基于受体结合结构域的二聚体和B群脑膜炎球菌的外膜囊泡的针对SARS-CoV-2病毒的疫苗组合物的制作方法

基于受体结合结构域的二聚体和b群脑膜炎球菌的外膜囊泡的针对sars-cov-2病毒的疫苗组合物
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别地涉及用于预防covid-19的疫苗。特别地，本发明描述了用于预防sars-cov-2病毒感染的新型疫苗组合物。所述组合物包含以稳定的二聚体形式表达的sars-cov-2病毒的受体结合结构域，作为相关抗原；和另外，源自b群脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseria meningitidis)的外膜蛋白的囊泡；和佐剂，所述组合物能够诱导针对sars-cov-2病毒的高的抗体滴度和细胞应答。
现有技术
2.covid19疾病是最近出现的，当时报道了未知病因学的严重肺炎病例。由sars-cov-2病毒引起的疾病以在人之间的快速扩散为特征，在有症状的病例(这占50％以下)中，主要具有诸如发热、咳嗽、鼻漏、咽痛和呼吸困难的症状的出现。在其余人中，该疾病是无症状形式的，这是在该疾病播散中的一个重要因素并且就该疾病的防治来说是一个流行病学挑战(who coronavirus disease(covid-2019)situation reports.https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports.2020年8月13日查阅)。
3.称为mers和sars的与sars-cov-2相似的冠状病毒是在近数十年中引起了类似流行病的致病因子。sars与sars-cov-2具有更大的同源性，并且相似性的因素之一为这两种病毒都利用ace2蛋白作为受体以穿透到人细胞中。因此，在sars中和在sars-cov-2中，在病毒蛋白s1的受体结合结构域(rbd；receptor binding domain)与蛋白ace2(血管紧张肽转变酶2)之间的相互作用对于在人类中的该病毒感染是决定性的(walls a等人,(2020),cell.https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.058)。sars-cov2病毒的s蛋白的该rbd结构域是一个大约223个氨基酸的片段，其是该病毒与受体ace2相互作用所经由的区域。
4.抗-rbd抗体的存在与covid-19的恢复期血清中的中和活性相关(dai l.等人,2020,cell,https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.06.035；quinlan b.d.等人,2020,https://doi.org/10.1101/2020.04.10.036418；zang j.等人,2020,https://doi.org/10.1101/2020.05.21.107565和https://clinicaltrials.gov/ct2/show/nct04466085？term＝nct04466085&draw＝2&rank＝1,2020年8月17日查询)。因此，寻求诱导抗-rbd抗体的疫苗策略具有高度的诱导针对所述病毒的中和抗体的可能性。
5.在sars-cov-2中采用的一种对于sars来说有效的策略在于使用rbd作为疫苗中的特异性抗原，其简单地与氧化铝或其他已知佐剂相组合。目的是取得提高的针对rbd的特异性抗体应答，其具有阻止该病毒进入细胞的能力。
6.迄今为止(2020年8月10日)，139种针对sars-cov-2的疫苗候选物处于临床前评价中，和28种处于临床试验阶段。其中至少八种候选物(2种处于临床阶段)使用rbd作为特异性抗原。另外，三种处于临床前阶段的候选物使用一些外膜囊泡作为疫苗平台(draft landscape of covid-19candidate vaccines
–
2020年8月10日,https://www.who.int/
publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines,2020年8月10查询)。
7.也已在动物中使用了吸收在氧化铝上的rbd单体，证明其诱导中和抗体而不增加由抗体引起的疾病(quinlan b.d.等人,(2020),https://doi.org/10.1101/2020.04.10.036418；zang j.等人,(2020),https://doi.org/10.1101/2020.05.21.107565)。也已在其他宿主中产生了rbd，虽然在331和343处的天冬酰胺的糖基化很大程度上取决于每种宿主的表达平台(chen wh等人,(2017),journal of pharmaceutical sciences 106:1961-1970)。在人中，已提议将吸收在氧化铝上的rbd(以直至50微克的高浓度)作为针对sars-cov的疫苗(https://clinicaltrials.gov/ct2/show/nct04466085？term＝nct04466085&draw＝2&rank＝1,2020年8月17日查询)。其他制剂评价了在昆虫细胞和杆状病毒中表达并纯化的包含319-545的氨基酸残基的rbd蛋白，但从未提及二聚体的获得(yang j等人,(2020),nature,https://doi.org/10.1038/s41586-020-2599-8)。
8.最接近本发明的技术方案为这样的针对covid-19的疫苗制剂的报道，所述疫苗制剂采用了在cho细胞中串联表达的rbd二聚体，和佐剂，其由中国科学院微生物研究所与安徽智飞龙科马生物制药有限公司(anhui zhifei longcom biopharmaceutics)开发，并且是强免疫原性的，具有105级别的特异性抗体滴度(dai l.等人,(2020),cell,https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.06.035)。该候选物处于临床试验阶段中。该技术方案的二聚体从编码该二聚体的序列的克隆开始来获得，这不同于本发明的二聚体，其通过设计而设想了一个保证rbd单体单元的二聚化的氨基酸序列。
9.处于临床前试验中的其他疫苗候选物纯化了携带病毒片段的经遗传修饰的囊泡。quadram institute bioscience和biomvis sr的情况就是如此(https://quadram.ac.uk/quadram-researchers-working-on-covid-19-vaccine-join-who-expert-groups/,2020年8月17日查询)。其他公司，例如intravacc，组合了omv与sars-cov-2的s蛋白的免疫原性特性(https://www.hospimedica.com/epivax-and-intravacc-to-jointly-develop-covid-19-vaccine-based-on-novel-click-on-omv-technology/articles/294782783/epivax-and-intravacc-to-jointly-develop-covid-19-vaccine-based-on-novel-click-on-omv-technology.html,2020年8月17日查询)。
10.通过将b群脑膜炎球菌的外膜囊泡(omv)与以稳定的二聚体形式的rbd相组合，本发明的发明人出人意料地发现了相对于使用rbd的已报道的疫苗组合物而言的优势，在下列方面：应答的迅速性和强度，所获得的抗体的亲和力和病毒的中和能力，th1型细胞应答，这些是在由sars-cov-2引起的大流行病的情形下非常重要的基本特征。用在本发明中所描述的疫苗组合物，在免疫接种7天时取得了抗-rbd igg抗体应答，具有朝向th1模式的细胞应答的极化，其以ifnγ和igg2a同种型的诱导为特征，因此预期没有对于针对冠状病毒的疫苗所报道的免疫病理学效应，其诱导th2模式。
