文所述的任何一些实施方式中，修饰的dnase蛋白的特征在于比相应的未修饰的dnase蛋白(即，没有本文所述的聚(亚烷基二醇)部分)具有更长的体内半衰期。在本文所述的一些这样的实施方式中，修饰的dnase蛋白的半衰期比相应的未修饰的dnase蛋白的半衰期长至少20％。在一些实施方式中，修饰的dnase蛋白的半衰期比相应的未修饰的dnase蛋白的半衰期长至少50％。在一些实施方式中，修饰的dnase蛋白的半衰期比相应的未修饰的dnase蛋白的半衰期长至少100％(即，至少是未经修饰的dnase蛋白的半衰期的两倍)。在一些实施方式中，修饰的dnase蛋白的半衰期是相应的未修饰的dnase蛋白的至少三倍。在一些实施方式中，修饰的dnase蛋白的半衰期是相应的未修饰的dnase蛋白的至少五倍。在一些实施方式中，修饰的dnase蛋白的半衰期是相应的未修饰的dnase蛋白的至少10倍。在一些实施方式中，修饰的dnase蛋白的半衰期是相应的未修饰的dnase蛋白的至少20倍。在一些实施方式中，修饰的dnase蛋白的半衰期是相应的未修饰的dnase蛋白的至少50倍。在一些实施方式中，修饰的dnase蛋白的半衰期是相应的未修饰的dnase蛋白的至少100倍。在一些实施方式中，修饰的dnase蛋白的半衰期是相应的未修饰的dnase蛋白的至少200倍。在一些实施方案中，修饰的dnase蛋白的半衰期是相应的未修饰的dnase蛋白的至少500倍。[0114](修饰的和/或未修饰的)dnase蛋白的半衰期可以通过，例如，在将测试的dnase蛋白注射到对象(例如人类、大鼠和/或小鼠)后，测定血液(例如血浆)中测试的dnase蛋白随时间的量来确定。如本文所例举的，可以使用dna浓度测定法(例如，使用鲑鱼睾丸(salmontestis)dna)来测定dnase蛋白的量，以评估dna浓度随时间的降低，例如，分光光度测定法，其中甲基绿染料非共价连接到dna，在dna水解时改变颜色(例如，如以下实施例部分所述)。任选地或附加地，可以使用合适的抗体来确定dnase蛋白的量，例如酶联免疫吸附测定(elisatest)。[0115]在本公开的任何一些实施方式中，修饰的dnase蛋白的特征在于大鼠和/或小鼠中至少1小时的血浆半衰期(例如，通过抗体识别和/或酶活性测定)。在一些这样的实施方式中，半衰期为至少2小时。在一些实施方式中，半衰期为至少3小时。在一些实施方式中，半衰期为至少6小时。在一些实施方式中，半衰期为至少12小时。在一些实施方式中，半衰期为至少24小时。在一些实施方式中，半衰期为至少两天，或至少三天，或至少一周。[0116]根据本文所述的任一相应实施方式，修饰的dnase蛋白的较长半衰期可任选地与修饰的dnase蛋白的较大分子量(其可降低从血流中去除的速率，例如通过在肾中过滤)和/或修饰的dnase蛋白的较低免疫原性(其可降低免疫系统的失活和/或破坏的速率)相关。[0117]聚(亚烷基二醇)部分：[0118]根据本文所述的任一相应实施方式的聚(亚烷基二醇)部分可以任选地与根据本文所述的任一实施方式的dnase多肽(例如，在本文的相应部分)以本文所述的任何方式(例如，根据本文所述的与聚(亚烷基二醇)部分连接到dnase多肽的性质有关的任何实施方式)结合。[0119]如本文所用的短语“聚(亚烷基二醇)(poly(alkyleneglycol))”包括具有以下通式的聚醚聚合物家族：-[o-(ch2)m]n-o-，其中m表示每个亚烷基二醇单元中存在的亚甲基的数量，n表示重复单元的数量，因此代表聚合物的大小或长度。例如，当m＝2时，该聚合物被称为聚乙二醇，并且当m＝3时，该聚合物被称为聚丙二醇。[0120]在一些实施方式中，m是大于1的整数(例如，m＝2、3、4等)。[0121]任选地，m在聚(亚烷基二醇)链的单元之间变化。例如，聚(亚烷基二醇)链可以包含连接在一起的乙二醇(m＝2)和丙二醇(m＝3)单元。[0122]短语“聚(亚烷基二醇)”还包括其类似物，其中氧原子被另一个杂原子例如s、-nh-等取代。该术语还包括上述衍生物，其中构成聚合物的一个或多个亚甲基被取代。亚甲基上的任选取代基的示例包括但不限于烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、羟基、氧代、硫醇和硫代烷氧基等。在一些实施方式中，亚甲基上的取代基(如果存在的话)是烷基、任选地c1-4-烷基和任选地甲基。[0123]如本文所用，短语“亚烷基二醇单元(alkyleneglycolunit)”包括如上文所述的-o-(ch2)m-基团或其类似物，其形成聚(亚烷基二醇)的主链，其中(ch2)m(或其类似物)结合到聚(亚烷基二醇)(如式-[o-(ch2)m]n-o-中所示)或其杂原子类似物的末端的氧原子(或其杂原子类似物)，或属于另一亚烷基二醇单元或dnase多肽的杂原子(在末端单元的情况下)；并且o(或前述末端氧原子)或其杂原子类似物结合到另一亚烷基二醇单元的(ch2)m(或其类似物)，或结合到与dnase多肽形成键的官能团(根据本文所述的任一实施方式)。[0124]亚烷基二醇单元可以是支化的(branched)，使得其连接到3个或更多个相邻的亚烷基二醇单元，其中3个或更多个相邻的亚烷基二醇单元中的每一个是聚(亚烷基二醇)链的一部分。这种支链亚烷基二醇单元通过其杂原子与一个相邻的亚烷基二醇单元连接，剩余的相邻亚烷基二醇单元的杂原子各自与支链亚烷基二醇单元的碳原子连接。此外，杂原子(例如氮)可以结合其所属的亚烷基二醇单元的一个以上碳原子，从而形成支链亚烷基二醇单元(例如[(-ch2)m]2n-等)。[0125]在示例性实施方式中，至少50％的亚烷基二醇单元是相同的，例如它们包含彼此相同的杂原子和相同的m值。任选地，至少70％，任选地至少90％，以及任选地100％的亚烷基二醇单元是相同的。在示例性实施方式中，与相同的烷基乙二醇单元结合的杂原子是氧原子和/或亚烷基二醇单元是未取代的。在进一步的示例性实施方式中，对于相同的单元，m为2。[0126]在任一相应实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分包含聚乙二醇(polyethyleneglycol，peg)或其类似物。[0127]如本文所用，术语“聚乙二醇(polyethyleneglycol)”描述了如上文所定义的聚(亚烷基二醇)，其中至少50％、至少70％、至少90％，优选100％的亚烷基二醇单元是-ch2ch2-o-。类似地，短语“乙二醇单元(ethyleneglycolunits)”在本文中被定义为-ch2ch2-o-的单元。[0128]在任一相应实施方式中，聚乙二醇(peg)或其类似物具有以下通式：[0129]-(y1-cr1r2-cr3r4)n-y2-[0130]其中y1和y2各自独立地为o、s或nr5(任选地为o)；[0131]n是整数，任选地为2至1000(任选地10至300，以及任选地30至100)，尽管也考虑更高的n值；并且[0132]r1、r2、r3、r4和r5各自独立地为氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、羟基、氧代、硫醇和/或硫代烷氧基。[0133]在任何一些实施方式中，r1、r2、r3、r4和r5各自独立地为氢或烷基，任选地为氢或c1-4-烷基，以及任选地为氢或甲基。在示例性实施方式中，r1、r2、r3、r4和r5各自是氢。[0134]聚乙二醇或其类似物可任选地包含共聚物，例如，其中上式中的y1-cr1r2-cr3r4单元并非彼此相同。[0135]在一些实施方式中，至少50％的y1-cr1r2-cr3r4单元是相同的。任选地，至少70％，任选地至少90％以及任选地100％的y1-cr1r2-cr3r4单元是相同的。[0136]任选地，聚乙二醇部分是支化的，例如，使得对于上式中的一个或多个y1-cr1r2-cr3r4单元，r1、r2、r3、r4和r5中的至少一个是-(y1-cr1r2-cr3r4)p-y2-，其中r1至r5和y1和y2如上文所定义，并且p是如本文根据任一相应实施方式对n所定义的整数(例如，2至1000)。[0137]每个聚(亚烷基二醇)部分可以任选地包含与dnase多肽形成共价键的官能团。官能团的示例包括亚烷基和羰基(-c(＝o)-)。亚烷基或羰基可以任选地连接到多肽的氮原子(例如胺基的氮原子)，例如，以分别一起形成胺基或酰胺基。每个官能团可以任选地直接连接到聚(亚烷基二醇)部分(根据本文所述的任一相应实施方式)，或通过连接基团间接连接，任选地其中连接基团是烃部分。[0138]在本文中，短语“连接基团(linkinggroup)”描述了与化合物中的两个或更多个部分连接的基团(例如，取代基)；而短语“端基(endgroup)”描述了经由其一个原子连接到化合物中的单个部分的基团(例如，取代基)。[0139]每个聚(亚烷基二醇)部分可以独立地在一个或多个位点共价连接到dnase多肽上。[0140]在本公开的任一相应实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的至少一部分或每一个是单官能的聚(亚烷基二醇)部分。“单官能的(monofunctional)”部分是指共价连接到一个位点(并且没有更多)的部分。因此，线性单官能部分(linearmonofunctionalmoiety)由末端基团封端，如该术语在本文中被定义(例如，氢或烃部分，任选地甲基)在共价连接远端的末端；而支链单官能部分包含两个或更多个带有这种端基的末端(其中在不同末端的官能团可以相同或不同)。[0141]在本公开的任何一些实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的至少一部分或每一个具有通式i：[0142]-l2-l1-[o-(ch2)m]n-o-r1[0143]通式i[0144]其中：[0145]l1和l2各自独立地是烃部分或不存在l1和l2；[0146]r1是氢或烃部分；[0147]m是至少为2的整数，任选地在2至10的范围内；并且[0148]n是至少为2的整数，任选地在2至1000的范围内。[0149]在本文所述的任何一些相应实施方式中，l1和l2各自独立地为取代或未取代的亚烷基，任选地长度为1至6个碳原子，任选地长度为1至4个碳原子，任选地长度为1至3个碳原子，并且任选地长度为1或2个碳原子。在一些这样的实施方式中，亚烷基是未取代的，例如ch2或ch2ch2。[0150]在本公开的任何一些相应实施方式中，对于聚(亚烷基二醇)部分的至少一部分或每一个，l2是ch2，使得聚(亚烷基二醇)部分具有通式i’：[0151]-ch2-l1-[o-(ch2)m]n-o-r1[0152]通式i’[0153]其中l1、r1、m和n如式i所定义(根据本文所述的任一相应实施方式)。[0154]在本文涉及包含变量m的通式的任何一些实施方式中，m是2、3或4。在一些实施方式中，m为2或3。在一些实施方式中，m为2，使得所述聚(亚烷基二醇)部分包含聚乙二醇部分(具有n个乙二醇亚单元)。[0155]在本文涉及包含变量n的通式的任何一些实施方式中，n为至少10(例如，10至300，或10至200，或10至150，或10至100，或10至80，或10至60)。在一些这样的实施方式中，n为至少20(例如，20至300，或20至200，或20至150，或20至100，或20至80，或20至60)。在一些实施方式中，n为至少30(例如，30至300，或30至200，或30至150，或30至100，或30至80，或30至60)。在一些实施方式中，n为至少40(例如，40至300，或40至200，或40至150，或40至100，或40至80，或40至60)。在一些实施方式中，n为至少50(例如，50至300，或50至200，或50至150，或50至100，或50至80)。在一些实施方式中，n为至少60(例如，60至300，或60至200，或60至150，或60至100，或60至80)。在一些实施方式中，n为至少70(例如，70至300，或70至200，或70至150，或70至100)。[0156]在本文涉及包含变量m和n的通式的任何一些实施方式中，n为至少10(例如，10至300，或10至200，或10至150，或10至100，或10至80，或从10至60)；并且m是2、3或4，优选地2或3，并且更优选地2。在一些这样的实施方式中，n为至少20(例如，20至300，或20至200，或20至150，或20至100，或20至80，或20至60)。在一些实施方式中，n为至少30(例如，30至300，或30至200，或30至150，或30至100，或30至80，或30至60)。在一些实施方式中，n为至少40(例如，40至300，或40至200，或40至150，或40至100，或40至80，或40至60)。在一些实施方式中，n为至少50(例如，50至300，或50至200，或50至150，或50至100，或50至80)。在一些实施方式中，n为至少60(例如，60至300，或60至200，或60至150，或60至100，或60至80)。在一些实施方式中，n为至少70(例如，70至300，或70至200，或70至150，或70至100)。[0157]在本公开的任何一些实施方式中，聚(亚烷基二醇)(任选地单官能的聚(亚烷基二醇))部分的至少一部分或每一个包含与多肽中胺基的氮原子共价连接的亚烷基基团(例如，未取代的亚烷基基团)；例如，赖氨酸残基侧链和/或n-末端的胺基。根据本文所述的任一相应实施方式，亚烷基(连接到氮原子)可以任选地为例如根据式i的l2、根据式i的l1(其中l2不存在)和/或根据式i’的末端ch2基团(任选地与l1的至少一部分结合)。[0158]如本文所例举的，这种共价连接到氮原子上的亚烷基可以任选地通过醛基与胺基在还原剂的存在下(例如，根据本文所述的方法)反应获得。[0159]不受任何特定理论的束缚，可以认为聚(亚烷基二醇)部分经由与多肽氮原子共价连接的亚烷基基团的连接比共价连接的取代技术，例如在羰基(-c(＝o)-)基团(任选地通过羧酸酯基团的缩合衍生)和多肽胺基团之间形成酰胺键，有利地具有更低的免疫原性和/或对酶活性更低的损害。[0160]在本文所述的任何一些相应实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分(任选地，单官能的聚(亚烷基二醇)部分)的分子量不超过约10kda。在一些这样的实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量不超过约7.5kda。在一些实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量不超过约5kda。[0161]在本文所述的任何一些相应实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分(任选地，单官能的聚(亚烷基二醇)部分)的分子量为至少约1.5kda。在一些这样的实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量在约1.5kda至约10kda的范围内。在一些实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量在约1.5kda至约7.5kda的范围内。在一些实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量在约1.5kda至约5kda的范围内。在一些实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量在约1.5kda至约3kda的范围内。[0162]在本文所述的任何一些相应实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分(任选地，单官能的聚(亚烷基二醇)部分)的分子量为至少约2kda。在一些这样的实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量在约2kda至约10kda的范围内。在一些实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量在约2kda至约7.5kda的范围内。在一些实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量在约2kda至约5kda的范围内。在一些实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量在约2kda至约3kda的范围内。在一些示例性实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量为约2kda。[0163]在本文所述的任何一些相应实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分(任选地，单官能的聚(亚烷基二醇)部分)的分子量为至少约3kda。在一些这样的实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量在约3kda至约10kda的范围内。在一些实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量在约3kda至约7.5kda的范围内。在一些实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量在约3kda至约5kda的范围内。在一些实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量在约2kda至约3kda的范围内。[0164]在本文所述的任何一些相应实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分(任选地，单官能的聚(亚烷基二醇)部分)的分子量为至少约4kda。在一些这样的实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量在约4kda至约10kda的范围内。在一些实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量在约4kda至约7.5kda的范围内。在一些实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量在约4kda至约5kda的范围内。