嵌合抗原受体

1.本发明涉及嵌合抗原受体等。


背景技术：

2.嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor。以下也称为“car”)根据抗体的特异性，与抗原结合，由此，能够引起靶标细胞的损伤、细胞因子释放、刺激后的t细胞分裂。能够通过基因导入对t细胞赋预特异性。细胞的制备总体上比对内源性的肿瘤特异性t细胞受体(tcr)阳性t细胞进行培养扩增的情况容易。另外，关于利用car的治疗方法(car-t疗法)，与抗体疗法相比显示更高的细胞伤害活性，由于以1次输注而利用抗原刺激进行自我扩增从而不需要多次治疗，从这些方面来讲是优异的。在tcr基因导入时，由于以hla和在其上提呈的肽的复合体为靶标，所以仅在患者具有特定的hla的情况下能够治疗(hla限制性)，car在没有hla限制性的方面更为有利。即，只要肿瘤细胞中靶标抗原为阳性，则能够以靶标抗原阳性的全部患者为对象进行治疗。
3.关于嵌合抗原受体基因导入t细胞(car-t细胞)疗法，cd19car-t在美国已经被批准作为药品。其临床效果高，对各种恶性肿瘤可以期待临床的有用性(例如，专利文献1)。
4.现有技术文献
5.专利文献
6.专利文献1：日本专利第5312721号公报


技术实现要素：

7.发明所要解决的技术课题
8.本发明的技术课题在于提供一种新型的嵌合抗原受体。优选以提供癌症的预防或治疗效果更高的抗原受体为技术课题。
9.用于解决技术课题的技术方案
10.本发明的发明人对于上述技术课题深入进行了研究，结果发现适合采用包含cd79a细胞内结构域和cd40细胞内结构域的细胞内信号结构域。而且，进一步进行研究的结果，作为一个方案，发现了一种嵌合抗原受体能够解决上述技术课题，该嵌合抗原受体包括抗原结合性结构域、跨膜结构域、以及包含cd79a细胞内结构域和cd40细胞内结构域的细胞内信号结构域，并且，(a)上述抗原结合性结构域与上述跨膜结构域之间的构成氨基酸残基数为100以下；和/或(b)上述抗原结合性结构域的靶标抗原为cd19以外的抗原。基于该发现进一步进行研究，结果完成了本发明。即，本发明包括下述方案。
11.即，本发明包括下述方案。
12.项1.一种嵌合抗原受体，其包括：抗原结合性结构域、跨膜结构域、以及包含cd79a细胞内结构域和cd40细胞内结构域的细胞内信号结构域，并且，(a)上述抗原结合性结构域与上述跨膜结构域之间的构成氨基酸残基数为100以下；和/或(b)上述抗原结合性结构域的靶标抗原为cd19以外的抗原。
13.项2.如项1所述的嵌合抗原受体，其中，上述细胞内信号结构域包含细胞内活化结构域。
14.项3.如项2所述的嵌合抗原受体，其中，上述细胞内活化结构域为选自cd3ζ细胞内结构域和fcεriγ细胞内结构域中的至少1种。
15.项4.如项2或3所述的嵌合抗原受体，其中，上述cd79a细胞内结构域、上述cd40细胞内结构域、和上述细胞内活化结构域从跨膜结构域侧起以该顺序配置。
16.项5.如项1～4中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，在上述抗原结合性结构域与上述跨膜结构域之间包含igg的铰链部或其一部分。
17.项6.如项1～5中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，上述构成氨基酸残基数为1～30。
18.项7.如项1～6中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，上述抗原结合性结构域的结构为单链抗体结构。
19.项8.如项1～7中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，上述抗原结合性结构域的靶标抗原为选自cd19、gd2、gd3、cd20、cd37、cea、her2、egfr、iii型突变egfr(type iii mutant egfr)、cd38、bcma、muc-1、psma、wt1、肿瘤睾丸抗原(cancer testis antigen)、突变肽(mutation peptide)、htert、pram、tyrp1、间皮素、pmel、和粘蛋白中的至少1种。
20.项9.编码项1～8中任一项所述的抗原受体的多核苷酸。
21.项10.包含项9所述的多核苷酸的细胞。
22.项11.如项10所述的细胞，其为淋巴细胞。
23.项12.含有项10或11所述的细胞的医药组合物。
24.项13.如项12所述的医药组合物，其用于癌症的治疗、预防或改善。
25.发明的效果
26.根据本发明，能够提供一种新型的抗原受体。通过使用该抗原受体，能够有效地治疗或预防癌症。
附图说明
27.图1表示试验例1中制作的car构建体的一部分的结构示意图。
28.图2表示试验例3的生物发光成像的结果。纵轴表示发光强度(表示癌的扩散程度。)。横轴表示接种癌细胞后的经过天数。数据以平均值
±
sem(双向anova；*p＜0.05、**p＜0.01)的形式表示，从使用3个不同的供体(cd19car sh t细胞：每组n＝8；tegfr-t：n＝4)的3个独立实验算出。
29.图3表示试验例3的存活曲线。纵轴表示小鼠的存活率。横轴表示接种癌细胞后的经过天数。wilcoxon检验；*p＜0.05、****p＜0.0001。
30.图4表示试验例4的生物发光成像的结果(短铰链的构建体的情况)。纵轴表示发光强度(表示癌的扩散的程度。)。横轴表示接种癌细胞后的经过天数。数据以平均值
±
sem(双向anova；*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001)的形式表示，从使用3个不同供体(cd19car sh t细胞：每组n＝13；tegfr-t：n＝7)的3个独立实验算出。
31.图5表示试验例4的生物发光成像的结果(长铰链的构建体的情况)。纵轴表示发光强度(表示癌的扩散的程度。)。横轴表示接种癌细胞后的经过天数。数据以平均值
±
sem(双
