包括GIP衍生物或其长效缀合物的用于预防或治疗狼疮相关疾病的药物组合物的制作方法

包括gip衍生物或其长效缀合物的用于预防或治疗狼疮相关疾病的药物组合物
技术领域
1.涉及一种包括gip衍生物或其长效缀合物的用于预防或治疗狼疮相关疾病的药物组合物。


背景技术：

2.系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)也称为全身性红斑狼疮、狼疮、或s.l.e，是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，其中在细胞核中产生针对特定蛋白质的自身抗体，并且自身的细胞或组织因免疫系统异常而被破坏。在大多数情况下，狼疮只有皮疹等轻微症状，但在某些患者中，其会导致身体主要器官即大脑、肺和肾脏等出现严重的免疫异常症状。
3.发生狼疮的确切原因尚不清楚。仅假设其是由遗传因素、荷尔蒙、和环境因素共同作用而引起。此外，据报道，暴露于紫外线、二氧化硅粉尘、吸烟和药物等会增加狼疮的发生。
4.狼疮患者每年都在增加。根据健康保险审查评价院(health insurance review&assessment service，hira)的统计资料，2017年有25757人因狼疮接受治疗，由2015年至2017年的三年间治疗人数增加了约3000人(13.5％)。当按年龄看接受治疗的人数时，40多岁(26.6％)最常见，其次是30多岁(22.2％)和50多岁(21.9％)。按照性别，示出女性(86.3％)比男性(13.7％)高6.3倍的比率。由此可见，30至50多0岁的女性需要特别注意。
5.狼疮也被归类为小血管血管炎(small vessel vasculitis)，其与其他血管炎不同的点是，其不仅影响血管的特定部位，关节和肌肉并且皮肤、神经组织、肺、肾、心脏和造血器官等全身所有组织也会成为受攻击的对象。同理，以狼疮为例，其疾病进展难以预测，并出现各种症状，因此临床诊断和治疗困难。
6.葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide：gip)是胃肠道分泌的代表性激素(肠促胰岛素激素)，也是一种神经激素，其受食物摄入刺激而分泌。gip是一种由小肠的k细胞分泌的42个氨基酸组成的激素，已知其可以通过以血糖浓度依赖性方式促进胰腺中胰岛素或胰高血糖素的分泌来帮助维持血糖稳态，并且在最近研究中已经报道了饮食抑制和抗炎症效果。
7.在天然型gip的情况下，当其n-末端被二肽基肽酶-4dipeptidyl peptidase-4：dpp-4)酶切割时，其活性丧失，该反应在体内以非常快的速度发生。因此，已知gip在人体内的半衰期很短，大约为7分钟(j clin endocrinol metab.2000oct；85(10)；3575-81)。因此，在利用gip的效能开发治疗剂的情况下，需要开发在体内具有增加的持续性的衍生物。
8.因此，本发明人开发了一种长效gip衍生物缀合物，其在人gip受体中显示出高活性并且在体内具有改善的持续性，并通过确认其作为狼疮相关疾病治疗剂的可能性而完成了本发明。


技术实现要素：

9.技术问题
10.提供一种用于预防或治疗狼疮相关疾病的药物组合物，其包括gip衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂化物、或其缀合物。
11.提供一种预防或治疗狼疮相关疾病的方法，其包括将有效量的所述gip衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂化物、其缀合物、或所述药物组合物施用于有需要的个体中。
12.提供一种所述gip衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂化物、或其缀合物在制造用于预防或治疗狼疮相关疾病的药物中的用途。
13.技术方案
14.在整个说明书中，不仅使用了对天然存在的氨基酸的通用1文字和3文字代码，还使用对诸如aib(α-氨基异丁酸)等的其他氨基酸的一般接受的3文字代码。另外，在本说明书中，通过缩写提及的氨基酸是根据iupac-iub命名而记载的。
[0015][0016]
一方面提供一种用于预防或治疗狼疮相关疾病的药物组合物，其包括gip衍生物、其药学上可接受的盐、或其溶剂化物。
[0017]“葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide或gastric inhibitory polypeptide：gip)”是一种受食物摄入刺激而从小肠中的的k细胞分泌的激素，其最早被报道为参与调节血糖浓度的物质。
[0018]
所述“gip衍生物”可以是天然型gip的衍生物，其中天然型gip序列中的一个或多个氨基酸被修饰。所述修饰可以选自由取代(substitution)、添加(addition)、删除(deletion)、修饰(modification)及其两种或更多种的组合组成的组。所添加的氨基酸序列可源自天然gip氨基酸序列，但不限于此。
[0019]
所述gip衍生物可以是对gip受体具有活性的肽。所述“对gip受体具有活性的肽”对所述gip受体具有显着水平的活性，具体地，这可能意味着与天然配体(天然型gip)相比，其显示出约0.1％或更多、1％或更多、2％或更多、3％或更多、4％或更多、5％或更多、6％或更多、7％或更多、8％或更多、9％或更多、10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、100％或更多、100％至500％、或100％至200％的对gip受体的体外(in vitro)活性。这种对gip受体具有活性的肽的体外活性的测量方法可参照本技术说明书的实施例2，但不特别限定于此，只要适当使用本领域公知的方法就可测量体外活性。
[0020]“约”是包括
±
0.5、
±
0.4、
±
0.3、
±
0.2、
±
0.1等全部的范围，包括与“约”后面的数值相等或相近的所有范围，但不限于至此。
[0021]
在一具体实施例中，所述gip衍生物可以是在天然型或未突变的gip蛋白质的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸中发生保守取代的衍生物，但不限于此。
[0022]“保守取代(conservative substitution)”是指一氨基酸由具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸取代。所述gip衍生物可在仍然保留天然型或未突变的gip蛋白质的生物活性的同时，具有例如一个或多个的保守取代。这种氨基酸取代通常可基于残基在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或双亲性(amphipathic nature)方面的相似性而发生。例如，带正电荷的(碱基性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；且疏水性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。此外，氨基酸可分为具有带电荷(electrically charged)的侧链的氨基酸和具有不带电荷(uncharged)的侧链的氨基酸。具有带电荷的侧链的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，且具有不带电荷的侧链的氨基酸可进一步分类为非极性(nonpolar)氨基酸或极性(polar)氨基酸。非极性氨基酸可包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和脯氨酸，且极性氨基酸可包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺。可以预期用具有与上述相似性质的氨基酸进行的保守取代会表现出相同或相似的活性。
[0023]
所述gip衍生物可能是非天然发生(non-naturally occurring)的。
[0024]
所述gip衍生物可以是分离的肽。
[0025]
在一具体实施例中，所述gip衍生物为包括由下一般式1表示的氨基酸序列的肽：
[0026]
tyr-aib(aminoisobutyric acid)-glu-gly-thr-phe-ile-ser-asp-tyr-ser-ile-xaa13-xaa14-xaa15-xaa16-xaa17-ala-xaa19-xaa20-xaa21-phe-xaa23-xaa24-trp-leu-xaa27-xaa28-xaa29-xaa30-xaa31-xaa32-xaa33-xaa34-xaa35-xaa36-xaa37-xaa38-xaa39-xaa40-xaa41-xaa42-xaa43(一般式1)
[0027]
在所述一般式1中，
[0028]
xaa13为丙氨酸(ala，a)、aib、酪氨酸(tyr，y)、或谷氨酰胺(gln，q)，
[0029]
xaa14为蛋氨酸(met，m)或亮氨酸(leu，l)，
[0030]
xaa15为天冬氨酸(asp，d)或谷氨酸(glu，e)，
[0031]
xaa16为丙氨酸(ala，a)、赖氨酸(lys，k)或甘氨酸(gly，g)，
[0032]
xaa17为异亮氨酸(ile，i)或谷氨酰胺(gln，q)，
[0033]
xaa19为谷氨酰胺(gln，q)或丙氨酸(ala，a)，
[0034]
xaa20为谷氨酰胺(gln，q)、aib、或赖氨酸(lys，k)，
[0035]
xaa21为天冬氨酸(asp，d)或谷氨酸(glu，e)，
[0036]
xaa23为缬氨酸(val，v)或异亮氨酸(ile，i)，
[0037]
xaa24为天冬酰胺(asn，n)、丙氨酸(ala，a)、或谷氨酰胺(gln，q)，
[0038]
xaa27为亮氨酸(leu，l)或异亮氨酸(ile，i)，
[0039]
xaa28为丙氨酸(ala，a)或aib，
[0040]
xaa29为谷氨酰胺(gln，q)或甘氨酸(gly，g)，
[0041]
xaa30为赖氨酸(lys，k)、甘氨酸(gly，g)、或组氨酸(his，h)，
[0042]
xaa31为脯氨酸(pro，p)、甘氨酸(gly，g)、或半胱氨酸(cys，c)，
[0043]
xaa32为丝氨酸(ser，s)或赖氨酸(lys，k)、或不存在，
[0044]
xaa33为丝氨酸(ser，s)或赖氨酸(lys，k)、或不存在，
[0045]
xaa34为甘氨酸(gly，g)或天冬酰胺(asn，n)、或不存在，
[0046]
xaa35为丙氨酸(ala，a)或天冬氨酸(asp，d)、或不存在，
[0047]
xaa36为脯氨酸(pro，p)或色氨酸(trp，w)、或不存在，
[0048]
xaa37为脯氨酸(pro，p)或赖氨酸(lys，k)、或不存在，
[0049]
