用于防治鱼病害的假单胞菌属菌株及其代谢物的制作方法

用于防治鱼病害的假单胞菌属菌株及其代谢物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术是2020年10月5日提交的国际专利申请号pct/us2020/54303和2021年10月4日提交的国际专利申请号pct/us2021/53405的部分继续申请，两者的发明名称都是“用于防治植物病害的假单胞菌属菌株及其代谢物”，并且要求其以及2020年10月5日提交的美国专利申请序列号17/063,540、2021年10月4日提交的美国专利申请序列号17/493,594、2020年10月5日提交的阿根廷专利申请系列号p 20 01 02757和2020年10月5日提交的台湾专利申请系列号109134454的优先权，将每个申请的全部内容通过引用并入本文。
发明领域
3.本发明属于生物农药领域。特别地，本发明涉及可以抑制多种鱼病原体生长的七种新的假单胞菌属物种(pseudomonas spp)菌株，0617-t307、0917-t305、0917-t306、0917-t307、0118-t319、0318-t327和0418-t328，由该细菌菌株产生的细胞肉汤和新代谢物。假单胞菌属菌株0617-t307、0917-t305、0917-t306、0917-t307、0118-t319、0318-t327和0418-t328已经保藏在美国典型培养物保藏中心(atcc)，并且分别具有atcc登录号pta-126796、pta-126797、pta-126798、pta-126799、pta-126800、pta-126801和pta-126802。
4.发明背景
5.野生鱼、养殖鱼和观赏鱼易于感染多种细菌病原体引起的传染病。最常描述的鱼细菌病原体是气单胞菌属(aeromonas)、爱德华氏菌属(edwardsiella)、假单胞菌属(pseudomonas)、希瓦氏菌属(shewanella)、分枝杆菌属(mycobacterium)、链球菌属(streptococcus)、黄杆菌属(flavobacterium)和弧菌属(vibrio)。杀鲑气单胞菌(aeromonas salmonicida)在淡水鱼群中引起疖病、出血、肌肉病变、下肠道炎症、脾肿大和死亡。由弧菌属(vibrio)物种引起的弧菌病是造成海洋观赏鱼大量死亡的原因。感染弧菌属的鱼的常见症状包括皮肤暗沉、鳃苍白、鳍基部出血、眼球突出、皮肤溃疡、角膜混浊、脾肿大和肠炎。发现副溶血弧菌(v.parahaemolyticus)是海洋观赏鱼尾腐病的病原体。该细菌攻击脂鳍，并且进行性感染总是致命的。两种革兰氏阳性细菌物种，无乳链球菌(streptococcus agalactiae)和海豚链球菌(streptococcus iniae)也对水产养殖业造成严重影响。无乳链球菌在鱼中引起脑膜炎，并且感染生存期通常显示神经障碍，例如不断的异常游泳。无乳链球菌已经成为罗非鱼的主要病原体。淡水鱼和咸水鱼对海豚链球菌的感染易感。海豚链球菌引起脑膜脑炎、皮肤病变和败血症。已经在至少27种养殖鱼或野生鱼中报道了海豚链球菌感染，导致每年损失超过1亿美元。海豚链球菌可在哺乳动物(包括人类)中引起疾害。手受伤的鱼处理者在接触感染海豚链球菌的鱼之后可能会因链球菌感染而生病。海洋黏着杆菌(tenacibaculum maritimum)是影响世界上大量海洋鱼物种的细菌性病原体，并且对水产养殖生产者具有相当大的经济意义。该病原体引起黏着杆菌病(tenacibaculosis，一种溃疡性疾病)，这是对许多具有商业价值的物种最具威胁的一种。除细菌性病原体之外，卵菌纲(oomycete)病原体寄生水霉(saprolegnia parasitica)既是腐殖型又是死体营养型。该病原体引起水霉病，水霉病是一种以淡水鱼的身体或鳍上可见
的白色或灰色丝状菌丝体斑块为特征的病害。水霉属感染受到孔雀石绿的防治。然而，禁止使用孔雀石绿导致水产养殖中水霉属感染的显著再次出现。寄生水霉现在正引起经济影响，特别是对鲶鱼、鲑鱼和鳟鱼物种。
6.需要来源于新菌株的新的生物农药，由这样的菌株产生的细胞肉汤和新代谢物，其可以抑制鱼病害的病原体生长。
7.发明简述
8.在第一方面，提供一种防治鱼病原体和鱼的相关病害的方法。所述方法包括几个步骤。一个步骤包括产生包含式(i)的农业组合物：
[0009][0010]
另一个步骤包括向鱼施用所述农业组合物以抑制鱼病原体的生长和鱼上的相关病害。
[0011]
在第二方面，提供一种防治鱼病原体病害的方法。所述方法包括向鱼施用包含在约1.0
×
105至1.0
×
109cfu每ml之间的假单胞菌属细菌的农业组合物以抑制鱼病原体的生长和相关病害的步骤。
[0012]
详细说明
[0013]
本发明涉及一种由本专利中列出的7种假单胞菌属菌株如0617-t307产生的新代谢物，其表现出针对病原微生物(包括细菌和真菌)的抗微生物活性。由16s rrna和其他管家基因序列，可以将菌株鉴定为恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)群中的土壤假单胞菌(pseudomonas soli)0617-t307。7种细菌菌株(例如0617-t307)的细胞肉汤含有新的、有效的6元杂环天然产物，其被命名为rejuagro a(式(i))，如下所示：
[0014][0015]
该化合物、其制备方法和用于抑制鱼微生物病原体的应用在本文中更详细地公开。
[0016]
定义