11.相关于本发明而言合乎情理地确定，没有任何先前的技术方案或科学出版物描述过基于二聚体-rbd与b群脑膜炎球菌的外膜囊泡的组合的疫苗组合物，其具有这样的令人惊讶的特性，即针对rbd所诱导的免疫应答的增强优于由不包含所述囊泡的疫苗组合物所诱导的那种。因此，本发明的新颖性在于提供了针对covid-19的新型疫苗组合物，其诱导强
有力的针对该病毒的免疫应答。
12.发明简述
13.在一个实施方案中，本发明涉及用于诱导针对sars-cov-2病毒进行保护的免疫应答的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含：sars-cov-2的s蛋白的受体结合结构域(rbd)的二聚体，作为抗原；和b群脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜囊泡，作为免疫增强运载体。特别地，设计rbd抗原，其具有在seq id no.1中所显示的氨基酸序列319-541，从而保证了在位置538处的游离的半胱氨酸，这有利于rbd的二聚体结构的形成。所述疫苗组合物另外还包含佐剂，其选自包括下列各项的组：任何矿物盐，例如氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙，但不限于这些。
14.另一个实施方案包括用于获得omv的方法，其包括下列步骤：通过搅动将所述omv溶解在制药用水中，和在低于10℃的温度下对所述omv进行超声处理。
15.在另一个实施方案中，本发明涉及上面所描述的疫苗组合物在预防由sars-cov-2病毒引起的感染中的用途。特别地，本发明涉及在本文中所描述的疫苗组合物在以通过肌内途径的免疫接种规划方案诱导针对sars-cov-2病毒的早期igg抗体应答中的用途，所述免疫接种规划方案优选地包括5-50μg的rbd、10-100μg的omv和0.5-2.0mg/ml的氢氧化铝的剂量范围，在1至3次免疫接种的范围内，优选地2次免疫接种。
16.在另一个特别的实施方案中，本发明涉及在本文中所描述的疫苗组合物在以通过肌内途径的免疫接种规划方案诱导以向着th1模式极化为特征的针对sars-cov-2病毒的细胞应答中的用途，所述免疫接种规划方案优选地包括2个包含5-50μg的rbd、10-100μg的omv和0.5-2.0mg/ml的氢氧化铝的剂量，在1至3次免疫接种的范围内，优选地2次免疫接种。
17.发明详述
18.获得抗原的方法
19.合成编码rbd蛋白的序列并且将其亚克隆到表达载体pcdna3.1中。所选择的rbd的氨基酸序列为相应于319至541的氨基酸的序列。将包含目标蛋白质的构建体转染到cho细胞中。
20.通过离心和过滤来收获目标蛋白质，然后将其加载到ni-sepharose亲和柱上，随后通过superdex 200进行纯化。通过合适的方法来分析经纯化的蛋白质，包括分子大小、纯度、身份、氨基酸序列的测定，所述合适方法可以是sds-page、sec-hplc、ms。
21.在rbd的纯化期间和在空气存在下(温和的氧化条件)，所述rbd通过在所述两个分子的处于位置538处的两个游离的半胱氨酸之间形成二硫桥而二聚化。该分子间二硫桥是足够稳定的并且仅在还原条件下断裂。
22.脑膜炎奈瑟氏球菌的omv的提取和纯化按照cu21888a1来进行。
23.疫苗组合物
24.该制剂是一种可注射悬浮液，其包含与b群脑膜炎球菌的外膜囊泡和佐剂相混合的rbd二聚体。
25.本发明涉及疫苗，其包含以稳定的二聚体形式表达的sars-cov-2的s蛋白的受体结合结构域作为相关抗原，所述受体结合结构域通过设计具有经选择的氨基酸序列319-541，其包含9个半胱氨酸，其中的8个形成4个分子内二硫桥，这保证了所述二聚体的稳定结构。通常在天然蛋白质中形成分子内二硫桥的半胱氨酸538，由于所选择的截短序列，而成
为是游离的，从而允许在两个游离的c538之间形成分子间二硫桥，这使得结构稳定化，从而形成比相应的单体更具免疫原性的二聚体。