[0165]在本文所述的任何一些相应实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分(任选地，单官能的聚(亚烷基二醇)部分)的分子量为至少约5kda。在一些这样的实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量在约5kda至约10kda的范围内。在一些实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量在约5kda至约7.5kda的范围内。在一些实施方式中，聚(亚烷基二醇)部分的分子量为约5kda。[0166]不受任何特定理论的束缚，可以认为聚(亚烷基二醇)部分可以以保护体内dnase活性和/或降低免疫原性的方式从免疫系统中掩蔽(mask)dnase多肽，并且过小的聚(亚烷基二醇)部分和/或少量(例如一个)聚(亚烷基二醇)部分可能导致多肽的无效掩蔽(ineffectivemasking)。可以进一步认为，过大的聚(亚烷基二醇)部分可能导致多肽的无效掩蔽，例如，其中大的聚(亚烷基二醇)部分的连接在空间上抑制了额外的聚(亚烷基二醇)部分的连接，在多肽的掩蔽中留下间隙(例如，抗体可以穿过该间隙)。还可以进一步认为，大的聚(亚烷基二醇)部分本身可能比较短的部分更具免疫反应性[rudmann等人，毒理学病理学(toxicologicpathology)2013,41:970-983；moreno等人，细胞化学生物学(cellchembiol)2019,26:634-644；garay等人，药物输送专家观点(expertopindrugdeliv)2012,9:1319-1323；wan等人，生化工艺(processbiochemistry)2017,52:183-191；ehrlich等人，分子识别杂志(jmolrecognition)2009,22:99-103]。[0167]降低免疫原性可能促进重复施用修饰的蛋白质和/或增强蛋白质的功效。例如，据报道，抗-peg抗体是在临床治疗期间peg化尿酸酶失去活性的原因[zhang等人，控制释放期刊(jcontrolrelease)2016,244:184-193]。此外，甚至急性治疗选择也可能由于针对聚(亚烷基二醇)部分的预先存在的抗体的存在而受到危害，所述抗体据报道存在于一般人群中[lubich等人，药学研究(pharmres)2016,33:2239-2249]。[0168]此外，使用相对较短的聚(亚烷基二醇)部分可以任选地允许对修饰的dnase蛋白的循环时间进行更好的控制，这是通过允许在确定修饰程度方面具有更大的灵活性(例如，通过调节聚(亚烷基二醇)部分的数量和/或聚(亚烷基二醇)部分的大小，如本文所例举的)，从而有助于将长效修饰的dnase适应于治疗不同适应症的特定需要。例如，相对短的半衰期(例如，约一天或更短)可能最适于治疗急性病症(例如，与炎症相关的急性病症)；然而，较长的半衰期可能最适于治疗慢性病症(例如，允许较不频繁的给药)。[0169]dnase多肽：[0170]除非明确提及修饰的dnase蛋白之外，以下部分描述了根据任何一个实施方式的dnase多肽，其对应于本文所述的修饰的dnase蛋白，除了存在本文所述的聚(亚烷基二醇)部分。[0171]在未修饰的蛋白质的上下文中，术语“蛋白质(protein)”和“多肽(polypeptide)”在本文中可互换使用。在修饰的蛋白质的上下文中，术语“多肽”仅用于强调衍生自未修饰的蛋白质的修饰的蛋白质部分，而不是聚(亚烷基二醇)部分，并且不旨在进行限制。[0172]通过考虑根据本节中描述的任一实施方式的未修饰的dnase，结合根据本文描述的任一相应实施方式的修饰(例如，聚乙二醇化)，技术人员将理解根据本公开的一些实施方式的修饰的dnase蛋白的结构。[0173]如本文所用，术语“dnase”和“dnase蛋白”包括任何脱氧核糖核酸酶，包括脱氧核糖核酸酶的dnasei和dnaseii家族。[0174]如本文所用，术语“dnasei”和“dnasei蛋白”是指脱氧核糖核酸酶i(ec3.1.21.1)多肽。dnasei被归类为核酸内切酶，其切割dna以产生5'-磷酸二核苷酸和5'-磷酸寡核苷酸终产物，优选双链dna底物和碱性ph最佳值。[0175]dnasei作用于单链dna、双链dna和染色质。[0176]如本文所用，术语“dnaseii”和“dnaseii蛋白”是指脱氧核糖核酸酶ii(ec3.1.22.1)多肽。dnaseii被归类为核酸内切酶，优选酸性ph最佳值。[0177]根据本教导的一些实施方式的dnase(即未修饰的)，被肌动蛋白抑制。[0178]根据本教导的一些实施方式的dnase(即未修饰的)，不被肌动蛋白抑制。[0179]本文中，短语“被肌动蛋白抑制(inhibitedbyactin)”是指在37℃下，在50μg/ml人类非肌动蛋白(相对于不存在肌动蛋白时的活性)存在下，dna水解活性(例如，dnase酶)降低至少20％。[0180]在本文所述的任何一些相应实施方式中，dnase是如本文所定义的dnasei。[0181]根据一个具体的实施方式，dnase是如seqidno:1所示的人类dnasei。[0182]还考虑了具有dnasei活性的人类dnasei的同源物(即，功能等同物)和直向同源物(例如，小鼠nm_010061.5no_034191.3)。[0183]在本文中，给定多肽的“同源物(homolog)”是指与给定多肽表现出至少80％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％同源性，更优选至少98％同源性的多肽(任选地，与给定多肽表现出至少80％、至少90％同一性，至少95％，或至少98％序列同一性)。在一些实施方式中，给定多肽的同源物进一步与给定多肽共享治疗活性。同源性的百分比是指第一多肽序列中与第一多肽所比较的第二多肽序列的相应残基相匹配的氨基酸残基的百分比。通常，对多肽进行比对以得到最大同源性。本领域已知多种策略用于进行氨基酸或核苷酸序列的比较以评估同一性程度，包括例如手动比对(manualalignment)、计算机辅助序列比对(computerassistedsequencealignment)及其组合。用于执行序列比对的许多算法(通常是计算机实现的)是广泛可用的，或者可以由本领域技术人员产生。代表性的算法包括，例如，史密斯-沃特曼局部同源性算法(localhomologyalgorithmofsmithandwaterman)[应用数学进展(advapplmath),1981,2:482]；尼德勒曼-翁施同源性比对算法(homologyalignmentalgorithmofneedlemanandwunsch)[分子生物学杂志(jmolbiol)1970,48:443]；pearson和lipman的搜索相似性算法[美国科学院院报(pnas)988,85:2444]；和/或通过这些算法的计算机化实现(例如，威斯康星遗传学软件包版本7.0(wisconsingeneticssoftwarepackagerelease7.0)中的gap、bestfit、fasta和tfasta，遗传学计算机集团(geneticscomputergroup)，575科学(science)麦迪逊博士(dr.,madison,wis.))。包含这种算法的容易获得的计算机程序包括，例如，blastn、blastp、gappedblast、pileup、clustalw等。当使用blast和gappedblast程序时，可以使用相应程序的默认参数。或者，从业者(practitioner)可以根据他或她的实验和/或其它要求来使用非默认参数(例如，参见网址为urlwww.ncbi.nlm.nih.gov的网站)。[0184]此类同源物可以例如与seqidno:1至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同或同源(同一性+同源性)，如使用威斯康星序列分析包(wisconsinsequenceanalysispackage)的bestfit软件，使用史密斯-沃特曼算法测定，其中间隙权重(间隙权重)等于50，长度权重(lengthweight)等于3，平均匹配(averagematch)等于10，平均错配(averagemismatch)等于-9。[0185]本公开的实施方式包括上文所述的核酸序列；其片段、可与其杂交的序列、与其同源的序列、与其直系同源的序列(sequencesorthologousthereto)、编码具有不同密码子用法的类似多肽的序列、以突变为特征的改变的序列，例如一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代，无论是天然发生的还是人工诱导的，随机的还是以靶向的方式，所有这些统称为“基本同源物(substantialhomologs)”。[0186]术语“基本同源物(substantialhomolog)”，当用于描述被修饰以提供修饰的dnase的氨基酸序列时，在本文中也指与本文详细描述的dnase蛋白的另一个氨基酸序列具有至少80％同源性、任选地至少90％同源性、任选地至少95％同源性、任选地至少98％同源性，以及任选地至少99％同源性的氨基酸序列。[0187]核酸内切酶的dnasei家族的其它成员是人类的dnasex、dnaseγ、dnaseλ、dnase1l2、dnase1l3和泪液脂质运载蛋白(tearlipocalin)。dnasei还包括，尤其是，碱性dnase、牛胰腺(bovinepancreatic，bp)dnase、dnasea、dna磷酸酶和dna核酸内切酶，例如，在黄牛(bostaurus)中。[0188]未修饰的dnase可以是从天然表达dnase的细胞/组织中提取的纯化dnase。[0189]任选地或另外地，dna酶是重组产生的。在一些实施方式中，dnase是重组产生的dnasei。在一些实施方式中，dnase(例如，dnasei)是植物重组多肽，即，由植物细胞重组产生。[0190]对于重组表达，编码dnase的核酸序列在顺式作用调节元件(例如启动子)的转录调节下连接到核酸表达载体中。[0191]除了包含转录和翻译插入的编码序列的必要元件之外，本公开一些实施方式的表达构建体还可以包括经工程改造以增强所表达的肽的稳定性、生产、纯化、产量或毒性的序列。各种原核或真核细胞可用作宿主表达系统，以表达本公开一些实施方式的dnase。这些包括但不限于微生物，例如用含有该编码序列的重组噬菌体dna、质粒dna或粘粒dna(cosmiddna)表达载体转化的细菌；用含有编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(yeast)；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病病毒(cauliflowermosaicvirus，camv)、烟草花叶病病毒(tobaccomosaicvirus，tmv))感染或用含有编码序列的重组质粒表达载体(如ti质粒)转化的植物细胞系统。哺乳动物表达系统也可用于表达本公开一些实施方式的多肽。[0192]细菌构建体的示例包括大肠杆菌表达载体的pet系列[studier等人，酶学方法(methodsenzymol)1990,185:60-89]。[0193]在酵母中，可以使用多种含有组成型或诱导型启动子的载体，如申请号为5,932,447的美国专利申请中所公开的。或者，可以使用促进外源dna序列整合到酵母染色体中的载体。[0194]在使用植物表达载体的情况下，编码序列的表达可以由多个启动子驱动。例如，可以使用病毒启动子如camv的35srna和19srna启动子[brisson等人，自然(nature)1984,310:511-514]，或tmv的外壳蛋白启动子(coatproteinpromoter)[takamatsu等人，欧洲分子生物学学会杂志(emboj)1987,6:307-311]。或者，可以使用植物启动子如rubisco的小亚基[coruzzi等人，欧洲分子生物学学会杂志(emboj)1984,3:1671-1680；brogli等人，科学(science)1984,224:838-843]，或热休克启动子如大豆hsp17.5-e或hsp17.3-b[gurley等人，生化与分子生物学(molcellbiol)1986,6:559-565]。可以使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电穿孔和本领域技术人员熟知的其它技术将这些构建体导入植物细胞。参见，例如，weissbach&weissbach，植物分子生物学方法(methodsforplantmolecularbiology)(1988),美国学术出版社(academicpress),ny，第viii节，第421-463页。[0195]根据一个具体的实施方式，dnase在植物细胞悬浮培养物中产生，如国际专利申请公开wo2013/114374中所述，其通过引用整体并入本文。[0196]因此，人类dnasei蛋白的至少一部分具有n-末端甘氨酸残基(seqidno:2)。在一些实施方式中，人类dnasei蛋白包含seqidno:2所示的dnasei和seqidno:1所示的dnasei的混合物。[0197]这种蛋白可以从核酸构建体表达，所述核酸构建体包含编码人类dnasei的核酸序列，所述核酸序列在其n-末端翻译融合到由seqidno:3中所示核酸序列编码的拟南芥abpi内质网靶向信号肽。[0198]如本文所用，术语“拟南芥abpi内质网靶向信号肽(arabidopsisabpiendoplasmicreticulumtargetingsignalpeptide)”是指拟南芥生长素结合蛋白的前导肽序列，其能够将表达的蛋白导向植物细胞内的内质网。在一个实施方式中，拟南芥abpi内质网靶向信号肽是seqidno:8所示的33个氨基酸的多肽。[0199]因此，根据一些实施方式，人类dnasei蛋白在n-末端与拟南芥abpi内质网靶向信号肽连续连接，人类dnasei蛋白具有seqidno:9中所示的氨基酸序列。[0200]人类dnasei蛋白可以任选地由seqidno:6所示的核酸序列编码。拟南芥abpi内质网靶向信号肽可以任选地由seqidno:3所示的核酸序列编码。在n-末端与拟南芥abpi内质网靶向信号肽连续连接的人类dnasei蛋白可以任选地由seqidno:7所示的核酸序列编码。[0201]本文还提供了编码天然人类dnasei蛋白(seqidno:5；基因库(genbank):nm_005223，序列(a))的天然核酸序列(seqidno:4)，所述天然人类dnasei蛋白包括天然信号前导肽。[0202]本公开的一些实施方式也可以使用其它表达系统，如昆虫和哺乳动物宿主细胞系统，他们是本领域公知的，并将在下文中进一步描述。[0203]根据本文所述的与人类dnasei相关的任何一些实施方式，dnasei是成熟的人类dnasei。在一些实施方式中，dnasei是多纳斯·阿尔法dnasei(dornasealfadnasei)(例如，)。[0204]根据本文所述的任何一些实施方式，人类dnasei包含seqidno:1所示的氨基酸序列。[0205]应当理解，具有与seqidno:1的人类dnasei氨基酸序列同源(例如，至少80％同源，如本文所述)的氨基酸序列的dnasei蛋白可以任选地保持人类dnasei的特征结构和/或功能。与人类dnasei蛋白的氨基酸序列同源的氨基酸序列的一个非限制性示例是seqidno:2。其与seqidno:1非常相似。[0206]在本文描述的任何一些实施方式中，dnase蛋白是人类dnasei蛋白的变体，任选地是人类dnasei的天然存在的(至少在一些人中)变体。已经公开了具有改变的催化和/或其他生物化学和结构特性的人类dnase蛋白的变体，例如改变的肌动蛋白亲和力、辅因子要求、ph最佳值、增加的储存保存期等、增强的重组表达或融合蛋白。合适的修饰的dnase多肽包括但不限于在美国专利us6,348,343、us6,391,607、us7,407,785和us7,297,526，以及国际专利申请公开wo96/26279、wo2008/039989和wo2013/114374中公开的dnase多肽，它们中的每一个通过引用整体并入本文，特别是关于脱氧核糖核酸酶多肽及其制备方法。[0207]在一些实施方式中，dnase在烟草(tobacco)(例如烟草(nicotianatabacum)细胞)中表达，其可以任选地在悬浮液中，例如，在亮黄-2(brightyellow-2，by2)细胞培养物中表达的dnasei(例如，如下文例举的，和/或如国际专利申请公开wo2013/114374中描述的)。[0208]在一些实施方式中，使用农杆菌介导的(agrobacterium-mediated)转化用于将外源基因引入植物细胞基因组。该技术基于农杆菌(agrobacterium)通过将质粒dna片段(即转移的dna(transferreddna)，t-dna)转移到宿主细胞基因组中来转化植物细胞的天然能力。使用这种方法，将由外源基因及其调节元件组成的t-dna分子随机引入植物基因组中。整合位点以及基因插入的拷贝数不受控制，因此转化过程产生了由具有不同转基因表达水平的细胞组成的转基因细胞的“库(pool)”。随后将转基因“库”用于克隆分离。克隆分离导致许多单细胞系的建立，然后从中选择具有最高外源基因表达水平的克隆。在一些实施方式中，农杆菌介导的转化用于将外源基因导入烟草(tobacco)细胞的基因组，例如但不限于烟草(nicotianatabacum)l.cv亮黄(by-2)细胞。[0209]在本文所述的任何一些实施方式中，dnase(例如植物重组人类dnasei)多肽的分子量类似于在哺乳动物细胞中表达的重组人类dnasei(dnasei)的分子量，如通过page和/或质谱测定。[0210]在本文所述的任何一些实施方式中，dnase(例如植物重组人类dnasei)多肽具有通过sds-page测量的约30kda的分子量，以及通过质谱测量的约32kda的分子量。[0211]在本文所述的任何一些实施方式中，未修饰的dnase(例如，植物重组人类dnasei)是糖基化的。[0212]在本文所述的任何一些实施方式中，修饰的dnase(例如，植物重组人类dnasei)是糖基化的。[0213]在本文所述的任何一些实施方式中，糖基化dnase(例如，植物重组人类dnasei)蛋白的等电点处于比在哺乳动物细胞中表达的重组人类dnasei的等电点更高的ph。