xaa38为脯氨酸(pro，p)或组氨酸(his，h)、或不存在，
[0050]
xaa39为丝氨酸(ser，s)、天冬酰胺(asn，n)、或半胱氨酸(cys，c)、或不存在，
[0051]
xaa40为半胱氨酸(cys，c)或异亮氨酸(ile，i)、或不存在，
[0052]
xaa41为苏氨酸(thr，t)或不存在，
[0053]
xaa42为谷氨酰胺(gln，q)或不存在，
[0054]
xaa43为半胱氨酸(cys，c)或不存在。
[0055]
该肽的示例性类型可以是包括选自由seq id no：1至26组成的组中的任一个的氨基酸序列的肽。
[0056]
在另一实施例中，所述肽可以包括由下一般式2表示的氨基酸序列：
[0057]
tyr-aib(aminoisobutyric acid)-glu-gly-thr-phe-ile-ser-asp-tyr-ser-ile-xaa13-xaa14-xaa15-xaa16-xaa17-ala-xaa19-xaa20-xaa21-phe-val-xaa24-trp-leu-xaa27-xaa28-xaa29-xaa30-xaa31-xaa32-xaa33-xaa34-xaa35-xaa36-xaa37-xaa38-xaa39-xaa40-xaa41-xaa42-xaa43(一般式2)
[0058]
在所述一般式2中，
[0059]
xaa13为丙氨酸(ala，a)、aib、或酪氨酸(tyr，y)，
[0060]
xaa14为蛋氨酸(met，m)或亮氨酸(leu，l)，
[0061]
xaa15为天冬氨酸(asp，d)或谷氨酸(glu，e)，
[0062]
xaa16为丙氨酸(ala，a)或赖氨酸(lys，k)，
[0063]
xaa17为异亮氨酸(ile，i)或谷氨酰胺(gln，q)，
[0064]
xaa19为谷氨酰胺(gln，q)或丙氨酸(ala，a)，
[0065]
xaa20为谷氨酰胺(gln，q)、aib、或赖氨酸(lys，k)，
[0066]
xaa21为天冬氨酸(asp，d)或谷氨酸(glu，e)，
[0067]
xaa24为天冬酰胺(asn，n)或谷氨酰胺(gln，q)，
[0068]
xaa27为亮氨酸(leu，l)或异亮氨酸(ile，i)，
[0069]
xaa28为丙氨酸(ala，a)或aib，
[0070]
xaa29为谷氨酰胺(gln，q)或甘氨酸(gly，g)，
[0071]
xaa30为赖氨酸(lys，k)、甘氨酸(gly，g)、或组氨酸(his，h)，
[0072]
xaa31为脯氨酸(pro，p)或甘氨酸(gly，g)，
[0073]
xaa32为丝氨酸(ser，s)或赖氨酸(lys，k)，
[0074]
xaa33为氨酸(ser，s)或赖氨酸(lys，k)，
[0075]
xaa34为甘氨酸(gly，g)或天冬酰胺(asn，n)，
[0076]
xaa35为丙氨酸(ala，a)或天冬氨酸(asp，d)，
[0077]
xaa36为脯氨酸(pro，p)或色氨酸(trp，w)，
[0078]
xaa37为脯氨酸(pro，p)或赖氨酸(lys，k)，
[0079]
xaa38为脯氨酸(pro，p)或组氨酸(his，h)，
[0080]
xaa39为丝氨酸(ser，s)、天冬酰胺(asn，n)、或半胱氨酸(cys，c)，
[0081]
xaa40为半胱氨酸(cys，c)或异亮氨酸(ile，i)、或不存在，
[0082]
xaa41为苏氨酸(thr，t)或不存在，
[0083]
xaa42为谷氨酰胺(gln，q)或不存在，
[0084]
xaa43为半胱氨酸(cys，c)或不存在。
[0085]
该肽的示例性类型可以是包括选自由seq id no：11、17、和19至26组成的组中的任一个的氨基酸序列的肽。
[0086]
在另一实施例中，所述肽可以包括由下一般式3表示的氨基酸序列：
[0087]
tyr-aib(aminoisobutyric acid)-glu-gly-thr-phe-ile-ser-asp-tyr-ser-ile-xaa13-xaa14-xaa15-xaa16-xaa17-ala-xaa19-xaa20-xaa21-phe-val-asn-trp-leu-leu-xaa28-xaa29-xaa30-xaa31-xaa32-xaa33-xaa34-xaa35-xaa36-xaa37-xaa38-xaa39-xaa40-xaa41-xaa42-xaa43(一般式3)
[0088]
在所述一般式3中，
[0089]
xaa13为丙氨酸(ala，a)或aib，
[0090]
xaa14为蛋氨酸(met，m)或亮氨酸(leu，l)，
[0091]
xaa15为天冬氨酸(asp，d)或谷氨酸(glu，e)，
[0092]
xaa16为丙氨酸(ala，a)或赖氨酸(lys，k)，
[0093]
xaa17为异亮氨酸(ile，i)或谷氨酰胺(gln，q)，
[0094]
xaa19为谷氨酰胺(gln，q)或丙氨酸(ala，a)，
[0095]
xaa20为谷氨酰胺(gln，q)或aib，
[0096]
xaa21为天冬氨酸(asp，d)或谷氨酸(glu，e)，
[0097]
xaa28为丙氨酸(ala，a)或aib，
[0098]
xaa29为谷氨酰胺(gln，q)或甘氨酸(gly，g)，
[0099]
xaa30为赖氨酸(lys，k)、甘氨酸(gly，g)、或组氨酸(his，h)，
[0100]
xaa31为脯氨酸(pro，p)或甘氨酸(gly，g)，
[0101]
xaa32为丝氨酸(ser，s)或赖氨酸(lys，k)，
[0102]
xaa33为氨酸(ser，s)或赖氨酸(lys，k)，
[0103]
xaa34为甘氨酸(gly，g)或天冬酰胺(asn，n)，
[0104]
xaa35为丙氨酸(ala，a)或天冬氨酸(asp，d)，
[0105]
xaa36为脯氨酸(pro，p)或色氨酸(trp，w)，
[0106]
xaa37为脯氨酸(pro，p)或赖氨酸(lys，k)，
[0107]
xaa38为脯氨酸(pro，p)或组氨酸(his，h)，
[0108]
xaa39为丝氨酸(ser，s)或天冬酰胺(asn，n)，
[0109]
xaa40为半胱氨酸(cys，c)或异亮氨酸(ile，i)，
[0110]
xaa41为苏氨酸(thr，t)或不存在，
[0111]
xaa42为谷氨酰胺(gln，q)或不存在，
[0112]
xaa43为半胱氨酸(cys，c)或不存在。
[0113]
该肽的示例性类型可以是包括选自由seq id no：11、17、21、和24组成的组中的任一个的氨基酸序列的肽。
[0114]
在另一实施例中，在所述一般式3中，
[0115]
xaa13为丙氨酸(ala，a)或aib，
[0116]
xaa14为亮氨酸(leu，l)，
[0117]
xaa15为天冬氨酸(asp，d)或谷氨酸(glu，e)，
[0118]
xaa16为赖氨酸(lys，k)，
[0119]
xaa17为谷氨酰胺(gln，q)，
[0120]
xaa19为谷氨酰胺(gln，q)或丙氨酸(ala，a)，
[0121]
xaa20为谷氨酰胺(gln，q)或aib，
[0122]
xaa21为天冬氨酸(asp，d)或谷氨酸(glu，e)，
[0123]
xaa28为丙氨酸(ala，a)或aib，
[0124]
xaa29为谷氨酰胺(gln，q)，
[0125]
xaa30为甘氨酸(gly，g)或组氨酸(his，h)，
[0126]
xaa31为脯氨酸(pro，p)，
[0127]
xaa32为丝氨酸(ser，s)，
[0128]
xaa33为丝氨酸(ser，s)，
[0129]
xaa34为甘氨酸(gly，g)，
[0130]
xaa35为丙氨酸(ala，a)，
[0131]
xaa36为脯氨酸(pro，p)，
[0132]
xaa37为脯氨酸(pro，p)，
[0133]
xaa38为脯氨酸(pro，p)，
[0134]
xaa39为丝氨酸(ser，s)，
[0135]
xaa40为半胱氨酸(cys，c)，
[0136]
xaa41至xaa43可以不存在。
[0137]
该肽的示例性类型可以是包括选自由seq id no：17、21、和24组成的组中的任一个的氨基酸序列的肽。
[0138]
在另一实施例中，在所述一般式1中，
[0139]
xaa13为丙氨酸(ala，a)，
[0140]
xaa14为蛋氨酸(met，m)，
[0141]
xaa15为天冬氨酸(asp，d)，
[0142]
xaa16为丙氨酸(ala，a)，
[0143]
xaa17为异亮氨酸(ile，i)，
[0144]
xaa19为谷氨酰胺(gln，q)，
[0145]
xaa20为谷氨酰胺(gln，q)，
[0146]
xaa21为天冬氨酸(asp，d)，
[0147]
xaa23为缬氨酸(val，v)，
[0148]
xaa24为天冬酰胺(asn，n)，
[0149]
xaa27为亮氨酸(leu，l)，
[0150]
xaa28为丙氨酸(ala，a)，
[0151]
xaa29为谷氨酰胺(gln，q)，
[0152]
xaa30为赖氨酸(lys，k)，
[0153]
xaa31为甘氨酸(gly，g)，
[0154]
xaa32为赖氨酸(lys，k)，
[0155]
xaa33为赖氨酸(lys，k)，
[0156]
xaa34为天冬酰胺(asn，n)，
[0157]
xaa35为天冬氨酸(asp，d)，
[0158]
xaa36为色氨酸(trp，w)，
[0159]
xaa37为赖氨酸(lys，k)，
[0160]
xaa38为组氨酸(his，h)，
[0161]
xaa39为天冬酰胺(asn，n)，
[0162]
xaa40为异亮氨酸(ile，i)，
[0163]
xaa41为苏氨酸(thr，t)，
[0164]
xaa42为谷氨酰胺(gln，q)，
[0165]
xaa43可以为半胱氨酸(cys，c)。
[0166]
然而，当所述一般式1至3中的xaa32至xaa43氨基酸中的任一个不存在时，其后续氨基酸序列可能不存在。例如，当xaa32不存在时，xaa33至xaa43可能不存在。作为另一例子，当xaa41不存在时，xaa42至xaa43可能不存在。
[0167]
在另一实施例中，所述肽可以包括选自由seq id no：1至26组成的组中的任一个氨基酸序列。另外，所述肽基本上由选自由seq id no：1至26组成的组中的任一个氨基酸序列组成，或者所述肽可以由选自由seq id no：1至26组成的组中的任一个氨基酸序列组成。
[0168]
在另一实施例中，所述肽可以包括选自由seq id no：11、17、以及19至26组成的组中的任一个氨基酸序列。另外，所述肽基本上由选自由seq id no：11、17、以及19至26组成的组中的任一个氨基酸序列组成，或者所述肽可以由选自由seq id no：11、17、以及19至26组成的组中的任一个氨基酸序列组成。
[0169]
