RO8191和/或AS2863619在促进红系祖细胞或红系前体细胞分化增殖中的应用的制作方法

(1,3,4-oxadiazol-2-yl)-2,4-bis(trifluoromethyl)imidazo[1,2-a][1,8]naphthyridine，cas编号：691868-88-9，分子式：c14h5f6n5o，是一种具有口服活性的、有效的干扰素（ifn）受体激动剂，其直接与ifnα/β受体2结合，激活ifn刺激的基因（isgs）表达和jak/stat磷酸化。ro8191对hcv和emcv均显示抗病毒活性，对hcv复制子的ic50为200 nm。ro8191通过具有干扰素样活性发挥cccdna调节剂作用，并具有抗hbv活性。
[0009][0010]
式(ⅰ)。
[0011]
在本发明中，所述as2863619是一种有效的、口服的细胞周期蛋白依赖性激酶8（cdk8）和cdk19抑制剂，结构式如式(ⅱ)所示，名称：4-(1-(2-methyl-1h-benzo[d]imidazol-6-yl)-1h-imidazo[4,5-c]pyridin-2-yl)-1,2,5-oxadiazol-3-amine dihydrochloride，cas编号：2241300-51-4，分子式：c16h14cl2n8o，as2863619可以将抗原特异性效应子或记忆t细胞转换为foxp3+调节性t(treg)细胞，以研究各种免疫疾病，其对cdk8抑制剂和cdk19抑制剂的ic50分别为0.61 nm和4.28 nm。as2863619抑制cdk8/19可增强stat5的激活，从而激活foxp3基因。
[0012][0013]
式(ⅱ)。
[0014]
在一些实施方案中，本发明通过实验验证首次发现ro8191和/或as2863619均能够促进红系祖细胞或红系前体细胞的分化、增殖和长时间维持，其中，ro8191和as2863619两者联合对红系祖细胞或红系前体细胞的分化、增殖和长时间维持具有协同增效的作用，能够显著提高红细胞诱导分化过程中红系祖细胞和红系前体细胞的诱导分化效率。
[0015]
本发明的第二方面提供了一种用于促进造血干细胞或造血祖细胞诱导分化为红系祖细胞或红系前体细胞的基础培养基。
[0016]
进一步，所述基础培养基包含ro8191和/或as2863619。
[0017]
进一步，所述基础培养基中还包含imdm培养基、its-x、抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、奎诺二甲基丙烯酸酯、bsa。
[0018]
进一步，所述基础培养基中各组分的含量分别为：5
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m ro8191、1
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m as2863619、1% its-x、50
ꢀµ
g/ml抗坏血酸、50
ꢀµ
m乙酰半胱氨酸、50
ꢀµ
m奎诺二甲基丙烯酸酯、0.5% bsa。
[0019]
在一些实施方案中，所述基础培养基中各组分的含量分别为：(0.5-20)
ꢀµ
m ro8191、(0.1-10)
ꢀµ
m as2863619、(0.1-10)% its-x、(10-100)
ꢀµ
g/ml抗坏血酸、(10-100)
ꢀµ
m乙酰半胱氨酸、(10-100)
ꢀµ
m奎诺二甲基丙烯酸酯、(0.1-10)% bsa。
[0020]
在具体实施方案中，所述基础培养基中各组分的含量分别为：5
ꢀµ
m ro8191、1
ꢀµ
m as2863619、1% its-x、50
ꢀµ
g/ml抗坏血酸、50
ꢀµ
m乙酰半胱氨酸、50
ꢀµ
m奎诺二甲基丙烯酸酯、0.5% bsa。
[0021]
在一些实施方案中，所述造血干细胞或造血祖细胞包括各种来源的造血干细胞或造血祖细胞，包括但不限于：脐血来源的造血干/祖细胞（cb-hspc）、诱导多能干细胞来源的造血干/祖细胞（hipsc-hspc）、骨髓来源的造血干细胞/祖细胞、外周血来源的造血干细胞/
祖细胞。各种来源的造血干细胞或造血祖细胞均在本发明的保护范围内。
[0022]
在本发明中，所述红系祖细胞（erythroid progenitor cells）是一类处于造血干细胞和红系前体细胞之间的细胞群，由红系祖细胞向红系前体细胞分化的阶段，是调节红细胞生成自体稳定机制中的一个关键过程。所述红系前体细胞（erythroid precursor cells）是在促红细胞生成素（erythropoietin，epo）的作用下分化得到的一类处于红系祖细胞和红细胞之间的细胞群。所述红系祖细胞和红系前体细胞表达cd36，其中，所述红系祖细胞不表达cd235a，而所述红系前体细胞表达cd235a。
[0023]
在本发明中，所述红细胞是具有红细胞成熟的特征性标志物的去核细胞，它们特别表达糖蛋白a(cd235a)，不表达标志物cd36。红细胞是血液中数量最多的一种血细胞，同时也是脊椎动物体内通过血液将氧气从肺或鳃运送到身体各个组织的最主要的媒介。红细胞的主要功能分子是血红蛋白，占红细胞的90%。血红蛋白是一种含有血红素的蛋白质分子，它可以在肺部或鳃部与氧气分子结合，然后在身体的组织中将结合的氧气分子释放。
[0024]
在本发明中，所述造血干细胞是指能够产生三种造血谱系（红系、淋巴系和髓系）的所有血细胞类型的干细胞，这些细胞类型包括髓系谱系（单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞）和淋巴系（t细胞、b细胞、nk细胞）。所述造血祖细胞是指造血干细胞在一定的微环境和某些因素的调节下，增殖分化为各类血细胞的祖细胞，其也是一种相当原始的具有增殖能力的细胞，但已失去多向分化能力，只能向一个或几个血细胞系定向增殖分化，造血祖细胞能够分化为造血系统的数种细胞类型的多能细胞，包括但不限于：粒细胞、单核细胞、红细胞、巨核细胞、b细胞和t细胞造血祖细胞定向于造血细胞谱系，一般不自我再生。所述造血干细胞和造血祖细胞表达cd45。