[0214]当出现一系列等电点(例如，在等电聚焦时观察到谱带(band))时，dnase的“等电点(isoelectricpoint)”在本文中是指平均等电点。[0215]不受任何特定理论的束缚，据信与哺乳动物细胞中表达的dnase(如本文所例举的植物重组dnasei)相比，较高的等电点(表明负电荷较少)和/或带正电荷的胺基团的保留(例如，如还原性胺化相对于酰胺键形成)可增强dnase对负电荷的dna的亲和力，从而降低米氏常数(michaelisconstant)。[0216]在本文所述的任何一些实施方式中，dnase(例如植物重组人类dnasei)是糖基化蛋白，其包含分子量为约29kda的多肽部分。[0217]在本文所述的任何一些实施方式中，修饰的和/或未修饰的dnase是纯化的蛋白质，其任选地特征在于纯度(例如，本文所述的组合物中的dnasei)为至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少91.5％、至少92％、至少92.5％、至少93％、至少93.1％、至少93.2％、至少93.3％、至少93.4％、至少93.5％、至少93.6％、至少93.7％、至少93.8％、至少93.9％、至少94％、至少94.5％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％，在至少95.0％至99.8％或100％范围内。在一些实施方式中，修饰的和/或未修饰的dnase蛋白的纯度通过hplc测量。[0218]上文所述的纯度是指低水平的(或不存在)杂质。故意添加到包含修饰和/或未修饰的dnase的组合物中的成分(例如，如本文所述的组合物的任何成分)在本文中不被认为是影响dnase蛋白的纯度的杂质。[0219]在一些实施方式中，dnase是重组dnase，任选地是植物重组人类dnase，并且上文所述的纯度是指低水平的(或不存在)杂质，所述杂质来自dnase蛋白分泌到其中的培养基和/或来生自宿主细胞(例如植物宿主细胞)，例如但不限于核酸和多核苷酸、氨基酸、寡肽和多肽、聚糖和其它碳水化合物、脂质等。在一些实施方式中，宿主细胞衍生的杂质包括生物活性分子，例如酶。[0220]在本文所述的任何一些实施方式中，dnase蛋白(例如植物重组dnase，例如植物重组dnasei)被糖基化，使得dnase多肽每个多肽分子平均具有至少0.2个、任选地至少0.5个、任选地至少1个、任选地至少2个、任选地至少3个或任选地至少4个或更多个裸露的(exposed)甘露糖残基。[0221]本文中，“裸露的(exposed)”残基是指仅通过一个共价键连接到聚糖非还原末端的单糖残基。[0222]在本文所述的任何一些实施方式中，dnase蛋白(例如植物重组dnase，例如植物重组dnasei)是糖基化的，使得dnase多肽每个多肽分子平均具有至少一个，任选地至少两个核心木糖残基。[0223]在本文所述的任何一些实施方式中，dnase蛋白(例如植物重组dnase，例如植物重组dnasei)是糖基化的，使得dnase多肽每个多肽分子平均具有至少0.2个、任选地至少0.5个、任选地至少一个、以及任选地约两个核心α-(1,3)岩藻糖残基。[0224]在本文所述的任何一些实施方式中，dnase蛋白(例如植物重组dnase，例如植物重组dnasei)是糖基化的，使得dnase多肽每个多肽分子平均具有至少一个核心木糖残基和至少一个α-(1,3)岩藻糖残基。[0225]在本文所述的任何一些实施方式中，dnase蛋白(例如植物重组dnase，例如植物重组dnasei)是糖基化的，使得dnase多肽每个多肽分子平均具有至少一个裸露的甘露糖残基、至少一个核心木糖残基和至少一个α-(1,3)岩藻糖残基。[0226]在本文所述的任何一些实施方式中，dnase蛋白(例如植物重组dnase，例如植物重组dnasei)是糖基化的，使得dnase多肽每个多肽分子，任选地在甘露糖残基的外部(远离多肽)，平均具有至少一个、任选地至少两个、任选地至少3个、任选地至少4个末端n-乙酰葡糖胺取代基。[0227]在本文所述的任何一些实施方式中，dnase蛋白(例如植物重组dnase，例如植物重组dnasei)缺乏唾液酸残基。[0228]本文中，“缺乏唾液酸残基(devoidofsialicacidresidues)”是指少于1％、任选地少于0.1％，以及任选地少于0.01％的聚糖含有唾液酸残基。[0229]上述关于糖基化的一些或所有特征可在植物重组dnase(根据本文所述的任一相应实施方式)中获得，其可以任选地表现出高甘露糖糖基化(例如，裸露的甘露糖残基和/或每个聚糖超过3个甘露糖残基)和植物特异性聚糖残基。[0230]根据本文所述的任何实施方式，可任选地将额外的修饰(除了连接聚(亚烷基二醇)部分之外)引入dnase，任选地引入增强肌动蛋白抗性的修饰。非限制性示例包括如国际专利申请公开wo2016/108244中所述的修饰(例如，用酰胺部分替换羧酸部分)，其内容通过引用整体并入本文，特别是关于修饰的内容，更特别是用于增强肌动蛋白抗性的修饰。[0231]修饰的dnase的制备：[0232]根据本公开的一些实施方式的一个方面，提供了制备根据本文描述的任一相应实施方式的修饰的dnase蛋白的方法。根据这些实施方式，该方法包括：(a)使dnase多肽(例如，根据本文所述的一个实施方式的dnase蛋白)与包含连接到醛基(-c(＝o)h)的聚(亚烷基二醇)(根据本公开的任一相应实施方式)的试剂接触，以获得多肽和包含聚(亚烷基二醇)的试剂的缀合物；以及(b)使所述缀合物与还原剂接触。[0233]在本文所述的任何一些相应实施方式中，聚(亚烷基二醇)包含不超过一个醛基。[0234]根据涉及方法的本公开的任何一些实施方式，包含聚(亚烷基二醇)的试剂具有通式ii：[0235]hc(＝o)-l1-[o-(ch2)m]n-o-r1[0236]通式ii[0237]其中，l1是烃部分；r1是氢或烃部分；m是至少2，任选地2至10的范围内的整数；并且n是至少2，任选地2至1000范围内的整数(例如，其中l1、r1、m和/或n如根据本文描述的与式i和/或i’相关的任何相应实施方式中所定义)。式ii的试剂可以任选地用于获得根据式i和/或i’的聚(亚烷基二醇)部分(根据本文所述的任一相应实施方式)；例如，醛基与胺基反应(例如，形成亚胺或半缩醛胺中间体)，并还原形成胺基。[0238]合适的还原剂的示例包括但不限于硼烷及其络合物(例如，甲基吡啶硼烷络合物)、硼氢化物(例如，硼氢化钠)、三乙酰氧基硼氢化物(例如，三乙酰氧基硼氢化钠)、氰基硼氢化物(例如，氰基硼氢化钠)，以及本领域已知的适用于还原胺化方法的任何其它还原剂。示例性的还原剂包括但不限于2-甲基吡啶硼烷络合物和氰基硼氢化钠。[0239]在涉及方法的本公开的任何一些相应实施方式中，使缀合物与还原剂接触在至少约7的ph下进行，以及任选地至少约8的ph下进行。在示例性实施方式中，ph为约7。[0240]不受任何特定理论的束缚，据信较高的ph值通常与更多具有活性的dnase胺基团(例如赖氨酸残基)相关，因此与更多的连接到dnase多肽的聚(亚烷基二醇)部分相关。[0241]dnase多肽、包含聚(亚烷基二醇)的试剂和还原剂可以任选地以任何顺序组合。例如，可以任选地将包含聚(亚烷基二醇)的试剂加入到包含多肽和还原剂的混合物中，或者可以任选地将多肽加入到包含含有聚(亚烷基二醇)的试剂和还原剂(例如，使得多肽和包含聚(亚烷基二醇)的试剂的缀合物在形成缀合物时已经与还原剂接触)的混合物中。在一些实施方式中，dnase多肽、包含聚(亚烷基二醇)的试剂和还原剂基本上同时结合(例如，作为“一锅反应”)。[0242]在本文所述的任何一些相应实施方式中，试剂(根据本文所述的任一相应实施方式)和与试剂(根据本文所述的任一相应实施方式)接触的dnase多肽的摩尔比至少为10:1。在一些这样的实施方式中，摩尔比为10:1至10,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为10:1至5,000:1。在一些实施方案中，摩尔比为10:1至2,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为10:1至1,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为10:1至500:1。在一些实施方式中，摩尔比为10:1至200:1。在一些实施方式中，摩尔比为10:1至100:1。[0243]在本文所述的任何一些相应实施方式中，试剂(根据本文所述的任一相应实施方式)和与试剂(根据本文所述的任一相应实施方式)接触的dnase多肽的摩尔比至少为20:1。在一些这样的实施方式中，摩尔比为20:1至10,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为20:1至5,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为20:1至2,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为20:1至1,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为20:1至500:1。在一些实施方式中，摩尔比为20:1至200:1。在一些实施方式中，摩尔比为20:1至100:1。[0244]在本文所述的任何一些相应实施方式中，试剂(根据本文所述的任一相应实施方式)和与试剂(根据本文所述的任一相应实施方式)接触的dnase多肽的摩尔比是至少50:1。在一些这样的实施方式中，摩尔比为50:1至10,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为50:1至5,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为50:1至2,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为50:1至1,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为50:1至500:1。在一些实施方式中，摩尔比为50:1至200:1。在一些实施方式中，摩尔比为50:1至100:1。[0245]在本文所述的任何一些相应实施方式中，试剂(根据本文所述的任一相应实施方式)和与试剂(根据本文所述的任一相应实施方式)接触的dnase多肽的摩尔比至少为100:1。在一些这样的实施方式中，摩尔比为100:1至10,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为100:1至5,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为100:1至2,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为50:1至1,000:1。在一些实施方式中，摩尔比为100:1至500:1。在一些实施方式中，摩尔比为100:1至200:1。[0246]在本文所述的任何一些相应实施方式中，试剂(根据本文所述的任一相应实施方conditions)的链霉素酶结合。[0257]可根据本公开的实施方式可治疗的疾病或病症的示例包括但不限于与以下疾病相关的病症：慢性中性粒细胞增多症(例如中性粒细胞数量的增加)；中性粒细胞聚集和白细胞淤积症；血栓形成和血管闭塞(例如镰状细胞病)；缺血-再灌注损伤(例如：中肠扭转、睾丸扭转、致肢体缺血-再灌注、重要器官缺血-再灌注、器官移植)；手术和创伤性组织损伤；急性或慢性炎症反应或疾病；自身免疫性疾病或病症(例如：系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，sle)、狼疮性肾炎、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)、血管炎、系统性硬化症、银屑病、特应性皮炎、炎症性肠病(inflammatoryboweldisease，ibd)、溃疡性结肠炎、克罗恩病(crohn’sdisease)、痛风、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)、抗磷脂综合征)；心血管疾病(例如：心肌梗塞、中风、动脉粥样硬化、静脉血栓栓塞症、深静脉血栓形成(deepveinthrombosis，dvt)，包括溶栓疗法(thrombolytictherapy)、冠状动脉病)；代谢疾病(例如糖尿病)；全身性炎症(systemicinflammation)(例如：全身炎症反应综合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，sirs)、脓毒病(sepsis)、败血症(septicemia)、感染性休克(septicshock)、脓毒病相关器官衰竭(sepsisassociatedorganfailure)、弥散性血管内凝血(disseminatedintravascularcoagulation，dic)和血栓性微血管病(thromboticmicroangiopathy，tma))；呼吸道的炎性疾病和病症(例如：囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease，copd)、急性肺损伤(acutelunginjury，ali)、烟雾诱导的肺损伤、输血诱导的肺损伤(transfusion-inducedlunginjury，trali)、急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratorydistresssyndrome，ards)、气喘、脓胸、卡塔格内氏综合征、肺叶不张(lobaratelectasis)、慢性支气管炎、支气管扩张、原发性纤毛运动不良症、毛细支气管炎、胸膜感染)；肾炎性疾病(急性和慢性肾脏疾病，包括急性肾损伤(acutekidneyinjury，aki)和慢性肾病(chronickidneydisease，ckd))；与移植组织有关的炎性疾病(例如，移植物抗宿主病)；癌症(例如：白血病、肿瘤转移和实体瘤、手术后的肿瘤转移、纤维化和与放疗和/或化疗相关的组织损伤)；神经变性疾病或病症；与病毒感染相关的病症(例如：与covid-19和流感、病毒感染相关的脓毒病、aki、ali或ards，和/或病毒感染相关的血栓形成相关的病症)；以及与细菌、真菌和/或原生动物感染(例如：脓毒病、aki、ali或ards，和/或血栓形成)相关的病症。[0258]在任何一些相应实施方式中，神经变性疾病或病症与患者的血液或脑脊液或肠中细胞外dna(例如，原核和/或人类)的水平增加有关，该水平高于对照水平(例如，健康年龄匹配的个体的血液或脑脊液或肠中细胞外dna的水平或若干健康年龄匹配的个体的血液或脑脊液或肠中细胞外dna的平均水平)。神经变性疾病和病症的非限制性示例包括，例如，阿尔茨海默病(例如，迟发性阿尔茨海默病)、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis，als)、亨廷顿病和神经系统功能障碍(例如，精神分裂症或双相型障碍)。[0259]根据本文描述的实施方式的修饰的dnase的其它应用包括但不限于伤口清洁和促进伤口愈合，以及治疗溃疡(例如，腿部溃疡)、气动后贫血、鼻窦炎、慢性血肿、心内膜炎、肝肾综合征、血胸、胆道内血栓、肝损伤、肝感染、横纹肌溶解症、结节病、肝硬化、纤维化、女性不育症、男性不育症、肝素诱导的血小板减少症、干眼症、急性冠脉综合征和/或创伤(trauma)(手术、损伤)，例如体外循环手术并发症、术后隆鼻术(post-operativerhinoplasties)。[0260]任选地，修饰的dnase可用于预防或改善与化疗、急性或慢性炎性病症，或急性或慢性感染相关的嗜中性白血球减少症。[0261]在一些实施方式中，对象患有导管系统中的导管闭塞或处于导管系统中的导管闭塞的风险中。导管系统或含有导管系统的器官或组织的非限制性示例包括：胆管、泪管、输乳管(lactiferousduct)、胆囊管、肝管、射精管、腮腺管、下颌腺管(submandibularduct)、舌下腺大管、下颌下腺管(submandibularduct)、巴多林氏管(bartholin’sduct)、大脑导水管、胰腺、乳腺、输精管、输尿管、膀胱、胆囊和肝。因此，本公开任选地用于治疗患有胰腺炎、胆管炎、结膜炎、乳腺炎、干眼症、输精管阻塞或肾病的对象。[0262]在其它实施方式中，对象具有或处于net积聚在内皮表面(例如，手术粘连)、皮肤(例如，伤口/疤痕、溃疡)或滑膜关节(例如，痛风、关节炎)的风险中。例如，net可能导致手术粘连，例如在侵入性医疗过程之后。本公开可任选地在外科手术期间施用，以防止或抑制外科手术粘连的形成。[0263]在其它实施方式中，修饰的dnase可以局部施用(例如施用于皮肤)，以预防或治疗伤口和/或疤痕。或者，可以将修饰的dnase施用于滑膜关节以预防或治疗痛风和关节炎。[0264]在一些实施方式中，所述组合物用于治疗呼吸(例如，肺部(pulmonary))病症和/或用于降低痰的粘度(例如，由剪切损失模量和/或剪切储能模量的降低来表示)。可以通过施用根据本文所述任一相应实施方式的经修饰的dnasei蛋白来治疗的呼吸病症或疾病包括，但不限于：急性或慢性支气管肺病、肺膨胀不全(例如，由于气管或支气管嵌塞和气管造口术的并发症)、支气管炎和气管支气管炎(例如，慢性支气管炎、哮喘性支气管炎)、囊性纤维化、肺炎、过敏性疾病(例如，过敏性气喘)、非过敏性气喘、结核病、支气管肺真菌感染、系统性红斑狼疮、修格兰氏症候群、支气管扩张(例如非囊性纤维化支气管扩张)、肺气肿、急性和慢性鼻窦炎和普通感冒。[0265]在本文所述的涉及可通过dnasei活性治疗的疾病或病症的任何一些实施方式中，所述疾病或病症是化脓性疾病或病症。在一些实施方式中，所述疾病或病症是化脓性肺病。在一些实施方式中，所述疾病或病症是慢性化脓性肺病(chronicsuppurativelungdisease，csld)，例如以慢性湿咳和进行性肺损伤为特征的疾病或病症。根据本公开的实施方式可治疗的csld可以任选地是囊性纤维化或非囊性纤维化csld。