向anova；***p＜0.001)的形式表示，从使用2个不同的供体(cd19car sh t细胞：每组n＝8；tegfr-t：n＝6)的2个独立实验算出。
32.图6表示试验例4的存活曲线(短铰链的构建体的情况)。纵轴表示小鼠的存活率。横轴表示接种癌细胞后的经过天数。
33.图7表示试验例4的存活曲线(长铰链的构建体的情况)。纵轴表示小鼠的存活率。横轴表示接种癌细胞后的经过天数。
34.图8表示试验例5的活细胞数测定结果。纵轴表示cd19car-t细胞的活细胞数的相对值，横轴表示从共培养开始后的经过天数。左侧的图表示不添加il-2时的结果，右侧的图表示添加了il-2时的结果。
35.图9表示试验例6的活细胞数测定结果。纵轴表示cd37car-t细胞的活细胞数的相对值，横轴表示从共培养开始后的经过天数。
36.图10表示试验例7的活细胞数测定结果。纵轴表示cd20car-t细胞的活细胞数的相对值，横轴表示从共培养开始后的经过天数。
具体实施方式
37.1.定义
38.在本说明书中，关于“含有”和“包含”的表达包括“含有”、“包含”、“实质上由
……
构成”和“仅由
……
构成”的概念。
39.氨基酸序列的“同一性”是指2个以上的能够比对的氨基酸序列相对于彼此的氨基酸序列的一致的程度。因此，某2个氨基酸序列的一致性越高，则这些序列的同一性或类似性越高。氨基酸序列的同一性的水平例如使用序列分析用工具fasta并利用默认参数来确定。或者，可以使用karlin和altschul的算法blast(karlins,altschul sf."methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes"proc natl acad sci usa.87:2264－2268(1990)；karlins,altschul sf."applications and statistics for multiple high－scoring segments in molecular sequences."proc natl acad sci usa.90:5873－7(1993))来确定。开发有基于这样的blast的算法的被称为blastx的程序。这些分析方法的具体方法是公知的，可以参照national center of biotechnology information(ncbi)的网址(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。另外，碱基序列的“同一性”也根据上述来定义。
40.在本说明书中，“保守性取代”是指氨基酸残基被具有类似的侧链的氨基酸残基取代的意思。例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸这样的具有碱性侧链的氨基酸残基彼此的取代就属于保守性取代。此外，天冬氨酸、谷氨酸这样的具有酸性侧链的氨基酸残基；甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸这样的具有非带电性极性侧链的氨基酸残基；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸这样的具有非极性侧链的氨基酸残基；苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸这样的具有β-分支侧链的氨基酸残基；酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸这样的具有芳香族侧链的氨基酸残基彼此的取代同样也属于保守性取代。
41.在本说明书中，“cdr”是complementarity determining region的简称，也被称为互补决定区。cdr是指存在于免疫球蛋白或t细胞受体的可变区的区域，是与抗体或t细胞受
体对抗原的特异性结合密切相关的区域。此外，“轻链cdr”是指存在于免疫球蛋白的轻链可变区的cdr，“重链cdr”是指存在于免疫球蛋白的重链可变区的cdr。在t细胞受体中，也有α链、β链、γ链、δ链等，关于这些cdr也同样。
42.在本说明书中，“可变区”是指包含cdr1～cdr3(以下，简称为“cdrs1-3”)的区域。这些cdrs1-3的配置顺序没有特别限定，优选在从n末端侧到c末端侧的方向上以cdr1、cdr2和cdr3的顺序或者以其相反顺序连续或经由后述的被称为框架区(fr)的其它氨基酸序列配置的区域。此外，“重链可变区”是指在免疫球蛋白中配置有上述重链cdrs1-3的区域，“轻链可变区”是指在免疫球蛋白中配置有上述轻链cdrs1-3的区域。在t细胞受体中，也有α链、β链、γ链、δ链等，关于这些cdr也同样。
43.各可变区的上述cdr1-3以外的区域如上所述被称为框架区(fr)。特别将可变区的n末端与上述cdr1之间的区域定义为fr1，将cdr1与cdr2之间的区域定义为fr2，将cdr2与cdr3之间的区域定义为fr3，将cdr3与可变区的c末端之间定义为fr4。
44.2.嵌合抗原受体
45.本发明在其一个方式中涉及一种嵌合抗原受体，其包括抗原结合性结构域、跨膜结构域、以及包含cd79a细胞内结构域和cd40细胞内结构域的细胞内信号结构域，并且，(a)上述抗原结合性结构域与上述跨膜结构域之间的构成氨基酸残基数为100以下；和/或(b)上述抗原结合性结构域的靶标抗原为cd19以外的抗原(在本说明书中，有时也表示为“本发明的嵌合抗原受体”。)。以下，对该本发明的嵌合抗原受体进行说明。
46.此外，本发明在其一个方式中还涉及一种包括抗原结合性结构域、跨膜结构域、以及包含cd79a细胞内结构域和cd40细胞内结构域的细胞内信号结构域的嵌合抗原受体。关于该嵌合抗原受体，根据本发明的嵌合抗原受体的说明。