[0025]
本发明的第三方面提供了一种促进造血干细胞或造血祖细胞诱导分化为红系祖细胞或红系前体细胞的培养体系。
[0026]
进一步，所述培养体系包括红细胞特化阶段培养基、红细胞扩增阶段培养基、红细胞成熟阶段培养基；所述红细胞特化阶段培养基包含本发明第二方面所述的基础培养基、scf、il-3、epo、地塞米松；所述红细胞扩增阶段培养基包含本发明第二方面所述的基础培养基、scf、il-3、epo、地塞米松；
[0027]
所述红细胞成熟阶段培养基包含本发明第二方面所述的基础培养基、scf、epo。
[0028]
进一步，所述红细胞特化阶段培养基中各组分的含量分别为：50 ng/ml scf、10 ng/ml il-3、10 ng/ml epo、1
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m地塞米松；所述红细胞扩增阶段培养基中各组分的含量分别为：50 ng/ml scf、10 ng/ml il-3、10 ng/ml epo、1
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m地塞米松；
[0029]
所述红细胞成熟阶段培养基中各组分的含量分别为：50 ng/ml scf、10 ng/ml epo。
[0030]
在一些实施方案中，所述红细胞特化阶段培养基中各组分的含量分别为：(10-100) ng/ml scf、(1-50) ng/ml il-3、(1-50) ng/ml epo、(0.1-10)
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m地塞米松。
[0031]
在具体实施方案中，所述红细胞特化阶段培养基中各组分的含量分别为：50 ng/
ml scf、10 ng/ml il-3、10 ng/ml epo、1
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m地塞米松。
[0032]
在一些实施方案中，所述红细胞扩增阶段培养基中各组分的含量分别为：(10-100) ng/ml scf、(1-50) ng/ml il-3、(1-50) ng/ml epo、(0.1-10)
ꢀµ
m地塞米松。
[0033]
在具体实施方案中，所述红细胞扩增阶段培养基中各组分的含量分别为：50 ng/ml scf、10 ng/ml il-3、10 ng/ml epo、1
ꢀµ
m地塞米松。
[0034]
在一些实施方案中，所述红细胞成熟阶段培养基中各组分的含量分别为：(10-100) ng/ml scf、(1-50) ng/ml epo。
[0035]
在具体实施方案中，所述红细胞成熟阶段培养基中各组分的含量分别为：50 ng/ml scf、10 ng/ml epo。
[0036]
在一些实施方案中，本发明所列举的数值范围或具体数值（例如，基础培养基中各组分的含量范围或具体含量、在各个分化阶段中添加的各种诱导分化因子的含量范围或具体含量、在各个分化阶段中的细胞密度范围或具体数值、在各个分化阶段中的培养天数、培养基的更换次数等）仅用于解释本发明所取得的技术效果，而不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员可在本发明所列举的数值范围或具体数值的基础上进行多种调整或修改，只要能够达到预期的诱导分化效果，这样经调整或修改后的数据范围或具体数值同样包含在本发明的保护范围内。
[0037]
本发明的第四方面提供了一种促进造血干细胞或造血祖细胞诱导分化为红系祖细胞或红系前体细胞的方法。
[0038]
进一步，所述方法包括采用本发明第三方面所述的培养体系对造血干细胞或造血祖细胞进行培养。
[0039]
进一步，所述方法包括如下步骤：(1) day0-6，红细胞特化阶段，采用本发明第三方面中所述的红细胞特化阶段培养基培养造血干细胞或造血祖细胞；(2) day6-12，红细胞扩增阶段，采用本发明第三方面中所述的红细胞扩增阶段培养基培养步骤(1)得到的细胞；
[0040]
(3) day12-15，红细胞成熟阶段，采用本发明第三方面中所述的红细胞成熟阶段培养基培养步骤(2)得到的细胞，获得红系祖细胞或红系前体细胞。
[0041]
进一步，在day0-3、day0-6、day0-9、day0-12或day0-15期间所使用的培养基中含有ro8191和as2863619。
[0042]
进一步，步骤(1)中细胞密度为1
×
105个/ml；步骤(2)中细胞密度为5
×
105个/ml；
[0043]
步骤(3)中细胞密度为1
×
106个/ml。
[0044]
进一步，每2天更换一次新鲜培养基，直至day20。
[0045]
在一些实施方案中，本发明通过实验验证首次发现，在day0-3、day0-6、day0-9、day0-12或day0-15期间所使用的培养基中同时添加ro8191和as2863619能够显著提高cd36+cd235a+红系前体细胞的分化效率，且作用时间越早、作用时间越久，cd36+cd235a+红系前体细胞的分化效率越高，此外，作用时间越久，cd36+cd235a-红系祖体细胞的分化效率越高，即诱导分化早期及长时间的ro8191和as2863619协同作用更有利于提高红系祖细胞和红系前体细胞的诱导分化。
[0046]
在一些实施方案中，步骤(1)中细胞密度为(0.01-10)
×
105个/ml，在具体实施方案中，步骤(1)中细胞密度为1
×
105个/ml。
[0047]