非囊性纤维化csld的示例包括但不限于非囊性纤维化支气管扩张和慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisorder，copd)(包括慢性支气管炎和肺气肿)。在一些实施方式中，所述疾病或病症是囊性纤维化。[0266]不受任何特定理论的束缚，据信本文所述的修饰的dnase蛋白的较长半衰期可能特别适用于涉及全身治疗(其中清除未修饰的dnase是其治疗效用的主要障碍)，以及全身给药可能有益于治疗的病症的治疗；然而，施用至呼吸道的未修饰的dnase受短半衰期的影响较小，所述短半衰期可被聚(亚烷基二醇)部分克服(例如，由于呼吸道中蛋白质的清除速度较慢)。[0267]在本文所述的涉及治疗的任何一些实施方式中，待治疗的对象患有假单胞菌(例如，铜绿假单胞菌)肺部感染，任选地除了本文所述的肺部疾病或病症之外，例如囊性纤维化。[0268]根据本文所述任一相应实施方式的修饰的dnase蛋白可用于生产药物组合物，和/或以与国际专利申请公开wo2016/108244(根据本文所述任一实施方式)中所述基本相同的方式使用和/或施用，其内容整体并入本文，特别是关于药物组合物，修饰的dnasei的用途和肺部施用的内容。例如，施用可以是全身性的(systemic)或局部的；和/或通过吸入、局部和/或通过注射。[0269]预期在从本技术开始的专利有效期内，将会发现许多与dna和/或nets相关的病症，术语“治疗(treating)”及其语法变体的范围旨在包括所有这些先验的新技术。[0270]根据本文所述的任一相应实施方式的修饰的dnase蛋白本身(perse)可以任选地使用，或者作为药物组合物的一部分使用，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。[0271]如本文所用，“药物组合物(pharmaceuticalcomposition)”是指本文所述的一种或多种修饰的dnase与其它化学成分如药学上可接受的和合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。[0272]下文中，术语“药学上可接受的载体(pharmaceuticallyacceptablecarrier)”是指不会对生物体造成显著刺激并且不会消除所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。载体的非限制性示例是丙二醇、盐水、乳液和有机溶剂与水的混合物，以及固体(例如粉末)和气态载体。[0273]本文中，术语“赋形剂(excipient)”是指加入到药物组合物中以进一步促进化合物的施用的惰性物质。赋形剂的示例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚合物如聚乙二醇。[0274]可以在以下文献中找到药物的配制和给药技术：“雷明登氏药学全书(remington'spharmaceuticalsciences)”，麦克出版公司(mackpublishingco.)，easton,pa，最新版，其通过引用并入本文。[0275]本公开的药物组合物可以通过本领域熟知的方法制备，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸、研磨、乳化、包封(encapsulating)、包埋(entrapping)或冻干方法。[0276]因此，根据本公开使用的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，所述载体包含赋形剂和助剂，其有助于将修饰的dnase蛋白加工成可药用的制剂。合适的剂型(formulation)取决于所选的给药途径。[0277]本文所述的修饰的dnase蛋白可以配制用于肠胃外给药，例如通过弹丸注射(bolusinjection)或连续输注(continuousinfusion)。用于注射的制剂可以以单位剂型(unitdosage)形式存在，例如在安瓿中或多剂量容器中，任选地添加防腐剂。组合物可以是在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制试剂(formulatoryagents)，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。[0278]用于肠胃外给药的药物组合物包括水溶性形式的修饰的dnase制剂的水溶液。对于注射或输注，修饰的dnase可以任选地配制在水溶液中，优选配制在生理相容的缓冲液中，例如汉克氏液(hank’ssolution)、林格氏液(ringer’ssolution)或生理盐缓冲液(含有或不含有机溶剂，例如丙二醇，聚乙二醇)。[0279]此外，修饰的dnase的悬浮液可以制备成合适的油基或水基注射悬浮液(例如：油包水、水包油或油包水油(water-in-oilinoil)乳液)。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(例如芝麻油)，或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯)，甘油三酯或脂质体。水性注射悬浮液(aqueousinjectionsuspensions)可含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。[0280]直接注射和/或输注到血流中(例如，静脉内给药)可特别适合于治疗血液中细胞外dna和/或net水平升高(包括与其相关的任何病症)。还可以任选地使用向血流中的施用来将修饰的dnase蛋白递送至特定组织。[0281]任选地或附加地，可以将修饰的dnase蛋白局部注射到例如受到细胞外dna和/或net水平升高影响的组织中。该组织任选地是与炎症相关的组织。[0282]对于经粘膜给药，在制剂中使用渗透剂。这种渗透剂在本领域中通常是已知的[0283]对于口服给药，可以通过将修饰的dnase蛋白与本领域公知的药学上可接受的载体组合来容易地配制本公开的修饰的dnase蛋白。这种载体使得药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，以供患者口服摄入(oralingestion)。用于口服使用的药物制剂可以使用固体赋形剂制备，任选地研磨所得混合物，如果需要，在加入合适的助剂后，加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂特别是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，pvp)。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，例如藻酸钠。[0284]糖衣丸芯具有合适的包衣。为此，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素添加到片剂或糖衣丸包衣中，以用于识别或表征活性化合物剂量的不同组合。[0285]可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合式胶囊(push-fitcapsules)以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的密封软胶囊。推入配合式胶囊可含有与填充剂(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)、润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，修饰的dnase蛋白可以溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。用于口服给药的所有制剂的剂量都应适合所选的给药途径。[0286]还可以使用例如常规栓剂基质(例如可可脂)或其它甘油酯，将本公开实施方式的修饰的dnase蛋白配制成直肠组合物，例如，栓剂或保留灌肠剂。[0287]口服和/或直肠给药可特别适于治疗胃肠道疾病或病症，例如与胃肠道炎症相关的病症(例如，炎症性肠病和/或胃肠炎)。[0288]对于颊给药(buccaladministration)，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。[0289]对于通过吸入给药(例如，用于治疗肺部疾病或病症，或实现全身给药)，药物组合物可以任选地是，例如，含有推进剂的气溶胶(propellant-containingaerosol)(例如，具有二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳推进剂)，或不含推进剂的可吸入溶液或悬浮液。在一些实施方式中，组合物是包含修饰的dnase的不含推进剂的可吸入溶液，其适于例如经由喷雾器施用于对象。其它合适的制剂包括但不限于液体喷雾(mist)、蒸气剂或喷雾吸入剂(spraypreparation)，只要包含蛋白质组合物的颗粒以与所述递送装置一致的尺寸范围被递送，例如药物组合物的干粉形式。在一些实施方式中，将组合物被配制成经由喷雾器递送。[0290]任选地，使用合适的推进剂，从加压包装或喷雾器中以气溶胶喷雾(aerosolspraypresentation)(其通常包括粉状、液化和/或气态载体)形式方便地递送修饰的dnase蛋白。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以输送计量的量来确定。用于吸入器或吹入器中的例如明胶的胶囊和药筒可以配制成含有修饰的dnase蛋白和合适的粉末基质(例如但不限于乳糖或淀粉)的粉末混合物。[0291]当液体溶液或悬浮液用于递送装置、喷雾器、定量吸入器或其它合适的递送装置时，以单次或多次分剂量，通过肺部吸入，将药学有效量的组合物以液滴形式递送至对象的肺部，例如，具有本文所述的相同粒度范围。制备和使用适合用作液体或悬浮液的制剂的方法是本领域已知的，例如，国际专利申请公开wo2011/004476中教导的油基基质。[0292]当在使用本公开的递送方法之前，所述液体药物组合物被冷冻干燥(lyophilized)，可以将冷冻干燥的组合物研磨以获得由本文所述的所需尺寸范围内的颗粒所组成的细碎干燥粉末。当使用喷雾干燥来获得所述液体药物组合物的干粉形式时，所述过程是在多个条件下执行，所述条件导致由上述所需尺寸范围内的颗粒所组成的本质上无定形的细碎干燥粉末。类似地，如果起始药物组合物已经是冷冻干燥的形式，则可以将组合物研磨以获得干燥粉末形式用于随后的制备，作为适于肺部吸入的气雾剂或其它制剂。当起始药物组合物为其喷雾干燥形式时，优选地制备所述组合物，使得所述组合物已经为干粉形式，具有适当的颗粒尺寸，用于根据本公开的肺部给药方法分配水性或非水性溶液或悬浮液。关于制备药物组合物的干粉形式的方法，例如参见国际专利申请公开号wo96/32149、wo97/41833和wo98/29096，以及美国专利us5,976,574、us5,985,248和us6,001,336，其通过引用并入本文。[0293]然后将得到的干燥粉末形式的组合物任选地放置在合适的递送装置中，用于之后的制备，作为气雾剂或其它合适的制剂，通过肺吸入递送至所述对象。[0294]当所述干燥粉末形式的药物组合物被制备并以水性或非水性溶液或悬浮液的形式分配时，任选地使用计量吸入器(metered-doseinhaler)或其它合适的递送装置。[0295]根据本公开的一些实施方式的干燥粉末形式的药物组合物可以任选地重新配制成水溶液，以便作为水溶液气溶胶用于随后的递送，可使用雾化器(nebulizer)、计量剂量吸入器或其它合适的递送装置。在使用雾化器的情况下，保存在流体储存器内的水溶液被转化为水性喷雾，其中只有一小部分离开雾化器以在任何给定时间递送到所述对象。[0296]剩余的喷雾回流到雾化器内的流体储存器中，所述雾化器再次将其雾化成水性喷雾。重复所述过程直到流体储存器被完全分配或者直到雾化喷雾的施用终止。本文描述了雾化器的示例。[0297]或者，修饰的dnase蛋白可以是粉末形式，用于在使用前与合适的载体，例如无菌、无热原的水一起构成。[0298]适用于本公开上下文的药物组合物包括多个组合物，其中包含多个活性成分于一有效量，以达到预期目的。更具体地，治疗有效量是指有效预防、缓解或改善疾病的症状或延长正在接受治疗的对象的生存的活性的修饰的dnase蛋白的量。[0299]对于根据本公开的实施方式使用的任何修饰的dnase蛋白，所述治疗有效量或剂量最初可以从动物的活性测定估计。例如可以在动物模型中配制剂量，以实现循环浓度范围，所述循环浓度范围包括通过活性测定确定的ic50(例如，测试蛋白结构的浓度，其实现修饰的dnase蛋白的生物活性的半数最大增加(half-maximalincrease))。这种信息可用于更准确地确定人体中的有用剂量。[0300]如以下实施例部分所证明的，本公开实施方式的修饰的dnase蛋白的治疗有效量可以在约0.1μg/kg体重和约500mg/kg体重之间的范围内。[0301]本文所述的修饰的dnase蛋白的毒性和治疗功效可以通过实验动物中的标准药物程序来确定，例如通过测定对象蛋白结构的ec50、ic50和ld50(导致50％受试动物死亡的致死剂量)来确定。从这些活性测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人类的剂量范围。[0302]剂量可以根据使用的剂型和使用的给药途径而变化。鉴于患者状况，各个医师可以选择确切的配方、给药途径和剂量。(例如参见fingl等人所著，1975，“治疗药理学基础(thepharmacologicalbasisoftherapeutics)”，ch.1p.1)。[0303]剂量的量和间隔可以单独调整，以提供足以维持所需效果的活性dnase的血浆水平，成为最低有效浓度(minimaleffectiveconcentration，mec)。mec将因每种制剂而有差异，但可以从体外(invitro)数据估算；例如，在体外达到所需活性水平所必需的浓度。实现mec所需的剂量取决于个体特征和给药途径。hplc测定或生物测定可用于测定血浆浓度。[0304]还可以使用mec值来确定剂量间隔。应当使用以下方案(regimen)施用制剂，其将血浆水平在10％至90％，优选在30％至90％之间，最优选50％至90％的时间保持在mec以上。[0305]如本文所讨论的，本文所述的修饰的dnase蛋白可以在体内表现出长的半衰期。这种特性可以允许使用相对不频繁的给药(当通过不方便的途径(如注射)给药时，这可能是特别有利的)和/或相对低剂量的给药(这对于降低毒性和/或对修饰的dnase蛋白的潜在免疫应答可能是特别有利的)。[0306]在本文所述的任何一些实施方式中，选择每次给药的给药频率和剂量，使得修饰的dnase蛋白的给药剂量(例如，通过注射至成人对象)不超过每月200mg修饰的dnase蛋白(例如，以3个月的间隔给药600mg将被认为是20mg/月的剂量)。在一些这样的实施方式中，剂量不超过100mg/月。在一些实施方式中，剂量不超过50mg/月。在一些实施方式中，剂量不超过20mg/月。在一些实施方式中，剂量不超过10mg/月。在一些实施方式中，剂量不超过5mg/月。在一些实施方式中，剂量不超过2mg/月。在一些实施方式中，剂量不超过1mg/月。[0307]取决于要治疗的病症的严重性和反应性，给药可以是单次给药，任选地施用上文所述的缓释组合物，治疗过程持续数天至数周，或直到治愈，或达到疾病状态的减轻。[0308]当然，要施用的组合物的量将取决于被治疗对象的痛苦严重性、给药方式、处方医师的判断等。[0309]如果需要，本公开的组合物可以存在于包装(pack)或分配器(dispenser)装置，例如美国fda(美国食品和药物管理局(u.s.foodanddrugadministration))批准的试剂盒，其可以包含含有活性成分的一个或多个单位剂型。举例而言，所述包装可以包括金属或塑料箔，诸如泡罩包装(blisterpack)。所述包装或分配装置可附有给药说明书。所述包装或分配器也可以伴随着与容器相关的通知，所述容器的形式是依照监管药品生产、使用或销售的政府机构所规定，所述通知反映所述组成物的用于人体或兽医的形式授所述机构批准。举例而言，这样的通知，可能是经过美国食品和药物管理局批准的处方药标签，或批准的产品插入物。组成物包括配制在药学相容的载体中的本公开的化合物，所述组合物可以被制备，置于合适的容器中，并标记，以用于治疗本文中所述的病症，如本文中详细说明。[0310]因此，根据本公开的一个实施方式，将本文所述的药物组合物包装在包装材料中，并在包装材料中或包装材料上印刷标识，用于治疗其中修饰的dnase蛋白的活性有益于治疗的病症，如上文所述。[0311]其他定义：[0312]在本文中，术语“烃(hydrocarbon)”和“烃部分(hydrocarbonmoiety)”描述了一种有机部分，包括多个碳原子所构成的炭链，作为其基本骨架，并由氢原子取代。烃可以是饱和或不饱和的，由脂族(aliphatic)、脂环族(alicyclic)或芳族(aromatic)部分所组成，并且可以任选被一个或多个取代基(除氢以外)取代。取代的烃可以具有一个或多个取代基，其中每个取代基可以独立地是例如杂芳基、杂脂环、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫代羟基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯(sulfonate)、硫酸酯(sulfate)、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基(phosphinyl)、氧代(oxo)、亚胺(imine)、肟(oxime)、腙(hydrazone)、羰基、硫代羰基、脲基(ureagroup)、硫脲基(thioureagroup)、o-氨基甲酰基(o-carbamyl)、n-氨基甲酰基(n-carbamyl)、o-硫代氨基甲酰基(o-thiocarbamyl)、n-硫代氨基甲酰基(n-thiocarbamyl)、s-硫代氨基甲酰基(s-thiocarbamyl)、c-酰氨基(c-amido)、n-酰氨基(n-amido)、c-羧基(c-carboxy)、o-羧基(o-carboxy)、磺酰氨基(sulfonamido)、脒基(guanyl)、胍基(guanidinyl)、肼(hydrazine)、酰肼(hydrazide)、硫酰肼(thiohydrazide)和氨基，这些术语如本文所定义。