26.一种对于获得本发明的效应来说必需的组分是具有150-300纳米的大小的脑膜炎球菌外膜囊泡(omv)。omv在溶液中倾向于形成聚集体，并且这生成具有有着宽的颗粒大小范围的群体的制备物。用于降低聚集程度的对omv的处理是对于获得具免疫原性的和可复现的制备物来说至关重要的过程(wo 2006/008504 a1)。本发明提供了omv的制备物，其在直至10℃，优选地2至8℃的温度下稳定至少10天，具有直至500nm，优选地100-300nm，优选地在150-300nm的范围内的颗粒大小；并且提供了用于获得其的方法。在本发明中用于使omv稳定化的方法从在70％乙醇中沉淀的omv开始，其经历在18-25℃的环境温度下，通过以低于500rpm，优选地100至300rpm搅动至少3小时，优选地1-2小时来溶解在制药用水中的过程。该过程继续以解聚集步骤，其通过在低于10℃，优选地2-8℃的温度下，在30分钟至4小时，优选地1-3小时的范围内的持续时间内，以20-40khz的频率进行在超声波浴中的超声处理来施行。为了测量omv的解聚集，采用动态光散射(dls)技术来测定在制备物中的平均大小和颗粒大小分布。
27.通过在18-25℃的环境温度下搅动至少30分钟，优选地10-20分钟来混合所述两种组分：以稳定的二聚体形式表达的sars-cov-2的s蛋白的rbd，和omv。通过以低于500rpm，优选地100至300rpm搅动30分钟至1小时，将混合物rbd-omv吸附在70-100％的氢氧化铝凝胶上。所述疫苗组合物包含可以调节ph的在药学上合适的赋形剂，尤其是在0.5-1.0mm的浓度范围内的磷酸盐缓冲液；等渗溶液，例如在50-150mm的浓度范围内的氯化钠，但不限于这些；和防腐剂，例如硫柳汞，但不限于此。作为本发明目标的疫苗组合物显现出相对于在现有技术中对于sars-cov-2的s蛋白的受体结合结构域的抗原所报道的那种而言的优势，在3个在大流行病的情形下是非常重要的特征方面：应答的迅速性和强度，抗体的亲和力，病毒的中和能力，和th1型细胞应答。
28.施用方法
29.基于受体结合结构域的二聚体和b群脑膜炎球菌的外膜囊泡的针对sars-cov-2病毒的疫苗组合物通过肌内或皮下途径进行施用，以5-50μg，优选地10-20μg的rbd的剂量，和20-50μg的omv的剂量，按照间隔21-28天的两剂的治疗规划方案。所述疫苗组合物可以包含任何矿物盐，例如氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙，但不限于这些，以500-2500μg，优选地500-1000μg的剂量。
30.这些制剂按照1-3剂，优选地两剂(间隔21-28天)的规划方案施用给受试者。
31.附图描述
32.图1.疫苗制剂的组分。a：rbd 319-541的氨基酸序列；b：解聚集的omv的通过dls测定的颗粒大小；和c：在用从在omv/al(oh)3中配制的rbd开始在药品生产质量管理规范(good manufacturing practice；gmp)条件下生产的批次进行免疫接种后，在balb/c小鼠中诱导的抗-rbd igg抗体的滴度。
33.图2.在用在omv/al(oh)3中和在al(oh)3中配制的rbd-二聚体进行免疫接种后七天时诱导的抗-rbd igg抗体的滴度。不同的字母表示显著差异(p≤0.05)。
34.图3.相比于在omv/al(oh)3中配制的rbd-单体而言，在用在omv/al(oh)3中配制的rbd-二聚体进行免疫接种后七天时抗-rbd igg抗体的滴度。不同的字母表示显著差异(p≤
0.05)。
35.图4.相比于在al(oh)3中配制的rbd-二聚体而言，由在omv/al(oh)3中配制的rbd-二聚体的不同的疫苗组合物所诱导的抗-rbd igg抗体的动力学。不同的字母表示显著差异(p≤0.05)。
36.图5.相比于在al(oh)3中配制的rbd-二聚体而言，由在omv/al(oh)3中配制的rbd-二聚体所诱导的抗-rbd抗体的亲和性指数。
37.图6.a)在用在omv/al(oh)3中配制的rbd进行免疫接种后在balb/c小鼠中诱导的抗体对于rbd-ace2相互作用的抑制。b)用两个剂量的rbdd/omv/al(oh)3进行免疫接种的小鼠的血清的针对sars-cov-2病毒的中和活性，相比于在al(oh)3中配制的rbdd而言。星号指明显著差异(p《0.05)。