在一些实施方案中，步骤(2)中细胞密度为(0.1-50)
×
105个/ml，在具体实施方案中，步骤(2)中细胞密度为5
×
105个/ml。
[0048]
在一些实施方案中，步骤(3)、步骤(4)中细胞密度为(0.01-10)
×
106个/ml，在具体实施方案中，步骤(3)、步骤(4)中细胞密度为1
×
106个/ml。
[0049]
此外，本发明还提供了一种诱导造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的方法。
[0050]
进一步，所述方法包括如下步骤：(1) day0-6，红细胞特化阶段，采用本发明第三方面中所述的红细胞特化阶段培养基培养造血干细胞或造血祖细胞；(2) day6-12，红细胞扩增阶段，采用本发明第三方面中所述的红细胞扩增阶段培养基培养步骤(1)得到的细胞；(3) day12-15，红细胞成熟阶段，采用本发明第三方面中所述的红细胞成熟阶段培养基培养步骤(2)得到的细胞；
[0051]
(4) day15-20，红细胞脱核阶段，采用红细胞脱核阶段培养基培养步骤(3)得到的细胞，获得红细胞。
[0052]
进一步，步骤(4)中所述红细胞脱核阶段培养基包含imdm培养基、its-x、抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、奎诺二甲基丙烯酸酯、bsa、epo。
[0053]
在一些实施方案中，所述红细胞脱核阶段培养基中各组分的含量分别为：(0.1-10)% its-x、(10-100)
ꢀµ
g/ml抗坏血酸、(10-100)
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m乙酰半胱氨酸、(10-100)
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m奎诺二甲基丙烯酸酯、(1-50) ng/ml epo、(0.1-10)% bsa、
[0054]
在具体实施方案中，所述红细胞脱核阶段培养基中各组分的含量分别为：1% its-x、50
ꢀµ
g/ml抗坏血酸、50
ꢀµ
m乙酰半胱氨酸、50
ꢀµ
m奎诺二甲基丙烯酸酯、0.5% bsa、10 ng/ml epo。
[0055]
进一步，在day0-3、day0-6、day0-9、day0-12或day0-15期间所使用的培养基中含有ro8191和as2863619。
[0056]
此外，本发明还提供了基于如前所述的诱导造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的方法诱导分化得到的红细胞在预防、治疗和/或改善红细胞相关疾病或障碍中的应用。
[0057]
此外，本发明还提供了一种预防、治疗和/或改善红细胞相关疾病或障碍的方法，所述方法包括向有需要的对象施用基于如前所述的诱导造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的方法诱导分化得到的红细胞。
[0058]
进一步，所述红细胞相关疾病或障碍是指需要进行红细胞输注的相关疾病或障碍，包括但不限于：严重贫血、急性失血、癌症、移植、自身免疫疾病、感染性疾病、炎症、免疫缺陷相关疾病等。
[0059]
在一些实施方案中，通过一种或多种选自全身、局部、静脉内、皮下、关节内、肌内、鞘内和腹膜内的途径向所述对象施用红细胞。在一些实施方案中，所述对象包括一种或多种动物，包括例如，牛、马、绵羊、灵长类动物、禽类和啮齿类动物物种。所述对象可以是其血液中包含红细胞的动物（例如，哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物或两栖动物）。在一些实施方案中，所述对象可以是哺乳动物，例如人或非人哺乳动物。在另一些实施方案中，所述对象可
以是小鼠、大鼠、仓鼠、白鼬、沙鼠、兔、猴子、黑猩猩、马、矮种马、驴、绵羊、猪、鸡、山羊、猫或狗。在优选的实施方案中，所述对象为人。
[0060]
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
[0061]
本发明首次发现ro8191和as2863619均能够促进cd36+红系祖细胞或红系前体细胞的分化、增殖和长时间维持，并且ro8191和as2863619两者联合具有协同增效的作用，解决了目前本领域存在的在红细胞诱导分化过程中红系祖细胞和红系前体细胞生成效率低下及无法有效实现红系祖细胞和红系前体细胞扩增的问题，该研究发现将极大地推动不同来源造血干祖细胞向红细胞诱导分化的研究，并推动体外红细胞规模化生产和制备，最终解决临床用血短缺及安全性问题。
附图说明
[0062]
图1为garcinone d、ro8191和as2863619对红细胞诱导分化的影响结果图，其中，a图：细胞流式分析5
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m garcinone d、5
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m ro8191和1
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m as2863619对红系祖细胞标志物cd36、cd71和红细胞标志物cd235a影响的结果图，b图：5
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m garcinone d、5
ꢀµ
m ro8191和1
ꢀµ
m as2863619对细胞形态变化影响的结果图，control为空白对照组；gd+as+ro为实验组，代表在day0-12期间，添加5