[0017]
当介绍本公开内容或特定实施方案的各个方面的要素时，冠词“一个”、“一种”、“该”和“所述”旨在表示存在一个或多个要素。术语“包括”、“包含”和“具有”旨在是包含性的，并且意味着可能存在除所列要素之外的附加要素。除非另有说明，否则术语“或”意指特定列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。
[0018]
如本文所预期的，术语“基本上”、“大约”和“约”以及类似术语旨在具有与本公开
hepatopancreatic)、水霉病(saprolegniasis)和黏着杆菌病(tenacibaculosis)。在第三方面，所述方法包括选自由以下组成的组的鱼：鲑鱼、鳟鱼、鲤鱼、狗鱼、鲈鱼、大头鱼、大菱鲆、鲽鱼、淡水鱼、海水鱼、野生鱼、养殖鱼、鱼、虾、鱿鱼、牡蛎、蟹和海螺。
[0029]
在第二方面，提供一种防治鱼病原体病害的方法。所述方法包括向鱼施用包含在约1.0
×
105至1.0
×
109cfu每ml之间的假单胞菌属细菌的农业组合物以抑制鱼病原体的生长和相关病害的步骤。
[0030]
在第一方面，所述方法包括选自由以下组成的组的假单胞菌属细菌：土壤假单胞菌0617-t307(登录号pta-126796)、土壤假单胞菌0917-t305(登录号pta-126797)、土壤假单胞菌0917-t306(登录号pta-126798)、土壤假单胞菌0917-t307(登录号pta-126799)、摩氏假单胞菌0118-t319(登录号pta-126800)、摩氏假单胞菌0318-t327(登录号pta-126801)和摩氏假单胞菌0418-t328(登录号pta-126802)。在第二方面，所述方法包括包含在约5.0
×
107至2.0
×
108cfu每ml之间的假单胞菌属细菌的组合物。在第三方面，所述方法包括选自由以下组成的组的鱼病原体：杀鲑气单胞菌、无乳链球菌、海豚链球菌、副溶血弧菌、寄生水霉和海洋黏着杆菌。在第四方面，所述方法包括选自由以下组成的组的相关病害疖病、链球菌病、链球菌病、弧菌病、急性肝胰腺病、水霉病和黏着杆菌病。在第五方面，所述方法包括选自由以下组成的鱼：鲑鱼、鳟鱼、鲤鱼、狗鱼、鲈鱼、大头鱼、大菱鲆、鲽鱼、淡水鱼、海水鱼、野生鱼、养殖鱼、鱼、虾、鱿鱼、牡蛎、蟹和海螺。
[0031]
生物保藏信息
[0032]
本发明人之一，杨庆鸿博士，将细菌菌株土壤假单胞菌0617-t307、土壤假单胞菌0917-t305、土壤假单胞菌0917-t306、土壤假单胞菌0917-t307、摩氏假单胞菌0118-t319、摩氏假单胞菌0318-t327和摩氏假单胞菌0418-t328于2020年6月25日提交给美国典型培养物保藏中心p.o.box 1549,manassas,va 20110usa(“atcc patent depository”)，其分别被给予非官方atcc专利号pta-126796、pta-126797、pta-126798、pta-126799、pta-126800、pta-126801和pta-126802。在存活测试之后，atcc专利保藏机构给予这些保藏的细菌菌株以下登录号，2020年6月25日生效：土壤假单胞菌0617-t307(登录号pta-126796)、土壤假单胞菌0917-t305(登录号pta-126797)、土壤假单胞菌0917-t306(登录号pta-126798)、土壤假单胞菌0917-t307(登录号pta-126799)、摩氏假单胞菌0118-t319(登录号pta-126800)、摩氏假单胞菌0318-t327(登录号pta-126801)和摩氏假单胞菌0418-t328(登录号pta-126802)。杨博士准许申请人将该生物保藏公开内容包括在本技术中。
实施例
[0033]
实施例1.rejuagro a用于抑制鱼病原体的用途
[0034]
使鱼病原体在它们各自的肉汤和温度(表1)中生长至指数期。在孵育后，将肉汤培养物1:10稀释，并移液到含有每个浓度(0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200μg/ml)化合物的96孔板的单独孔中。此外，包括病原体对照和空白对照(仅培养基)。使用分光光度计捕获每个孔的光密度(od600)读数以确定mic。将每种浓度的病原体对照和技术重复组合，并一式三份将100μl铺板在相应的琼脂上，以确定最终mic。rejuagro a对杀鲑气单胞菌、无乳链球菌、海豚链球菌、副溶血性弧菌和海洋黏着杆菌的mic分别为1.56、1.56、
3.13、0.39和12.5μg/ml。一式三份测定最小致死浓度(mlc)。rejuagro a对寄生水霉的mlc为100μg/ml。这些结果证实，rejuagro a对由杀鲑气单胞菌、无乳链球菌、海豚链球菌、寄生水霉和海洋黏着杆菌引起的疖病、链球菌病、水霉病和黏着杆菌病提供了良好的抑制作用。rejuagro a还显示出对弧菌病、急性肝胰腺坏死以及由副溶血弧菌引起的鱼、虾、鱿鱼、牡蛎、蟹和海螺中的污染的抑制作用。
[0035]
表1.rejuagro a对于不同鱼病原体的抗微生物作用概述
[0036][0037][0038]
na:不适用于分离物
[0039]
“‑”
不可获得
[0040]
实施例2.实施例中使用的培养基组合物
[0041]
表2包括实施例中示例性的培养基组合物。
[0042]
表2.培养基组合物
[0043]
[0044][0045]
实施例3.细菌菌株、天然产物及其引用的参考文献.
