产油酵母菌株及其用于生产脂质的用途的制作方法

1.本发明涉及一种新的油脂丝孢酵母(trichosporon oleaginosus)物种的产油酵母菌株，其特征在于影响基因组的突变，这些突变提高了其耐热性。
2.本发明还涉及通过培养所述产油酵母菌株生产脂质的方法。由此获得的脂质可有利地用作合成中间体，特别是在所谓的“绿色化学”领域，或在生物燃料如生物柴油或“绿色柴油”的生产中，其可原样使用，或与其他汽车燃料混合使用。


背景技术：

3.脂质的微生物生产被认为是目前从可再生资源生产方法的有利替代。与从植物中提取脂质相比，从经济的角度来看，微生物法更方便，因为它们更容易扩大规模，需要更少的人力，并且利用微生物的特性，以低成本的底物为代价快速繁殖，例如木质纤维素材料水解的衍生物。此外，它们不受气候因素的影响并且不与农业上用于食物用途开发的土壤竞争。
4.为此目的特别有希望的是产油酵母菌，即可以在特定的培养条件下以其干重的25％以上积累脂质(尤其是甘油三酸酯)的酵母。
5.使用产油酵母生产脂质是所述的现有技术的一部分，例如在：
[0006]-galafassi s.等人,bioresource technol.(2012),vol.111,pp.398-403；
[0007]-capusoni c.等人,bioresource technol.(2017)238:281-289；
[0008]-noguevsi等人,green chem,20(2018),pp.4349-4365；
[0009]-vasconcelos b.等人,appl microbiol biotechnol.2019 mar 25.doi:10.1007/s00253-019-09742-x；
[0010]-spagnuolo m.等人,curr opin biotechnol.2019 mar 12；57:73-81.doi:10.1016/j.copbio.2019.02.011.
[0011]
通常，所述脂质是通过在生物反应器中在有氧条件下培养产油酵母获得的。产油酵母使用糖溶液生长，所述糖溶液可从淀粉植物或含糖水果中获得，并被定义为“第一代糖”，或者优选通过处理和糖化不可食用的木质纤维素生物质获得，并因此被定义为“第二代糖”。木质纤维素生物质可以是例如农业残余物(如小麦秸秆或玉米秸秆)，或不能用于食品领域的植物(如普通芦苇、纤维高粱、芒属植物)，或非食用植物(如银胶菊、桉树、杨树)的加工残余物，或来自造纸领域的森林残余物或加工残余物。这些第二代糖混合物称为水解产物，含有5个(c5)和6个(c6)碳原子的糖。产油酵母天然能够在c5糖(如木糖)和c6糖(如葡萄糖)上生长，产生细胞生物质，并且在特定的生长条件下，以相对于干细胞重量的高百分比积累脂质。
[0012]
通过在生物反应器中培养所述产油酵母，获得包含必须回收的产油细胞生物质的培养液。随后，细胞内积累的脂质必须从仍然存在的培养液和由适当的裂解或破裂技术产生的细胞碎片中提取和分离出来。
[0013]
目前用于微生物生产脂质的技术方案提供了在受控温度下进行的方法在生物反
应器中培养这些酵母。众所周知，每个微生物物种都有一个最适生长温度，这个温度一般取决于该物种在自然界中所处的生态环境。
[0014]
由于产油酵母的发酵过程是放热的，因此需要非常有效的冷却系统来维持微生物生长的最佳温度，通常为20℃-30℃，从而增加了操作成本。因此，即使有限的提高发酵温度(例如从30℃至35℃)，也可以在简化冷却系统和降低生产成本方面获得相当大的优势。
[0015]
此外，如果使用木质纤维素废料进行这些发酵过程，其需要酶水解来生产游离单糖混合物(同步糖化和发酵过程)，则在更高温度下操作的可能性更加有利，以减少用于维持所用水解酶的最佳活性温度的能量消耗(参见例如choudhary j.等人,electronic j.biotechn 201621:82-92)。
[0016]