38.图7.a)由用在omv/al(oh)3中的rbd-二聚体进行免疫接种的小鼠的脾细胞(其在体外用rbd再刺激)对于ifnγ和il-4的产生的诱导，其是通过定量elisa测定的。数据以pg/ml显示。不同的字母指明根据tukey检验的显著差异(p《0.05)。b)igg2a/igg1同种型比，作为th1模式的诱导的指示。
实施例
39.实施例1.针对sars-cov-2的疫苗组合物的配制
40.从下列物质开始获得两种制剂：作为疫苗抗原的具有在图1a中所显示的序列的以其二聚体形式的rbd，浓度为10至20μg；大小为150-300nm的解聚集的omv，浓度为20至40μg；和作为佐剂的氢氧化铝，浓度为500μg。
41.通过在cu21888a1中所描述的方法提取omv并且在乙醇中进行沉淀。从omv沉淀物开始，称取必需的质量并且重悬浮在注射用水中，通过温和地搅动和在环境温度下进行均质化直至完全溶解(大约1小时)。一旦omv溶解，就验证其不存在凝块，也不混浊，并且在超声波浴中进行解聚集，其中在超声处理时间期间保持温度≤10℃。解聚集时间过后，取样品以用于通过动态光散射(dls)来进行颗粒大小的测定(图1b)。作为该过程的对照，omv应当具有150-300nm的大小。将解聚集的omv保存在2-8℃的温度下。
42.通过温和地搅动(100-300rpm)15分钟来使解聚集的omv与rbd的混合物(omv-rbd)均质化。
43.最后，将omv-rbd混合物的所有内容物添加到氢氧化铝上，通过过滤添加所述制剂的组分，其中保持前面所调整的参数30分钟至1小时。将所述制剂保存于2-8℃的温度下。
44.从在omv/al(oh)3中配制的rbd开始在药品生产质量管理规范(gmp)条件下生产的制剂(图1c)在balb/c小鼠中诱导比没有疫苗抗原的组更强的抗-rbd igg抗体应答。
45.实施例2.不同于在al(oh)3中的rbd二聚体，具有在omv/al(oh)3中的rbd二聚体的制剂在balb/c小鼠中诱导早期抗体应答
46.在时间0时，用下列制剂之一以0.1ml的施用体积通过肌内途径对balb/c小鼠进行免疫接种：
[0047]-组1：10μg的rbd-二聚体，其与20μg的解聚集的omv相混合，并且共吸附在800μg的al(oh)3上；
[0048]-组2：10μg的rbd-二聚体，其共吸附在800μg的al(oh)3上；
[0049]-组3：20μg的解聚集的并且吸附在800μg的al(oh)3上的omv；和
[0050]-组4：800μg的al(oh)3。
[0051]
组3和4构成阴性对照制剂。
[0052]
在时间0和免疫接种后7天时进行血液抽取。经免疫接种的动物的血清通过间接elisa来进行分析，以测定抗-rbd抗体的滴度。将nunc maxisorp 96-孔微量滴定板用50μl的rbd(浓度为3μg/ml，在碳酸盐-碳酸氢盐调节溶液ph 9.6中)进行包被，在37℃下温育1小时，并且在结束时用洗涤溶液洗涤三次。然后，在37℃下使用100μl的5％脱脂乳封闭溶液封闭未包被的位点1小时。在如上面所描述的那样进行另一个洗涤步骤后，以系列稀释(1:3)(通常从1/50开始)和以50μl/孔的体积添加溶解在磷酸盐调节溶液ph 7.2+1％bsa中的血清。将平板在37℃下温育1小时并且再次进行洗涤。接着，添加50μl的在磷酸盐调节溶液ph 7.2+1％bsa中的与过氧化物酶相缀合的抗小鼠免疫球蛋白g的稀释液(1:5000)，并且温育1小时。在最后的洗涤步骤后，施加50μl/孔的过氧化物酶底物溶液。在黑暗中温育20分钟，并且以50μl/孔用2n h2so4溶液来使反应终止。在multiskan ex elisa阅读仪(thermoscientific)上在450nm下读取吸光度。将igg的滴度定义为在当达到经1/50稀释的免疫前血清(t0)的吸光度平均值的4倍时每个个体动物的血清稀释度的倒数。为了更好地呈现和分析结果，计算每个个体动物的滴度的log10。为了定义应答者动物，将》1.70的滴度的log认为是截断值，这相应于大于1/50的血清稀释度。将其滴度低于测定法检测极限的动物认为具有等于25的滴度值和1.4的log 10的值。
[0053]