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m garcinone d、5
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m ro8191和1
ꢀµ
m as2863619；图2为garcinone d、ro8191和as2863619对红细胞诱导分化的影响结果图，其中，a图：诱导分化第9天细胞流式分析5
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m garcinone d、5
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m ro8191或/和1
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m as2863619对造血干祖细胞标志物cd34、cd45，红系祖细胞标志物cd36、cd71和红细胞标志物cd235a影响的结果图，b图：诱导分化第15天细胞流式分析5
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m garcinone d、5
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m ro8191或/和1
ꢀµ
m as2863619对造血干祖细胞标志物cd34、cd45，红系祖细胞标志物cd36、cd71和红细胞标志物cd235a影响的结果图，control为空白对照组；gd代表在day0-12期间，添加5
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m garcinone d；ro代表在day0-12期间，添加5
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m ro8191；as代表在day0-12期间，添加1
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m as2863619；ro+as代表在day0-12期间，同时添加5
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m ro8191和1
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m as2863619；图3为细胞流式分析1
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m as2863619或/和5
ꢀµ
m ro8191对造血干祖细胞标志物cd34、cd45，红系祖细胞标志物cd36、cd71和红细胞标志物cd235a影响的结果图，其中，control为空白对照组；as代表day0-12处理1
ꢀµ
m as2863619；ro+as代表在day0-12用1
ꢀµ
m as2863619处理的基础上分别于day0-3、day0-6、day0-9、day0-12用5
ꢀµ
m ro8191处理；
[0063]
图4为ro8191协同as2863619促进红系祖细胞和红系前体细胞生成的时间窗口摸索结果图，其中，a图和b图：诱导分化第15天细胞流式分析1
ꢀµ
m as2863619和5
ꢀµ
m ro8191联合作用不同作用时间窗口对红系祖细胞标志物cd36、cd71和红细胞标志物cd235a影响的结果图，control为空白对照组；ro+as联合作用时间窗口分别代表day0-3、day0-6、day3-6、day3-9、day6-9、day6-12、day9-12处理5
ꢀµ
m ro8191和1
ꢀµ
m as2863619，c图：诱导分化第20天细胞流式分析1
ꢀµ
m as2863619和5
ꢀµ
m ro8191联合作用不同作用时间窗口对红系祖细胞标志物cd36和红细胞标志物cd235a影响的结果图，control为空白对照组；ro+as联合作用时间窗口分别代表于day0-6、day0-9、day0-12、day0-15同时用5
ꢀµ
m ro8191和1
ꢀµ
m as2863619处理。
具体实施方式
[0064]
本发明建立了一种无血清的、化学成分明确的红细胞诱导分化体系，所述分化体系中包含ro8191和/或as2863619，该分化体系适用于各种来源的造血干细胞或造血祖细胞向红细胞的诱导分化，解决了常规红细胞诱导分化过程中红系祖细胞和红系前体细胞诱导效率低下、无法有效增殖及快速衰老分化等难题，从而使得诱导多能干细胞来源的造血干/祖细胞（hipsc-hspc）向红细胞的诱导分化流程更接近于脐血来源的造血干/祖细胞（cb-hspc）。本发明的研究发现将极大地推动不同来源造血干/祖细胞向红细胞诱导分化的研究，并推动体外红细胞规模化生产和制备，最终解决临床用血短缺及安全性问题。
[0065]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
[0066]
本发明各实施例中所使用到的实验材料见下表1。
[0067]
[0068]
本发明各实施例中所涉及的流式细胞术（facs）检测细胞表面标志物的实验方法如下：1、facs检测所需试剂和抗体
[0069]
（1）清洗试剂：buffer a (pbs+4% fbs)。
[0070]
（2）直标一抗：fitc anti-human cd34 antibody，apc anti-human kdr antibody，pe anti-human pdgfrα antibody，pe anti-human cd144 antibody，apc anti-human itga3 antibody，pe anti-human epcr antibody，percp/cyanine5.5 anti-human cd90 antibody。