因此，申请人面临的问题是提高适用于生产脂质的产油酵母的耐热性，以便相对于常规方法提高发酵温度，并在任何情况下保证微生物在发酵过程中的重要功能。


技术实现要素：

[0017]
申请人发现了一种新的油脂丝孢酵母物种的产油酵母菌株，其于2020年5月28日保藏在莱布尼茨研究所(leibniz-institut)dsmz，保藏号为dsm 33530，其相比亲本菌株能够在更高的温度下执行其重要功能，因此允许使用更高的发酵温度，从而简化了生物反应器的冷却系统。
[0018]
本发明的新的产油酵母菌株通过诱变由同一申请人于2017年5月17日保藏在莱布尼茨研究所dsmz，保藏号为dsm 32508的油脂丝孢酵母物种的产油酵母菌株(也参见专利申请wo 2019/016703)获得。
[0019]
因此，在第一个方面，本发明涉及2020年5月28日保藏在莱布尼茨研究所dsmz，保藏号为dsm 33530的油脂丝孢酵母物种的产油酵母菌株。
[0020]
在第二个方面，本发明涉及生产脂质的方法，包括：
[0021]-制备接种物，其包含至少一种油脂丝孢酵母物种的产油酵母菌株dsm33530；
[0023]-将所述接种物进料至培养装置获得培养液；
[0024]-对所述培养液进行发酵，以获得包含悬浮在水相中的脂质的产油细胞生物质；
[0025]-从水相中分离包含脂质的产油细胞生物质；
[0026]-回收产油细胞生物质中存在的脂质。
[0027]
由于使用了本发明的菌株，发酵阶段可以在比已知菌株相对更高的温度下进行。发酵阶段通常可以在10℃至40℃，优选30℃至40℃，甚至更优选33℃至38℃的温度下进行。
[0028]
在本说明书和以下权利要求中，除非另有说明，数值范围的定义包括该范围内的单个值及其端点值。
[0029]
在本说明书和下述的权利要求中，术语“包括”也包括术语“其基本上由
…
组成”或“其由
…
组成”。
[0030]
在本说明书和下述的权利要求中，术语“生物柴油”是指用于柴油发动机的燃料，其包含衍生自生物来源的长链脂肪酸的烷基酯(例如，甲基、丙基或乙基)。
[0031]
在本说明书和下述的权利要求中，术语“绿色柴油”是指用于柴油发动机的燃料，其包含在氢气和至少一种催化剂存在下衍生自生物来源的脂质氢化或脱氧产物。
[0032]
在本说明书和下述的权利要求中，表述“培养”和“发酵”表示微生物细胞在人控制
的条件下生长和繁殖的过程。
[0033]
在本说明书和下述的权利要求中，表述“培养基”表示液体或凝胶，其被设计用于支持微生物的生长，特别是产油酵母细胞的生长。培养基可以具有确定的组成(例如，“ypd”土壤，“b”土壤等)或者它可以来源于对未选择的来源的处理，例如废水、商业废物或水解的木质纤维素材料。
[0034]
在本说明书和下述的权利要求中，表述“碳源”、“氮源”、“硫源”和“磷源”是指培养基中含有的有机或无机物质，或分别基于碳、氮、硫(例如硫酸盐)和磷(例如磷酸盐)的所述物质的组合物，并且微生物可以通过代谢它以获得能量。
[0035]
在本说明书和下述的权利要求中，术语“生物质”是指在本发明的脂质生产过程中或在其他培养方法中产生的细胞的集合。
具体实施方式
[0036]
从下述的详细描述中，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。
[0037]
本发明的产油酵母菌株是通过对专利申请wo 2019/016703中描述的油脂丝孢酵母物种的菌株dsm 32508的诱变，并随后筛选以更大热耐受性为特征的突变体而获得。
[0038]
更详细地说，诱变过程是通过将亲本菌株dsm 32508的细胞暴露于波长为230nm-260nm的紫外(uv)辐射下进行的。通过暴露于紫外辐射的诱变可以根据已知的技术进行，例如在winston f.等人,current protocols in molecular biology(2008),john wiley&sons；doi:10.1002/0471142727.mb1302s82。例如，所述诱变可以通过将放置在培养皿中具有琼脂的固化培养基上的亲本菌株的细胞暴露于紫外线辐射源5秒至5分钟来实现，所述紫外线辐射源放置在离培养皿10cm至50cm的距离处。紫外辐射源通常是一个或多个功率范围从8瓦至15瓦的灯，其产生波长范围从230nm至260nm的辐射。