[0046]
本技术中描述的和所附权利要求书中存在的细菌菌株和天然产物在微生物学文献中是众所周知的。对于本文公开的各种引用的细菌菌株和天然产物，这些参考文献在下表3中呈现，将其内容通过引用整体并入本文。
[0047]
表3.细菌菌株、天然产物和作为其可用性证据的支持引用的参考文献
[0048][0049]
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[0066]
通过引用并入
[0067]
将本文引用的所有文献、出版物、专利、专利申请和相关材料通过引用并入，如同本文完全阐述一样。

技术特征：
1.一种防治鱼病原体和鱼的相关病害的方法，包括步骤：i.生产包含式(i)的农业组合物：和ii.向鱼施用所述农业组合物以抑制鱼病原体的生长和鱼上的相关病害。2.权利要求1的方法，其中鱼病原体选自由以下组成的组：杀鲑气单胞菌、无乳链球菌、海豚链球菌、副溶血弧菌、寄生水霉和海洋黏着杆菌。3.根据权利要求1的方法，其中相关病害选自由以下组成的组：疖病、链球菌病、链球菌病、弧菌病、急性肝胰腺病、水霉病和黏着杆菌病。4.根据权利要求1的方法，其中鱼选自由以下组成的组：鲑鱼、鳟鱼、鲤鱼、狗鱼、鲈鱼、大头鱼、大菱鲆、鲽鱼、淡水鱼、海水鱼、野生鱼、养殖鱼、鱼、虾、鱿鱼、牡蛎、蟹和海螺。5.一种防治鱼病原体病害的方法，包括：向鱼施用包含在约1.0
×
105至1.0
×
109cfu每ml之间的假单胞菌属细菌的农业组合物以抑制鱼病原体的生长和相关病害。6.权利要求5的方法，其中假单胞菌属细菌选自由以下组成的组：土壤假单胞菌0617-t307(登录号pta-126796)、土壤假单胞菌0917-t305(登录号pta-126797)、土壤假单胞菌0917-t306(登录号pta-126798)、土壤假单胞菌0917-t307(登录号pta-126799)、摩氏假单胞菌0118-t319(登录号pta-126800)、摩氏假单胞菌0318-t327(登录号pta-126801)和摩氏假单胞菌0418-t328(登录号pta-126802)。7.根据权利要求5的方法，其中组合物包含在约5.0
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107至2.0
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108cfu每ml之间的假单胞菌属细菌。8.权利要求5的方法，其中鱼病原体选自由以下组成的组：杀鲑气单胞菌、无乳链球菌、海豚链球菌、副溶血弧菌、寄生水霉和海洋黏着杆菌。9.根据权利要求5的方法，其中相关病害选自由以下组成的组：疖病、链球菌病、链球菌病、弧菌病、急性肝胰腺病、水霉病和黏着杆菌病。10.根据权利要求5的方法，其中鱼选自由以下组成的组：鲑鱼、鳟鱼、鲤鱼、狗鱼、鲈鱼、大头鱼、大菱鲆、鲽鱼、淡水鱼、海水鱼、野生鱼、养殖鱼、鱼、虾、鱿鱼、牡蛎、蟹和海螺。

技术总结
本公开内容涉及使用，可以抑制多种鱼病原体生长的，新的细菌菌株0617-T307、0917-T305、0917-T306、0917-T307、0118-T319、0318-T327和0418-T328，由该细菌菌株产生的细胞肉汤和新代谢物的方法。所述方法包括使用所述菌株产生的新的、有效的抗微生物代谢物，其对应于具有式(I)的化合物：式(I)的化合物：式(I)的化合物：


技术研发人员：杨庆鸿 黄剑
受保护的技术使用者：UWM研究基金会有限公司
技术研发日：2021.10.05
技术公布日：2023/8/24