47.抗原结合性结构域是本发明的嵌合抗原受体配置在细胞膜上时被配置在细胞外的结构域，只要是识别抗原且能够与该抗原结合的结构域即可，没有特别限制。作为抗原，具体而言，例如可以列举cd19、gd2、gd3、cd20、cd37、cea、her2、egfr、iii型突变egfr、cd38、bcma、muc-1、psma、wt1、肿瘤睾丸抗原(例如ny-eso-1、mage-a4等)、突变肽(例如k-ras、h-ras、p53等)、htert、pram、tyrp1、间皮素、pmel、粘蛋白等、以及这些片段与mhc的复合体(pmhc)等。这些之中，在本发明的一个方式中，优选列举cd19。另外，在本发明的另一个方式中，优选列举cd19以外的抗原，更优选列举cd20、cd37等。抗原结合性结构域通常具有对于抗原的抗体或t细胞受体的cdr(例如如果为抗体的cdr，则为重链cdr1、重链cdr2、重链cdr3、轻链cdr1、轻链cdr2和轻链cdr3)之中的1个以上、优选2个、3个、4个、5个以上、更优选全部6个。抗原结合性区域更优选包含对于抗原的抗体或t细胞受体的可变区(抗体的情况下，例如为重链可变区和/或轻链可变区)。
48.抗原结合性结构域优选采用单链抗体结构，更优选采用scfv结构。在如scfv结构这样包含重链可变区和轻链可变区的情况下，重链可变区与轻链可变区通常经由接头连结。接头只要不明显损害抗原结合性即可。没有特别限制，可以为任意接头。作为接头，优选为由甘氨酸构成的接头或者由甘氨酸和丝氨酸构成的接头(ggs接头、gs接头、ggg接头等)。接头的长度没有特别限定。接头的氨基酸残基数例如为5～30，优选为10～25。重链可变区和轻链可变区的配置关系没有特别限制，能够采用n末端侧为轻链可变区的方案和n末端侧为重链可变区的情况的任意一种。该配置关系优选为前者。
49.跨膜结构域是在本发明的嵌合抗原受体配置在细胞膜上时被配置在细胞膜内的结构域，只要能够构成嵌合抗原受体即可，没有特别限制。作为跨膜结构域，例如可以使用cd28、cd3ε、cd8α、cd3、cd4、4-1bb等的跨膜区。各因子的跨膜区是公知的，或者能够从公知的序列信息(例如利用跨膜区的预测程序等)容易地确定。另外，也可以使用由人工构建的多肽构成的跨膜结构域。这些跨膜结构域只要不明显损害嵌合抗原受体的功能，也可以适当导入突变。
50.作为跨膜结构域，能够优选采用cd28的跨膜区。作为cd28的跨膜区的具体例，可以列举下述(a)中记载的氨基酸序列或下述(b)中记载的氨基酸序列：
51.(a)序列编号3所示的氨基酸序列；或者
52.(b)与序列编号3所示的氨基酸序列具有85％以上的同一性、且在本发明的嵌合抗原受体配置在细胞膜上时能够被配置在细胞膜内的氨基酸序列。
53.在上述(b)中，同一性优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为98％以上，特别优选为99％以上。
54.作为上述(b)中记载的氨基酸序列的一例，例如可以列举：
55.(b
′
)对序列编号3所示的氨基酸序列取代、缺失、添加或插入有1个或多个氨基酸、且在本发明的嵌合抗原受体配置在细胞膜上时能够被配置在细胞膜内的氨基酸序列。
56.在上述(b
′
)中，多个例如为2～5个，优选为2～3个，更优选为2个。
57.在本发明的一个方式中，抗原结合性结构域和跨膜结构域优选直接或经由比较短的间隔子连结。在本发明的嵌合抗原受体中，抗原结合性结构域与跨膜结构域之间的构成氨基酸残基数例如可以为400以下、300以下或250以下，特别优选为100以下。该构成氨基酸残基数优选为0～60，更优选为0～40，进一步优选为0～30。在本发明的特别优选的方式中，该氨基酸残基数为1个以上、4个以上或8个以上，另外为25个以下、20个以下或15个以下，另外为1～25、4～20、或8～15。间隔子的序列没有特别限定，例如可以在间隔子中使用igg、优选人igg(例如亚型igg1或igg4)的铰链部或其一部分、铰链部和ch2的一部分、或跨膜结构域中利用的因子(例如cd28)的一部分等的序列。此外，通过利用铰链部或其一部分序列，能够期待构成为富有柔软性的间隔子。
58.细胞内信号结构域是在本发明的嵌合抗原受体配置在细胞膜上时被配置在细胞内的结构域，是能够传递免疫细胞的效应子功能的发挥所必须的信号、即在抗原结合性结构域与抗原结合时能够传递免疫细胞的活化所必须的信号的结构域。本发明的嵌合抗原受体中，细胞内信号结构域包含cd79a细胞内结构域和cd40细胞内结构域。
59.cd79a细胞内结构域是由cd79a的氨基酸的细胞内结构域的氨基酸序列构成的结构域，只要满足该要求就没有特别限制。
60.作为cd79a，例如能够采用源自人、猴、小鼠、大鼠、狗、猫、兔等各种哺乳类的cd79a。其中，优选源自对象生物(例如人)的cd79a。
61.源自各种生物种类的cd79a细胞内结构域的氨基酸序列是公知的。具体而言，例如可以列举序列编号4所示的氨基酸序列等。
62.cd79a细胞内结构域只要具有nfκb信号活化作用，也可以具有氨基酸的取代、缺失、添加、插入等突变。作为突变，从更加不易损害上述作用的观点考虑，优选列举取代、更优选列举保守性取代。
63.作为cd79a细胞内结构域的氨基酸序列的优选具体例，可以列举选自下述(c)中记载的氨基酸序列和下述(d)中记载的氨基酸序列中的至少1种：
64.(c)序列编号4所示的氨基酸序列；和
65.(d)与序列编号4所示的氨基酸序列具有85％以上的同一性、且构成具有nfκb信号活化作用的蛋白质的氨基酸序列。
66.在上述(d)中，同一性优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为98％以上，特别优选为99％以上。
67.作为上述(d)中记载的氨基酸序列的一例，例如可以列举：
68.(d
′
)对序列编号4所示的氨基酸序列取代、缺失、添加或插入有1个或多个氨基酸、且具有nfκb信号活化作用的氨基酸序列。
69.在上述(d
′
)中，多个例如为2～5个，优选为2～3个，更优选为2个。
70.cd40细胞内结构域是由cd40的氨基酸的细胞内结构域的氨基酸序列构成的结构域，只要满足该要求就没有特别限制。
71.作为cd40，例如能够采用源自人、猴、小鼠、大鼠、狗、猫、兔等各种哺乳类的cd40。其中，优选源自对象生物(例如人)的cd40。
72.源自各种生物种类的cd40细胞内结构域的氨基酸序列是公知的。具体而言，例如可以列举序列编号5所示的氨基酸序列等。