[0039]
与亲本菌株dsm 32508相比，油脂丝孢酵母物种的产油酵母菌株dsm33530的细胞形态的变化在几个实验中得到证实，其中一些在下面的实施例中描述，其中所述修饰在光学显微镜下和通过流式细胞荧光测定法进行检测。
[0040]
本发明的菌株dsm 33530的基因型也通过分析其整个基因组dna的序列并用生物信息学工具将其结果与其亲本菌株dsm 32508的结果进行比较来表征。细节在实施例2中报道。
[0041]
本说明书所附的表1和表2(如图1和图2)报告了与亲本菌株dsm 32508相比，在新菌株dsm 33530的基因组dna中检测到的突变。对于每一个突变，在所谓的“支架”上的位置被指出，即在基因组dna的一个连续区域上，这些区域根据它们的核苷酸序列组装，允许基因组的重建。突变的类型(snv：“单核苷酸变异”，即单核苷酸的突变；mnv：“多核苷酸变异”，即序列中几个核苷酸的突变；一个或多个核苷酸的插入；一个或多个核苷酸的缺失)；还分别显示了亲本菌株dsm 32508基因组和菌株dsm 33530基因组中涉及的核苷酸数目、突变的氨基酸。纯合性突变是在基因组中以单拷贝存在的基因中发现的突变(表1)；杂合性突变是那些在基因组中以多拷贝存在的基因中发现的突变(表2)。其突变对菌株dsm 33530耐热性的提高有直接或间接影响的基因用粗体表示。
[0042]
确定突变的精确影响目前非常困难，因为需要为每个突变的基因产生一个敲除突变体。目前还没有针对这种酵母的分子工具可以做到这一点。
[0043]
复杂突变，如缺失和插入，以及单核苷酸突变(snvs)可以破坏/损害基因或产生积极影响，提高其稳定性或促进其转录。突变基因编码的蛋白质也是如此；其可能是无活性的，也可能表现出更强的活性/稳定性。
[0044]
耐热性是一种复杂的表现型，这可能要归因于许多机制的激活，包括涉及细胞膜渗透性、蛋白质变性以及修复dna和rna损伤的酶的调节的机制。事实上，在较高温度下生长的能力很可能不是由基因中的特定突变决定的，而是由基因组中几个点上的一系列纯合和杂合突变导致的，这些突变共同决定了新的油脂丝孢酵母物种的产油酵母菌株dsm 33530的耐热表现型。
[0045]
参与获得耐热性的基因的精确数量和性质在不同的生物之间可能有很大的差异；然而，在分子“伴侣”的水平上，反应是保守的(richter k.等人,mol.cell,2010,volume 40,issue 2,p.253-266)。事实上，表1突出了编码hsp104p的基因的突变，hsp104p是
‘
热休克蛋白’(hsp)家族的活生物体中高度保守的蛋白质。这些蛋白质与耐热性密切相关，它们的表达实际上由胁迫条件如热休克和暴露于紫外光诱导(lindquist和craig(1988)the heat-shock proteins.annual review of genetics,vol.22,p.631-677)。hsp104p位于胞质溶胶中充当分子伴侣；事实上，其热保护功能在于修复热损伤的蛋白质并使未折叠多肽链的聚集体可溶(parsell d.a.等人(1994)nature,372(6505),p.475-8)。
[0046]
已经表明hsp104p如何与其他分子“伴侣”一起作用，以解决和防止蛋白质的错误折叠和聚集，这种现象在高温生长期间是有利的。由分子“伴侣”调节蛋白质聚集体的聚集、解聚和清除的分子机制至今仍是争论和深入研究的主题(grimminger marquardt v.等人(2009)biopolymers,volume 93,issue 3,p.252-276)。
[0047]