图2显示了通过用包含处于omv/al(oh)3中的rbd-二聚体的组1的制剂和包含处于al(oh)3中的rbd-二聚体的组2的制剂进行免疫接种所诱导的早期igg抗体应答。可以看到，在免疫接种后7天，相比于用包含处于al(oh)3中的rbd-二聚体的制剂进行免疫接种的小鼠而言，在90％(10只中的9只)的用包含处于omv/al(oh)3中的rbd-二聚体的制剂进行免疫接种的小鼠中诱导了显著地更高的(p≤0.05，普通单因素anova和tukey多重比较检验)抗-rbd抗体应答。该特性归因于在所述制剂中存在的omv的免疫增强能力。实施例3.不同于在omv/al(oh)3中的rbd单体，具有在omv/al(oh)3中的rbd二聚体的制剂在balb/c小鼠中诱导早期抗体应答
[0054]
在时间0时，用下列制剂之一以0.1ml的施用体积通过肌内途径对balb/c小鼠进行免疫接种：
[0055]-组1：10μg的rbd-二聚体，其与20μg的解聚集的omv相混合，并且共吸附在800μg的al(oh)3上；
[0056]-组2：10μg的rbd-二聚体，其共吸附在800μg的al(oh)3上；
[0057]-组3：10μg的rbd-单体，其与20μg的解聚集的omv相混合，并且共吸附在800μg的al(oh)3上；
[0058]-组4：10μg的rbd-单体，其吸附在800μg的al(oh)3上；
[0059]-组5：20μg的解聚集的并且吸附在800μg的al(oh)3上的omv；和
[0060]-组6：800μg的al(oh)3。
[0061]
组5和6构成阴性对照制剂。
[0062]
用于获得血清的血液抽取以及所采用的评价方法与在实施例2中所描述的相一致。
[0063]
图3显示了相比于在相同制剂中的rbd-单体而言，通过用包含处于omv/al(oh)3中的rbd-二聚体的制剂进行免疫接种所诱导的早期igg抗体应答。可以看到，在免疫接种后7天，相比于包含处于相同的omv/al(oh)3制剂中的rbd-单体的组3而言，在用包含处于omv/al(oh)3中的rbd-二聚体的组1的制剂进行免疫接种的小鼠组中诱导了显著地更高的(p≤0.05，普通单因素anova和tukey多重比较检验)抗-rbd抗体应答。该特性归因于二聚体相对于单体而言的更强的免疫原性。
[0064]
实施例4.在两剂后，具有在omv/al(oh)3中的rbd-二聚体的制剂在小鼠中是高度免疫原性的
[0065]
在时间0和14天时，用下列制剂之一，以0.1ml的施用体积，用两个剂量的疫苗，通过肌内途径对balb/c小鼠进行免疫接种：
[0066]-组1：3μg的rbd-二聚体，其与20μg的解聚集的omv相混合，并且共吸附在800μg的al(oh)3上；
[0067]-组2：10μg的rbd二聚体，其与20μg的解聚集的omv相混合，并且共吸附在800μg的al(oh)3上；
[0068]-组3：3μg的rbd-二聚体，其吸附在800μg的al(oh)3上；
[0069]-组4：10μg的rbd-二聚体，其吸附在800μg的al(oh)3上；
[0070]-组5：20μg的解聚集的并且吸附在800μg的al(oh)3上的omv；和
[0071]-组6：800μg的al(oh)3。
[0072]
组5和6构成阴性对照制剂。
[0073]
用于获得血清的血液抽取在时间0、7、14、21和28天进行，即免疫前血清，和在每次免疫接种后7和14天进行。该规划方案的目标为比较在具有omv/al(oh)3的制剂中和仅在al(oh)3中的3和10μg的二聚体-rbd的剂量，和评价由不同制剂所诱导的抗体的动力学。
[0074]
用于测定抗-rbd抗体的elisa描述在实施例2中。
[0075]
在图4中可以看到，对于在omv/al(oh)3中的rbd二聚体的制剂具有以剂量依赖性方式的抗-rbd抗体动力学，其在第二剂疫苗后显著增加。然而，在第二剂疫苗后未观察到在omv/al(oh)3中或在al(oh)3中配制的rbd二聚体的显著差异。在21和28天时达到的滴度对于这两种制剂都是显著地高的，在10
4-106的级别。
[0076]