[0071]
2、待测样品的准备
[0072]
（1）配制tryple工作液：吸取适量dpbs至新的15 ml离心管中，按照1：1的比例加入相应体积的tryple原液，混匀后即为工作液，37℃水浴锅预热10分钟。
[0073]
（2）从培养箱取分化的细胞，吸弃原培养液，加入适量的dpbs清洗细胞，并用dpbs洗两遍（每次dpbs用量不少于原培养基用量），每次1分钟（洗的时候，要将dbps在板/瓶内放置30-45秒再行吸出）。
[0074]
（3）加tryple工作液（6孔培养板中每孔加入1 ml tryple工作液），使其均匀覆盖板底，置于培养箱孵育2-5分钟，期间可镜下观察，细胞收缩变圆且分散开即可。
[0075]
（4）轻轻拍打培养瓶/板，使细胞脱离板底，然后用移液器轻轻吹打几次，最后加入等体积buffer a终止消化，细胞计数后取1
×
106细胞（悬浮细胞不需要细胞消化步骤，直接收取悬浮细胞进行后续操作）。
[0076]
（5）配平后离心，200 g离心5 min，离心结束后吸弃上清，轻弹离心管底部使细胞充分分散，加入适量buffer a重悬，200 g离心5分钟，弃上清。
[0077]
（6）用buffer a清洗细胞2次，每次3 ml buffer a，200 g离心5分钟，弃上清。
[0078]
（7）孵育直标一抗：用100
ꢀµ
l buffer a重悬细胞后，每管加入1 test直标一抗，4℃孵育30分钟，并每隔10分钟轻弹离心管，使细胞与抗体充分结合。
[0079]
（8）用buffer a清洗细胞3次，每次3 ml buffer a，200 g离心5分钟，弃上清。
[0080]
（9）每管加入200
ꢀµ
l dpbs重悬细胞，并经70
ꢀµ
m孔径滤网过滤细胞，以除去未消化开的细胞团块，转移至96孔培养板中，置于4℃避光保存，等待上机检测。
[0081]
注明：诱导分化的第9天检测红系祖细胞标志物cd36和红细胞标志物cd235a的表达情况；诱导分化的第12天检测红系祖细胞标志物cd36、cd71和红细胞标志物cd235a的表达情况；诱导分化的第15天检测红系祖细胞标志物cd36、cd71和红细胞标志物cd235a的表达情况；诱导分化的第20天检测红系祖细胞标志物cd36、cd71和红细胞标志物cd235a的表达情况。
[0082]
（10）流式上机检测，所述流式上机检测的步骤如下：
[0083]
1）开启流式细胞仪guava easycyte ht和电脑。
[0084]
2）设置流式仪；打开流式软件，设置各种参数。
[0085]
3）待机器变为ready状态后，清洗机器。
[0086]
4）首先通过同型对照样品，设置fsc和ssc的电压和增益，使离散细胞群位于象限的合适位置，一般左下角为细胞碎片，右上角为较大的细胞团块。圈出目标细胞群，设置gate，进入下一步分析。
[0087]
5）根据抗体偶联的荧光素，选择合适的检测通道。通过调节相应通道电压和补偿，使得阴性细胞群和阳性细胞群可以明显地区分，然后依次检测实验样品。
[0088]
6）检测完毕，清洗流式仪，关闭流式仪和电脑。
[0089]
实施例1 造血干细胞（hsc）的制备1、单层贴壁细胞形成
[0090]
（1）配制tryple工作液：吸取5 ml dpbs至新的15 ml离心管中，再加入5 ml tryple原液，混匀后即为tryple工作液。
[0091]
（2）根据传代所需的培养基量，配制含1% ps（penicillin-streptomycin）、10 μm y-27632（rocki）的e8完全培养基，每毫升培养基加1 μl y-27632（10 mm）储存液。
[0092]
（3）从培养箱取出待传代的hipsc孔板/培养瓶，吸弃上清，用dpbs洗两遍（每次dpbs用量不少于原培养基用量），每次1 min（洗的时候，要将dbps在孔/瓶内放置30-45 sec再行吸出）。
[0093]
（4）加tryple工作液后（六孔板加约1 ml tryple工作液，t25瓶加约2 ml tryple工作液），置于培养箱孵育2-5 min，期间可镜下观察，细胞收缩变圆且分散开即可。
[0094]
（5）轻轻拍打培养瓶/板，使细胞脱离板底，然后用移液器轻轻吹打几次，最后加入dmem/f12终止消化。吸取适量的细胞悬液计数。
[0095]
（6）配平后离心，200 g，5 min，离心结束后吸弃上清，轻震离心管底部，按照不同的细胞密度，加入含10 μm y-27632的e8完全培养基重悬。细胞充分混匀后，将细胞悬液滴至培养板孔中，接种细胞密度为4000 cells/cm2，置于37℃，5% co2培养箱中静置培养。
[0096]
（7）培养24 h后，使用dpbs清洗两次后进行后续的诱导分化。
[0097]
2、hsc诱导分化培养基配制
[0098]
中胚层诱导培养基：stemdiff
™ꢀ
apel
™
2 medium + 1% penicillin-streptomycin + 9 μm chir99021。
[0099]
造血中胚层特化培养基：stemdiff
™ꢀ
apel
™
2 medium + 1% penicillin-streptomycin + 20 ng/ml vegf + 20 ng/ml bfgf。
[0100]
生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基：stemdiff
™ꢀ
apel
™
2 medium + 1% penicillin-streptomycin + 20 ng/ml vegf + 20 ng/ml bfgf + 20 ng/ml scf + 10 ng/ml il-3 + 30 ng/ml tpo + 10 ng/ml flt-l + 10 ng/ml bmp4。