在这个案例中，hsp104基因中的一个单纯合突变导致了一个氨基酸的替换，从不带电荷的极性氨基酸(asn)替换为带正电荷的氨基酸(his)。这可以改变蛋白质的稳定性和/或与其他伴侣的相互作用类型。
[0048]
新菌株dsm 33530耐热性的获得也可以通过纯合性的突变(表1)来促进，所述突变属于涉及泛素机制(uba3，hse1)、凋亡调节(wdr)、细胞内运输(snx12)和dna损伤修复(rev1)的基因(larimer f.w.等人(1988)journal of bacteriology,vol 171,p.230-237)。
[0049]
表2列出了杂合性中存在的突变，因此只存在于突变基因的一个等位基因上。粗体突出显示的基因与高温耐受性相关，尽管是间接相关；编码与染色质沉默(hst3)、双链dna断裂修复(rad)、线粒体基因组维持(cox18)相关的蛋白质的基因发生突变(jarolim s.等人(2013)g3(bethesda),9；3(12),p.2321-33)。
[0050]
虽然是杂合的，但所有这些与纯合突变相关的突变都可能导致对热胁迫反应的深刻改变，因此与不同温度耐受性的新菌株dsm 33530的表型相关。
[0051]
此外，在新菌株dsm 33530中发现的一些突变与耐热性的获得无关，而是与脂质的积累有关。在其他种类的产油酵母中，营养缺陷型基因(met5，arg2，his3)的突变与脂质生产增加之间的相关性已得到强调(coradetti s.t.等人(2018),elife 2018；7:e32110)。
[0052]
如已经报道的，本发明还涉及用于脂质生产的方法，包括：
[0053]-制备接种物，其包含至少一种油脂丝孢酵母物种的产油酵母菌株dsm33530；
[0054]-将所述接种物进料至培养装置获得培养液；
[0055]-对所述培养液进行发酵，以获得包含悬浮在水相中的脂质的产油细胞生物质；
[0056]-从水相中分离包含脂质的产油细胞生物质；
[0057]-回收产油细胞生物质中存在的脂质。
[0058]
培养装置可以是，例如，生物反应器。分离阶段可以例如通过离心来进行。
[0059]
优选地，发酵阶段可以在10℃至40℃的温度下进行，优选30℃至40℃，甚至更优选33℃至38℃。
[0060]
优选地，发酵阶段可以进行40小时至200小时，优选80小时至150小时。
[0061]
优选地，发酵阶段可以在有氧条件下进行。所述需氧条件可以通过例如向培养装置中吹入无菌空气并搅拌来实现，所述搅拌取决于所用培养装置的类型。
[0062]
优选地，在发酵阶段，溶解氧浓度(do2，溶解氧)保持在20％-40％的饱和值。
[0063]
此外，发酵阶段可以在含有发酵培养基的生物反应器中进行，所述发酵培养基包含葡萄糖、磷酸铵、ye(酵母提取物)、css、kh2po4、mgso4、cacl2、nacl和发酵过程的任何抑制剂，例如乙酸。该发酵培养基优选具有400ml/l的浓度。
[0064]
此外，为了恢复ye和硫酸铵的初始浓度，任选可以向培养物中加入氮气流。
[0065]
优选地，在发酵阶段，为了在整个过程中保持糖浓度大于零，向培养物中补加葡萄糖。
[0066]
根据本发明的优选实施方案，发酵阶段可以在3.0至8.0，优选4.0至7.0的ph范围内进行。为了保持ph值在所需范围内，可以在培养基中加入至少一种无机碱的水溶液，例如，氢氧化钠(naoh)、氢氧化钾(koh)、二氢氧化钙[ca(oh)2]、氢氧化镁[mg(oh)2]，或其混合物，优选氢氧化钾(koh)，或至少一种无机酸的水溶液，例如磷酸(h3po4)、硫酸(h2so4)、盐酸(hcl)或其混合物，优选硫酸(h2so4)，以获得所需的ph值。
[0067]
优选地，发酵阶段可以从接种物开始进行，接种物的数量为培养基总体积的1％至5％(体积/体积)，从所述菌株dsm 33530的先前培养中获得，在相同的培养基中进行6小时至24小时的时间。
[0068]