73.cd40细胞内结构域只要具有nfκb信号活化作用，也可以具有氨基酸的取代、缺失、添加、插入等突变。作为突变，从更加不易损害上述作用的观点考虑，优选列举取代、更优选列举保守性取代。
74.作为cd40细胞内结构域的氨基酸序列的优选具体例，可以列举选自下述(e)中记载的氨基酸序列和下述(f)中记载的氨基酸序列中的至少1种：
75.(e)序列编号5所示的氨基酸序列；和
76.(f)与序列编号5所示的氨基酸序列具有85％以上的同一性、且构成具有nfκb信号活化作用的蛋白质的氨基酸序列。
77.在上述(f)中，同一性优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为98％以上，特别优选为99％以上。
78.作为上述(f)中记载的氨基酸序列的一例，例如可以列举：
79.(f
′
)对于序列编号5所示的氨基酸序列取代、缺失、添加或插入有1个或多个氨基酸、且具有nfκb信号活化作用的氨基酸序列。
80.在上述(f
′
)中，多个例如为2～5个，优选为2～3个，更优选为2个。
81.cd79a细胞内结构域和cd40细胞内结构域的配置关系没有特别限制，能够采用n末端侧为cd79a细胞内结构域的方案和n末端侧为cd40细胞内结构域的情况的任意一种。该配置关系优选为前者。cd79a细胞内结构域和cd40细胞内结构域优选直接连结或者经由接头连结。接头只要不明显损害nfκb信号活化作用即可，没有特别限制，可以为任意接头。作为接头，优选为由甘氨酸构成的接头或者由甘氨酸和丝氨酸构成的接头(ggs接头、gs接头、ggg接头等)。接头的长度没有特别限定。接头的氨基酸残基数例如为1～20，优选为1～10，更优选为1～5。
82.细胞内信号结构域优选包含细胞内活化结构域。作为细胞内活化结构域，例如除
了可以采用cd3ζ以外，还可以采用fcεriγ等的细胞内结构域。优选采用cd3ζ。cd3只要不损害抗原受体的功能，也可以适当导入突变。在对cd3导入突变的情况下，优选以包含itam(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，免疫受体酪氨酸激活基序)的方式进行。
83.作为细胞内活化结构域的具体例，可以列举下述(g)中记载的氨基酸序列或下述(h)中记载的氨基酸序列：
84.(g)序列编号6所示的氨基酸序列；或
85.(h)与序列编号6所示的氨基酸序列具有85％以上的同一性、且具有免疫细胞的活化作用的氨基酸序列。
86.在上述(h)中，同一性优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为98％以上，特别优选为99％以上。
87.作为上述(h)中记载的氨基酸序列的一例，例如可以列举：
88.(h
′
)对序列编号6所示的氨基酸序列取代、缺失、添加或插入有1个或多个氨基酸、且具有免疫细胞的活化作用的氨基酸序列。
89.在上述(h
′
)中，多个例如为2～15个，优选为2～10个，更优选为2～5个，进一步优选为2～3个。
90.细胞内活化结构域的位置没有特别限制。细胞内活化结构域优选配置得比cd79a细胞内结构域和cd40细胞内结构域靠细胞内侧(与跨膜结构域相反的一侧)。在本发明的特别优选的一个方式中，cd79a细胞内结构域、cd40细胞内结构域和细胞内活化结构域从跨膜结构域侧起以该顺序配置。
91.本发明的嵌合抗原受体可以包含上述以外的其它区域。作为其它区域，例如可以列举共刺激因子细胞内结构域、用于促进car向细胞膜上的输送的前导序列(信号肽)(例如，gm-csf受体的前导序列)、间隔子/接头(例如跨膜区与细胞内信号结构域之间、细胞内信号结构域内的各结构域间)等。共刺激因子的细胞内结构域只要为源自t细胞等所具有的共刺激因子的细胞内结构域即可，没有特别限定。例如可以适当选择ox40、4－1bb、gitr、cd27、cd278和cd28等中的1种以上来使用。
92.此外，目前为止有一些利用car的实验、临床研究等的报道(例如rossig c,et al.mol ther 10:5-18,2004；dotti g,et al.hum gene ther20:1229-1239,2009；ngo mc,et al.hum mol genet 20(r1):r93-99,2011；ahmed n,et al.mol ther 17:1779-1787,2009；pule ma,et al.nat med 14:1264-1270,2008；louis cu,et al.blood 118:6050-6056,2011；kochenderfer jn,et al.blood 116:4099-4102,2010；kochenderfer jn,etal.blood 119:2709-2720,2012；porter dl,et al.n engl j med365:725-733,2011；kalos m,et al.sci transl med 3:95ra73,2011；brentjens rj,et al.blood 118:4817-4828,2011；brentjens rj,et al.sci transl med 5:177ra38,2013)，可以参照这些报道构建本发明的嵌合抗原受体。
93.作为本发明的嵌合抗原受体的特别优选的一个方式，可以列举包含抗原结合性结构域、跨膜结构域、cd79a(cd40)细胞内结构域和cd40(cd79a)细胞内结构域、以及细胞内活化结构域以该顺序配置而成的核心区的嵌合抗原受体。在该核心区中，抗原结合性结构域和跨膜结构域经由间隔子连结，跨膜结构域与cd79a(cd40)细胞内结构域和cd40(cd79a)细
胞内结构域之间、cd79a(cd40)细胞内结构域与cd40(cd79a)细胞内结构域之间、cd79a(cd40)细胞内结构域和cd40(cd79a)细胞内结构域与细胞内活化结构域之间直接连结或经由间隔子/接头连结。关于间隔子/接头，与上述的说明相同。
94.本发明的嵌合抗原受体可以是由1种多肽构成的分子，也可以是由2种以上的多肽的复合体构成的分子。另外，本发明的嵌合抗原受体可以是由多肽或其复合体构成的分子，也可以是在多肽或其复合体上连结其它物质(例如荧光物质、放射性物质、无机颗粒等)而成的分子。