实施例5.相比于在al(oh)3中的rbd二聚体而言，由用omv/al(oh)3配制的rbd二聚体所诱导的抗体的比较亲和力
[0077]
为了评价抗体的亲和力，基于通过用离液剂硫氰酸铵(nh4scn)进行处理以使抗原-抗体相互作用解离来测定亲和性指数。为此，用50μl的rbd(浓度为3μg/ml，在碳酸盐-碳酸氢盐调节溶液ph 9.6中)进行包被，在37℃下温育1小时，并且最后用洗涤溶液洗涤三次。然后，在37℃下使用100μl的5％脱脂乳封闭溶液封闭未包被的位点1小时，和然后以其吸光度值在滴定elisa中为大约1这样的稀释度添加血清，在37℃下温育1小时。接着，在环境温度下添加固定浓度的nh4scn(2m)15分钟。该测定法的其余部分与在实施例2中所描述的相似。
[0078]
亲和性指数(avidity index；ai)指明了在用离液剂进行处理后仍然与抗原结合的igg抗体的百分比，并且通过下述公式来进行计算：(具有nh4scn的igg滴度/没有nh4scn的igg滴度)*100。具有大于50％的ai的抗体被认为是具有良好亲和性的抗体。仅对于应答者
动物(滴度的log》1.70)测定ai，通过滴定elisa来测定。
[0079]
如在图5中所看到的，由在omv/al(oh)3中配制的rbd所诱导的抗体具有比由具有氧化铝的制剂所诱导的抗体更高的亲和力(p≤0.05)，这表明了由作为本发明目标的制剂所诱导的免疫应答的更好的质量。
[0080]
实施例6.由在omv/al(oh)3中的rbd-二聚体制剂所诱导的抗-rbd抗体的功能性活性
[0081]
所诱导的抗体对于rbd-ace2相互作用的抑制
[0082]
在elisa中采用在时间28时抽取的来自按照在实施例2中所描述的程序进行免疫接种的小鼠的血清，以测定其抑制rbd和ace2的相互作用的能力。
[0083]
将96-孔微量滴定板用50μl的ace2-小鼠fc(浓度为5μg/ml，在碳酸盐-碳酸氢盐调节溶液ph 9.6中)进行包被，在4℃下温育过夜，并且最后用洗涤溶液洗涤三次。然后，在37℃下使用200μl的2％脱脂乳封闭溶液封闭未包被的位点1小时。接着，在磷酸盐调节溶液ph7.2+0.2％乳中制备40ng/ml的rbd-人fc。以不同的稀释度(包括1:25至1:400的范围)制备经免疫接种的或免疫前的小鼠血清。使用另一种不相关蛋白质(人pdl1-f)作为阴性对照。将经稀释的血清与rbd-人fc一起以1:1的比例在37℃下预温育1小时，然后向平板添加50μl/孔的该混合物并且在37℃下温育1小时30分钟。在新的洗涤步骤后，在37℃下添加50μl的在磷酸盐调节溶液ph 7.2+0.2％乳中的与碱性磷酸酶相缀合的抗-人igg的稀释物(1:1000)1小时。在最后的洗涤步骤后，施加50μl/孔的在二乙醇胺缓冲液中的pnpp(1mg/ml)。在黑暗中温育20分钟，并且以50μl/孔用3m naoh溶液来使反应终止。在elisa阅读仪上在405nm下读取吸光度。
[0084]
用下面的公式来计算抑制百分比：(1-abs
405nm rbd-人fc+小鼠血清/abs
405nm rbd-人fc)*100。
[0085]
图6a显示了用作为本发明目标的制剂进行免疫接种的小鼠的血清的抑制能力。
[0086]
抗-rbd抗体针对sars-cov-2病毒的中和能力
[0087]
通过使用中性红的比色测定法来评价按照在实施例2中所描述的程序进行免疫接种的小鼠的血清针对sars-cov-2的中和能力。在补充有2％胎牛血清(fbs)、25mm/ml的l-谷氨酰胺、2μg/ml的碳酸氢盐、80μg/ml的艮他霉素和5μg/ml的两性霉素b的mem培养基中温育vero e6细胞。从平板中去除上清液，并且向每个孔添加100μl的包含0.02％中性红的平衡盐溶液ph 7.2(pbs)。将平板在环境温度下温育一小时，然后丢弃中性红溶液。用包含0.05％tween20的无菌pbs将细胞单层洗涤两次。向每个孔添加100μl的裂解溶液(50份无水乙醇、49份超纯水和一份冰醋酸)。将平板在环境温度下温育15分钟，并且用分光光度计在540nm下进行测量。将具有大于截断值的光密度值的所评价的最大血清稀释度认为是中和滴度。将所述截断值计算为细胞对照的孔的光密度值除以2的平均值。