所述先前培养物又可以从前培养物接种，或者它可以从菌株dsm 33530的样品开始接种，该样品在-80℃保存在含有15％(体积/体积)甘油的悬浮液中。
[0069]
优选地，发酵阶段可以在包含葡萄糖作为碳源和硫酸铵[(nh4)2so4]作为氮源的培养基中进行。
[0070]
根据本发明的优选实施方案，发酵阶段可以在不连续培养(“补料-分批”)中进行。
[0071]
优选地，在接种后15小时至25小时的时间内，发酵阶段可以进一步以“补料-分批”的方式进行，优选25小时至175小时的时间，更优选65小时至125小时的时间，添加至少一种额外的氮源，例如，“玉米蒸馏液”或“玉米蒸馏固体”、酵母提取物、硫酸铵、尿素，其数量以使培养液中的氮总量为0.5g/l至5g/l。
[0072]
优选地，在接种后15小时至25小时的时间后，发酵阶段可以进一步以“补料分批”进行，优选时间范围为25小时至175小时，更优选范围为65小时至125小时，加入葡萄糖水溶液以使培养液中葡萄糖的恒定浓度范围为25g/l至50g/l。
[0073]
培养过程中的细胞生长可以通过分光光度方法测量，即在660nm下测定培养液样品的浊度或光密度(od)(od 660)。
[0074]
在发酵阶段结束时，菌株dsm 33530的细胞可以通过本领域已知的方法从培养液
中分离，例如过滤、压滤、微滤或超滤、离心，优选通过离心。优选地，所述离心可以在3000rpm至9000rpm，优选4000rpm至8000rpm的转速下进行5分钟至30分钟，优选15分钟至25分钟的时间。应该注意的是，所示的离心操作条件与在实验室规模上进行的过程有关：在通常使用连续离心机的工业过程的情况下，本领域的技术人员将能够适应这些操作条件。
[0075]
所获得的产油细胞生物质的浓度可以通过在预定间隔和所述过程结束时测定已知体积的培养液样品中产油酵母细胞的干重来测量，单位为克/升培养液。具体而言，产油细胞生物质的“干重”是指已知体积的培养液中所含细胞的重量，通过在通风烘箱中于105℃热处理除去所有水分直至恒重(约24小时)后称重上述细胞来确定。
[0076]
脂质回收相的产油细胞生物质可以根据本领域已知的方法进行细胞裂解，例如在国际专利申请wo 2014/102254中描述的方法，包括例如在加压反应器中热处理、用匀浆器机械处理或用微波处理。
[0077]
在所述细胞裂解结束时，可以根据本领域已知的并且例如在国际专利申请wo 2014/102254中描述的方法，通过用极性或非极性有机溶剂提取，从获得的悬浮液中回收脂质。
[0078]
在本发明的工艺结束时，产油酵母的脂质生产可以用本领域已知的比色方法直接在酵母细胞悬浮液样品中测量，例如用磺基-磷酸-香草醛，使用例如由spinreact s.a.u.,ctra.santa coloma,7e-17176st.esteve d’en bas(gi),西班牙销售的试剂盒“总脂质-磺基-磷酸-香草醛”。
[0079]
此外，产生的脂质的量可以通过重量分析法对用有机溶剂混合物从冻干的生物质样品中提取的级分进行测定，例如用氯仿:甲醇2:1，vol/vol，如folch j.等人,the journal of biological chemistry(1957),vol.226,p.497-509中所述；或者，用正己烷:异丙醇3:2，vol/vol，如hara a.等人,analytical biochemistry(1978),vol.90,p.420-426中所述。
[0080]
因此，为了评价与亲本菌株dsm 32508相比，菌株dsm 33530中脂质积累的性能，在过程结束时，用上面列出的方法测定生物质的干重(以g/l表示)和脂质的量(以g/l表示)，并计算这两个参数之间的百分比。
[0081]
脂质级分通过色谱技术进行分析，例如通过气相色谱法或通过高效液相色谱法(hplc)根据已知技术的流程进行分析。
[0082]