95.本发明的嵌合抗原受体可以是经化学修饰的受体。构成本发明的嵌合抗原受体的多肽的c末端可以是羧基(－cooh)、羧酸根(－coo
－
)、酰胺(－conh2)或酯(－coor)的任意种。这里，作为酯中的r，例如可以使用甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基等的c
1－6
烷基；例如环戊基、环己基等的c
3－8
环烷基；例如苯基、α－萘基等的c
6－12
芳基；例如苄基、苯乙基等的苯基－c
1－2
烷基；α－萘基甲基等的α－萘基－c
1－2
烷基等的c
7－14
芳烷基；特戊酰基氧基甲基等。构成本发明的嵌合抗原受体的多肽的c末端以外的羧基(或羧酸根)可以被酰胺化或酯化。作为该情况的酯，例如可以使用上述的c末端的酯等。此外，构成本发明的嵌合抗原受体的多肽还包括：n末端的氨基酸残基的氨基被保护基(例如甲酰基、乙酰基等的c
1－6
烷酰基等的c
1－6
酰基等)保护的多肽、能够在生物体内被切断而生成的n末端的谷氨酰胺残基被焦谷氨酸化的多肽、分子内的氨基酸的侧链上的取代基(例如－oh、－sh、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)被适当的保护基(例如甲酰基、乙酰基等的c
1－6
烷酰基等的c
1－6
酰基等)保护的多肽。
96.本发明的嵌合抗原受体可以添加有公知的蛋白质标签、信号序列等蛋白质或肽。作为蛋白质标签，例如可以列举生物素、his标签、flag标签、halo标签、mbp标签、ha标签、myc标签、v5标签、pa标签、荧光蛋白标签等。
97.本发明的嵌合抗原受体可以是与酸或碱的药学上可接受的盐的形态。盐只要是药学上可接受的盐即可，没有特别限定，可以采用酸性盐、碱性盐的任意种。例如，作为酸性盐的例子，可以列举盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等无机酸盐；乙酸盐、丙酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐等有机酸盐；天冬氨酸盐、谷氨酸盐等氨基酸盐等。另外，作为碱性盐的例子，可以列举钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土金属盐等。
98.本发明的嵌合抗原受体也可以为溶剂合物的形态。溶剂只要是药学上可接受的溶剂即可，没有特别限定，例如可以列举水、乙醇、甘油、乙酸等。
99.制造嵌合抗原受体及表达其的car－t细胞的技术是公知的。这些可以按照或基于公知的方法来制造。
100.3.多核苷酸及其利用
101.本发明在其一个方式中涉及编码本发明的嵌合抗原受体的多核苷酸(在本说明书中，有时表示为“本发明的多核苷酸”。)。以下，对其进行说明。
102.本发明的多核苷酸中，除了包含本发明的嵌合抗原受体的编码序列以外，还可以包含其它序列。本发明的多核苷酸优选以能够表达本发明的嵌合抗原受体的状态包含。作为其它序列，可以列举启动子序列、增强子序列、抑制子序列、绝缘子序列、复制基点、报告子蛋白质(例如荧光蛋白质等)编码序列、药剂耐性基因编码序列等。
103.本发明的多核苷酸优选包含本发明的嵌合抗原受体的表达盒。表达盒包含启动子和处于该启动子的控制下的本发明的嵌合抗原受体的编码序列。为了处于启动子的控制下，通常编码序列配置在启动子的下游。作为car表达盒能够利用的启动子，例如可以列举cmv-ie(来自巨细胞病毒早期基因的启动子)、sv40ori、逆转录病毒ltp、srα、ef1α、β肌动蛋白启动子等。启动子与编码序列以可操作的方式连结。其中，“启动子与编码序列以可操作的方式连结”与“在启动子的控制下配置有编码序列”同义，通常，在启动子的3'末端侧直接或经由其它序列连结编码序列。在编码序列的下游配置多聚a添加信号序列。通过使用多聚a添加信号序列，结束转录。作为多聚a添加信号序列，可以使用sv40的多聚a添加序列、来自牛的生长激素基因的多聚a添加序列等。
104.在表达盒内可以包含检测用基因(报告子基因、细胞或组织特异性基因、选择标记基因等)、增强子序列、wrpe序列等。检测用基因用于表达盒的导入的成功与否和效率的判定、car基因的表达的检测或表达效率的判定、表达car基因的细胞的选择和分选等。另一方面，通过增强子序列的使用实现表达效率的提高。作为检测用基因，可以使用赋予对新霉素的耐性的neo基因、赋予对卡那霉素等的耐性的npt基因(herrera estrella、embo j.2(1983),987-995)或nptii基因(messing&vierra.gene 1 9:259-268(1982))、赋予对潮霉素的耐性的hph基因(blochinger&diggl mann,mol cell bio 4:2929-2931)、赋予对甲氨蝶呤的耐性的dhfr基因(bourouis et al.,embo j.2(7))等(以上，标记基因)、荧光素酶基因(giacomin,p1.sci.116(1996),59～72；scikantha,j.bact.178(1996)、121)、β-葡糖醛酸糖苷酶(gus)基因、gfp(gerdes,febs lett.389(1996),44-47)或其改变体(egfp或d2egfp等)等的荧光蛋白质的基因(以上，报告子基因)、缺少细胞内结构域的上皮生长因子受体(egfr)基因等的基因。检测用基因例如经由双顺反子控制序列(例如，核糖体内部识别序列(ires))或编码自裂解肽的序列与car基因连结。自裂解肽的例子为来自thosea asigna virus(明脉扁刺蛾病毒)的2a肽(t2a)，但不限定于此。作为自裂解肽，已知有源自口蹄疫病毒(fmdv)的2a肽(f2a)、源自马鼻炎a病毒(erav)的2a肽(e2a)、源自猪捷申病毒(porcine teschovirus)(ptv-1)的2a肽(p2a)等。