烃可以是端基(endgroup)或连接基团，如这些术语在本文中所定义的。优选地，烃部分具有1至20个碳原子。每当一个数值范围；例如，“1至20”在本文中被陈述时，这意味着该基团(在这种情况下是烃)，可以含有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，至多并且包括20个碳原子。任选地，烃是具有1至10个碳原子的中等大小的烃。任选地，烃具有1至4个碳原子。[0313]如本文通篇所用，术语“烷基(alkyl)”是指包括直链和支链基团的饱和脂族烃(aliphatichydrocarbon)。优选地，烷基具有1至20个碳原子。每当一个数值范围(例如，“1至20”)在本文中被陈述时，这意味着该基团(在这种情况下是烃)可以含有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，至多且包括20个碳原子。更优选地，烷基是具有1至10个碳原子的中等大小的烷基。最优选地，除非另有说明，烷基是具有1至4个碳原子的低级烷基(loweralkyl)。烷基可以是取代或未取代的。当被取代时，可以是例如环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫代羟基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯(sulfonate)、硫酸酯(sulfate)、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基、氧代、亚胺、肟、腙、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、o-氨基甲酰基、n-氨基甲酰基、o-硫代氨基甲酰基、n-硫代氨基甲酰基、s-硫代氨基甲酰基、c-酰氨基、n-酰氨基、c-羧基、o-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫酰肼和氨基，这些术语如本文所定义。[0314]本文中，术语“烯基(alkenyl)”描述了包含至少一个碳-碳双键的不饱和脂族烃，包括直链和支链基团。优选地，烯基具有2至20个碳原子。更优选地，烯基是具有2至10个碳原子的中等大小的烯基。最优选地，除非另有说明，烯基是具有2至4个碳原子的低级烯基。烯基可以是取代的或未取代的。取代的烯基可以具有一个或多个取代基，其中每个取代基可以独立地是例如炔基(alkynyl)、环烷基、炔基(alkynyl)、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫代羟基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基、氧代、亚胺、肟、腙、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、o-氨基甲酰基、n-氨基甲酰基、o-硫代氨基甲酰基、n-硫代氨基甲酰基、s-硫代氨基甲酰基、c-酰氨基、n-酰氨基、c-羧基、o-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫酰肼和氨基。[0315]本文中，术语“炔基(alkynyl)”描述了包含至少一个碳-碳三键的不饱和脂族烃，包括直链和支链基团。优选地，炔基具有2至20个碳原子。更优选地，炔基是具有2至10个碳原子的中等大小的炔基。最优选地，除非另有说明，炔基是具有2至4个碳原子的低级炔基。炔基可以是取代的或未取代的。取代的炔基可以具有一个或多个取代基，其中每个取代基可以独立地是例如环烷基、烯基、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫代羟基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基、氧代、亚胺、肟、腙、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、o-氨基甲酰基、n-氨基甲酰基、o-硫代氨基甲酰基、n-硫代氨基甲酰基、s-硫代氨基甲酰基、c-酰氨基、n-酰氨基、c-羧基、o-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫酰肼和氨基。[0316]术语“亚烷基(alkylene)”描述了饱和或不饱和脂族烃连接基团，该术语如本文中所定义，其与如本文所定义的烷基(当饱和时)或烯基或炔基(当不饱和时)的不同，仅在于亚烷基是连接基团而不是端基(如这些术语在本文中所定义的)。[0317]“环烷基(cycloalkyl)”基团是指饱和的或不饱和的全碳单环或稠环(fusedring)(即共享一对相邻的碳原子的环)，其中多个环中的一者或多者不具有完全共轭的π电子系统。环烷基的非限制性示例是环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊烯、环己烷、环己二烯、环庚烷、环庚三烯和金刚烷(adamantane)。环烷基可以是取代或未取代的。当被取代时，取代基可以是例如：烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫代羟基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基、氧代、亚胺、肟、腙、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、o-氨基甲酰基、n-氨基甲酰基、o-硫代氨基甲酰基、n-硫代氨基甲酰基、s-硫代氨基甲酰基、c-酰氨基、n-酰氨基、c-羧基、o-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫酰肼和氨基，这些术语如本文中定义。当环烷基是不饱和的时，它可以包含至少一碳-碳双键和/或至少一碳-碳三键。[0318]“芳基(aryl)”基团是指具有完全共轭的π电子体系的全碳单环或稠环多环(即共享一对相邻的碳原子的环)。芳基的非限制性示例是苯基、萘基和蒽基。芳基可以是取代的或未取代的。当被取代时，取代基可以是例如：烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫代羟基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基、氧代、亚胺、肟、腙、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、o-氨基甲酰基、n-氨基甲酰基、o-硫代氨基甲酰基、n-硫代氨基甲酰基、s-硫代氨基甲酰基、c-酰氨基、n-酰氨基、c-羧基、o-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫酰肼和氨基，这些术语如本文中定义。[0319]“杂芳基(heteroaryl)”基团是指在环中具有一个或多个原子，例如氮、氧和硫，此外还具有完全共轭的π电子体系的单环或稠环(即共享一对相邻的碳原子的环)。杂芳基的非限制性示例包括吡咯(pyrrole)、呋喃、噻吩、咪唑、恶唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉和嘌呤。杂芳基可以是取代或未取代的。当被取代时，取代基可以是例如：烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫代羟基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基、氧代、亚胺、肟、腙、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、o-氨基甲酰基、n-氨基甲酰基、o-硫代氨基甲酰基、n-硫代氨基甲酰基、s-硫代氨基甲酰基、c-酰氨基、n-酰氨基、c-羧基、o-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫酰肼和氨基，这些术语如本文中定义。[0320]“杂脂族(heteroalicyclic)”基团是指在环中具有一个或多个原子，例如氮、氧和硫的单环或稠环(即共享一对相邻的碳原子的环)。所述环也可以具有一个或多个双键。然而所述环不具有完全共轭的π电子体系。杂脂环可以被取代或未取代。当被取代时，取代基可以是例如：烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、硫代羟基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸酯、硫酸酯、氰基、硝基、叠氮化物、膦酰基、氧膦基、氧代、亚胺、肟、腙、羰基、硫代羰基、脲基、硫脲基、o-氨基甲酰基、n-氨基甲酰基、o-硫代氨基甲酰基、n-硫代氨基甲酰基、s-硫代氨基甲酰基、c-酰氨基、n-酰氨基、c-羧基、o-羧基、磺酰氨基、脒基、胍基、肼、酰肼、硫酰肼和氨基，这些术语如本文中定义。代表性示例为哌啶、哌嗪、四氢呋喃、四氢吡喃、吗啉等。[0321]本文中，术语“胺(amine)”和“氨基(amino)”分别指-nr’r”基团或-n+r’r”r”’基团，其中r’、r”和r”’各自是氢或是取代的或未取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂脂环(通过其环碳与胺氮连接)、芳基，或杂芳基(通过其环碳与胺氮连接)，如本文所定义。任选地，r’、r”和r”’是氢和包含1至4个碳原子的烷基。任选地，r’和r”(以及r”’，如果存在的话)是氢。当被取代时，与胺的氮原子键合的r’、r”或r”’烃部分的碳原子不被氧代取代(除非另有明确说明)，使得r’、r”和r”’不是(例如)羰基、c-羧基或酰胺，如这些基团在本文中所定义。[0322]“叠氮化物(azide)”基团是指-n＝n+＝n-基团。[0323]“烷氧基(alkoxy)”基团是指-o-烷基(-o-alkyl)、-o-烯基(-o-alkenyl)、-o-炔基(-o-alkynyl)和-o-环烷基(-o-cycloalkyl)中的任一个，如本文所定义。[0324]“芳氧基(aryloxy)”基团是指-o-芳基(-o-aryl)和-o-杂芳基(-o-heteroaryl)，如本文所定义。[0325]“羟基(hydroxy)”基团是指-oh基团。[0326]“硫代羟基(thiohydroxy)”或“硫醇(thiol)”基团是指-sh基团。[0327]“硫代烷氧基(thioalkoxy)”基团是指-s-烷基(-s-alkyl)、-s-烯基(-s-alkenyl)、-s-炔基(-s-alkynyl)、-s-环烷基(-s-cycloalkyl)和-s-杂脂环(-s-heteroalicyclic)基团中的任一个，如本文所定义。[0328]“硫代芳氧基(thioaryloxy)”基是指-s-芳基(-s-aryl)和-s-杂芳基(-s-heteroaryl)，如本文所定义。[0329]“羰基(carbonyl)”或“酰基(acyl)”基团是指-c(＝o)-r’基团，其中r’如上文所定义。[0330]“硫代羰基(thiocarbonyl)”基团是指-c(＝s)-r’基团，其中r’如本文所定义。[0331]“c-羧基(c-carboxy)”基团是指-c(＝o)-o-r’基团，其中r’如本文所定义。[0332]“o-羧基(o-carboxy)”基团是指r’c(＝o)-o-基团，其中r’如本文所定义。[0333]“羧酸(carboxylicacid)”基团是指-c(＝o)oh基团。[0334]“氧代(oxo)”基团是指＝o基团。[0335]“亚胺(imine)”基团是指＝n-r’基团，其中r’如本文所定义。[0336]“肟(oxime)”基团是指＝n-oh基团。[0337]“腙(hydrazone)”基团是指＝n-nr’r”基团，其中r’和r”各自如本文所定义。[0338]“卤代(halo)”基团是指氟、氯、溴或碘。[0339]“亚磺酰基(sulfinyl)”基团是指-s(＝o)-r’基团，其中r’如本文所定义。[0340]“磺酰基(sulfonyl)”基团是指-s(＝o)2-r’基团，其中r’如本文所定义。[0341]“磺酸酯(sulfonate)”基团是指-s(＝o)2-o-r’基团，其中r’如本文所定义。[0342]“硫酸酯(sulfate)”基团是指-o-s(＝o)2-o-r’基团，其中r’如本文所定义。[0343]“磺酰胺(sulfonamide)”或“磺酰氨基(sulfonamido)”基团包括s-磺酰氨基(s-sulfonamido)和n-磺酰氨基(n-sulfonamido)基团，如本文所定义。[0344]“s-磺酰氨基(s-sulfonamido)”基团是指-s(＝o)2-nr’r”基团，其中r’和r”各自如本文所定义。[0345]“n-磺酰氨基(n-sulfonamido)”基团是指r’s(＝o)2-nr”‑基团，其中r’和r”各自如本文所定义。[0346]“o-氨基甲酰基(o-carbamyl)”基团是指-oc(＝o)-nr’r”基团，其中r’和r”各自如本文所定义。[0347]“n-氨甲酰基”基团是指r’oc(＝o)-nr”‑基团，其中r’和r”各自如本文所定义。[0348]“o-硫代氨基甲酰基(o-thiocarbamyl)”基团是指-oc(＝s)-nr’r”基团，其中r’和r”各自如本文所定义。[0349]“n-硫代氨基甲酰基(n-thiocarbamyl)”基团是指r’oc(＝s)nr”‑基团，其中r’和r”各自如本文所定义。[0350]“s-硫代氨基甲酰基(s-thiocarbamyl)”基团是指-sc(＝o)-nr’r”基团，其中r’和r”各自如本文所定义。[0351]“酰胺(amide)”或“酰氨基(amido)”基团包括c-酰氨基和n-酰氨基，如本文所定义。[0352]“c-酰氨基(c-amido)”基团是指-c(＝o)-nr’r”基团，其中r’和r”各自如本文所定义。[0353]“n-酰胺基(n-amido)”基团是指r’c(＝o)-nr”‑基团，其中r’和r”各自如本文所定义。[0354]“脲基团(ureagroup)”是指-n(r’)-c(＝o)-nr”r”’基团，其中r’、r”和r”’各自如本文所定义。[0355]“硫脲基(thioureagroup)”是指-n(r’)-c(＝s)-nr”r”’基团，其中r’、r”和r”’各自如本文所定义。[0356]“硝基(nitro)”基团是指-no2基团。[0357]“氰基(cyano)”基团是指-cn基团。[0358]术语“膦酰基(phosphonyl)”或“膦酸酯(phosphonate)”描述了-p(＝o)(or’)(or”)基团，其中r’和r”如上文所定义。[0359]术语“磷酸酯(phosphate)”描述了-o-p(＝o)(or’)(or”)基团，其中r’和r”各自如上文所定义。[0360]术语“氧膦基(phosphinyl)”描述了-pr’r”基团，其中r’和r”各自如上文所定义。[0361]术语“肼(hydrazine)”描述了-nr’‑nr”r”’基团，其中r’、r”和r”’，如本文所定义。[0362]如本文所用，术语“酰肼(hydrazide)”描述-c(＝o)-nr’‑nr”r”’基团，其中r’、r”和r”’如本文所定义。[0363]如本文所用，术语“硫代酰肼(thiohydrazide)”描述了-c(＝s)-nr’nr”r”’基团，其中r’、r”和r”’如本文所定义。[0364]“胍基(guanidinyl)”基团是指-ranc(＝nrd)-nrbrc基团，其中ra、rb、rc和rd中的每一个可以如本文对于r’和r”所定义。[0365]“脒基(guanyl)”或“鸟嘌呤(guanine)”基团是指rarbnc(＝nrd)-基团，其中ra、rb和rd如本文所定义。[0366]本文所述的化合物和结构包括本文所述化合物的任何立体异构体，包括对映异构体和非对映异构体，除非具体指明了特定的立体异构体。[0367]如本文所用，术语“对映异构体(enantiomer)”是指化合物的立体异构体，其相对于其对应物仅通过彼此的完全反转/反射(镜像)而可重叠。对映异构体被称为具有“手性(handedness)”，因为它们相互参照，就像右手和左手一样。对映异构体具有相同的化学和物理性质，除非存在于本身具有手性的环境中，如所有的生命系统。在本实施方式的上下文中，化合物可表现出一个或多个手性中心，每个手性中心表现出(r)或(s)构型以及任意组合，并且根据本公开一些实施方式的化合物可以具有表现出(r)或(s)构型的任意手性中心。[0368]本文所用的术语“非对映异构体(diastereomers)”是指彼此不是对映异构体的立体异构体。当化合物的两个或更多个立体异构体在一个或多个，但不是所有的等同(相关)立体中心处具有不同构型并且彼此不是镜像时，就会发生非对映异构现象。当两种非对映异构体只有一个立体中心不同时，它们是差向异构体。每个立体中心(手性中心)产生两种不同的构型，并因此产生两种不同的立体异构体。在本公开的上下文中，本公开实施方式包括具有多个手性中心的化合物，其以立体构型的任何组合出现，即任何非对映异构体。[0369]对于本文所述的任何实施方式，本文所述的化合物可以是盐的形式，例如药学上可接受的盐，和/或前药的形式。[0370]如本文所用，短语“药学上可接受的盐(pharmaceuticallyacceptablesalt)”是指母体化合物及其抗衡离子的带电种类，其通常用于改变母体化合物的溶解度特性和/或减少母体化合物对生物体的任何显著刺激，同时不消除所施用的化合物的生物活性和性质。或者，如本文所述的化合物的药学上可接受的盐可以在化合物的合成过程中形成，例如，在从反应混合物分离化合物或使化合物再结晶的过程中。[0371]在一些本公开实施方式的上下文中，本文所述的化合物的药学上可接受的盐可任选地为酸加成盐和/或碱加成盐。[0372]酸加成盐包含化合物的至少一个带正电荷形式(例如，其中碱性基团被质子化)的碱性(例如，胺和/或胍基)基团，以及至少一个来自所选择的酸的反离子，与至少一个衍生自所选酸的抗衡离子结合，形成药学上可接受的盐。因此，本文所述化合物的酸加成盐因此可以是化合物的一个或多个碱性基团与一个或多个当量的酸之间形成的络合物。[0373]碱加成盐包含化合物的至少一个带负电荷形式的酸性(例如，羧酸)基团(例如，其中酸性基团被去质子化)，与至少一个衍生自所选碱的抗衡离子结合，形成药学上可接受的盐。