在另一实施例中，所述肽可以包括选自由seq id no：11、17、21、和24组成的组中的任一个氨基酸序列。另外，所述肽基本上由选自由seq id no：11、17、21、和24组成的组中的任一个氨基酸序列组成，或者所述肽可以由选自由seq id no：11、17、21、和24组成的组中的任一个氨基酸序列组成。
[0170]
在另一实施例中，所述肽可以包括选自由seq id no：17、21、和24组成的组中的任一个氨基酸序列。另外，所述肽基本上由选自由seq id no：17、21、和24组成的组中的任一个氨基酸序列组成，或者所述肽可以由选自由seq id no：17、21、和24组成的组中的任一个氨基酸序列组成。
[0171]
在本技术中，即使描述为“由特定序列号组成的肽”，如果与由该序列号的氨基酸序列组成的肽具有相同或相应的活性，该序列号的氨基酸序列前后的无意义序列添加或自然发生的突变或其沉默突变(silent mutation)不被排除，并且即使有这样的序列添加或突变，其很明显地也属于本发明的范围内。换言之，即使一些序列存在差异，只要表现出一
定水平或更高水平的序列同一性并且表现出对gip受体的活性，则可以属于本发明的范围内。具体地，所述肽可以包括与seq id no：1至26的氨基酸序列具有40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％或更高的同一性的氨基酸序列，但不限于此。
[0172]“同源性(homology)”或“同一性(identity)”是指两个给定的氨基酸序列或碱基序列彼此相关的程度，并可以用百分比表示。任意两个肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以通过使用例如与pearson等人(1988)[proc.natl.acad.sci.usa 85]:2444中相同的默认参数且使用诸如“fasta”程序的已知的计算机算法来确定。或者，如在emboss包的needleman程序(emboss:the european molecular biology open software suite，rice等人，2000，trends genet.16:276-277)(版本5.0.0或其后版本)中执行的那样，通过使用needleman-wunsch算法(needleman和wunsch，1970，j.mol.biol.48:443-453)来确定(包括gcg程序包(devereux，j.等人，nucleic acids research 12:387(1984))、blastp，blastn，fasta(atschul，[s.][f.,][et al，j molec biol 215]:403(1990)；guide to huge computers，martin j.bishop，[ed.,]academic press，san diego,1994、以及[carillo eta/.](1988)siam j applied math 48:1073)。例如，可以通过使用国家生物工学信息数据库中心的blast或clustal来确定同源性、相似性或同一性。
[0173]
例如，如在smith和waterman，adv.appl.math(1981)2:482中所述，可以通过使用例如与needleman等人.(1970)，j mol biol.48:443相同的gap计算机程序比较序列信息来确定肽的同源性、相似性或同一性。总之，gap程序定义了两个序列中较短序列中的符号总数除以类似排列的符号(即氨基酸)的数量。用于gap程序的默认参数可以包括(1)一元比较矩阵(含有为了同一性的1以及为了非同一性的0的值)以及如由schwartz and dayhoff，eds.，蛋白质序列和结构地图集，美国国家生物医学研究基金会，pp.353-358(1979)所公开的gribskov等人(1986)nucl.acids res.14：6745的加权比较矩阵(或ednafull(ncbi nuc4.4的emboss版本)取代矩阵)；(2)用于各空位的3.0罚分以及用于各空位中的每个符号的额外0.10罚分(或者空位开罚分10，空位延伸罚分0.5)；以及(3)用于对末端空位的无罚分。因此，如在本发明中所用，术语“同源性”或“同一性”表示序列之间的相关性(relevance)。
[0174]
在一具体实施例中，可以以用于制造各种肽的几种方法来制造包括根据一方面的一般式1的氨基酸序列的肽。
[0175]
根据一方面的肽根据其长度可以通过本领域已知的方法例如通过自动肽合成仪合成，或者可以通过基因操作技术生产。具体地，可以通过标准合成方法、重组表达系统或本领域的任何其他方法来制造所述肽。因此，根据一方面的肽可以例如以多种方法合成，所述方法包括下项，但不限于此：
[0176]
(a)通过固体相或液体相方法分步或片段组装来合成肽，并分离和纯化最终的肽产物的方法；或
[0177]
(b)在宿主细胞中表达编码肽的核酸构建体并从宿主细胞培养物中回收表达产物的方法；或
[0178]
(c)进行编码肽的核酸构建体的无细胞体外表达和回收表达产物的方法；或
[0179]
以(a)、(b)、和(c)的任意组合获得肽片段，然后将片段连接以获得肽，并回收肽的方法。
[0180]
此外，在所述肽的制造中，通过使用l型或d型氨基酸和/或非天然型氨基酸进行修饰；和/或天然型序列的修饰，侧链官能团的修饰、诸如对分子内共价键，如侧链间成环、甲基化、酰化、泛素化、磷酸化、氨基己烷化、生物素化等的修饰都包括在内。另外，所述修饰包括所有用非天然型化合物的取代。
[0181]
所述修饰中使用的取代或添加的氨基酸可以使用20个在人类蛋白质中常见的氨基酸以及非典型或非天然发生的氨基酸。非典型氨基酸的商业来源可能包括但不限于sigma-aldrich、chempep、和genzyme pharmaceuticals。例如，氨基异丁酸(aminoisobutyric acid：aib)可以在丙酮中通过斯特雷克氨基酸合成来制造，但不限于此。包括这种非典型或非天然发生的氨基酸的肽和和典型肽序列可以通过商业肽合成公司，例如美国的美国肽公司(american peptide company)或bachem、或韩国的anygen来合成和购买，但不限于此。
[0182]
另外，所述肽的n-末端和/或c-末端未被修饰，但为保护其在体内免受蛋白裂解酶的侵害且增加稳定性而对其n-末端和/或c-末端进行化学修饰或有机基团保护，或在肽末端等添加氨基酸而修饰的形式也当然包括在根据所述方面的肽的范围内。当c-末端未被修饰时，肽的末端具有游离羧基，但不特别限于此。
[0183]
特别是，在化学合成的肽的情况下，由于n-和c-末端带电荷，n-末端和/或c-末端可被修饰以去除这些电荷。例如，n-末端可以被乙酰化(acetylation)和/或c-末端可以被酰胺化(amidation)，但不特别限于此。
[0184]
在一具体实施例中，所述肽的c-末端可以未经修饰或酰胺化，但不限于此。
[0185]
在一具体实施例中，所述肽的c-末端被酰胺化。
[0186]
所述肽包括所有肽本身、其盐(例如，所述肽的药学上可接受的盐)、或其溶剂化物的形式。
[0187]
所述盐的种类没有特别限制。然而，其优选为对个体如哺乳类安全有效的形式，但不特别限于此。
[0188]
此外，所述肽可以是药学上可接受的任何形式。
[0189]
术语“药学上可接受的”是指其在足以表现出治疗效果的量而不会引起副作用，并可以由本领域技术人员根据诸如疾病的类型、患者的年龄、体重、健康状况、性别、患者对药物的敏感度、施用途径、施用方法、施用次数、治疗期间、配合或同时施用的药物等医学领域上众所周知的因素来容易地确定。
[0190]
在一具体实施例中，所述肽可以为其药学上可接受的盐的形式。所述盐包括用于药学领域如狼疮治疗剂领域中的常规酸加成盐，例如，诸如衍生自盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸或硝酸的无机酸的盐；以及衍生自诸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、柠檬酸、马来酸、丙二酸、甲磺酸、酒石酸、苹果酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、草酸三氟乙酸的有机酸的盐。此外，所述盐可以是诸如铵盐、二甲胺、一甲胺、一乙胺、二乙胺等碱加成盐。另外，所述盐包括常规的金属盐形式，例如衍生自金属如锂、钠、钾、镁或钙的盐。所述酸加成盐、碱加成盐或金属盐可按照常规方法制造。药学上可接受的盐和其一般制造方法论是本领域公知的。例如，可以参照文献[p.stahl等
人，handbook of pharmaceutical salts:properties，selection and use，第二修订版(wiley-vch，2011)]；[s.m.berge，等人，"pharmaceutical salts,"journal of pharmaceutical sciences，vol.66，no.1，1977年1月]。
[0191]
为受保护的氨基酸或肽的缩合，可以使用在肽合成中有用的各种活性化试剂，特别优选三膦盐、四甲基脲盐、和碳二亚胺等。三膦盐的示例包括六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(pybop)、三吡咯烷基溴化六氟磷酸盐(pybrop)、六氟磷酸(7-氮杂苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷磷(pyaop)，四甲基脲盐的示例包括2-(1h-苯并三唑-1-氧基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟硼酸酯(hbtu)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)、2-(1h-苯并三偶氮l-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tbtu)、2-(内-5-降冰片烯-2,3-二羧酰亚胺)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(tntu)、o-(n-琥珀酰亚胺)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tstu)，碳二亚胺的示例包括n,n
’‑
二环己基碳二亚胺(dcc)、n,n
’‑
二异丙基碳二亚胺(dipcdi)、n-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edci
·
