一种重组呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化工艺方法与流程

一种重组呼吸道合胞病毒f蛋白的纯化工艺方法
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种重组呼吸道合胞病毒f蛋白的纯化工艺方法。


背景技术：

2.呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，以下简称rsv）广泛分布于世界各地，是导致婴幼儿、老年人和免疫力低下的成年人急性下呼吸道感染（acute lower respiratory illness, alri）的重要病毒病原，目前中国国内尚无有效的rsv预防性疫苗获批上市，世界卫生组织将rsv疫苗列为当前应优先发展的疫苗之一。
3.rsv感染主要由糖蛋白f 和g 介导，不同亚型间f序列高度保守，以f蛋白作为抗原的疫苗有望激发机体产生更广谱的保护力，因此f 蛋白成为rsv疫苗的最重要候选抗原。为保持f蛋白与天然状态的相似性，尤其是糖基化等翻译后修饰水平的相似性，通常需采用哺乳动物细胞系进行表达。经哺乳动物细胞表达的f蛋白在纯化制备过程存在两方面技术障碍：一方面哺乳动物细胞表达需要较长的培养周期，导致细胞培养上清液中易产生多种蛋白质聚集体，也会释放出宿主蛋白，影响目标蛋白的纯度及均一性；另一方面，f 蛋白构象不稳定，在纯化过程中易存在构象变化、断裂、聚集等现象。用作疫苗的重组蛋白制品，需要较高的纯度和构象均一性来避免杂质导致的毒性或免疫原性异常，因此如何持续稳定的制备出特定构象的、高纯度、且均一的f蛋白存在很大挑战。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供一种重组呼吸道合胞病毒f蛋白的纯化方法，适用于规模化生产，能够得到高纯度、高活性的重组呼吸道合胞病毒f蛋白。
5.本发明的第一个目的是提供了一种重组呼吸道合胞病毒f蛋白的纯化方法，包括如下步骤：s1、采用s/d灭活法对收集的重组呼吸道合胞病毒f蛋白细胞培养澄清液进行灭活，得到灭活液；s2、对灭活液进行阴离子交换层析，得到纯化液1；s3、对纯化液1进行复合弱阳离子层析，得到纯化液2，其中，复合弱阳离子层析的填料配基带有苯环和羧基；s4、对纯化液2进行疏水层析去除聚集体，得到纯化液3；s5、对纯化液3进行过滤去除病毒，得到除病毒过滤液；s6、对除病毒过滤液进行uf/df，得到纯化的重组呼吸道合胞病毒f蛋白。
6.在本发明中，选用带有阴离子的树脂吸附捕获目的蛋白，去除大部分核酸、宿主蛋白及内毒素；再利用带有苯环和羧基的复合弱阳离子交换层析，通过苯环的疏水作用与蛋白高盐结合，去除绝大部分的宿主蛋白及残余的少量核酸；再进一步，采用疏水层析以流穿或结合模式进一步精纯去除聚集体。
7.进一步地，s/d灭活法具体包括以下步骤：将收获的澄清液，添加含有非离子表面活性剂的灭活剂母液，使非离子表面活性剂的质量终浓度为0.3%~0.7%，置于20~26℃，灭活1~2h，得到所述灭活液。
8.进一步地，所述非离子表面活性剂为tritonx-100、聚山梨酯20、聚山梨酯80、泊洛沙姆188中的一种或多种。
9.进一步地，所述的阴离子交换层析中阴离子交换填料为带有-ch2n
+
(ch3)3季铵基功能基团的阴离子交换填料。
10.进一步地，所述的阴离子交换层析具体包括以下步骤：用磷酸缓冲液（pb缓冲液）平衡阴离子交换层析柱至基线平稳；将灭活液调节电导率不高于8.0ms/cm进行上样；上样结束后，用磷酸缓冲液再次平衡层析柱至基线平稳；使用含nacl的磷酸缓冲液洗脱，收集目的蛋白洗脱液，得到所述纯化液1，其中，nacl的浓度不低于0.05m。
11.进一步地，所述阴离子交换层析柱的填料为unigel 80q或q bestarose ff。
12.在本发明中，阴离子交换层析时，8.0ms/cm电导率为目的蛋白可以稳定结合的最高电导率，若高于此电导率，则目的蛋白与层析柱的结合效果较差，电导率过高则无法结合。
13.阴离子交换层析时，nacl的浓度0.05m，为可较好洗脱目的蛋白的最低盐浓度，高于此浓度同样可以洗脱，但低于则无法有效的洗脱。
14.进一步地，所述磷酸缓冲液（pb缓冲液）的浓度为10~30mm。
15.进一步地，所述的复合弱阳离子层析具体包括以下步骤：用磷酸缓冲液平衡层析柱至基线平稳；将纯化液1高盐上样至复合弱阳离子层析柱；上样结束后，用磷酸缓冲液再次平衡层析柱至基线平稳；使用含nacl的磷酸缓冲液洗脱，收集目的蛋白洗脱液，得到所述纯化液2，其中，nacl的浓度不低于0.10m。