105.本发明的多核苷酸可以是直链状的多核苷酸，也可以是环状的多核苷酸(载体等)。载体可以为质粒载体或病毒载体。另外，载体例如可以是克隆用载体或表达用载体。作为表达用载体，可以列举大肠杆菌或放线菌等的原核细胞用的载体、或者酵母细胞、昆虫细胞、或哺乳类细胞等的真核细胞用的载体。更具体而言，作为病毒载体，可以列举逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、仙台病毒载体等，作为非病毒载体的例子，可以列举各种质粒载体、脂质体载体、正电荷型脂质体载体(felgner,p.l.,gadek,t.r.,holm,m.et al.,proc.natl.acad.sci.,84:7413-7417,1987)、yac载体、bac载体。
106.本发明的多核苷酸不仅包含dna、rna，还包含对它们实施了如下所例示的那样的公知的化学修饰的核苷酸。为了防止核酸酶等水解酶引起的分解，可以将各核苷酸的磷酸残基(磷酸酯)例如取代为硫代磷酸酯(ps)、甲基磷酸酯、二硫代磷酸酯等的化学修饰磷酸残基。另外，也可以将各核糖核苷酸的糖(核糖)的2位的羟基取代为-or(r例如表示ch3(2
′‑
o-me)、ch2ch2och3(2
′‑
o-moe)、ch2ch2nhc(nh)nh2、ch2conhch3、ch2ch2cn等)。此外，也可以对碱基部分(嘧啶、嘌呤)实施化学修饰，例如可以列举向嘧啶碱基的5位导入的甲基或阳离子
性官能团、或者2位的羰基取代成硫代羰基等。此外，可以列举磷酸部分或羟基部分例如被生物素、氨基、低级烷基胺基、乙酰基等修饰后的核苷酸等，但不限定于此。另外，“多核苷酸”的术语不仅包括天然的核酸，还包括bna(bridged nucleic acid，桥接核酸)、lna(locked nucleic acid，锁核酸)、pna(peptide nucleic acid，肽核酸)等的任意种。
107.通过包括将本发明的多核苷酸导入细胞的步骤的方法，能够得到具有抗癌作用的细胞。该细胞表达本发明的嵌合抗原受体。以下对其一个方式进行说明。
108.作为可以导入本发明的多核苷酸的细胞(car表达用细胞)，可以列举cd4阳性cd8阴性t细胞、cd4阴性cd8阳性t细胞、由ips细胞制备的t细胞、αβ-t细胞、γδ-t细胞、nk细胞、nkt细胞等。只要包括如上所述的淋巴细胞或祖细胞，则可以使用各种细胞群。从末梢血采集的pbmc(末梢血单核细胞)为优选的靶标细胞之一。即，在优选的一个方式中，对pbmc进行基因导入操作。pbmc能够按照或基于常规方法制备。
109.优选在本发明的多核苷酸的导入前预先使car表达用细胞活化。例如能够用抗cd3抗体和抗cd28抗体刺激，使car表达用细胞活化。例如，通过用抗cd3抗体和抗cd28抗体涂布了培养面的培养容器(例如培养皿)培养，能够利用抗cd3抗体和抗cd28抗体施加刺激。也可以利用涂布了抗cd3抗体和抗cd28抗体的磁珠(例如veritas公司提供的dynabeads t-activator cd3/cd28)进行该刺激。
110.为了提高细胞的存活率/增殖率，优选在活化处理时，使用添加有t细胞增殖因子的培养液。作为t细胞增殖因子，可以使用il-2、il-15、il-7等。il-2、il-15、il-7等的t细胞增殖因子能够按照常规方法制备。另外，也可以利用市售品。虽然不排除使用人以外的动物种类的t细胞增殖因子，但通常t细胞增殖因子使用源自人的t细胞增殖因子(也可以是重组体)。
111.典型而言，为了其应用(向患者的投予)，使导入本发明的多核苷酸后的细胞(本发明的多核苷酸导入淋巴细胞)增殖。例如，使用添加有t细胞增殖因子的培养液，培养本发明的多核苷酸导入淋巴细胞(根据需要进行传代培养)。在该培养之外，还可以进行与car表达用细胞的活化时同样的处理(再活化)。
112.此外，car表达用细胞和本发明的多核苷酸导入淋巴细胞的培养也可以使用添加有血清(人血清、胎牛血清等)的培养基，但通过采用无血清培养基，能够制备出临床应用时的安全性高、且具有不易出现因血清批次间的差异引起的培养效率不同的优点的细胞。在使用血清的情况下，优选使用自体血清、即从接受car基因导入淋巴细胞的投予的患者采集的血清。
113.4.细胞
114.本发明在其一个方式中涉及含有本发明的多核苷酸的细胞(在本说明书中，有时也表示为“本发明的细胞”。)。以下，对其进行说明。
115.本发明的细胞的来源细胞没有特别限制。本发明的细胞只要是出于在本发明的嵌合抗原受体的纯化中使用的目的，则作为来源细胞，可以列举蛋白质表达中能够使用的细胞(例如，昆虫细胞、真核细胞、哺乳类细胞等)等。
116.本发明的细胞优选为淋巴细胞(例如，t细胞(例如cd4阳性cd8阴性t细胞、cd4阴性cd8阳性t细胞、从ips细胞制备的t细胞、αβ-t细胞、γδ-t细胞等)、nk细胞、nkt细胞等)。这些细胞优选为表达本发明的嵌合抗原受体的细胞，在更具体的方式中，这些细胞在细胞膜
上表达本发明的抗原受体，优选为本发明的抗原受体以抗原结合性结构域露出到细胞膜外的状态表达。
117.表达嵌合抗原受体的t细胞等在抗原结合性区域识别抗原后，将其识别信号传递到t细胞等的内部，使触发细胞伤害活性的信号发挥作用，与此联动，该细胞能够对表达抗原的其它细胞或组织进行攻击或发挥细胞伤害活性。
118.在发挥这样的功能的细胞为ctl的情况下，被称为嵌合抗原受体t细胞(car－t细胞)。nk细胞等具有发挥细胞伤害活性的可能性的细胞也与嵌合抗原受体t细胞同样，通过抗原结合性区域与抗原结合，而能够发挥细胞伤害活性。因此，包含编码本发明的嵌合抗原受体的多核苷酸的宿主细胞(特别是具有细胞伤害活性的宿主细胞)作为医药组合物的有效成分有用。
119.5.医药组合物
120.本发明在其一个方式中涉及含有本发明的细胞的医药组合物(在本说明书中，有时也表示为“本发明的医药组合物”。)。以下，对其进行说明。