通过所述分析方法，发现在本发明的菌株dsm 33530和亲本菌株dsm 32508的产油酵母细胞中积累的脂质的90％由甘油三酯代表，优选甘油与具有8至24个碳原子的脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸、油酸和α-亚油酸的酯。
[0083]
可能存在的其它脂质是：磷脂、甘油单酯、甘油二酯、游离脂肪酸或其混合物。
[0084]
根据本发明的方法目标获得的脂质可以有利地用作合成中间体，特别是在所谓的“绿色化学”领域。此外，它们可以在至少一种具有1-4个碳原子的醇，优选甲醇或乙醇，和至少一种酸或碱催化剂的存在下进行酯基转移，以生产甘油和烷基酯，特别是甲酯或乙酯(生物柴油)。
[0085]
或者，所述脂质可以在氢气和至少一种催化剂的存在下进行氢化/脱氧，以生产“绿色柴油”。氢化/脱氧过程在本领域中是已知的，并且在例如欧洲专利申请ep 1,728,844中有所描述。
[0086]
为了进一步说明本发明，下面报告了一些实施方案的实例，这些实施方案不应该被解释为对本发明本身范围的限制。
[0087]
实施例1：获得和筛选油脂丝孢酵母物种的产油酵母菌株dsm 33530。
[0088]
将来自油脂丝孢酵母物种的产油酵母亲本菌株dsm 32508的细胞样品接种到含有“ypd”培养基(酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l)的烧瓶中：将烧瓶置于30℃的振荡培养箱中过夜。然后通过以3,500rpm离心5分钟来分离和收集细胞，在无菌水中洗涤，然后稀释并铺在含有“ypd”培养基的培养皿上，以便具有大约100个菌落。
[0089]
诱变后，如下筛选能在35℃生长的油脂丝孢酵母物种的菌落。
[0090]
在35℃获得的突变体库中，一定数量的达到较大尺寸的菌落在液体“ypd”培养基(酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l)中孵育，并根据35℃下的生长速率进行第一次选择。通过测定培养液样品在660nm(od
660
)的光密度，用分光光度法评估细胞生长。这些培养物用于制备含有15％(vol/vol)甘油的悬浮液，保持在-80℃，用于储存所获得的油脂丝孢酵母物种的产油酵母的突变体。
[0091]
在35℃下，将显示出最佳动力学生长的油脂丝孢酵母物种的产油酵母的突变体在脂源性培养基'b'(葡萄糖50g/l，硫酸铵[(nh4)2so4]1g/l，酵母提取物1g/l，磷酸二氢钾[kh2po4]1g/l，七水硫酸镁[mgso4·
7h2o]0.05g/l，氯化钠[nacl]0.01g/l，二水氯化钙[cacl2·
2h2o]0.01g/l)中培养来监测脂质的产生。为了进行比较，亲本菌株dsm 32508的样品在35℃的相同条件下进行培养。
[0092]
为了评价与亲本菌株dsm 32508相比新菌株dsm 33530的脂质积累，测定生物质的干重(以g/l表示)和脂质的量(以g/l表示)，并计算这两个参数之间的百分比。
[0093]
可以用本领域已知的比色方法直接在酵母细胞悬浮液样品中测量产油酵母的脂质生产，例如使用磺基-磷酸-香草醛，使用例如由spinreact sau,ctra.santa coloma,7e-17176st.esteve d'en bas(gi),西班牙销售的“总脂质-磺基-磷酸-香草醛”试剂盒。
[0094]
图3显示了与在30℃和35℃下孵育96小时后的亲本菌株dsm 32508相比，在35℃下孵育的新菌株dsm 33530的生物质(干重)和脂质产量(以g/l表示)。
[0095]
图4报告了与在30℃和35℃孵育96小时后的亲本菌株dsm 32508相比，在35℃孵育的突变体dsm 33530的脂质产量，以％干重表示。
[0096]
突变体dsm 33530已经显示出比在35℃下生长的亲本菌株dsm 32508在浓度(g/l)和干重方面具有更高的脂质产量。将新突变体与亲本菌株在其最佳温度下的性能进行比较，观察到新微生物达到相同的脂质滴度(7.5g/l)和更大量的微生物生物质。