hcl)。为了使用其的缩合，优选添加外消旋抑制剂[例如，n-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(honb)、1-羟基苯并三唑(hobt)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(hoat)、3,4-二氢-3-羟基-4-oxo-1,2,3-苯并三嗪(hoobt)、2-肟氰乙酸乙酯(oxyma)等]。用于缩合的溶剂可适当地选自已知可用于肽缩合反应的溶剂。例如，可以使用诸如无水或含水的n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、和n-甲基吡咯烷酮等的酸酰胺、诸如二氯甲烷和氯仿等的卤代烃、诸如三氟乙醇和苯酚等的醇、诸如二甲基亚砜等的亚砜、诸如吡啶的等的三级胺、诸如二恶烷和四氢呋喃等的醚、诸如乙腈和丙腈等的腈、诸如乙酸甲酯和乙酸乙酯等的酯、以及其合适的混合物等。反应温度在已知可用于肽结合反应的范围内适当选择，通常在-20℃至90℃的范围内选择。激活的氨基酸衍生物通常以超过1.5至6倍的量使用。在固相合成中，当使用茚三酮反应的试验表现缩合不充分时，可以通过重复缩合反应而不去除保护基来进行充分的缩合。当重复反应后缩合仍不充分时，未反应的氨基酸可用酸酐、乙酰咪唑等来被乙酰化，以免影响后续反应。
[0192]
起始氨基酸的氨基保护基团的实例包括苄氧羰基(z)、叔丁氧羰基(boc)、叔戊氧羰基、异冰片氧羰基、4-甲氧基苄氧羰基、2-氯苄氧羰基(cl-z)、2-溴苄氧羰基(br-z)、金刚烷氧羰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰、甲酰基、2-硝基苯亚磺酰基、二苯基膦硫基、9-芴甲氧羰基(fmoc)、三苯甲基等。
[0193]
起始氨基酸的的羧基保护基团的示例除了上述c
1-6
烷基、c
3-10
环烷基、c
7-14
芳烷基之外，包括芳基、2-金刚烷基、4-硝基苄基、4-甲氧基苄基、4-氯苄基、苯甲酰甲基和苄氧基羰基酰肼、叔丁氧羰基肼、三苯代甲基酰肼等。
[0194]
丝氨酸或苏氨酸的羟基可以例如通过酯化或醚化来受保护。适于酯化的基团的实例包括诸如乙酰基的低级(c
2-4
)烷酰基、苯甲酰基等芳酰基、以及衍生自有机酸等的基团。另外，适合醚化的基团的实例包苄基、四氢吡喃基、叔丁基(but)、三苯甲基(trt)等。
[0195]
酪氨酸的苯酚性羟基的保护基团的实例包括bzl、2,6-二氯苄基、2-硝基苄基、br-z、叔丁基等。
[0196]
组氨酸的咪唑的保护基团的实例包括对甲苯磺酰基(tos)、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基(mtr)、二硝基苯(dnp)、苄氧甲基(bom)、叔丁氧基甲基(bum)、boc、trt、和fmoc等。
[0197]
精氨酸的胍基的保护基团的实例包括tos、z、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基(mtr)、对甲氧基苯磺酰基(mbs)、2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(pmc)、均三甲苯基-2-砜基(mts)、2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(pbf)、boc、z、和no2等。
[0198]
赖氨酸的侧链氨基的保护基团的实例包括z、cl-z、三氟乙酰基、boc、fmoc、trt、mtr、4,4-二甲基-2,6-二氧亚环己基(dde)等。
[0199]
色氨酸的吲哚基的保护基团的实例包括for、z、boc、mts、mtr等。
[0200]
天冬酰胺和谷氨酰胺的保护基团的实例包括trt、呫吨基(xan)、4,4'-二甲氧基二苯甲基(mbh)、2,4,6-三甲氧基苯基(tmob)等。
[0201]
起始物质中的激活的羧基的实例包括相应的酸酐、叠氮化物、活性酯[与醇的酯(例如，五氯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4-二硝基酚、氰甲基醇、对硝基苯酚、honb、n-羟基丁二酰亚胺、1-羟基苯并三唑(hobt)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(hoat))]等。起始材料中激活的氨基的实例包括相应的磷酰胺。
[0202]
去除保护基团的方法的实例包括在钯黑(pd-black)或钯碳(pd-carbon)等催化剂存在下在氢气流中进行催化还原；使用无水氟化氢、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸(tfa)、三甲基溴甲硅烷(tmsbr)、三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯、四氟硼酸、三(三酸)氟硼酸、三溴化硼、或其混合物进行酸处理；使用二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪等碱处理；在液体氨中用钠还原等。通过上述酸处理的去除反应一般在-20℃至40℃的温度下进行；酸处理可以通过添加苯甲醚、苯酚、硫代苯甲醚、间甲酚和对甲酚；二甲硫醚、1,4-丁二硫醇、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷等阳离子清除剂(cation scavenger)来有效地进行。例外，用作组氨酸的咪唑的保护基团的2,4-二硝基苯基经苯硫酚处理去除，且用作色氨酸的吲哚的保护基团的甲酰基除了在1,2-乙二硫醇、1,4-丁二硫醇等存在下进行酸处理来去除，还可以通过稀氢氧化钠、稀氨水等碱处理进行脱保护来被去除。
[0203]
不应参与反应的官能团的保护、保护基团的去除、参与反应的官能团的激活可以从已知的保护基团和已知手段中适当地选择。
[0204]
对于在本说明书中提及的肽，根据常规肽标记，左侧端位点n末端(氨基末端)，且右侧端部为c末端(羧基末端)。肽的c末端可以为酰胺(-conh2)、羧基(-cooh)、羧酸盐(-coo-)、烷基酰胺(-conhr'，在此，r'为烷基)、以及酯(-coor'，在此，r'为烷基或芳基)中的任一个。
[0205]
在制造肽的酰胺的方法中，其通过使用树脂的固相合成以合成酰胺、或羧基末端氨基酸的α-羧基被酰胺化、肽链向氨基延伸至所需的链长、然后制造仅肽链的n-末端α-氨基保护基团已被去除的肽以及仅从肽链中去除了c-末端羧基的保护基团的肽，这两种肽在上述混合溶剂中缩合。缩合反应的详细内容应用如上所述。将由缩合得到的保护肽纯化后，可以通过上述方法去除所有保护基，从而得到所需的肽。可以通过使用主要分馏纯化和冻结干燥的各种公知的手段制造肽的所需酰胺。
[0206]
在一具体实施例中，所述肽可以是其溶剂化物的形式。“溶剂化物”是指所述肽或其盐与溶剂分子形成复合体。
[0207]
在一具体实施例中，所述肽可以为长效缀合物的形式。所述缀合物在显示出与天然型gip同等或更高的对gip受体的活性，同时与不结合有载体(或生物相容性物质)的天然型gip或gip衍生物相比，可以表现增加的效力的持续性。因此，所述缀合物可以为长效缀合
物。术语“长效缀合物”是指与未结合生物相容性物质的天然型gip或gip衍生物相比具有增加的效力持续性的缀合物。因此，所述缀合物可称为“长效gip衍生物缀合物”或“长效gip衍生物”或“长效gip缀合物”。这样的缀合物不仅包括上述形式，还包括包封在生物分解性纳米颗粒中的形式等。
[0208]
所述缀合物可以为分离的缀合物。
[0209]
所述缀合物可以是是非天然发生的(non-naturally occurring)。
[0210]
在一具体实施例中，所述肽可以是缀合物的形式，其结合有增加活体内半衰期的生物相容性物质。因此，所述药物组合物可以包括缀合物，其中所述gip衍生物与增加活体内半衰期的生物相容性物质结合。所述生物相容性物质可以与载体(carrier)互相使用。
[0211]
所述生物相容性物质可以与所述gip衍生物通过共价化学键或非共价化学键结合，并可以以共价化学键、非共价化学键或其组合通过接头(linker，l)彼此结合。gip衍生物中的一个或多个氨基酸侧链可以与此类生物相容性物质接合以增加活体内可溶性和/或半衰期和/或增加生物利用率。这种修饰也可以减少治疗性蛋白质和肽的清除(clearance)。上述生物相容性物质可以是水溶性的(两亲性或亲水性的)和/或无毒性和/或药学上可接受的。
[0212]
所述生物相容性物质可以选自由高分子量聚合物、脂肪酸、胆固醇、白蛋白及其片段、白蛋白结合物质、特定氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、fcrn结合物质、活体内结合组织、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白(transferrin)、糖类(saccharide)、肝素、和弹性蛋白组成的组，但不特别地限于此。
[0213]
所述高分子量聚合物的实例可以是选自由聚乙二醇(peg)、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多醇、聚乙烯醇、多糖类、聚乙烯乙基醚、生物降解聚合物、脂质聚合物、甲壳素、透明质酸、寡核苷酸、和其组合组成的组的高分子量聚合物，并且所述多糖类可以包括葡聚糖，但不特别限于此。
[0214]
所述聚乙二醇为包括所有乙二醇同种聚合物、peg共聚物、或单甲基取代的peg共聚物(mpeg)的形式的术语，但不特别限于此。
[0215]
所述脂肪酸可在活体内与白蛋白具有结合力，但不特别限于此。
[0216]
所述生物相容性物质包括聚赖氨酸、聚天冬氨酸和聚谷氨酸等聚氨基酸，但不限于此。
[0217]
在所述弹性蛋白的情况下，其可以是作为水溶性前驱体的人原弹性蛋白(tropoelastin)，并且可以是其中一部分序列或一部分重复单元的聚合物，例如，包括作为弹性蛋白类似多肽的所有情况，但不特别限于此。
[0218]
在一具体实施例中，所述生物相容性物质为fcrn结合物质。具体地，所述fcrn结合物质可以是免疫球蛋白fc区，更具体地igg fc区，更具体地非糖基化igg4 fc区，但不特别限于此。
[0219]“免疫球蛋白fc区”是指包括除了免疫球蛋白的重链和轻链可变区的重链恒定区2(ch2)和/或重链恒定区3(ch3)部分的位点。所述免疫球蛋白fc区可以为构成根据一方面的缀合物的部分的一个构成。
[0220]
这样的免疫球蛋白fc区可以包括重链恒定区中的铰链(hinge)部分，但不限于此。
[0221]
在一具体实施例中，免疫球蛋白fc区可在其n-末端包含特定的铰链序列。
[0222]
术语“铰链序列”是指位于重链中通过二硫化物间键(inter disulfide bond)形成免疫球蛋白fc片段二聚体的位点。
[0223]
在一具体实施例中，所述铰链序列可以通过删除具有以下氨基酸序列的铰链序列的一部分来突变为仅具有一个半胱氨酸残基，但不限于此：
[0224]
glu-ser-lys-tyr-gly-pro-pro-cys-pro-ser-cys-pro(seq id no：27).