121.本发明的医药组合物作为细胞制剂，能够广泛用于表达抗原结合性结构域的靶标抗原的肿瘤/癌(靶标疾病)的治疗、预防或改善。靶标疾病包括实体瘤和血癌。作为靶标疾病，例如可以列举各种b细胞性恶性淋巴瘤(b细胞性急性淋巴性白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、malt淋巴瘤、血管内b细胞性淋巴瘤、cd20阳性霍奇金淋巴瘤等)、骨髓增生性疾病、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤(cmml,jmml,cml,mds/mpn-uc)、骨髓增生异常综合征、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、肺癌、大肠癌、卵巢癌、乳腺癌、脑瘤、胃癌、肝癌、舌癌、甲状腺癌、肾癌、前列腺癌、子宫癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤等。“治疗”包括缓和靶标疾病特征性的症状或伴随症状(轻症化)、阻止或延迟症状的恶化等。“预防”是指防止或延迟疾病(障碍)或其症状的发病/表现、或者降低发病/表现的危险性。另一方面，“改善”是指疾病(障碍)或其症状缓和(轻症化)、好转、缓解、或治愈(包括部分治愈)。
122.本发明的医药组合物含有治疗上有效量的本发明的细胞。例如作为1次给药用，可以含有1
×
10 4
个～1
×
10 10
个细胞。以细胞保护为目的，可以在细胞制剂中含有二甲亚砜(dmso)、血清白蛋白等，以阻止细菌的混入为目的可以在细胞制剂中含有抗生物质等，可以在细胞制剂中含有以细胞的活化、增殖或分化诱导等为目的的各种成分(维生素类、细胞因子、生长因子、类固醇等)等的成分。
123.本发明的car基因导入淋巴细胞或细胞制剂的给药途径没有特别限定。例如通过静脉内注射、动脉内注射、门静脉注射、皮内注射、皮下注射、肌肉注射或腹腔内注射来给药。不仅可以全身给药，也可以局部给药。作为局部给药，可以例示向目标组织、脏器、器官的直接注入。给药方案考虑对象(患者)的性别、年龄、体重、病情等制成即可。除了单次给药以外，也可以连续或定期多次给药。
124.实施例
125.以下，基于实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不受这些实施例限定。
126.试验例1.car构建体的制作
127.＜试验例1-1.cd19.cd79a.40z.sh构建体的制作＞
128.设计car构建体(图1，氨基酸序列：序列编号9，碱基序列：序列编号18)，其中，从n末端侧起依次配置有：
129.抗cd19 scfv结构域(氨基酸序列：序列编号1，碱基序列：序列编号10)、igg4铰链部(氨基酸序列：序列编号2，碱基序列：序列编号11)、cd28跨膜结构域(氨基酸序列：序列编号3，碱基序列：序列编号12)、cd79a细胞内结构域(氨基酸序列：序列编号4，碱基序列：序列编号13)、ggg接头(氨基酸序列：n末端－ggg，碱基序列：5
′
－ggcggaggg)、cd40细胞内结构域(氨基酸序列：序列编号5，碱基序列：序列编号14)、cd3ζ细胞内结构域(氨基酸序列：序列编号6，碱基序列：序列编号15)、t2a序列(氨基酸序列：序列编号7，碱基序列：序列编号16)、truncated egfr结构域(氨基酸序列：序列编号8，碱基序列：序列编号17)，
130.将该car的编码序列(碱基序列：序列编号18)利用添加在其两末端侧的限制酶识别序列(5
′
侧为hindiii、3
′
侧为noti)整合到lzrs-pbmn-z载体中。
131.＜试验例1-2.cd19.28z.sh构建体的制作＞
132.采用cd28的细胞内结构域(氨基酸序列：序列编号19，碱基序列：序列编号20)代替由cd79a细胞内结构域、ggg接头和cd40细胞内结构域构成的细胞内信号结构域，除此以外，与试验例1-1同样地制作与cd79a.40z.sh构建体相同的car构建体(图1)。
133.＜试验例1-3.cd19.bbz.sh构建体的制作＞
134.采用4-1bb的细胞内结构域(氨基酸序列：序列编号21，碱基序列：序列编号22)代替由cd79a细胞内结构域、ggg接头和cd40细胞内结构域构成的细胞内信号结构域，除此以外，与试验例1-1同样地制作与cd79a.40z.sh构建体相同的car构建体(图1)。
135.＜试验例1-4.cd19.cd79a.40z.lh构建体的制作＞
136.采用免疫球蛋白铰链+ch2-ch3部(氨基酸序列：序列编号23，碱基序列：序列编号24)代替igg4铰链部，除此以外，与试验例1-1同样地制作与cd19.cd79a.40z.sh构建体相同的car构建体。
137.＜试验例1-5.cd19.28z.lh构建体的制作＞
138.采用免疫球蛋白铰链+ch2-ch3部(氨基酸序列：序列编号23，碱基序列：序列编号24)代替igg4铰链部，除此以外，与试验例1-1同样地制作与cd19.28z.sh构建体相同的car构建体。
139.＜试验例1-6.cd37.cd79a.40z.sh构建体的制作＞
140.采用抗cd37 scfv结构域(氨基酸序列：序列编号25，碱基序列：序列编号26)代替抗cd19 scfv结构域，除此以外，与试验例1-1同样地制作与cd19.cd79a.40z.sh构建体相同的car构建体。
141.＜试验例1-7.cd37.28z.sh构建体的制作＞
142.采用抗cd37 scfv结构域(氨基酸序列：序列编号25，碱基序列：序列编号26)代替抗cd19 scfv结构域，除此以外，与试验例1-1同样地制作与cd19.28z.sh构建体相同的car构建体。
143.＜试验例1-8.cd37.bbz.sh构建体的制作＞
144.采用抗cd37 scfv结构域(氨基酸序列：序列编号25，碱基序列：序列编号26)代替抗cd19 scfv结构域，除此以外，与试验例1-1同样地制作与cd19.bbz.sh构建体相同的car构建体。
145.＜试验例1-9.cd20.cd79a.40z.sh构建体的制作＞
146.采用抗cd20 scfv结构域(氨基酸序列：序列编号27，碱基序列：序列编号28)代替
4或试验例1-5的构建体)的抗癌效果进行评价。具体而言，如下所述进行。
160.对6～8周龄的雄性nsg小鼠经由尾静脉进行静脉内接种5
×