[0097]
实施例2：油脂丝孢酵母物种的产油酵母菌株dsm 33530的基因型特征。
[0098]
上面已经说明的表1和表2中报道的菌株dsm 33530的基因型特征如下获得。
[0099]
通过使用生物信息学工具分析油脂丝孢酵母物种的产油酵母菌株dsm33530基因型的完整基因组dna的序列对其进行表征并将其结果与其亲本油脂丝孢酵母物种的产油酵母菌株dsm 32508的结果进行比较。
[0100]
为此，从在“ypd”培养基(酵母提取物10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖20g/l)中制备的两种菌株的培养物中提取基因组dna过夜。提取的dna遵循制造商的说明用quiagen的商业dnaeasy血液和组织试剂盒(cat.no.69504)纯化。
[0101]
通过电泳验证纯度和完整性后，按照与试剂盒结合的方案，用来自illumina的商
业试剂盒“tryseq dna library preparation kit”分别处理每个菌株的基因组dna。简而言之，加工dna以获得大小为200-400个碱基对的片段，然后在3’和5’末端连接到试剂盒中提供的寡核苷酸连接物上，随后使用相同的寡核苷酸作为“引物”通过聚合酶链式反应(pcr)进行扩增。使用安捷伦科技公司的生物分析仪2100对基因扩增产物进行定量和检查。使用illumina测序仪“2500测序系统”测定获得的每个片段的dna序列，并如前所述根据“phred”值优化获得的序列，例如ewing b.等人,genome research(1998),vol.8(3),p.175-185中所述。
[0102]
序列分析允许鉴定1703个连续区域(“重叠群”)，其平均大小为11605个碱基对(考虑最小长度为300个碱基对的重叠群)，总共19,763,953个碱基对。该值与在系统发育上类似于丝孢酵母属的酵母的基因组dna的大小一致，因此认为所得文库代表了菌株dsm 33530和亲本菌株dsm 32508的完整基因组。使用clcbio软件“对照图谱读数”和“基于质量的变异体检测”比较两种基因组dna的序列。
[0103]
通过验证它们在两个测序方向上的存在并通过“phred”值确定它们的准确性来确认所鉴定的突变。
[0104]
亲本菌株dsm 32508的基因组大小为19,800,719bp，包含7,786个基因，其中3,995个基因已被鉴定具有已知功能。与dsm 33530基因组的比较揭示了总共889个突变，包括61个缺失、40个插入、727个单核苷酸变异(snv)和61个多核苷酸变异(mnv)。在所有已鉴定的突变中，568个是杂合的(仅在一个等位基因中发现)，321个是纯合的(在突变基因的两个等位基因中都发现)。
[0105]
实施例3：用于生产脂质的生物反应器中的发酵过程。
[0106]
评估亲本菌株dsm 32508的细胞和根据本发明的菌株dsm 33530的细胞的生长和脂质积累。
[0107]
为此目的，将菌株dsm 33530的细胞样品和亲本菌株dsm 32508的细胞样品接种在两个500ml烧瓶中的100ml“ypd”培养基(酵母提取物10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖20g/l)中：将烧瓶分别置于35℃振荡培养箱中过夜。
[0108]
将如此获得的细胞悬浮液用于接种1l生物反应器，其含有400ml如下培养基：葡萄糖50g/l、(nh4)2so
4 5g/l、ye 2g/l、css 5g/l、kh2po
4 6g/l、mgso4.7h2o 0.3g/l、cacl2.2h2o 0.06g/l、nacl 0.06g/l。
[0109]
发酵过程在35℃的相同条件下进行。
[0110]
每个菌株的接种体积是获得400ml细胞浓度为0.5od
660
的悬浮液所必需的。
[0111]