[0088]
通过病毒中和测定法显示了由在omv/al(oh)3中的rbd二聚体制剂所诱导的血清中和能力，这证明在免疫接种后28天时达到了平均为1:640的中和滴度，如在图6b中所显示的。
[0089]
实施例7.th1模式细胞免疫应答，通过ifnγ诱导和igg2a/igg1同种型比所测定的
[0090]
在按照在实施例2中所描述的程序进行免疫接种的小鼠中进行细胞免疫应答的评价(在时间28时抽取)。从用在omv/al(oh)3中的rbd二聚体和在al(oh)3中的rbd二聚体进行
免疫接种的balb/c小鼠中分离出脾细胞，并且将其在rbd(5μg/ml)存在下进行体外刺激。所采用的细胞浓度为1
×
106个细胞/ml。在刺激72小时之时，通过定量elisa在培养物上清液中测定il-4和ifn-γ的水平。
[0091]
图7a证明，用在omv/al(oh)3中的rbd二聚体进行的免疫接种诱导比在al(oh)3中的rbd制剂更高的ifn-γ水平，这证明了向th1模式的t细胞应答的极化。另外，igg同种型的应答证明，相对于在al(oh)3中的制剂而言，在其中rbd在omv/al(oh)3中进行配制的制剂之中igg2a/igg1比更有利于igg2a，这证明了向th1应答的极化。

技术特征：
1.用于诱导针对sars-cov-2病毒的免疫应答的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含：sars-cov-2的s蛋白的受体结合结构域(rbd)的一部分，作为抗原；由源自b群脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseria meningitidis)的外膜的囊泡(omv)组成的免疫刺激剂；和佐剂。2.根据权利要求1的疫苗组合物，其特征在于，所述抗原具有序列seq id no.1。3.根据权利要求1-2中任一项的疫苗组合物，其中所述rbd以二聚体的形式。4.根据权利要求3的疫苗组合物，其中所述二聚体通过游离的半胱氨酸c538的连接来形成。5.根据权利要求1的疫苗组合物，其中所述佐剂选自包括下列各项的组：-氢氧化铝，-磷酸铝，和-磷酸钙。6.根据权利要求1的疫苗组合物，其中作为免疫刺激剂进行使用的b群脑膜炎球菌的外膜囊泡具有在150-300nm范围内的颗粒大小。7.根据权利要求1的疫苗组合物，其中所述rbd在5-50μg的剂量范围内。8.根据权利要求1的疫苗组合物，其还包含在药学上合适的赋形剂。9.用于获得权利要求6的omv的方法，其包括下列步骤：a)通过搅动将所述omv溶解在制药用水中，和b)在低于10℃的温度下对所述omv进行超声处理。10.权利要求1-8中任一项的疫苗组合物在预防由sars-cov-2病毒引起的感染中的用途。11.权利要求1-8中任一项的疫苗组合物在预防由sars-cov-2病毒引起的感染中的用途，当需要在免疫接种后七天开始出现针对所述病毒的特异性抗体时。12.权利要求1-8中任一项的疫苗组合物在预防由sars-cov-2病毒引起的感染中的用途，当在两个剂量的所述疫苗组合物后需要针对所述病毒的特异性的中和抗体应答和th1型细胞应答模式时。13.权利要求1-8中任一项的疫苗组合物在通过肌内途径，以5-50μg的rbd、10-100μg的omv的剂量，按照1至3剂的免疫接种规划方案诱导针对sars-cov-2病毒的抗体应答中的用途。

技术总结
本发明涉及生物技术，特别地涉及人类健康领域。本发明提供了诱导针对SARS-CoV-2的中和免疫应答的疫苗组合物。这些疫苗组合物包含：与SARS-CoV-2的受体相结合蛋白的一部分，作为抗原；和源自B群脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)的外膜蛋白的囊泡，作为免疫增强剂；和另外，佐剂。在本发明中所描述的疫苗组合物在预防由SARS-CoV-2病毒引起的感染中是有用的。有用的。有用的。


技术研发人员：Y
受保护的技术使用者：分子免疫中心
技术研发日：2021.08.05
技术公布日：2023/8/24