[0225]
所述铰链序列可以通过删除seq id no：27的铰链序列的第8和或第11个半胱氨酸残基来仅包括一个半胱氨酸残基。根据一具体实施例的铰链序列可为包括仅一个半胱氨酸残基的由3至12个氨基酸组成的，但不限于此。更具体地，根据一具体实施例的铰链顺序可以具有以下序列：glu-ser-lys-tyr-gly-pro-pro-pro-ser-cys-pro(seq id no：28)、glu-ser-lys-tyr-gly-pro-pro-cys-pro-ser-pro(seq id no：29)、glu-ser-lys-tyr-gly-pro-pro-cys-pro-ser(seq id no：30)、glu-ser-lys-tyr-gly-pro-pro-cys-pro-pro(seq id no：31)、lys-tyr-gly-pro-pro-cys-pro-ser(seq id no：32)、glu-ser-lys-tyr-gly-pro-pro-cys(seq id no：33)、glu-lys-tyr-gly-pro-pro-cys(seq id no：34)、glu-ser-pro-ser-cys-pro(seq id no：35)、glu-pro-ser-cys-pro(seq id no：36)、pro-ser-cys-pro(seq id no：37)、glu-ser-lys-tyr-gly-pro-pro-ser-cys-pro(seq id no：38)、lys-tyr-gly-pro-pro-pro-ser-cys-pro(seq id no：39)、glu-ser-lys-tyr-gly-pro-ser-cys-pro(seq id no：40)、glu-ser-lys-tyr-gly-pro-pro-cys(seq id no：41)、lys-tyr-gly-pro-pro-cys-pro(seq id no：42)、glu-ser-lys-pro-ser-cys-pro(seq id no：43)、glu-ser-pro-ser-cys-pro(seq id no：44)、glu-pro-ser-cys(seq id no：45)、ser-cys-pro(seq id no：46)。
[0226]
更具体地，所述铰链序列可包括seq id no：37(pro-ser-cys-pro)或seq id no：46(ser-cys-pro)的氨基酸序列，但不限于此。
[0227]
根据一具体实施例的免疫球蛋白fc区可以为在铰链序列的存在下免疫球蛋白fc链的两个分子形成二聚体的形式。另外，根据一具体实施例的化学式1的缀合物可以是其中接头的一末端与二聚体免疫球蛋白fc区的一条链连接的形式，但不限于此。
[0228]
术语“n-末端”是指蛋白质或多肽的氨基末端，其可以包括氨基末端的最末端或从最末端开始直至1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个的氨基酸。本发明的免疫球蛋白fc片段可以在n-末端包括铰链序列，但不限于此。
[0229]
另外，只要具有与天然型实际地同等或改进的效果，所述免疫球蛋白fc免疫球蛋白fc可以为包括仅除了免疫球蛋白的重链和轻链可变区的部分或整个重链恒定区1(ch1)和/或轻链恒定区1(cl1)的扩张的fc区。另外，也可以是相当于ch2和/或ch3的相当长的氨基酸序列的一部分被除去的区域。
[0230]
例如，所述免疫球蛋白fc区可以选自由(a)ch1结构域、ch2结构域、ch3结构域和ch4结构域；(b)ch1结构域和ch2结构域；(c)ch1结构域和ch3结构域；(d)ch2结构域和ch3结构域；(e)ch1结构域、ch2结构域、ch3结构域和ch4结构域中的一个或两个或多个结构域与免疫球蛋白铰链区或铰链区的一部分的组合；以及(f)重链恒定区的各结构域和轻链恒定区的二聚体组成的组，但不限于此。
[0231]
所述免疫球蛋白fc区可以是二聚体形式(dimeric form)，gip衍生物的一分子可以共价连接于二聚体形式的一个fc区，此时，所述免疫球蛋白fc和gip衍生物可以通过非肽
聚合物相互连接。另一方面，也有可能gip衍生物两个分子对称地结合于二聚体形式的一个fc区。此时，所述免疫球蛋白fc和gip衍生物可以通过非肽性接头相互连接。然而，不限于上述示例。
[0232]
此外，所述免疫球蛋白fc区包括天然型氨基酸序列及其序列衍生物。氨基酸序列衍生物是指由于天然氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基缺失、插入、非保守或保守取代或其组合而具有不同的序列。
[0233]
例如，已知在igg fc的情况下对于结合重要的214至238、297至299、318至322或327至331的氨基酸残基可用作用于修饰的合适位点。此外，诸如其中能够形成二硫键的位点可被去除、天然型fc中的n-末端的一些氨基酸可被去除、或天然fc的n-末端中可添加蛋氨酸残基的各种类型的衍生物都是可能的。此外，为了消除效应子功能，可以去除补体结合位点，例如clq结合位点，并且也可以去除抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody dependent cell mediated cytotoxicity：adcc)。国际专利公开第wo97/34631号和国际专利公开第96/32478号等公开了制造这种免疫球蛋白fc区序列衍生物的技术。
[0234]
不完全改变分子活性的蛋白质和肽中的氨基酸交换是本领域已知的(neurath，r.l.hill，the proteins，美国学术出版社，纽约，1979)。最常发生的交换是氨基酸残基ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、thy/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu、asp/gly之间的交换。根据情况，可以以磷酸化(phosphorylation)、硫酸化(sulfation)、丙烯酸化(acrylation)、糖基化(glycosylation)、甲基化(methylation)、法呢基化(farnesylation)、乙酰化(acetylation)、和酰胺化(amidation)等被修饰(modification)。
[0235]
所述的fc衍生物可以表现出与所述fc区同等的生物活性并且增加fc区对热、ph等的结构稳定性。
[0236]
此外，这样的fc区可以从诸如人、牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠或豚鼠等的动物活体中分离的天然型中获得，或者可以为从转化的动物细胞或微生物获得的重组型或其衍生物。在此，从天然型获得的方法可以是在从人或动物的活体分离后通过处理蛋白质分解酶来获得整个免疫球蛋白的方法。当用木瓜蛋白酶处理时，其被切割成fab和fc，当用胃蛋白酶处理时，其被切割pf'c和f(ab)2。对其使用尺寸排阻色谱法(size-exclusion chromatography)等可分离fc或pf'c。在更具体的实施例中，人源性fc区是从微生物获得的重组免疫球蛋白fc区。
[0237]
此外，免疫球蛋白fc区可以具有天然型糖链、与天然型相比增加的糖链、与天然型相比减少的糖链或糖链已被去除的形式。可以使用规方法例如化学方法、酶促方法和使用微生物的基因工学方法来进行这种免疫球蛋白fc糖链的增减或去除。在此，从fc中去除糖链的免疫球蛋白fc区与补体(c1q)的结合力显着降低，抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性降低或消除，从而在活体内不会诱导不必要的免疫反应。在这方面，更适合其作为药物载体的原始目的的形式可以称为其中糖链被去除或非糖基化的免疫球蛋白fc区。
[0238]“糖链的去除(deglycosylation)”是指通过酶从中去除糖的fc区，非糖基化(aglycosylation)是指在是指在原核动物或更具体的实施方案中大肠杆菌中生产且未糖基化的fc区。
[0239]
此外，免疫球蛋白fc区可以是通过igg、iga、igd、ige或igm、或其组合
(combination)或其混合(hybrid)的fc区。在更具体的实施例中，其源自人血液中最丰富的igg或igm，并且在更具体的实施例中，源自已知可提高配体结合蛋白质的半衰期的igg。在更具体的实施例中，所述免疫球蛋白fc区是igg4 fc区，在最具体的实施例中，所述免疫球蛋白fc区是源自人igg4的非糖基化fc区，但不限于此。
[0240]“组合(combination)”是指当形成二聚体或多聚体时编码同源单链免疫球蛋白fc区的多肽与不同源的单链多肽形成键。换言之，从二聚体或多聚体可以由两个或多个片段制造，所述片段选自由igg fc、iga fc、igm fc、igd fc和ige的fc片段组成的组。
[0241]
所述gip衍生物可以通过接头与生物相容性物质连接。
[0242]
所述接头可以是肽接头或非肽接头。
[0243]
当接头是肽性接头时，其可包括一个或多个氨基酸，例如1至1000个氨基酸，但不特别限于此。所述肽性接头可以包括gly、asn和ser残基，并且还可以包括诸如thr和ala的中性氨基酸。各种已知的肽性接头可用于连接所述生物相容性物质和gip衍生物。此外，可以考虑接头的优化来调节用于拷贝数“n”以达成功能部件之间的充分分离或保持必要的中间部分(inter-moiety)的相互作用。其他柔性接头在本领域中是已知的，例如，可以具有g和s接头，其中不仅添加极性氨基酸残基以提高水溶性，而且添加诸如t和a的氨基酸残基以保持柔韧性。因此，在一实施例中，所述接头可以是包括g、s和/或t残基的柔性接头。所述接头可具有选自(gpss)n和(spgs)n的一般式，在这情况下，独立地p为1至10的整数，s＝0至10的0或整数，p+s为20或更小的整数，以及n为1至20的整数。更具体地，接头的例子为(ggggs)n、(sgggg)n、(srssg)n、(sgssc)n、(gkssgsgsesks)n、(rppppc)n、(ssppppc)n、(gstsgsgkssegkg)n、(gstsgsgkssegsgstkg)n、(gstsgsgkpgsgegstkg)n、或(egkssgsgseskef)，并且所述n为1至20或1至10的整数。
[0244]