[0101]
3、中内胚层诱导（day0）
[0102]
（1）配置适量的中胚层诱导培养基，37℃水浴锅预热。
[0103]
（2）吸弃原培养液，加入适量的dpbs清洗细胞。
[0104]
（3）添加中胚层诱导培养基，然后置于37℃，5% co2培养箱中静置培养24 h。
[0105]
4、造血中胚层特化（day1）
[0106]
（1）配置适量的造血中胚层特化培养基，37℃水浴锅预热。
[0107]
（2）吸弃原培养液，加入适量的dpbs清洗细胞。
[0108]
（3）添加造血中胚层特化培养基，然后置于37℃，5% co2培养箱中静置培养48 h。
[0109]
5、生血内皮特化及内皮-造血细胞转化（day3）
[0110]
（1）配置适量的生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基，37℃水浴锅预热。
[0111]
（2）造血中胚层特化48 h后，吸弃原培养液；加入适量的dpbs清洗细胞，tryple工
作液消化细胞至单细胞，终止细胞消化，200 g，5 min离心后，用生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基重悬细胞，并加入10 μm y-27632，按照20000 cells/cm2接种细胞；然后置于37℃，5% co2培养箱中静置培养。
[0112]
（3）培养24 h后更换新鲜的生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基。
[0113]
（4）此后，每2天更换一次新鲜的生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基。培养至day12收取悬浮细胞。
[0114]
实施例2 由造血干细胞/造血祖细胞分化制备红细胞造血干细胞/造血祖细胞向红细胞的诱导分化包括如下四个阶段：（1）红细胞特化阶段（day0-6）细胞密度为：1
×
105个/ml；
[0115]
培养基组成为：imdm、1% its-x、50
ꢀµ
g/ml抗坏血酸（ascorbic acid，aa）、50
ꢀµ
m乙酰半胱氨酸（acetylcysteine，nac）、50
ꢀµ
m奎诺二甲基丙烯酸酯（trolox）、0.5% bsa（牛血清白蛋白）、50 ng/ml scf（干细胞生长因子）、10 ng/ml il-3（白介素-3）、10 ng/ml epo（促红细胞生成素）、1
ꢀµ
m dexamethasone（地塞米松）。
[0116]
（2）红细胞扩增阶段（day6-12）细胞密度为：5
×
105个/ml；
[0117]
培养基组成为：imdm、1% its-x、50
ꢀµ
g/ml抗坏血酸、50
ꢀµ
m乙酰半胱氨酸、50
ꢀµ
m奎诺二甲基丙烯酸酯、0.5% bsa、50 ng/ml scf、10 ng/ml il-3、10 ng/ml epo、1
ꢀµ
m dexamethasone。
[0118]
（3）红细胞成熟阶段（day12-15）细胞密度为：1
×
106个/ml；
[0119]
培养基组成为：imdm、1% its-x、50
ꢀµ
g/ml抗坏血酸、50
ꢀµ
m乙酰半胱氨酸、50
ꢀµ
m奎诺二甲基丙烯酸酯、0.5% bsa、50 ng/ml scf、10 ng/ml epo。
[0120]
（4）红细胞脱核阶段（day15-20）细胞密度为：1
×
106个/ml；
[0121]
培养基组成为：imdm、1% its-x、50
ꢀµ
g/ml抗坏血酸、50
ꢀµ
m乙酰半胱氨酸、50
ꢀµ
m奎诺二甲基丙烯酸酯、0.5% bsa、10 ng/ml epo。
[0122]
红细胞诱导分化过程中，每2天更换一次新鲜培养基，直至day20。
[0123]
实施例3 garcinone d、ro8191和as2863619对红系祖细胞或红系前体细胞生成的影响11、实验方法
[0124]
本发明分别测试了garcinone d（gd）、ro8191（ro）和as2863619（as）对红系祖细胞或红系前体细胞诱导分化的影响。
[0125]
实验分组情况如下：control组—空白对照组（处理方式同实施例2），gd+as+ro组（实施例2中day0-12期间同时添加5
ꢀµ
m garcinone d、5
ꢀµ
m ro8191和1
ꢀµ
m as2863619）。在分化第12天进行流式检测。
[0126]
2、实验结果
[0127]
细胞流式分析结果图见图1a，结果显示，在红细胞诱导分化的第0-12天期间，添加5
ꢀµ
m garcinone d、5
ꢀµ
m ro8191和1
ꢀµ
m as2863619（gd+as+ro组）明显地促进cd36+细胞的
诱导分化，其中，cd36+cd235a-红系祖细胞的诱导效率为35.18%，cd36+cd235a+红系前体细胞的诱导效率为54.82%；而对照组（control）仅获得，0.85% cd36+cd235a-红系祖细胞，0.88% cd36+cd235a+红系前体细胞，45.26% cd235a+cd36-红细胞。同时，结果显示，garcinone d、ro8191和as2863619明显地促进cd71++细胞的生成。细胞形态变化结果图见图1b，结果显示，garcinone d、ro8191和as2863619能够促进细胞集落的生成。上述结果表明，garcinone d、ro8191和as2863619能够促进cd36+cd71++红系祖细胞或红系前体细胞的分化和增殖。
[0128]
实施例4 garcinone d、ro8191和as2863619对红系祖细胞或红系前体细胞生成的影响21、实验方法