105个萤火虫荧光素酶基因导入nalm6细胞。1周后，对小鼠经由尾静脉进行静脉内投予2
×
106个tegfr导入细胞或cd19car-t细胞(试验例2)，由此进行治疗。为了评价肿瘤的进展，使用ivis光谱系统实施生物发光成像(bli)。将bli的结果表示于图4和图5，将存活曲线表示于图6和图7。图4和图6是导入了短铰链的构建体(试验例1-1、试验例1-2、试验例1-3的构建体)的car-t细胞的结果，图5和图7是导入了长铰链的构建体(试验例1-4、试验例1-5的构建体)的car-t细胞的结果。
161.由图4～7可知，短铰链的情况下抗癌效果高。另外，其中，cd79a.40z.sh导入car-t细胞的抗癌效果也高。
162.试验例5.抗癌效果的评价3
163.对试验例2中制备的car-t细胞(导入试验例1-1、试验例1-2、或试验例1-3的构建体)的抗癌效果进行评价。具体而言，将car-t细胞和cd37基因导入k562(放射线照射后的抗原阳性细胞)以成为1∶1(car-t细胞；k562细胞)的比例混合，进行共培养。在第1、4、7、11天加入il-2 50u/ml或不添加进行培养，对活细胞数进行计数。将结果表示于图8。
164.由图8可知，在不添加il-2的情况和加入il-2的情况的任意一种情况下，cd19.cd79a.40z.sh导入car-t细胞的抗原刺激后的car-t细胞增殖都高于cd19.28z.sh导入car-t细胞和cd19.bbz.sh导入car-t细胞的抗原刺激后car-t细胞增殖。
165.试验例6.抗癌效果的评价4
166.对试验例2中制备的car-t细胞(导入试验例1-6、试验例1-7、或试验例1-8的构建体)的抗癌效果进行评价。具体而言，将car-t细胞和cd37基因导入k562(放射线照射后的抗原阳性细胞)以成为1∶1(car-t细胞；k562细胞)的比例混合，进行共培养。在第1、4、7、11天加入il-2 50u/ml进行培养，对活细胞数进行计数。将结果表示于图9。
167.由图9可知，cd37.cd79a.40z.sh导入car-t细胞的抗原刺激后的car-t细胞增殖高于cd37.28z.sh导入car-t细胞和cd37.bbz.sh导入car-t细胞的抗原刺激后car-t细胞增殖。
168.试验例7.抗癌效果的评价5
169.对试验例2中制备的car-t细胞(导入试验例1-9、试验例1-10、或试验例1-11的构建体)的抗癌效果进行评价。具体而言，将car-t细胞和cd20基因导入k562(放射线照射后的抗原阳性细胞)以成为1∶1(car-t细胞；k562细胞)的比例混合，不添加il-2，进行共培养，对活细胞数进行计数。将结果表示于图10。
170.由图10可知，cd20.cd79a.40z.sh导入car-t细胞的抗原刺激后的car-t细胞增殖高于cd20.28z.sh导入car-t细胞和cd20.bbz.sh导入car-t细胞的抗原刺激后car-t细胞增殖。

技术特征：
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于：包括：抗原结合性结构域、跨膜结构域、以及包含cd79a细胞内结构域和cd40细胞内结构域的细胞内信号结构域，并且(a)所述抗原结合性结构域与所述跨膜结构域之间的构成氨基酸残基数为100以下；和/或(b)所述抗原结合性结构域的靶标抗原为cd19以外的抗原。2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述细胞内信号结构域包含细胞内活化结构域。3.如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述细胞内活化结构域为选自cd3ζ细胞内结构域和fcεriγ细胞内结构域中的至少1种。4.如权利要求2或3所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述cd79a细胞内结构域、所述cd40细胞内结构域和所述细胞内活化结构域从跨膜结构域侧起以该顺序配置。5.如权利要求1～4中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于：在所述抗原结合性结构域与所述跨膜结构域之间包含igg的铰链部或其一部分。6.如权利要求1～5中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述构成氨基酸残基数为1～30。7.如权利要求1～6中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述抗原结合性结构域的结构为单链抗体结构。8.如权利要求1～7中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述抗原结合性结构域的靶标抗原为选自cd19、gd2、gd3、cd20、cd37、cea、her2、egfr、iii型突变egfr、cd38、bcma、muc-1、psma、wt1、肿瘤睾丸抗原、突变肽、htert、pram、tyrp1、间皮素、pmel和粘蛋白中的至少1种。9.编码权利要求1～8中任一项所述的抗原受体的多核苷酸。10.包含权利要求9所述的多核苷酸的细胞。11.如权利要求10所述的细胞，其特征在于：其为淋巴细胞。12.一种医药组合物，其特征在于：含有权利要求10或11所述的细胞。13.如权利要求12所述的医药组合物，其特征在于：用于治疗、预防或改善癌症。

技术总结
本发明的技术课题在于提供一种新型的嵌合抗原受体，该技术课题通过如下的嵌合抗原受体来解决，该嵌合抗原受体包括抗原结合性结构域、跨膜结构域、以及包含CD79A细胞内结构域和CD40细胞内结构域的细胞内信号结构域，并且，(A)上述抗原结合性结构域与上述跨膜结构域之间的构成氨基酸残基数为100以下；和/或(B)上述抗原结合性结构域的靶标抗原为CD19以外的抗原。抗原。


技术研发人员：寺仓精太郎 J
受保护的技术使用者：国立大学法人东海国立大学机构
技术研发日：2021.11.09
技术公布日：2023/8/24