所述“非肽性接头”包括生物相容性聚合物，其中结合有两个或更多个重复单元。所述重复单元通过肽键以外的任何共价键相互连接。所述非肽性接头可以是组成所述缀合物的部分的一构成。
[0245]
所述“非肽性接头”可与“非肽性聚合物”互换使用。
[0246]
在一具体实施例中，所述缀合物可以是其中生物相容性物质和gip衍生物可以通过在两侧末端包括能够与生物相容性物质，具体地为免疫球蛋白fc区和gip衍生物结合的反应基团的非肽性接头彼此共价连接的。
[0247]
具体地，所述非肽性接头可选自由脂肪酸、糖类(saccharide)、高分子量聚合物、低分子量化合物、核苷酸和其组合组成的组。
[0248]
不特别限于此，但所述非肽性接头可以选自由诸如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖类、聚乙烯乙基醚、聚乳酸(polylactic acid：pla)和聚乳酸-乙醇酸(polylactic-glycolic acid：plga)的生物降解聚合物、脂质聚合物、甲壳素类、透明质酸、寡核苷酸、及其组合组成的组。所述多糖类可为葡聚糖，但不限于此。
[0249]
在更具体的实施例中，所述非肽性聚合物可以是聚乙二醇，但不限于此。因此，所述接头可以含有乙二醇重复单元。此外，本领域已知的其衍生物和以本领域技术人员的水平可以容易地制造的衍生物也包括在本发明的范围内。
[0250]
可以不受限制地使用所述非肽性接头，只要其是在或体内对蛋白水解酶具有抗性
的聚合物即可。非肽性聚合物的化学式量可以为1kda至1000kda的范围内，具体地在1kda至100kda的范围内，并且更具体地在1至20kda的范围内，但不限于此。此外，作为所述非肽性接头，不仅可以使用一种类型的聚合物，还可以使用不同类型的聚合物的组合。在一具体实施例中，所述乙二醇重复单元部分的化学式量可以为1kda至100kda的范围内，更具体地在1kda至20kda的范围内。
[0251]
在一具体实施例中，所述非肽性接头的两端可以分别结合于生物相容性物质，例如免疫球蛋白fc区的胺基或硫醇基和gip衍生物的胺基或硫醇基。
[0252]
具体地，所述非肽性聚合物可以在两末端分别包括可与生物相容性物质(例如，免疫球蛋白fc区)和gip衍生物结合的反应基团，具体地为可与位于生物相容性物质(例如，免疫球蛋白fc区)的n-末端或赖氨酸的胺基，或半胱氨酸的硫醇基结合的反应基团，但不限于此。
[0253]
另外可与生物相容性物质例如免疫球蛋白fc区和gip衍生物结合的所述非肽性聚合物的反应基团可选自由醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物组成的组，但不限于此。在上文中，醛基的实例包括丙醛基或丁醛基，但不限于此。在上述中，作为琥珀酰亚胺衍生物，可以使用琥珀酰亚胺戊酸酯、甲基丁酸琥珀酰亚胺酯、甲基丙酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基丁酸、琥珀酰亚胺基丙酸、n-羟基琥珀酰亚胺、羟基琥珀酰亚胺、羧甲基琥珀酰亚胺酯或碳酸琥珀酰亚胺酯，但不限于此。
[0254]
另外，通过醛键的还原性烷基化而生成的最终产物比通过酰胺键连接的最终产物稳定得多。醛反应基团在低ph中选择性地在n末端发生反应，在高ph如ph 9.0的条件下与赖氨酸残基形成共价键。
[0255]
另外，所述非肽性接头的两侧末端的反应基团可以彼此相同或彼此不同，例如，一侧末端可具有马来酰亚胺基，且另一侧末端可具有醛基、丙醛基或丁醛基。然而，只要在非肽性接头的各末端生物相容性物质，具体地，免疫球蛋白fc区和gip衍生物可以结合，则不特别限于此。例如，作为反应基团，所述非肽性接头的一侧末端可包括马来酰亚胺基，而另一侧末端可包括醛基、丙醛基或丁醛基。
[0256]
在使用两侧末端具有羟基反应基团的聚乙二醇作为非肽性聚合物的情况下，可以通过已知的化学反应激活所述羟基为所述各种反应基团或市售的具有修饰的反应基团的聚乙二醇来制造所述长效缀合物。
[0257]
在一具体实施例中，所述非肽性聚合物可以连接到gip衍生物的半胱氨酸残基，更具体地连接到半胱氨酸的-sh基团，但不限于此。
[0258]
如果使用马来酰亚胺-peg-醛，马来酰亚胺基可以通过硫醚(thioether)键接到gip衍生物的-sh基团，并且醛基可以通过还原烷基化反应与生物相容性物质，具体地为免疫球蛋白fc的-nh基团连接，但不限于此。
[0259]
另外，在所述缀合物中，非肽性聚合物的反应基团可以与位于免疫球蛋白fc区n-末端的-nh2连接，但这对应于一个例子。
[0260]
因此，根据所述一方面的缀合物可由下化学式1表示：
[0261]
[化学式1]
[0262]
x-l-f
[0263]
然而，在这种情况下，x为gip衍生物，
[0264]
l为接头；
[0265]
f为增加x在活体内的半衰期的生物相容性物质，
[0266]-表示x和l之间以及l和f之间的键合连接。
[0267]
在所述化学式1中，gip衍生物、接头和生物相容性物质如上所述。
[0268]
在所述化学式1中，l可为la，其中a为0或自然数，然而，在a为2或更大时，各个l可彼此独立。
[0269]
具体地，所述接头可以是由下式化学式2表示的聚乙二醇(peg)，但不限于此：
[0270]
[化学式2]
[0271][0272]
在此，n＝10至2400、n＝10至480、或n＝50至250，但不限于此。
[0273]
在所述长效缀合物中，peg部分不仅可以包括-(ch2ch2o)n-结构，还可以包括介于连接元素和-(ch2ch2o)n-之间的氧原子，但不限于此。
[0274]
所述聚乙二醇为包括所有乙二醇同种聚合物、peg共聚物、或单甲基取代的peg共聚物(mpeg)的形式的术语，但不特别限于此。
[0275]
在一具体实施例中，所述-表示x和l之间以及l和f之间的共价键合连接。
[0276]
确认了所述gip衍生物或其缀合物改善了狼疮疾病模型小鼠的水肿，恢复了皮肤病变，并减少由于炎症反应而扩大的脾脏的重量和大小。因此，所述gip衍生物或其缀合物可用于预防或治疗狼疮相关疾病。
[0277]
术语“预防”是指通过施用所述组合物抑制或延迟狼疮相关疾病发病的所有行为。
[0278]
术语“治疗”是指通过施用所述组合物改善或使狼疮相关疾病的症状有益的所有行为。
[0279]“狼疮(lupus)”是一种自身免疫性疾病。我们身体的白血球免疫细胞攻击我们的身体而使组织受损，同时全身出现炎症。狼疮的意思是红色皮疹，但这种病叫做系统性红斑狼疮，简称狼疮，因为这种病不仅发生在皮肤上，而且发生在全身各处。本病90％的患者为女性，特征为在20至50多岁的育龄期发病。其是一种自身免疫性疾病，因此身体的任何地方都会发生炎症，导致症状会以各种方式出现，并且由于症状会随着时间的推移而变化，因此是一种不容易诊断的疾病。
[0280]
自身免疫反应可引起身体任何部位的炎症，并且会根据发炎部位引起各种症状。按常见顺序列出，关节发生炎症导致关节疼痛，且全身性炎症导致全身发热，皮炎导致红斑。蛋白尿由于肾脏发炎引起，而胸痛是由于包围肺部和心脏的膜发炎引起的。此外，还可能出现光过敏反应、脱发、血细胞异常、雷诺现象、抽搐、口腔溃疡等。
[0281]“狼疮(lupus)”泛指系统性红斑狼疮。“系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，sle)”也称为“全身红斑狼疮”或“s.l.e.”，其为一种慢性炎症性自身免疫性疾病，并且是侵犯全身各器官，如结缔组织、皮肤、关节、血液、肾脏等的全身性疾病。系统性红斑狼疮不一定会在全身出现症状，在某些情况下，症状只会出现在身体的某部分。狼疮也被归类为小血管血管炎的一种。然而，与只影响称为血管的特定部位的血管炎不同，身体的所有组织为狼疮攻击的对象。因此，对治疗血管炎有效的药物不一定对治疗狼疮有效，反之亦然。
[0282]“狼疮相关疾病(lupus-associated diseases)”包括通常意义上的狼疮(lupus)或系统性红斑狼疮，并旨在包括所有与狼疮伴同或相关的疾病或症状。所述狼疮相关疾病可以是在肺、心脏、肌肉和关节的任何一个或多个器官中出现症状的。所述狼疮相关疾病可能伴有皮肤病变(skin lesion)。因此，狼疮相关疾病可以通过皮肤病变分数(skin lesion score)来诊断。根据一具体实施例的药物组合物可具有通过减少患者的皮肤病变来治疗狼疮相关疾病的效果。
[0283]
具体地，所述狼疮相关疾病可包括系统性红斑狼疮(sle)、盘状红斑狼疮(discoid lupus erythematosus，dle)、药物性红斑狼疮(drug-induced lupus)、新生儿狼疮(neonatal lupus)等。
[0284]“盘状红斑狼疮(discoid lupus erythematosus，dle)”又称“慢性盘状红斑狼疮”或“皮肤性红斑性狼疮(cutaneous lupus rythematosus)”，其在面部、手脚等皮肤出现皮疹。随着经过，可能伴有毛孔脱落和色素沉着等。
[0285]
所述“药物性红斑狼疮(drug-induced lupus)”是指因施用特定药物而引起的狼疮。
[0286]
所述“新生儿狼疮(neonatal lupus)”是发生在怀孕期间患有狼疮的母亲所生的新生儿中的狼疮。
[0287]
另外，所述狼疮相关疾病可包括例如狼疮性肾炎(lupus nephritis)、心包炎(pericarditis)、胸膜炎(pleuritis)、间质性肺炎(interstitial pneumonia)、关节炎(arthritis)等的与狼疮伴同的疾病。
[0288]
此外，所述狼疮相关疾病包括例如蝴蝶皮疹(butterfly rash)、冻疮样皮疹(pernio-like rash)、雷诺(raynaud)现象、口腔溃疡(oral ulcer)、光敏性(photosensitivity)、青斑(livedo)等的狼疮相关症状。
[0289]
在一具体实施例中，所述狼疮相关疾病可以是系统性红斑狼疮、盘状红斑狼疮、药物性红斑狼疮、新生儿狼疮、狼疮性肾炎、蝴蝶皮疹、或冻疮样皮疹，但不限于此。
[0290]
在一具体实施例中，所述药物组合物可以减少皮肤病变(skin lesion)。所述药物组合物可以减少由狼疮相关疾病增加的皮肤病变分数。
[0291]
所述药物组合物还可以包括药学上可接受的载体。药学上可接受的载体在口服施用时可以使用结合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、色素和香料等，并在注射剂时，可以混合使用缓冲剂、防腐剂、无痛剂、增溶剂、张力剂和稳定剂等，且在用于局部施用时，可以使用基质、赋形剂、润滑剂和防腐剂等。