[0129]
为进一步确定garcinone d、ro8191和as2863619的具体作用，本实施例分别测试了上述3种试剂单独作用及其组合作用对红细胞诱导分化的影响。在红细胞诱导分化的第0-12天（实施例2中所述的第0-12天）分别添加5
ꢀµ
m garcinone d（gd）、5
ꢀµ
m ro8191（ro）、1
ꢀµ
m as2863619（as）或5
ꢀµ
m ro8191和1
ꢀµ
m as2863619（ro+as），在诱导分化的第9天和第15天分别进行流式分析。
[0130]
实验分组：control—空白对照组，gd—day0-12用5
ꢀµ
m garcinone d处理，ro—day0-12用5
ꢀµ
m ro8191处理，as—day0-12用1
ꢀµ
m as2863619处理，ro+as—day0-12用5
ꢀµ
m ro8191和1
ꢀµ
m as2863619同时处理。
[0131]
2、实验结果
[0132]
诱导分化第9天细胞流式分析结果见图2a，结果显示，ro8191和as2863619均可以促进cd36+cd235a-红系祖细胞（17.93%，26.93%）和cd36+cd235a+红系前体细胞的生成（3.48%，10.62%），且显著优于garcinone d。而ro8191和as2863619协同作用明显提高cd36+cd235a-红系祖细胞（22.08%）和cd36+cd235a+红系前体细胞的生成（43.61%）细胞的生成，即ro8191和as2863619两者联合产生了协同增效的作用。
[0133]
同时本发明发现，ro8191和as2863619联合可以明显提高红系祖细胞和红系前体细胞表面标志物cd71的表达，相对于ro8191和as2863619单独作用，ro8191和as2863619协同作用极大地促进了cd71++细胞的生成（66.23% vs. 16.10% or 39.63%）（见图2a），这一结果再次证明了ro8191和as2863619两者联合具有协同增效的作用。
[0134]
诱导分化第15天细胞流式分析结果见图2b，结果显示，as2863619处理组cd36+细胞分化效率为62.52%，as2863619+ro8191处理组cd36+细胞分化效率为78.25%；而control组和ro8191处理组cd36+细胞分化效率仅分别为6.43%和10.28%。
[0135]
上述实验结果表明，as2863619是促进cd36+细胞表达的关键因素；且ro8191和as2863619联合作用激活jak/stat信号通路可以明显地促进cd36+和cd71+红系祖细胞和红系前体细胞的生成，从而使hipsc-hspc向红细胞的分化过程更接近cb-hspc，解决了hipsc-hspc向红细胞分化过程中红系祖细胞和红系前体细胞生成效率低下及无法有效实现红系祖细胞和红系前体细胞扩增的问题。
[0136]
实施例5 ro8191协同as2863619促进红系祖细胞和红系前体细胞生成的时间窗口摸索11、实验方法
[0137]
为进一步探索ro8191协同as2863619促进cd36+和cd71+红系祖细胞和红系前体细胞生成的最佳作用时间窗口，本实施例在第0-12天（实施例2中所述的第0-12天）添加as2863619的基础上，分别于诱导分化的第0-3天（d0-3）、第0-6天（d0-6）、第0-9天（d0-9）和第0-12天（d0-12）额外添加5
ꢀµ
m ro8191，在分化的第15天进行流式检测。
[0138]
实验分组：control—空白对照组，as—day0-12用1
ꢀµ
m as2863619处理，as+d0-3 ro—在day0-12用1
ꢀµ
m as2863619处理的基础上于day0-3用5
ꢀµ
m ro8191处理，as+d0-6 ro—在day0-12用1
ꢀµ
m as2863619处理的基础上于day0-6用5
ꢀµ
m ro8191处理，as+d0-9 ro—在day0-12用1
ꢀµ
m as2863619处理的基础上于day0-9用5
ꢀµ
m ro8191处理，as+d0-12 ro—在day0-12用1
ꢀµ
m as2863619处理的基础上于day0-12用5
ꢀµ
m ro8191处理。
[0139]
2、实验结果
[0140]
结果显示，相对于对照组（control），as2863619处理明显地提高了cd71+cd235a+（≥49.18%）和cd36+cd235a+（≥21.19%）红系前体细胞的诱导效率；而在as2863619的基础上，额外添加ro8191明显地提高了cd71+cd235a+（≥63.77%）和cd36+cd235a+（≥25.77%）红系前体细胞的诱导效率。同时本发明发现，相较于d0-3和d0-6较短时间的ro8191处理，d0-9和d0-12较长时间的ro8191处理更有利于维持cd36+细胞的生成和维持（见图3）。上述结果表明，ro8191协同as2863619促进cd71+cd235a+和cd36+cd235a+红系前体细胞的诱导分化，且ro8191的作用时间是维持cd36+细胞生成和维持的重要因素。
[0141]
实施例6 ro8191协同as2863619促进红系祖细胞和红系前体细胞生成的时间窗口摸索21、实验方法
[0142]
为进一步了解ro8191和as2863619协同作用的时间点，本实施例对ro8191和as2863619协同作用的时间窗口进行了摸索。于诱导分化的第0-3天（d0-3）、第0-6天（d0-6）、第0-9天（d0-9）、第0-12天（d0-12）、第0-15天（d0-15）、第3-6天（d3-6）、第3-9天（d3-9）、第6-9天（d6-9）、第6-12天（d6-12）、第9-12天（d9-12）同时添加1