因此，本文所述化合物的碱加成盐可以是化合物的一个或多个酸性基团与一个或多个当量的碱之间形成的络合物。[0374]根据化合物中带电基团与盐中的抗衡离子之间的化学计量比，酸加成盐和/或碱加成盐可以是单加成盐或多加成盐。[0375]如本文所用，短语“单加成盐(mono-additionsalt)”是指这样一种盐，其中化合物的抗衡离子与带电荷形式之间的化学计量比为1:1的盐，使得加成盐包括每一摩尔当量的化合物一摩尔当量的抗衡离子。[0376]如本文所用，短语“多加成盐(poly-additionsalt)”是指这样一种盐，其中化合物的抗衡离子与带电荷形式之间的化学计量比大于1:1，例如为2:1、3:1、4:1等，使得加成盐包括每一摩尔当量的化合物两个或更多摩尔当量的抗衡离子。[0377]药学上可接受的盐的非限制性示例是铵阳离子或胍阳离子及其酸加成盐，和/或羧酸根阴离子及其碱加成盐。[0378]碱加成盐可以包括阳离子抗衡离子，例如钠、钾、铵、钙、镁等，其形成药学上可接受的盐。[0379]酸加成盐可以包括多种有机酸和无机酸，例如但不限于提供盐酸加成盐的盐酸、提供氢溴酸加成盐的氢溴酸、提供乙酸加成盐的乙酸、提供抗坏血酸加成盐的抗坏血酸、提供苯磺酸盐加成盐的苯磺酸、提供樟脑磺酸加成盐的樟脑磺酸、提供柠檬酸加成盐的柠檬酸、提供马来酸加成盐的马来酸、提供苹果酸加成盐的苹果酸、提供甲磺酸(甲磺酸盐)加成盐的甲磺酸、提供萘磺酸加成盐的萘磺酸、提供草酸加成盐的草酸、提供磷酸加成盐的磷酸、提供对甲苯磺酸加成盐的甲苯磺酸、提供琥珀酸加成盐的琥珀酸、提供硫酸加成盐的硫酸、提供酒石酸加成盐的酒石酸和提供三氟乙酸加成盐的三氟乙酸。这些酸加成盐中的每一种可以是单加成盐或多加成盐，这些术语如本文所定义。[0380]如本文所用，术语“前药(prodrug)”是指在体内转化为活性化合物的化合物(例如，上文所述的式的化合物)。前药通常被设计成促进给药，例如通过增强吸收。前药可包括：例如用酯基修饰的活性化合物，例如，其中化合物的任何一个或多个羟基被酰基、任选的(c1-4)-酰基(例如，乙酰基)修饰以形成酯基，和/或化合物的任何一个或多个羧酸基团被烷氧基或芳氧基修饰。任选地，(c1-4)-烷氧基(例如，甲基、乙基)形成酯基。[0381]此外，本文所述的每种化合物，包括其盐，可以是其溶剂化物或水合物的形式。[0382]术语“溶剂化物(solvate)”是指由溶质(本文所述的杂环化合物)和溶剂形成的可变化学计量(例如，二-、三-、四-、五-、六-等)的复合物，由此溶剂不干扰溶质的生物活性。[0383]术语“水合物(hydrate)”是指如上文所定义的溶剂化物，其中溶剂是水。[0384]本文所述的化合物可用作多晶型物，并且本实施方式进一步包括化合物的任何同型体及其任何组合。[0385]在本文中，术语“多肽(polypeptide)”是指包含至少10个由肽键或其类似物(如下文所述)连接的氨基酸残基的聚合物，并且任选地仅由肽键本身连接。在一些实施方式中，多肽包含至少20个氨基酸残基或其类似物。在一些实施方式中，多肽包含至少30个氨基酸残基或其类似物。在一些实施方式中，多肽包含至少50个氨基酸残基或其类似物。[0386]术语“多肽”包括天然多肽(例如降解产物、合成的多肽和/或重组多肽)，包括但不限于天然蛋白质、天然蛋白质的片段和天然蛋白质和/或其片段的同源物；以及肽模拟物(peptidomimetics)(通常是合成的多肽)和类肽(peptoids)和半类肽(semipeptoids)，它们是多肽类似物，它们可以具有，例如修饰，使多肽在体内更稳定或更能渗入细胞。这种修饰包括但不限于n-末端修饰、c-末端修饰、肽键修饰、主链修饰和残基修饰。制备肽模拟物化合物的方法是本领域熟知的，并且例如在定量药物设计(quantitativedrugdesign，c.a.ramsdengd.，17.2章，f.choplinpergamonpress(1992))中有详细说明，该文献通过引用整体并入本文中，如同在本文中完全阐述一样。下文提供了这方面的进一步细节。[0387]多肽内的肽键(-co-nh-)可以被例如n-甲基化酰胺键(-n(ch3)-co-)、酯键(-c(＝o)-o-)、酮亚甲基键(-co-ch2-)、亚磺酰亚甲基键(-s(＝o)-ch2-)、-氮杂键(-nh-n(r)-co-)取代，其中r是任何烷基(例如，甲基)、胺键(-ch2-nh-)、硫键(-ch2-s-)、乙烯键(-ch2-ch2-)、羟基乙烯键(-ch(oh)-ch2-)、硫代酰胺键(-cs-nh-)、烯烃双键(-ch＝ch-)、氟化烯烃双键(-cf＝ch-)、反酰胺键(-nh-co-)、肽衍生物(-n(r)-ch2-co-)，其中r是天然存在于碳原子上的“正”侧链。[0388]这些修饰可以发生在沿着多肽链的任何键上，甚至同时发生在几个(2至3)键上。[0389]天然芳香族氨基酸trp、tyr和phe可以被非天然芳香族氨基酸如1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylicacid，tic)、萘基丙氨酸、phe的环甲基化衍生物、phe的卤代衍生物或o-甲基-tyr取代。[0390]本公开一些实施方式的多肽还可以包括一个或多个修饰的氨基酸或一个或多个非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等)。[0391]术语“氨基酸(aminoacid或aminoacids)”应理解为包括20种天然存在的氨基酸；那些通常在体内翻译后修饰的氨基酸，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；和其它不常见的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链素(isodesmosine)、正缬氨酸(nor-valine)、正亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语“氨基酸(aminoacid)”包括d-氨基酸和l-氨基酸。[0392]下表1和2列出了天然存在的氨基酸(表1)和非常规或修饰的氨基酸(non-conventionalormodifiedaminoacids)(例如，合成的，表2)，其可以用于本公开的一些实施方式。[0393]表1[0394][0395][0396]表2[0397][0398][0399][0400][0401]本公开的一些实施方式的多肽优选以线性形式使用，尽管应当理解，在环化不会严重干扰多肽特性的情况下，也可以使用所述多肽的环状形式。[0402]由于本公开的多肽优选用于需要多肽为可溶性形式的治疗或诊断，本公开一些实施方式的多肽优选包括一种或多种非天然或天然极性氨基酸，包括但不限于丝氨酸和苏氨酸，它们由于其含羟基侧链而能够增加多肽的溶解度。[0403]本公开一些实施方式的多肽可以通过肽合成领域技术人员已知的任何技术合成。对于固相肽合成，许多技术可以总结在以下文献中：j.m.stewart和j.d.young,固相肽合成(solidphasepeptidesynthesis),w.h.freeman公司(旧金山),1963，以及j.meienhofer，荷尔蒙蛋白质和肽(hormonalproteinsandpeptides)，第2卷，第46页，学术出版社(academicpress)(纽约)，1973。对于经典的溶液合成，参见g.schroder和k.lupke,肽(thepeptides),第1卷，学术出版社(academicpress)(纽约)，1965。[0404]通常，这些方法包括将一个或多个氨基酸或适当保护的氨基酸顺序加入到生长的肽链中。通常，第一个氨基酸的氨基或羧基被合适的保护基保护。然后，在适于形成酰胺键的条件下，被保护或衍生的氨基酸可以附着在惰性固体支持物上，或者通过添加序列中具有适当保护的互补(氨基或羧基)基团的下一个氨基酸而在溶液中使用。然后从这个新加入的氨基酸残基中除去保护基团，然后加入下一个氨基酸(适当保护的)，等等。在所有所需氨基酸以适当的顺序连接后，依次或同时除去任何剩余的保护基团(和任何固体支持物)，以提供最终的多肽化合物。通过对该通用方法的简单修改，有可能在生长的链上一次加入一个以上的氨基酸，例如，通过将保护的三肽与适当保护的二肽偶联(在不使手性中心外消旋的条件下)，在去保护后形成五肽等。肽合成的进一步描述公开于美国专利us6472505。[0405]制备本公开一些实施方式的多肽化合物的优选方法包括固相肽合成。[0406]andersson[生物聚合物(biopolymers)2000,55(3):227-50]描述了大规模肽合成。[0407]如本文所用，术语“约(about)”是指±20％，在任选的实施方式中是指±10％。[0408]术语“包括(comprises、comprising、includes、including)”、“具有(having)”及其同源词(conjugates)意为“包括但不限于”。[0409]术语“由……组成(consistingof)”是为“包括并限于”。[0410]术语“基本上由……组成(consistingessentiallyof)”意为组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，但前提是另外的成分、步骤和/或部分不会实质性地改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特性。[0411]如本文所使用的，单数形式“一个(a、an)”和“所述(the)”包括复数，除非上下文另有明确的指示。例如，术语“化合物(acompound)”或“至少一种化合物(atleastonecompound)”可以包括多种化合物，包括其混合物。[0412]在整个申请中，本公开的各个实施方式可以以范围的形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应当被解释为对本公开的范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应当被认为已经具体公开了子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度如何，都适用。[0413]每当本文指出数值范围时，意为包括在所指出的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。表述“第一指示数和第二指示数之间的范围(ranging/rangesbetweenafirstindicatenumberandasecondindicatenumber)”和“从第一指示数到第二指示数的范围(ranging/rangesfromafirst,indicatenumber“to”asecondindicatenumber)”在本文中可互换使用，意为包括第一指示数字和第二指示数字以及它们之间的所有数和整数。[0414]如本文所用，术语“方法(method)”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知的或者容易从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。[0415]如本文所用，术语“治疗(treating)”包括放弃、基本上抑制、减缓或逆转病症的发展、基本上改善病症的临床或美学症状，或基本上防止病症的临床或美学症状的出现。[0416]当提及特定的序列表时，这种提及应理解为还包括基本上与其互补序列相对应的序列，包括由例如测序错误、克隆错误或导致碱基替换、碱基缺失或碱基添加的其它改变引起的微小序列变异，只要这种变异的频率为50个核苷酸中少于1个；可替代地，100个核苷酸中少于1个；可替代地，200个核苷酸中少于1个；可替代地，500个核苷酸中少于1个；可替代地，1000个核苷酸中少于1个；可替代地，5000个核苷酸中少于一个；可替代地，10,000个核苷酸中少于一个。[0417]应当理解，为了清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述的本公开的某些特征也可以在单个实施方式中组合地提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本公开的各个特征也可以单独提供，或者以任何合适的子组合提供，或者以本公开的任何其它描述的实施方式中的合适的方式提供。在各个实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是这些实施方式的必要特征，除非该实施方式在没有这些元件的情况下不起作用。[0418]如上文所述以及如以下权利要求部分所要求的本公开的各个实施方式和方面在以下实施例中得到实验支持。[0419]实施例[0420]现在参考下面的实施例，这些实施例与上面的描述一起以非限制性的方式说明了本公开的一些实施方式。[0421]通常，本文使用的命名和本公开中使用的实验室方法包括分子、生物化学、微生物和重组dna技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见，例如：“分子克隆：实验室手册(molecularcloning:alaboratorymanual)”sambrook等人，(1989)；“分子生物学实验(currentprotocolsinmolecularbiology)”，第i-iii卷，ausubel,r.m.编(1994)；ausubel等人，“分子生物学实验(currentprotocolsinmolecularbiology)”，约翰威立国际出版公司(johnwileyandsons,baltimore,md.)，巴尔的摩，马里兰州(1989)；perbal，“分子克隆实用指南(apracticalguidetomolecularcloning)”，约翰威立国际出版公司，纽约(1988)；watson等人，“重组dna(recombinantdna)”，科学美国人书籍(scientificamericanbooks)，纽约；birren等人(编辑)，“基因组分析：实验室手册系列(genomeanalysis:alaboratorymanualseries)”，第1-4卷，冷泉港实验室出版社(coldspringharborpress)，纽约(1998)；hermanson，“生物偶联技术(bioconjugatetechniques)”，第2版，爱思唯尔公司(elsevierinc.)，伯灵顿，马萨诸塞州(2009)；如以下美国专利中所述的方法：us4,666,828、us4,683,202、us4,801,531、us5,192,659和us5,272,057；“细胞生物学：实验室手册(cellbiology:alaboratoryhandbook)”，第i-iii卷，cellis,j.e.编辑(1994)；“当前免疫学方案”卷i-iii，coliganj.e.编辑(1994)；stites等人编辑，“基础和临床免疫学(basicandclinicalimmunology)”(第八版)，appleton&lange出版社，诺沃克，ct(1994)；mishell和shiigi编辑，“细胞免疫学中的选定方法(selectedmethodsincellularimmunology)”，曼出版公司，纽约(1980)；可用的免疫测定在专利和科学文献中被广泛描述，参见，例如：美国专利us3,791,932、us3,839,153、us3,850,752、us3,850,578、us3,853,987、us3,867,517、us3,879,262、us3,901,654、us3,935,074、us3,984,533、us3,996,345、us4,034,074、us4,098,876、us4,879,219、us5,011,771和us5,281,521；“寡核苷酸合成(oligonucleotidesynthesis)”，gait,m.j.编辑(1984)；“核酸杂交(nucleicacidhybridization)”，hames,b.d.和higginss.j.编辑(1985)；“转录与翻译(transcriptionandtranslation)”，hames,b.d.,andhigginss.j.编辑(1984)；“动物细胞培养(animalcellculture)”，freshney,r.i.编辑(1986)；“固定化细胞和酶(immobilizedcellsandenzymes)”，irl出版社(1986)；“分子克隆实用指南(apracticalguidetomolecularcloning)”，perbal,b.(1984)和“酶学方法”，317卷，美国学术出版社；“pcr方案：方法和应用指南(aguidetomethodsandapplications)”，美国学术出版社，圣地亚哥，ca(1990)；marshak等人，“蛋白质纯化和表征策略-实验室课程手册(strategiesforproteinpurificationandcharacterization-alaboratorycoursemanual)”，cshl出版社(1996)；所有这些都通过引用的方式并入本文，如同在本文中完全阐述一样。在本文中还提供了其它的一般参考资料。其中的过程被认为是本领域公知的，是为了方便读者而提供的。其中包含的所有信息通过引用并入本文。[0422]材料和方法[0423]材料：[0424]氰基硼氢化钠(sodiumcyanoborohydride)(nabh3cn)、甲基绿(methylgreen)、缓冲组分、cacl2、mgcl2和其它化学品，获自于西格玛-奥德里奇(sigma-aldrich)公司。[0425]单官能聚乙二醇丙醛(monofunctionalpolyethyleneglycolpropionaldehyde)(peg-a1d)试剂，获自于creativepegworks、nof和jenkemtechnologyusa公司。[0426]聚乙二醇双-n-羟基琥珀酰亚胺双-nhs-peg试剂(polyethyleneglycolbis-n-hydroxysuccinimidebis-nhs-pegreagents)，获自于rapppolymeregmbh和irisbiotechgmbh公司。