[0292]
在一具体实施例中，所述药物组合物还可以包括药学上可接受的赋形剂。
[0293]
所述药物组合物的剂型可以通过与如上所述的药学上可接受的载体混合而不同地制造。例如，在口服施用时，可以制造成锭剂、片剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆和薄片等形式，并在注射剂的情况下，可以制造成单位施用安瓿或多次施用形式。此外，还可制剂化成溶液、悬浮剂、丸药、胶囊和释放型制剂。
[0294]
作为适用于制剂化的载体、赋形剂和稀释剂的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁或矿物油等。另外，还可以包括填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香料、
乳化剂和防腐剂等。
[0295]
所述药物组合物还可以包括用于治疗狼疮相关疾病的一种或多种的其他制剂。具体地，所述其他制剂可以是抗炎症剂或免疫抑制剂，但不限于此。更具体地，所述其他制剂可以是狼疮治疗剂，但不限于此。
[0296]“抗炎症剂”是指用于治疗炎症性疾病或与其相关的症状的化合物。作为非限制性实例，抗炎症剂包括非甾体类抗炎药物(nsaid；例如，阿司匹林、布洛芬、萘普生、水杨酸甲酯、二氟尼柳、吲哚美辛、舒林酸、双氯芬酸、酮洛芬、酮咯酸、卡洛芬、非诺洛芬、甲芬那酸、吡罗昔康、美洛昔康、甲氨蝶呤、塞来昔布、伐地昔布、帕瑞昔布、依托考昔和尼美舒利)、皮质类固醇(例如，泼尼松、倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、曲西龙和氟替卡松)、雷帕霉素(例如，参照文献[migita等人，clin.exp.immunol.(1997)108:199-203]；[migita等人，clin.exp.immunol.(1996)104:86-91]；[foroncewicz等人，transpl.int.(2005)18:366-368]、高密度脂质蛋白(hdl)和hdl胆固醇升高化合物(例如，参照文献[birjmohun等人007)arterioscler.thromb.vasc.biol.，27:1153-1158]；[nieland等人(2007)j.lipid res.，48:1832-1845]；公开了罗格列酮作为抗炎剂的用途[bloedon等人.(2008)j.lipid res.，samaha等人.(2006)arterioscler.thromb.vasc.biol.，26:1413-1414]、[duffy等人.(2005)curr.opin.cardiol.，20:301-306])、rho激酶抑制剂(例如，参照文献[hu，e.(2006)rec.patents cardiovasc.drug discov.，1:249-263]、抗疟药(例如，羟氯喹和氯喹)、对乙酰氨基酚、糖皮质激素、类固醇、β-激动剂、抗胆碱能药、甲基黄嘌呤、金注入(例如，乳清硫苹果酸钠)、柳氮磺胺吡啶、青霉胺、抗血管生成药、氨苯砜、补骨脂素、抗病毒药、他汀类药物(例如，参照文献[paraskevas等(2007)curr.pharm.des.，13:3622-36]；[paraskevas，k.i.(2008)clin.rheumatol.27:281-287])、以及抗生剂(例如四环素)。在特定具体实施例中，抗炎症剂是他汀类药物或高密度脂质蛋白(hdl)和hdl-胆固醇升高化合物。
[0297]“免疫抑制剂”和“免疫抑制性制剂”包括抑制免疫反应或与其相关的症状的化合物或组合物。作为非限制性实例，免疫抑制剂包括嘌呤类似物(例如，硫唑嘌呤)、甲氨蝶呤、环孢菌素(例如，环孢素a)、环磷酰胺、来氟米特、霉酚酸酯(麦考酚吗乙酯)、类固醇(例如糖皮质激素，皮质类固醇)、甲泼尼龙、泼尼松、非甾体抗炎药(nsaid)、氯喹、羟氯喹、苯丁酸氮芥、cd20拮抗剂(例如，利妥昔单抗、奥瑞珠单抗、维妥组单抗、或奥法木单抗)、阿巴西普、tnf拮抗剂(例如，英夫利昔单抗、阿达木单抗、依那西普)、大环内酯类(如吡美莫司、他克莫司(fk506)和西罗莫司)、二氢表雄酮、来那度胺、cd40拮抗剂(例如，抗cd40l抗体)、阿维莫司钠、blys拮抗剂(例如，抗blys(例如，贝利木单抗))、更生霉素、丛林胺、青霉胺、来氟米特、巯基嘌呤、嘧啶类似物(例如，阿糖胞苷)、咪唑立宾、烷化剂(例如氮芥、苯丙氨酸芥、白消安和环磷酰胺)、叶酸拮抗剂(如氨基蝶呤和甲氨蝶呤)、抗生素(例如，雷帕霉素、放线菌素d、丝裂霉素c、呋喃霉素和氯霉素)、人igg、抗淋巴细胞球蛋白(alg)、抗体(例如，抗cd3(okt3)、抗cd4(okt4)、抗cd5、抗cd7、抗il-2受体(例如，达珠单抗和巴利昔单抗)、抗alpha/beta tcr、抗icam-1、莫罗莫那-cd3、抗il-12、阿仑单抗和免疫毒素抗体)、1-甲基色氨酸、以及其衍生物和类似物。在特定实施例中，免疫抑制剂选自甲氨蝶呤、羟氯喹、cd20拮抗剂(例如利妥昔单抗、奥瑞珠单抗、维妥组单抗、或奥法木单抗)阿巴西普、tnf拮抗剂(例如，英夫利昔单抗、阿达木单抗、依那西普)、西罗莫司和blys拮抗剂(例如抗blys(例如贝利木单
抗))组成的组。
[0298]“狼疮治疗剂”包括抑制或治疗与狼疮相关的症状的化合物或组合物。所述狼疮可以使用已知的物质。
[0299]
所述药物组合物的施用量和次数根据作为活性成分的药物种类以及所治疗的疾病、施用途径、患者的年龄、性别和体重、疾病的严重程度等各种相关因素来确定。
[0300]
由于所述药物组合物具有优异的活体内持续性和效力，因此可以显着减少施用次数和频率。
[0301]
另一方面提供一种预防或治疗狼疮相关疾病的方法，其包括将有效量的所述gip衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂化物、所述缀合物、或所述药物组合物施用于有需要的个体中。
[0302]
所述gip衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂化物、所述缀合物、所述药物组合物和狼疮相关疾病如上所述。
[0303]“有效量”或“药学上有效量”是指所述gip衍生物、其药学上可接受的盐、缀合物的量或用量，其在以单一或多次用量施用于患者时为接受诊断或治疗的患者提供期望的效果。作为本领域技术人员，主治医师诊断师可以通过使用已知技术或通过观察在类似情况下获得的结果来容易地确定有效量。在确定患者的有效量时，主治医师诊断师通过考虑各种因素来确认，其包括哺乳动物物种；其大小、年龄和一般健康状况；所涉及的具体疾病或障碍；疾病或障碍的参与程度或严重程度；个体患者反应；所施用的特定化合物；施用模式；施用制剂的生物利用性特征；选定的施用方案；同时药物处理的使用；以及其他相关情况，但不限于此。
[0304]“个体”是指需要治疗疾病的对象，更具体地，是指哺乳类，例如人类或非人类灵长类动物、小鼠(mouse)、大鼠(rat)、狗、猫、马和牛。
[0305]“施用”是指通过任何合适的方法将预定物质引入患者体内。施用途径可以是能够在患者体内达到靶的任何一般途径。所述施用可以是例如腹腔内施用、静脉内施用、肌肉内施用、皮下施用、皮内施用、口服施用、局部施用、鼻内施用或直肠内施用，但不限于此。
[0306]
所述施用可为每天向每个体以0.0001mg至1,000mg的量施用，例如，0.1mg至1,000mg、0.1mg至500mg、0.1mg至100mg、0.1mg至50mg、0.1mg至25mg、1mg至1,000mg、1mg至500mg、1mg至100mg、1mg至50mg、或1mg至25mg。然而，施用量可以根据制剂化方法、施用方法、患者的年龄、体重、性别、病状态、饮食、施用时间、施用途径、排泄速度和反应敏感性等因素而以多种方式处方，且本领域技术人员可以考虑这些因素适当调节施用量。施用次数可为每天1次或在临床上可接受的副作用范围内两次或更多次，对于施用部位，可以在1处或2处或更多处施用，每天或以2至5天的间隔的总施用天数可以在一次治疗中施用1天至30天。有需要时，如有必要，可在滴定期后重复相同的治疗。对于非人动物，每kg以与人相同的施用量施用，或例如通过将上述施用量按目标动物与人的器官(心脏等)的体积比(例如，平均值)换算而获得的量来施用。
[0307]
在所述方法中，将有效量的所述gip衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其缀合物与有效量的一种或多种其他活性成分同时、分别或依次施用。所述一种或多种其他活性成分可以是但不限于用于治疗狼疮相关疾病的一种或多种的其他制剂。
[0308]
另一方提供一种所述gip衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂化物、或所述缀合
物在制造用于预防或治疗狼疮相关疾病的药物中的用途。
[0309]
所述gip衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂化物、所述缀合物、和狼疮相关疾病如上所述。
[0310]
在本技术中公开的每个描述和实施例也可以适用于彼此的描述和实施例。换言之，在本技术中公开的各种要素的所有组合都落入本发明的范围内。此外，不能说本发明的范围受下述具体描述的限制。
[0311]
有益效果
[0312]
根据一方面的gip衍生物或其长效缀合物改善狼疮疾病模型小鼠的水肿，恢复了皮肤病变，并减少由于炎症反应而扩大的脾脏的重量和大小，因此可用于预防或治疗狼疮相关疾病。
附图说明
[0313]
图1为示出制造gip衍生物(seq id no：11、17、21和24)-peg-免疫球蛋白fc区缀合物并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page))分析的结果的图。
[0314]
图2为示出正常小鼠对照组、疾病模型(mrl/lpr)小鼠对照组和长效gip缀合物施用组的10周后体重变化率(％)的图表。
[0315]
图3为示出正常小鼠对照组、疾病模型(mrl/lpr)小鼠对照组和长效gip缀合物施用组的10周期间皮肤病变分数的图表。
[0316]
图4a示出正常小鼠对照组、疾病模型(mrl/lpr)小鼠对照组和长效gip缀合物施用组的10周后脾脏重量。