在有氧条件下通过吹入1l/min的空气和根据菌株的需要在250和1050rpm之间变化的搅拌进行生长，以保持溶解氧浓度(do2，溶解氧)等于饱和值的30％。必要时，通过加入5m的koh溶液将ph值保持在约5.0。
[0112]
发酵过程以“补料分批”方式进行93小时。24小时后，用氮“补料”对培养物进行补料，以恢复酵母提取物和硫酸铵的初始浓度。为了在整个过程中保持大于零的糖浓度恒定，用600g/l的葡萄糖溶液进行糖补料，以2-10g/h的可变速度进行，直到过程结束。
[0113]
表3显示了两种过程在生产率方面获得的结果。
[0114]
表3
[0115] dsm 32508dsm 33530
时间(h)9393x(g/l)1080.73脂质(g/l)-44.55脂质％(w/w)-55.19y x/s0.200.26y l/s(g/g)-0.14p(g/l/h)-0.48
[0116]
生物量(x)表示为每升培养物中干生物量的重量。产生的脂质的量以每升培养物中脂质的克数和相对于干生物量x的百分比两者来表示。
[0117]
y x/s代表消耗每克糖产生的生物量(以克计)；y l/s是每消耗一克糖所产生的脂类的量(以克计)。p g/l/h是每小时产生的脂质的量(g/l)。
[0118]
图5显示了在35℃下与亲本菌株dsm 32508相比，新菌株dsm 33530的生物量产量(以g/l干物质表示)。两个菌株之间在生产力方面的显著差异是显而易见的。对于亲本菌株，脂质浓度值低于所用技术的检测限，因此相应的产量(y l/s)和生产率(p)值也没有报告。

技术特征：
1.油脂丝孢酵母物种的产油酵母菌株，其于2020年5月28日保藏在莱布尼茨研究所dsmz，保藏号为dsm 33530。2.用于脂质生产的方法，包括：-制备接种物，其包含至少一种油脂丝孢酵母物种的产油酵母菌株dsm33530；-将所述接种物进料至培养装置获得培养液；-对所述培养液进行发酵，以获得包含悬浮在水相中的脂质的产油细胞生物质；-从水相中分离包含脂质的产油细胞生物质；-回收产油细胞生物质中存在的脂质。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述发酵阶段在10℃至40℃，优选30℃至40℃，甚至更优选33℃至38℃的温度下进行。4.根据权利要求2所述的方法，其中发酵阶段进行40小时至200小时，优选80小时至150小时。5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述发酵阶段在有氧条件下进行。6.根据权利要求5所述的方法，其中在发酵阶段，溶解氧浓度(do2，溶解氧)保持在20％-40％的饱和值。7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述发酵阶段在3.0至8.0，优选4.0至7.0的ph下进行。8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述发酵阶段在包含葡萄糖作为碳源和硫酸铵[(nh4)2so4]作为氮源的培养基中进行。9.根据权利要求2到8中任一项所述的方法，其中所述发酵阶段在不连续培养(“补料分批”)中进行。

技术总结
本发明涉及于2020年5月28日保藏在莱布尼茨研究所(Leibniz-Institut)DSMZ，保藏号为DSM 33530的油脂丝孢酵母(Trichosporon oleaginosus)物种的产油酵母菌株。该菌株可用于通过发酵生产脂质，并通过诱变和随后的筛选从油脂丝孢酵母物种的产油酵母菌株DSM 32508中获得。菌株DSM 33530的特征在于高耐热性，例如与常规方法相比允许发酵温度增加，并且其本身仍然保证微生物在发酵过程中的重要功能。身仍然保证微生物在发酵过程中的重要功能。身仍然保证微生物在发酵过程中的重要功能。


技术研发人员：达妮埃莱
受保护的技术使用者：埃尼股份公司
技术研发日：2021.08.24
技术公布日：2023/8/24