[0427]植物重组人类dnasei:[0428]如国际专利申请公开wo2013/114374中所述，制备植物重组人类dnasei，通过在转基因烟草(transgenicnicotianatabacum)亮黄-2(by2)细胞培养基中表达，并从细胞外培养基中收获。所述dnasei通常含有氨基酸序列的混合物，其中大多数具有seqidno：1，小部分具有seqidno：2。[0429]by2悬浮培养基与根癌土壤杆菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105菌株共培养48小时，所述根癌土壤杆菌携带含有dnasei基因的载体和新霉素磷酸转移酶(neomycinphosphotransferase，nptii)的选择基因。[0430]随后，将细胞保持在补充有50毫克/升卡那霉素(kanamycin)和250毫克/升头孢噻肟(cefotaxime)的培养基中。nptii基因赋予对卡那霉素的抗性，因此只有nptii阳性by2细胞在所述选择培养基中存活。头孢噻肟用于选择性杀死农杆菌(agrobacterium)，所述植物细胞对所述抗生素具有抗性。一旦建立了良好生长的转基因细胞悬浮液，其被用于筛选和分离单个细胞系。为了允许选择单个细胞系，将高度稀释的细胞悬浮液的等分试样(aliquiots)铺在固体by2培养基上。然后细胞生长直到小的愈伤组织(calli)发育。随后将每个愈伤组织重新悬浮在液体培养基中。之后对培养基进行取样并评估dnasei浓度。然后进一步重新分析分泌dnasei浓度相对高的品系，并将dnasei浓度进行比较，以选择最终候选的dnasei表达品系。[0431]收集表达人类dnasei蛋白的转化的by2细胞的培养基样品，并且当需要时，通过amicontmultra离心过滤器((10kda截止值(cutoff))浓缩5倍。dnasei在细胞培养基中的催化活性通过dna甲基绿分析测定，并与总dnasei量进行比较，通过酶联免疫吸附分析(enzyme-linkedimmunosorbentassay)测定总dnasei量。[0432]植物重组人类dnasei(plantrecombinanthumandnasei，prh-dnasei)使用四个色谱步骤纯化，包括离子交换和疏水相互作用，以及两个超滤步骤。获得浓度为5mg/ml的高纯度的prh-dnasei。[0433]与peg-nhs反应[0434]在mes缓冲液(100mm,ph7)中稀释dnasei，并向反应混合物中加入cacl2。加入peg-n-羟基琥珀酰亚胺(peg-nhs)，并将反应混合物在室温下轻轻搅拌2小时。在反应中使用dnasei与peg-nhs的摩尔比为1:200。最终浓度为2mg/ml蛋白质和10mmcacl2。使用具有30kda截止值(merck)的amicontm过滤器，通过透析配制缓冲液来终止反应。[0435]dnase与peg-丙醛(peg-propionaldehyde，peg-ald)的反应[0436]将dnasei加入到在mes(2-(n-吗啉代)乙磺酸(2-(n-morpholino)ethanesulfonicacid))缓冲液(100mm，ph7)中稀释的peg-丙醛(peg-a1d)中，并将cacl2加入到反应混合物中，随后在mes缓冲液(100mm，ph7)中加入新制备的nabh3cn。在反应中使用的摩尔比是相对于蛋白质计算的，范围从1:100至1:600(蛋白质:peg-a1d)。最终浓度为2mg/ml蛋白质，10mmcacl2和100mmnabh3cn。在温和搅拌下，在室温下反应过夜(至少10小时)。使用具有30kda截止值(merck)的amicontm过滤器，通过透析配制或装载缓冲液来终止反应。[0437]光密度[0438]使用nanodroptm2000装置(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))，从其在280nm的吸光度(消光系数为1.43cm-1(gr/l)-1)获得纯化蛋白质的定量。[0439]通过基于甲基绿的活性测定评估蛋白质含量和活性：[0440]通过甲基绿酶活性分析评估dnasei和修饰的dnasei的活性，使用与甲基绿复合的鲑鱼睾丸(salmontestis)dna作为基质。染料甲基绿插入双链dna的堆叠碱基之间。一旦长dna分子由于dnasei活性而被水解，就会发生甲基绿从dna的解离。游离甲基绿进行自发脱色，这可能是由染料的互变异构体所引起的。[0441]为了评价dnasei活性，通过对配方缓冲液(formulationbuffer)(150mmnacl、1mmcacl2、ph6.1-6.5)透析来纯化测试的dnasei变体。通过在活性缓冲液(25mmhepes-naoh、4mmcacl2、4mmmgcl2、0.1％牛血清白蛋白、0.05％tween-20、ph7.5)以2倍系列稀释度稀释浓度范围为0.3ng/ml至20ng/ml的标准未修饰的dnasei，来制备标准曲线。以类似的方式稀释样品和对照组。对于药代动力学分析，根据样品稀释度对标准曲线和对照进行加标(spike)。[0442]将100μl的标准品、对照组和样品一式两份加入到含有100μldna-甲基绿基质的96孔板(nunc)中，并将内容物充分混合。然后将板在37℃下温育过夜，然后在620nm的波长下测量吸光度。以吸光度相对于标准浓度进行绘图，数据通过marquardt的非线性回归方法拟合为4-参数对数模型。然后计算dnase和dnase变体的浓度。[0443]maldi-tof(基质辅助激光解吸/电离飞行时间(matrix-assistedlaserdesorption/ionization-timeofflight))质谱：[0444]样品制备(samplepreparation)：通过混合375μl20mg/ml的2,5-dhap(2,5-二羟基苯乙酮(2,5-dihydroxyacetophenone))在乙醇溶液和125μl18mg/mldac(柠檬酸氢二铵(diammoniumhydrogencitrate))水溶液来制备基质溶液。将2μl样品溶液与2μl2％的tfa溶液混合，然后与2μl基质溶液混合。然后向上和向下吸取该三元混合物，直到结晶开始，由此先前透明的混合物变得不透明。将0.5μl体积的该混合物施加到maldi钢靶板上。蒸发溶剂后，将靶插入质谱仪中。[0445]质谱(massspectrometry)：使用maldi-tof/tofautoflextm速度质谱仪(brukerdaltonilkgmbh公司)获得maldi-tof质谱。质谱仪配备有smartbeamtm-ii固态激光器(改进的nd:yag激光器)λ＝355nm，并且在20000至200000m/z或60000至200000m/z的质量范围内以正离子线性模式操作。每个样品的激光流畅性都进行了优化。激光器以2千赫的频率工作，光谱以1000次激光发射的倍数累积，总共2000次发射。[0446]激光在2千赫的频率下操作，并且光谱在1000次激光照射的倍数中累积，总共2000次照射。[0447]sds-page：[0448]通过sds-page分析dnasei和修饰的dnase种类。根据制造商的说明，通过考马斯亮蓝染色(coomassiebrilliantbluestaining，bio-rad)实现蛋白质的检测。[0449]实施例1[0450]peg修饰对植物重组人类dnasei活性影响[0451]根据上述材料和方法部分描述的方法，使用来自3个不同供应商的peg-ald(peg-丙醛(peg-propionaldehyde))和来自2个不同供应商的peg-nhs(甲氧基-peg-n-琥珀酰亚胺基活性酯(methoxy-peg-n-succinimidylactiveesters))，以1:200(蛋白质:peg)的摩尔比，用peg(5kda)修饰植物重组人类dnasei(prh-dnasei)。然后通过透析(使用具有30kda截止值的过滤器)将反应混合物纯化为含有1mmcacl2和150mmnacl的制剂缓冲液。如上文所述，通过sds-page，通过光密度(opticaldensity，od)分析产物以确定蛋白质含量，并通过基于甲基绿的测定法来确定酶活性。[0452]如图1所示，prh-dnasei的分子量约为32kda，在sds-page中迁移到相应的位置；而聚乙二醇化(peg)的prh-dnasei种类表现出较高的分子量，并且当用peg-a1d(5000da)聚乙二醇化(peg)时，在95kda标记上方观察到条带的主要部分。表观分子量增加60kda对应于每5kda的约6个peg部分的修饰，因为peg在sds-page中迁移的程度大约是其分子量的两倍。如其中进一步显示的，peg-nhs的修饰效率较低，并且在来自两个供应商的peg-nhs之间的效率不同，这可能是由于不同的试剂质量。大多数条带低于95kda标记。观察到被1至5个peg部分修饰的聚乙二醇化(peg)dnase变体。[0453]如表3所示，由peg-aid修饰的prh-dnasei保持了超过85％的酶活性；而peg-nhs-修饰的prh-dnasei(尽管具有较低水平的修饰，如图1所示)在相当大的程度上影响了修饰的蛋白质的酶活性，仅保持了23％至27％的活性。[0454]表3：用5000dapeg聚乙二醇化的prh-dnasei的蛋白质含量和酶活性，含量和活性之间的比率代表活性％。[0455][0456]如表4所示，由2000dapeg-ald修饰的prh-dnasei保持了比由2000dapeg-nhs修饰的prhdnasei高得多的酶活性，类似于上述用5000dapeg获得的结果。[0457]表4：用2000dapeg聚乙二醇化的prh-dnasei的蛋白质含量和酶活性，含量和活性之间的比率代表活性％。[0458][0459]不受任何特定理论的束缚，据信活性的差异与酰胺化(用peg-nhs)将带正电荷的胺基改变为中性酰胺基的事实相关，而在还原胺化(用peg-a1d)中，保留带正电荷的胺基，其可促进与带负电荷的基质(dna)的相互作用。[0460]聚乙二醇化(peg)条件和聚乙二醇化程度对dnasei修饰的影响通过按照上述方法使prh-dnasei与不同量的聚乙二醇化试剂(即，相对于蛋白质而言200、400和600摩尔当量)反应来评估。通过sds-page和maldi-tof质谱分析产物，以确定修饰后分子量的变化。[0461]如图2所示，当分别与200、400和600摩尔当量的2000dapeg-a1d反应时，用平均2、3和4个peg部分修饰prh-dnasei；并且在分别与200、400和600摩尔当量的5000dapeg-a1d反应时，具有平均4、5和6个peg部分(通过sds-page分析测定)。[0462]通过maldi-tof质谱测定的peg部分的数量(数据未示出)类似于通过sds-page分析测定的数量(如上文所述)。[0463]这些结果表明，dnase的peg修饰程度以可控方式与peg化试剂与dnase的比例相关。[0464]实施例2[0465]示例性聚乙二醇化dnasei在大鼠体内的药代动力学[0466]静脉给药后，重组人类dnase被迅速从体循环中清除。对大鼠体内prh-dnasei的药代动力学研究也证明了该酶的半衰期较短(静脉注射1mg/kg体重时，半衰期为7.1分钟；数据未显示)。[0467]为了评估如本文所述的聚乙二醇化对dnasei的影响，根据上文所述的方法，使用200摩尔当量的peg-ald，通过peg-ald(5000dapeg)对prh-dnasei进行聚乙二醇化，并使用制备型(preparative)尺寸排阻色谱法(sizeexclusionchromatography，sec)纯化。如通过酶活性测定所确定的，聚乙二醇化的prh-dnasei保留了约63％的未修饰的prhdnasei的初始活性(在本文中也称为“修饰前(beforemodification)”或“prh-dnasei”本身)。[0468]如图3所示，如通过sds-page分析所确定的，dnase被3-5个peg链修饰。[0469]给五只wistar大鼠静脉注射聚乙二醇化的dnasei，剂量为1mg/kg体重(根据酶活性定量)。[0470]在静脉注射后10分钟和0.5、1、2、8、16和24小时，将血液样品收集到肝素管中，并分离血液的血浆部分。根据上文所述的方法，通过基于甲基绿的活性测定来分析血浆样品。[0471]如图4所示，注射聚乙二醇化的dnasei后，血液中的dnase活性逐渐下降，半衰期(与清除率相关)约为10.2小时。[0472]这些结果表明，本文所述的dnase的修饰显著延长了血液中dnase活性的持续时间，并降低了清除率。[0473]在另一项研究中，比较了如下3种聚乙二醇化的prh-dnase变体(根据上文所述的制备制备)和两种非聚乙二醇化的变体的药代动力学：[0474]a组：未修饰的dnasei(prh-dnasei)；[0475]b组：阿立链道酶α(通过用乙二胺酰胺化修饰的非聚乙二醇化的prh-dnasei，如国际专利申请公开wo2016/108244中所述)；[0476]c组：修饰的dnasei(prh-dnasei)，其中每2kdapeg蛋白质具有约4个部分(通过maldi-tof质谱法确定的共轭peg的平均总质量约为8kda)，使用400当量的peg-ald(2kdapeg)制备；[0477]d组：修饰的dnasei(prh-dnasei)，其中每5kdapeg蛋白质具有约3个部分(通过maldi-tof质谱法确定的共轭peg的平均总质量约为15kda)，使用100当量的peg-ald(5kdapeg)制备；和[0478]e组：修饰的dnasei(prh-dnasei)，其中每5kdapeg蛋白质具有约4个部分(通过maldi-tof质谱法确定的共轭peg的平均总质量约为20kda)，使用100当量的peg-ald(5kdapeg)制备。[0479]如图5所示，当考虑到peg在sds-page中两倍于其真实质量的表观质量相关时，通过sds-page测定的三种修饰的dnasei变体(c、d和e组)的质量增加与通过maldi-tof质谱测定的质量增加一致。[0480]表5：用不同摩尔当量的peg(2kda或5kda)peg聚乙二醇化的prh-dnasei的蛋白质含量和酶活性(平均值±标准偏差)，含量和活性之间的比率表示活性％[0481][0482]将dnasei变体以1mg/kg体重的剂量静脉注射给spraguedawley大鼠(8周龄)(其中根据活性测定浓度，如表5所示)，每个试验组有6只动物。在注射前和静脉注射(ivinjection)后的不同时间间隔将血样收集到肝素锂管中，并分离血浆。通过基于甲基绿的活性测定来评估血浆样品中活性dnase的量。[0483]如图6a-8所示,与未聚乙二醇化的dnasei(未修饰的dnasei或阿立链道酶α)相比，聚乙二醇化的dnasei表现出相当长的半衰期(图6a-7)和更高的曲线下面积(auc)(图8)，其中半衰期和auc与peg部分的数目和peg部分的大小正相关。[0484]这些结果表明，具有多个peg部分的聚乙二醇化在延长dnasei的体内(invivo)活性方面是高度有效的，并且可以通过控制聚乙二醇化的程度来控制dnase活性。[0485]实施例3[0486]示例性长效dnase对盲肠结扎和穿刺动物模型中脓毒病的影响[0487]选择如实施例2中所述的具有约4个5kdapeg部分的dnasei(其中描述的具有最长半衰期的示例性修饰的dnasei)，用于通过盲肠结扎和穿刺(cecalligationandpuncture，clp)在雄性c57bl/6小鼠(8至9周龄)中诱导的脓毒病小鼠模型中的进一步研究。[0488]将盲肠结扎在盲肠末端下方约1cm处，用18号针穿刺两次，挤出约1cm的粪便(fecalmatter)。所有动物在手术后立即接受1ml盐水皮下注射，并在手术后1小时接受抗生素治疗(皮下注射厄他培南钠(ertapenemsodium)，30mg/kg)，其后每12小时一次，直至48小时。在手术后4小时给予液体复苏(1ml盐水)，然后给予抗生素。[0489]clp后24小时，通过测定脲(urea)、血清谷草转氨酶(serumglutamic-oxaloacetictransaminase(sgot)，也称为天冬氨酸转氨酶(aspartatetransaminase)或ast)、肌酸磷酸激酶和血清谷丙转氨酶(serumglutamicpyruvictransaminase(sgpt)，也称为丙氨酸转氨酶(alaninetransaminase)或alt)的血清水平(如通过美国医学实验室中心实验室服务(americanmedicallaboratoriescentrallaboratoryservices)所测定)的血清水平以及游离dna的血清水平(如使用quant-ittmpicogreentm双链dna检测试剂盒(英杰(invitrogen))根据制造商的说明进行测定，在55℃下与1.8mg/ml蛋白酶k一起温育30分钟，以降低背景信号)相对于未处理的对照小鼠(数据未示出)显著增加，证实了脓毒病模型的有效性。[0490]clp后1、4或8小时，给小鼠静脉注射10mg/kg修饰的dnasei(或对照)，每12小时测定一次存活率；每个试验组5只动物。盐水和未修饰的prhdnasei各自用作对照。[0491]如图9a和9b所示，与盐水相比，手术后1或4小时施用单剂量的dnasei(未修饰的或修饰的)提高了存活率增，其中修饰的dnasei比未修饰的dnasei更大程度地提高了存活率。如本文进一步显示的，手术后4小时施用修饰的dnasei比手术后1小时施用更大程度地提高了存活率。[0492]这些结果表明，如本文所述的修饰的dnase，即使还给予抗生素，也对脓毒病产生了增强的治疗效果。这些结果进一步表明dnase给药的时机可能对治疗效果具有重要的影响，这可能是由于net在对脓毒性损伤的早期免疫反应中的作用[mai等人，休克(shock)2015,44:166-172]。[0493]在手术后4和8小时施用修饰的dnasei后，在相同的模型(使用盐水作为对照)中再次测试了修饰的dnasei的效果。[0494]如图10a和10b所示，与盐水相比，在手术后4小时施用单剂量的修饰的dnasei显著地提高了存活率。[0495]如图11a和11b所示，与盐水相比，在手术后8小时施用单剂量的修饰的dnasei在提高存活率方面非常有效。[0496]这些结果表明，在脓毒病诱导后约8小时施用dnase对于提供针对脓毒病的治疗效果是特别有效的。[0497]此外，在脓毒病模型中，通过在clp后4小时(根据上文所述的方法)施用10、5、1和0.1mg/kg体重的剂量，来评估剂量的效果。