[0317]
图4b示出正常小鼠对照组、疾病模型(mrl/lpr)小鼠对照组和长效gip缀合物施用组的10周后脾脏大小。
[0318]
最佳模式
[0319]
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例是为了举例说明本发明，本发明的范围不限于这些实施例。
[0320]
实施例1：制造对gip受体具有活性的gip衍生物
[0321]
通过制造对人gip受体表现出活性的gip衍生物，下表1示出其序列。
[0322]
【表1】
[0323][0324][0325]
在所述表1中所记载的序列中，表示为aib的氨基酸为-氨基异丁酸(aminoisobutyric acid：aib)。
[0326]
所述，gip衍生物肽根据需要使用其c-末端经酰胺化的gip衍生物。
[0327]
实施例2：测量gip衍生物的体外(in vitro)活性
[0328]
为了测量所述实施例1中制造的gip衍生物的活性，使用转化有gip受体的细胞株在体外测量细胞活性的方法。所述细胞株转化为在中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary：cho)中表达各人gip受体基因，适用于测量gip活性。
[0329]
为测量所述实施例1中制造的gip衍生物在人gip受体的活性，人gip从16nm连续稀释4倍到0.000015 nm，并且在所述实施例1制造的gip衍生物从16nm连续稀释4倍到0.000015 nm。从所述培养的表达人gip受体的cho细胞中去除培养液，并向所述细胞中添加的经稀释的各物质，然后添加的含camp抗体的缓冲液，在常温培养15分钟。然后，通过添加的含有细胞溶解缓冲液检测混合物来溶解缓细胞，并在常温下反应90分钟。将所述反应完成的细胞溶解物应用于lance camp试剂盒(perkinelmer，usa)，并通过累积的camp计算ec50值，然后相互比较。
[0330]
下表2示出在人gip受体中相比于人gip的相对潜能。
[0331]
【表2】
[0332][0333][0334]
实施例3：制造长效的gip缀合物
[0335]
制造包括所述实施例1中制造的gip衍生物的长效缀合物。具体地，seq id no：11、17、21和24的gip衍生物分别通过非肽性聚合物的聚乙二醇(polyethylene glycol：peg)与免疫球蛋白fc区连接。
[0336]
长效缀合物的具体制造工艺如下，重覆相同工艺以制造seq id nos：11、17、21和24的gip衍生物缀合物。为了聚乙二醇化免疫球蛋白fc区的n末端，免疫球蛋白fc区与mal-10k peg-ald(分别具有马来酰亚胺(maleimide)和丙醛(propionaldehyde)基团的10 kdapeg，nof，日本)在摩尔比为1：1至2、总蛋白浓度为至ph为6.0至6.5、以及4℃至8℃下反应3至4小时。此时，添加氰基硼氢化钠(sodium cyanoborohydride，nacnbh3)还原剂来进行反应，在反应液中，使用captoq impres(ge healthcare life science，美国)柱纯化单一聚乙二醇化的免疫球蛋白fc区。
[0337]
为了将纯化的单一聚乙二醇化的免疫球蛋白fc区与gip衍生物结合，将单一聚乙二醇化的免疫球蛋白fc区与gip衍生物(seq id no：11、17、21、和24)的摩尔比设为1：1至3且总蛋白浓度设为至至18小时。对反应液使用source 15iso(ge healthcare life science，美国)柱纯化其中gip衍生物(seq id no：11、17、21和24)分别
通过peg共价连接到免疫球蛋白fc区的缀合物。
[0338]
结果，确认了纯化的seq id no：11的gip衍生物-peg-免疫球蛋白fc区缀合物、纯化的seq id no：17的gip衍生物-peg-免疫球蛋白fc区缀合物、纯化的seq id no：21的gip衍生物-peg-免疫球蛋白fc区缀合物、以及纯化的seq id no：24的gip衍生物-peg-免疫球蛋白fc区缀合物是以90％或更高的高纯度制造的，且sds-page分析结果如图1所示。
[0339]
实施例4：测量长效gip缀合物的体外活性
[0340]
为了测量所述实施例3中制造的长效gip缀合物的活性，与所述实施例2一样，使用通过使用gip受体经转化的细胞株在体外测量细胞活性的方法。
[0341]
具体地，为了测量长效gip缀合物在人gip受体中的活性，将人gip从16 nm连续稀释4倍到0.000015 nm，并且将长效gip缀合物从50 nm连续稀释4倍到0.000048 nm。从所述培养的表达人gip受体的cho细胞中去除培养液，并向所述细胞中添加的经稀释的各物质，然后添加的含camp抗体的缓冲液，在常温培养15分钟。然后，通过添加的含有细胞溶解缓冲液检测混合物来溶解缓细胞，并在常温下反应90分钟。将所述反应完成的细胞溶解物应用于lance camp试剂盒(perkinelmer，usa)，并通过累积的camp计算ec50值，然后相互比较。
[0342]
下表3示出在人gip受体中相比于人gip的相对潜能。
[0343]
【表3】
[0344][0345][0346]
所述实施例中示出本发明的gip衍生物保留有天然型gip的活性，特别是当制造为长效缀合物时表现出同等或高于天然型gip的活性，同时具有增加的半衰期，因此具有作为药物的优异特性。
[0347]
实施例5：确认长效gip缀合物在狼疮疾病模型中的效力
[0348]
为了确认长效gip衍生物在疾病模型中对狼疮的效力，使用mrl/lpr小鼠。
[0349]
具有施用赋形剂的正常小鼠对照组和疾病模型对照组，以及具有分别以0.12、1.05和3.16mg/kg施用长效gip缀合物的试验组。赋形剂和药物的施用间隔为2天，且试验在第10周时终止。作为长效gip缀合物，使用在实施例3中制造的长效gip衍生物(seq id no：17)。
[0350]
在施用期间测量体重，从第4周起每隔1周观察嘴、耳朵、肩胛骨周围和眼睛等，并以分数测量皮肤病变的程度。试验完成后，通过解剖取脾脏，并测量重量且进行观察。
[0351]
图2为示出正常小鼠对照组、疾病模型(mrl/lpr)小鼠对照组和长效gip缀合物施用组的10周后体重变化率(％)的图表。
[0352]
如图2所示，可以确认疾病模型与正常小鼠相比具有增加的体重。在狼疮患者的情况下，显示出由于炎症反应引起的全身水肿导致体重增加的特征，疾病模型也表现出相同的特征。另外，在施用长效gip缀合物的试验组中，可以确认，与疾病模型小鼠对照组相比体
重减轻，由此可得知水肿得到改善。
[0353]
图3为示出正常小鼠对照组、疾病模型(mrl/lpr)小鼠对照组和长效gip缀合物施用组的10周期间皮肤病变分数的图表。
[0354]
如图3所示，可以确认，在疾病模型对照组中，皮肤病变随时间经过逐渐恶化。然而，在长效gip缀合物施用组的情况下，皮肤病变的程度恢复到接近于正常小鼠的程度。
[0355]
图4a示出正常小鼠对照组、疾病模型(mrl/lpr)小鼠对照组和长效gip缀合物施用组的10周后脾脏重量。
[0356]
图4b示出正常小鼠对照组、疾病模型(mrl/lpr)小鼠对照组和长效gip缀合物施用组的10周后脾脏大小。
[0357]
如图4a和图4b所示，显示出，在疾病模型对照组的情况下，由于炎症反应，脾脏非常大的特征。可以确认，在长效gip缀合物施用组的情况下，与疾病模型对照组相比，脾脏的重量和大小减少。
[0358]
因此，可以得知长效gip缀合物具有治疗或改善狼疮相关疾病的效果。

技术特征：
1.一种用于预防或治疗狼疮相关疾病的药物组合物，其包括：药学上可接受的赋形剂；以及药学上有效量的肽，所述肽包括seq id no：1至26中任一个氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述肽为长效缀合物，且所述长效缀合物由下化学式1表示：[化学式1]x-l-f然而，此时，x为包括seq id no：1至26中任一个氨基酸序列的肽；l为含有乙二醇重复单元的接头，f为免疫球蛋白fc区，-表示x和l之间以及l和f之间的共价键合连接。3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中，所述肽的c-末端被酰胺化。4.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中，所述肽包括选自由seq id no：11、17和19至26组成的组中的氨基酸序列。5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，所述肽包括选自由seq id no：11、17、21和24组成的组中的氨基酸序列。6.根据权利要求2所述的药物组合物，其中，所述l中乙二醇重复单元部分的化学式量在1kda至100kda范围内。7.根据权利要求2所述的药物组合物，其中，所述f为igg fc区。8.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中，所述狼疮相关疾病在肺、心脏、肌肉和关节中的任何一个或多个器官中出现症状。9.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中，所述狼疮相关疾病为系统性红斑狼疮、盘状红斑狼疮、药物性红斑狼疮、新生儿狼疮、狼疮性肾炎、蝴蝶皮疹、或冻疮样皮疹。10.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中，所述药物组合物用于减少皮肤病变。

技术总结
本发明涉及一种用于预防或治疗狼疮相关疾病的药物组合物，其包括GIP(Glucose-dependent insulinotropic peptide)衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂化物、或其长效缀合物。所述GIP衍生物或其长效缀合物在狼疮疾病模型小鼠中具有改善水肿的效果、恢复皮肤病变的效果、以及减少由于炎症反应而扩大的脾脏的重量和大小的效果。的重量和大小的效果。的重量和大小的效果。


技术研发人员：金垠廷 崔宰赫 金晶雅 刘宁相 任炫炷
受保护的技术使用者：韩美药品株式会社
技术研发日：2021.10.18
技术公布日：2023/8/24