ꢀµ
m as2863619和5
ꢀµ
m ro8191，在分化的第15天进行流式检测。
[0143]
2、实验结果
[0144]
结果显示，相对于对照组（control），d0-3、d0-6、d3-6和d3-9早期的ro8191和as2863619协同作用明显地提高cd36+cd235a+红系前体细胞的分化效率，且作用时间越早、作用时间越久，cd36+cd235a+红系前体细胞的分化效率越高；而d6-9、d6-12和d9-12晚期的ro8191和as2863619协同作用不能有效地提高cd36+cd235a+红系前体细胞的分化效率；但ro8191和as2863619协同作用均有效地提高了cd71++cd235a+红系前体细胞的诱导效率（见图4a和图4b）。上述结果表明，ro8191和as2863619协同作用促进cd36+cd235a+红系前体细胞的分化的有效时间窗口位于红细胞诱导分化的早期阶段。随后，本实施例对早期更长作用时间窗口进了摸索，第20天的流式分析结果显示，相对于对照组，d0-6、d0-9、d0-12和d0-15处理ro8191和as2863619明显地提高cd36+细胞分化效率（72.74% vs. 87.66%、91.86%、93.9%、94.28%）；但d0-6处理组更多的细胞是表达cd36+cd235a+红系前体细胞，而更长时间处理组cd36+cd235a-红系祖体细胞比例更高（见图4c）。上述结果表明，诱导分化早期及长时间的ro8191和as2863619协同作用更有利于提高红系祖细胞和红系前体细胞的诱导分化。
[0145]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

技术特征：
1.ro8191和/或as2863619在促进红系祖细胞或红系前体细胞分化增殖中的应用。2.一种用于促进造血干细胞或造血祖细胞诱导分化为红系祖细胞或红系前体细胞的基础培养基，其特征在于，所述基础培养基包含ro8191和/或as2863619。3.根据权利要求2所述的基础培养基，其特征在于，所述基础培养基中还包含imdm培养基、its-x、抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、奎诺二甲基丙烯酸酯、bsa。4.根据权利要求3所述的基础培养基，其特征在于，所述基础培养基中各组分的含量分别为：5
ꢀµ
m ro8191、1
ꢀµ
m as2863619、1% its-x、50
ꢀµ
g/ml抗坏血酸、50
ꢀµ
m乙酰半胱氨酸、50
ꢀµ
m奎诺二甲基丙烯酸酯、0.5% bsa。5.一种促进造血干细胞或造血祖细胞诱导分化为红系祖细胞或红系前体细胞的培养体系，其特征在于，所述培养体系包括红细胞特化阶段培养基、红细胞扩增阶段培养基、红细胞成熟阶段培养基；所述红细胞特化阶段培养基包含权利要求2-4中任一项所述的基础培养基、scf、il-3、epo、地塞米松；所述红细胞扩增阶段培养基包含权利要求2-4中任一项所述的基础培养基、scf、il-3、epo、地塞米松；所述红细胞成熟阶段培养基包含权利要求2-4中任一项所述的基础培养基、scf、epo。6.根据权利要求5所述的培养体系，其特征在于，所述红细胞特化阶段培养基中各组分的含量分别为：50 ng/ml scf、10 ng/ml il-3、10 ng/ml epo、1
ꢀµ
m地塞米松；所述红细胞扩增阶段培养基中各组分的含量分别为：50 ng/ml scf、10 ng/ml il-3、10 ng/ml epo、1
ꢀµ
m地塞米松；所述红细胞成熟阶段培养基中各组分的含量分别为：50 ng/ml scf、10 ng/ml epo。7.一种促进造血干细胞或造血祖细胞诱导分化为红系祖细胞或红系前体细胞的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求5或6所述的培养体系对造血干细胞或造血祖细胞进行培养。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1) day0-6，红细胞特化阶段，采用权利要求5或6中所述的红细胞特化阶段培养基培养造血干细胞或造血祖细胞；(2) day6-12，红细胞扩增阶段，采用权利要求5或6中所述的红细胞扩增阶段培养基培养步骤(1)得到的细胞；(3) day12-15，红细胞成熟阶段，采用权利要求5或6中所述的红细胞成熟阶段培养基培养步骤(2)得到的细胞，获得红系祖细胞或红系前体细胞。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在day0-3、day0-6、day0-9、day0-12或day0-15期间所使用的培养基中含有ro8191和as2863619。10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)中细胞密度为1
×
105个/ml；步骤(2)中细胞密度为5
×
105个/ml；步骤(3)中细胞密度为1
×
106个/ml。

技术总结
本发明公开了RO8191和/或AS2863619在促进红系祖细胞或红系前体细胞分化增殖中的应用，本发明首次发现RO8191和AS2863619均能够促进红系祖细胞或红系前体细胞的分化、增殖和长时间维持，并且RO8191和AS2863619两者联合具有协同增效的作用，解决了目前本领域存在的在红细胞诱导分化过程中红系祖细胞和红系前体细胞生成效率低下及无法有效实现红系祖细胞和红系前体细胞扩增的问题，具有良好的应用前景。前景。前景。


技术研发人员：杜如龙 于蕾 武雪宁 黄雯静 张成志 郜华磊 吴理达 顾雨春
受保护的技术使用者：呈诺再生医学科技（北京）有限公司
技术研发日：2023.07.24
技术公布日：2023/8/24