[0498]如图12a和12b所示，每个测试剂量的修饰的dnasei降低了死亡率，但死亡率的降低是剂量依赖性的，在clp后7天，施用最高剂量(10mg/kg)时没有观察到死亡率。[0499]这些结果进一步证实了如本文所述的修饰的dnase对脓毒病具有治疗效果。[0500]实施例4[0501]示例性长效dnase在盲肠结扎和穿刺脓毒病模型中的进一步研究[0502]根据实施例3中所述的方法，通过盲肠结扎和穿刺(clp)，随后进行抗生素治疗，并施用(例如，clp后4小时)修饰的dnasei(用未修饰的dnasei和/或盐水作为对照)，在小鼠中诱导脓毒病。[0503]然后收集血清(例如，clp后24小时)，使用本领域已知的合适技术，任选地评估器官损伤生物标记物(organdamagebiomarkers)(例如，肌酸磷酸激酶、脲、血清谷草转氨酶(sgot)、血清谷丙转氨酶(sgpt)和/或内皮细胞特异分子(endocan))、肺组织中的循环游离dna/nets(例如，使用如实施例3中所述的quant-ittmpicogreentm双链dna测定试剂盒，和/或基于抗双链dna抗体的elisa测定)、tnf、il-6和髓过氧化物酶(myeloperoxidase(mpo))(例如使用elisa测定)，和/或血液中的细菌水平，以便评价修饰的dnasei降低游离dna水平和/或减弱器官损伤的能力。[0504]实施例5[0505]示例性长效dnase对病毒感染的作用[0506]用致死剂量的流感病毒(例如，约500个噬斑形成单位的病毒)攻击小鼠。[0507]任选地或附加地，将获自美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)(马纳萨斯，弗吉尼亚州)的甲型流感病毒a/puertorico/8/34h1n1(pr8)在含胚胎的蛋中在37℃下繁殖72小时，并收获尿囊液。[0508]将示例性长效dnase(任选地以1mg/kg施用)(及其任何组合)的效果与相同剂量和盐水对照的未修饰的dnase的效果进行比较，所述长效dnase如上文任一相应实施方式所述通过聚乙二醇化来制备。具体而言，评估了示例性长效dnase对nets(中性粒细胞胞外陷阱)/dna-相关实体的存活和/或死后balf(支气管肺泡灌洗液)含量的影响(例如，如narasarju等人在[美国病理学杂志(amjpathol)2011,179:199-210]中所述)。[0509]根据lin等人描述的方法，经由感染马丁达比犬肾(madin-darbycaninekidney，mdck)细胞，任选地通过噬菌斑测定法测定病毒滴度[公共科学图书馆期刊(plosone)2017,12:e0172299]。[0510]任选地根据如debuhr和vonkockritz-blickwede所描述的方法测量nets(中性粒细胞胞外陷阱)[中性粒细胞胞外陷阱(nets)和net标记物的检测、可视化和量化(detection,visualization,andquantificationofneutrophilextracellulartraps(nets)andnetmarkers)，第425-442页，在：quinnm.,deleof.(编辑)中性粒细胞(neutrophil)，分子生物学方法(methodsinmolecularbiology)，第2087卷，哈门那公司(humana)，纽约]。[0511]评估了长效dnase(例如相对于未修饰的dnase)降低死亡率、病毒滴度、balf含量和/或net含量的能力。[0512]实施例6[0513]示例性长效dnase对中风的作用[0514]用如上所述制备的单剂量示的例性长dnase以及组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tissueplasminogenactivator，tpa)和/或其他当前标准护理实践来治疗中风患者。[0515]任选地，评估了使用组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tpa)时，缺血-再灌注损伤的继发性损伤和/或中风导致的残疾的治疗窗(therapeuticwindow)，例如，与不使用示例性长效dnase的tpa进行比较。[0516]不受任何特定理论的束缚，据信示例性长效dnase和tpa的共同施用减少了凝块溶解所需的时间，并减少了未被tpa溶解的凝块的数量，从而减少了血管内手术的需要，并增加了使用tpa的治疗窗。[0517]实施例7[0518]示例性长效dnase对心肌梗塞(myocardialinfarction)的作用[0519]根据michael等人所述的方法[美国生理学杂志(amjphysiol)1995,269:h2147-h2154]，对野生型c57bl6/j小鼠(例如，8周龄)冠状动脉左前降支(leftdescendingcoronaryartery)进行永久结扎，以诱发心肌梗塞(mi)，并以假手术作为对照。治疗组任选地为：示例性长效dnase(静脉注射，1mg/kg)；未修饰的prh-dnase(静脉注射，1mg/kg)；和盐水。在再灌注之前进行一次治疗。[0520]任选地，评估梗塞面积、左心室重构、炎症标记(tnf-α和/或其它促炎性细胞因子)和/或血浆游离细胞dna，例如，以便评估示例性长效dnase(例如，相对于未修饰的dnase和/或盐水)减少梗塞面积、炎症标记和/或血浆游离细胞dna和/或增加左心室重构的能力。[0521]任选地，根据如vogel等人[血管基础研究杂志(basicrescardiol)2015,110:15]所述的方法，评估左心室重构。任选地，根据如alborelli等人[细胞死亡和疾病(celldeathdis)2019,10:534]所述的方法，收集并评估游离细胞dna(cell-freedna，cfdna)。任选地，使用可商购的基于elisa的试剂盒评价炎性标记物(inflammationmarkers)。[0522]实施例8[0523]示例性长效dnase在脂多糖诱导脓毒病动物模型中的作用[0524]将小鼠分成4组(例如，每组5只动物)，并进行如下处理：[0525]1)对照(稚细胞(naive))，[0526]2)脂多糖(lipopolysaccharide，lps)+盐水(皮下注射生理盐水治疗lps诱导的内毒素性休克)，[0527]3)脂多糖(lps)+prh-dnasei(用prh-dnasei治疗的lps诱导的内毒素休克)。[0528]4)脂多糖(lps)+示例性长效prh-dnase(用示例性长效dnase治疗的lps诱导的内毒素休克，根据如上所述的方法制备)。[0529]在内毒素休克之前10分钟和之后8小时，用亚致死剂量的lps和盐水或dnase(10mg/kg，静脉内)治疗小鼠。内毒素性休克诱导后12小时，任选地，评估肺组织中器官损伤生物标记物(例如，肌酸磷酸激酶、血尿素氮(bloodureanitrogen，bun)和天冬氨酸转氨酶(aspartatetransaminase，ast))、循环游离dna、tnf-α和髓过氧化物酶(mpo)的血液水平。另外，任选地评估了内毒素性休克诱导后12小时肾组织中的net沉积。[0530]实验组之间生物标记物水平的比较可以证明聚乙二醇化对dnase减少炎性反应的能力的影响。[0531]为了评估dnase聚乙二醇化对存活的影响，如上文所述处理小鼠，不同之处在于使用致死剂量的lps，每8小时一次，直到第3天。[0532]实施例9[0533]示例性长效dnase在化疗后中性粒细胞减少症动物模型中的作用[0534]根据如mittra等人[肿瘤学年鉴(annalsofoncology)2017,28:2119-2127]所述的方法，评估根据上文所述方法制备的示例性长效dnase对化疗诱导的中性粒细胞减少症的作用。[0535]简言之，单次注射阿霉素(10mg/kg)后，每天进行血细胞计数，持续10天。将小鼠和/或大鼠分为3组(例如，每组5只动物)，进行如下处理：[0536]1)阿霉素(10mg/kg，腹膜内)；[0537]2)阿霉素(10mg/kg，腹膜内)+prh-dnase(1mg/kg，静脉内)；[0538]3)阿霉素(10mg/kg，腹膜内)+示例性长效prh-dnase(1mg/kg，静脉内)。[0539]评估血细胞计数和炎性生物标记物(例如，tnf-α和其它促炎性细胞因子)(例如，如上文所述)，以评估示例性长效dnase改善血细胞计数和/或减少炎性生物标记物的能力。[0540]实施例10[0541]示例性长效dnase在炎性肠病(inflammatoryboweldisease，ibd)和结肠炎的动物模型中的作用[0542]为了研究net降解和中性粒细胞减少(neutrophildepletion)对结肠炎进展的影响，根据例如li等人[jcrohn’scolitis2020,14:240-253]所述的方法使用诱导的结肠炎小鼠模型。[0543]给小鼠(例如，8周龄，雄性)在饮用水中饲喂3％(w/v)右旋糖酐硫酸钠(dextransulfatesodium，dss，例如，mw36kda至40kda)，持续5天，随后饲喂正常饮用水，直到第8天。每天给动物称重，并监测它们是否有痛苦的迹象。将小鼠分成3组(例如，每组5只动物)，并进行如下处理：[0544](1)dss+盐水；[0545](2)dss+prh-dnase；[0546](3)dss+示例性长效prh-dnase。[0547]在模型诱导的第5天，以5mg/kg的单剂量静脉注射dnase变体。除了体重减轻、疾病活动指数、结肠缩短水平和/或炎症的组织学体征之外，还评估了净形成和游离细胞dna水平。dss引发后第4天和第6天，测定了dss诱导的结肠炎中血清游离细胞dna和net形成的增加，以及示例性长效dnase减少net形成、游离细胞dna、体重减轻、疾病活性指数、结肠缩短和/或炎症的组织学迹象和/或增加存活的能力(例如，与未修饰的dnase相比)。[0548]尽管已经结合本公开的具体实施方式描述了本公开，但是显然，对于本领域技术人员来说，许多替代、修改和变化将是显而易见的。因此，旨在包含落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这些替换、修改和变化。[0549]申请人的意图在于，本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用全部并入本说明书中，结合程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请都通过引用具体和单独地结合到本说明书中。此外，本技术中任何参考的引用或标识不应解释为承认此类参考可作为本公开的现有技术。就所使用的章节标题而言，它们不应被理解为必要的限制。此外，本公开的任何一个或多个优先权文件的全部内容过引用的方式整体并入本文。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种修饰的dnase蛋白，包含连接到至少两个聚(亚烷基二醇)部分dnase多肽。2.根据权利要求1所述的修饰的dnase蛋白，其中所述至少两个聚(亚烷基二醇)部分的至少一个或每一个的分子量不超过约10kda。3.根据权利要求2所述的修饰的dnase蛋白，其中所述至少两个聚(亚烷基二醇)部分的至少一个或每一个的分子量在约2kda至约5kda的范围内。4.根据权利要求1至3中任一项所述的修饰的dnase蛋白，其中所述多肽连接到2至7个聚(亚烷基二醇)部分。5.根据权利要求1至4中任一项所述的修饰的dnase蛋白，其中所述多肽连接到至少三个聚(亚烷基二醇)部分。6.根据权利要求5所述的修饰的dnase蛋白，其中所述多肽连接到至少4个聚(亚烷基二醇)部分。7.根据权利要求1至6中任一项所述的修饰的dnase蛋白，其中所述聚(亚烷基二醇)部分的至少一个或每一个是单官能聚(亚烷基二醇)部分。8.根据权利要求1至6中任一项所述的修饰的dnase蛋白，其中所述聚(亚烷基二醇)部分的至少一个或每一个包含与所述多肽中的胺基的氮原子共价连接的亚烷基。9.根据权利要求8所述的修饰的dnase蛋白，其中所述胺基由赖氨酸残基侧链和/或n-末端构成。10.根据权利要求9所述的修饰的dnase蛋白，其中所述多肽中由赖氨酸残基侧链和所述n-末端构成的所述胺基的至少80％与所述聚(亚烷基二醇)部分共价连接。11.根据权利要求1至10中任一项所述的修饰的dnase蛋白，其中所述聚(亚烷基二醇)部分的至少一个或每一个具有通式i：-l
2-l
1-[o-(ch2)m]n-o-r1通式i其中：l1和l2各自独立地是烃部分，或不存在l1和l2；r1是氢或烃部分；m是2至10范围内的整数；并且n是在2至1000范围内的整数。12.根据权利要求1至10中任一项所述的修饰的dnase蛋白，其中所述聚(亚烷基二醇)部分的至少一个或每一个具有通式i’：-ch
2-l
1-[o-(ch2)m]n-o-r1通式i’其中：l1是烃部分或不存在l1；r1是氢或烃部分；m是2至10范围内的整数；和n是2至1000范围内的整数。13.根据权利要求11所述的修饰的dnase蛋白，其中n在20至200的范围内。14.根据权利要求11至13中任一项所述的修饰的dnase蛋白，其中l1是未取代的亚烷基。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的修饰的dnase蛋白，其中l1长度为1至6个碳原子。16.根据权利要求1至15中任一项所述的修饰的dnase蛋白，其中所述聚(亚烷基二醇)部分的至少一或每一个是聚乙二醇部分。17.根据权利要求1至16中任一项所述的修饰的dnase蛋白，其中所述多肽是重组多肽。18.根据权利要求17所述的修饰的dnase蛋白，其中所述多肽是植物重组多肽。19.根据权利要求1至18中任一项所述的修饰的dnase蛋白，其中所述dnase蛋白是dnasei蛋白。20.根据权利要求19所述的修饰的dnase蛋白，其中所述dnase i蛋白与人类dnasei蛋白具有至少80％的同源性。21.根据权利要求20所述的修饰的dnase蛋白，其中所述dnase i蛋白包含或具有seq id no:2所示的氨基酸序列。22.根据权利要求20所述的修饰的dnase蛋白，其中所述dnase i蛋白包含或具有seq id no:1所示的氨基酸序列。23.一种药物组合物，包含根据权利要求1至22中任一项所述的修饰的dnase蛋白和药学上可接受的载体。24.根据权利要求23所述的组合物或根据权利要求1至22中任一项所述的修饰的dnase蛋白，用于治疗其中dnase活性有益于治疗的疾病或病症。25.根据权利要求24所述的组合物或修饰的dnase蛋白，其中所述疾病或病症选自由以下所组成的组：血栓形成；血管闭塞；炎性疾病或病症；自身免疫性疾病或病症；支气管肺病；心血管疾病；代谢疾病；癌症；神经退行性疾病或病症；与感染、肝损伤、纤维化和导管闭塞有关的疾病或病症。26.根据权利要求24所述的组合物或修饰的dnase蛋白，其中所述疾病或病症选自由以下所组成的组：急性冠脉综合征；急性肾损伤；急性肺损伤；急性呼吸窘迫综合征；过敏；阿尔茨海默病；肌萎缩性侧索硬化症；关节炎；气喘；肺膨胀不全；动脉粥样硬化；特应性皮炎；双相型障碍；支气管扩张；毛细支气管炎；支气管炎和气管支气管炎；胆管炎；慢性肾病；慢性中性粒细胞增多症；慢性阻塞性肺疾病；慢性化脓性肺病结膜炎；普通感冒；囊性纤维化；深静脉血栓形成；糖尿病；弥散性血管内凝血；干眼症；脓胸；心内膜炎；女性不育症；痛风；移植物抗宿主病；血肿；血胸；肝素诱导的血小板减少症；肝肾综合征；亨廷顿病；炎症性肠病；胆道内血栓；缺血-再灌注损伤；卡塔格内氏综合征；白血病；白细胞淤积症；肝硬化；狼疮性肾炎；男性不育症；乳腺炎；心肌梗塞；嗜中性白血球减少症；中性粒细胞聚集；输精管阻塞；胰腺炎；帕金森病；肺炎；气动后贫血；原发性纤毛运动不良症；银屑病；横纹肌溶解症；结节病；精神分裂症；脓毒病；镰状细胞病；鼻窦炎；修格兰氏症候群；烟雾诱导的肺损伤；实体瘤和/或肿瘤转移；中风；手术粘连；手术和/或创伤性组织损伤；全身炎症反应综合征；系统性红斑狼疮；系统性硬化症；血栓性微血管病；与放疗和/或化疗相关的组织损伤；输血诱导的肺损伤；结核病；血管炎；静脉血栓栓塞症；病毒、细菌、真菌和/或原虫感染；以及伤口或溃疡。27.根据权利要求26所述的组合物或修饰的dnase蛋白，其中所述疾病或病症是脓毒病。
28.根据权利要求23所述的组合物或根据权利要求1至22中任一项所述的修饰的dnase蛋白，用于治疗与有需要的对象的流体、分泌物或组织中的过量细胞外dna相关的疾病或病症。29.根据权利要求24至28中任一项所述的组合物或修饰的dnase蛋白，其中所述疾病或病症与中性粒细胞胞外陷阱(nets)有关。30.一种制备根据权利要求1至22中任一项所述的修饰的dnase蛋白的方法，所述方法包括：(a)使所述多肽与包含连接到醛基的聚(亚烷基二醇)的试剂接触，以获得所述多肽和所述试剂的缀合物；和(b)使所述缀合物与还原剂接触。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述还原剂选自由甲基吡啶硼烷复合物和氰基硼氢化钠所组成的组。32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述试剂具有通式ii：hc(＝o)-l
1-[o-(ch2)m]n-o-r1通式ii其中：l1是烃部分；r1是氢或烃部分；m是2至10范围内的整数；并且n是2至1000范围内的整数。33.根据权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述试剂与所述多肽的摩尔比在10:1至2,000:1的范围内。34.根据权利要求30至33中任一项所述的方法，其中使所述缀合物与所述还原剂的接触在至少约7的ph下进行。

技术总结
本文描述了修饰的DNase蛋白以及包含该修饰的DNase蛋白的药物组合物，所述修饰的DNase蛋白包含与至少两个聚(亚烷基二醇)部分连接的DNase多肽。本文还描述了制备修饰的DNase蛋白的方法，所述方法包括：使所述多肽与包含与醛基连接的聚(亚烷基二醇)的试剂接触，以获得所述多肽和所述试剂的缀合物；以及使所述缀合物与还原剂接触。物与还原剂接触。物与还原剂接触。


技术研发人员：宜尔雅
受保护的技术使用者：波塔力克斯有限公司
技术研发日：2021.10.07
技术公布日：2023/8/24