16.在本发明中，复合弱阳离子层析时，nacl的浓度0.10m，为可较好洗脱目的蛋白的最低盐浓度，高于此浓度同样可以洗脱，但低于则无法有效的洗脱。
17.进一步地，所述的复合弱阳离子层析中填料为带有苯环和羧基的复合弱阳离子交换填料。
18.进一步地，所述复合弱阳离子层析柱的填料为diamond mmc mustang或capto mmc impres。
19.在本发明中，通过填料配基上的苯环可做到常规离子交换做不到的高盐上样，因此，上一步样品无需任何处理，可直接高盐上样。
20.进一步地，所述的疏水层析包括以下步骤中的一种：使用含nacl的磷酸缓冲液平衡层析柱至基线平稳，其中，nacl的浓度不高于0.55m；将纯化液2调节电导率至不高于55.0ms/cm，上样至疏水层析柱，再以流穿模式收集流穿液，得到所述纯化液3；或，使用含nacl的磷酸缓冲液平衡层析柱至基线平稳，其中，nacl的浓度不低于0.55m；将纯化液2调节电导率至不低于55.0ms/cm，上样至疏水层析柱，上样结束后，使用含nacl的磷酸缓冲液平衡层析柱至基线平稳，其中，nacl的浓度不高于0.50m；使用磷酸缓冲液洗脱，收集目的蛋白洗脱液，得到所述纯化液3。
21.在本发明中，两种疏水层析模式都是为了去除聚集体，第一种为流穿模式，优点在于可处理的载量相对更高，nacl的浓度调节也较温和，0.5m，且回收率远优于结合模式；但结合-洗脱模式同样可以达到效果，只是需要补盐浓度过高，操作相对复杂一些。
22.进一步地，所述的疏水层析中疏水填料为带有苯基的疏水填料。
23.在本发明中，疏水层析中的填料带有苯基，起到较强的疏水作用，而在复合弱阳离子层析中的填料带有的苯环，能够起到一定的疏水作用，主要还是为了满足高盐上样的作用。
24.进一步地，所述疏水层析柱的填料为diamond phenyl mustang或monomix mc-hic phenyl。
25.进一步地，所述的除病毒过滤的具体过程如下：将纯化液3依次进行经过sartopore 2型囊氏滤器k7预过滤和virosart hf除病毒过滤。
26.进一步地，所述的uf/df的具体包括以下步骤：采用30kda~50kda超滤膜包对除病毒过滤后抗原进行超滤换液，换液倍数≥ 4，获得纯化的重组呼吸道合胞病毒f蛋白。
27.进一步地，所述重组呼吸道合胞病毒f蛋白细胞培养澄清液是通过在cho细胞、293细胞或昆虫杆状病毒中表达重组呼吸道合胞病毒f蛋白后收集的细胞培养澄清液。
28.本发明的第二个目的是提供所述纯化方法制备得到的重组呼吸道合胞病毒f蛋白产品。
29.借由上述方案，本发明至少具有以下优点：采用本发明所述方法，可以将cho细胞表达的重组呼吸道合胞病毒f蛋白有效的分离纯化，经纯化后，sec-hplc综合纯度大于98.5%，rp-hplc综合纯度大于99.0%，hcp小于100ppm，sds-page电泳条带清晰且单一，方法简便，重复性好，适用于规模化生产，同时能有效地用于生产呼吸道合胞病毒重组蛋白疫苗。
30.上述说明仅是本发明技术方案和部分结果的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如下。
附图说明
31.图1：cho细胞表达的重组呼吸道合胞病毒f蛋白阴离子层析填料筛选电泳检测图谱，由左至右泳道依次为，m：蛋白marker指示剂，1：阴离子层析捕获前样品，2：捕获流穿液，3~5：不同的峰收集；图2：cho细胞表达的重组呼吸道合胞病毒f蛋白阳离子层析填料筛选电泳检测图谱，由左至右泳道依次为，m：蛋白marker指示剂，1：阳离子层析捕获前样品，2~3：捕获流穿液，4~8：不同的峰收集；图3：cho细胞表达的重组呼吸道合胞病毒f蛋白疏水层析填料筛选电泳检测图谱，由左至右泳道依次为，m：蛋白marker指示剂，1：疏水层析预处理前样品，2：疏水层析预处理后样品，3：空白，4：收集流穿液；图4：cho细胞表达的重组呼吸道合胞病毒f蛋白复合弱阳离子层析填料筛选电泳检测图谱，由左至右泳道依次为，m：蛋白marker指示剂，1：复合弱阳离子层析捕获前样品，
2：捕获流穿液，3~6：不同的峰收集；图5：cho细胞表达的重组呼吸道合胞病毒f蛋白羟基磷灰石层析填料筛选电泳检测图谱，由左至右泳道依次为，m：蛋白marker指示剂，1：羟基磷灰石层析捕获前样品，2~4：不同的峰收集；图6：cho细胞表达的重组呼吸道合胞病毒f蛋白低ph调节电泳检测图谱，由左至右为不同的ph样品, m：蛋白marker指示剂；图7：cho细胞表达的重组呼吸道合胞病毒f蛋白s/d灭活电泳检测图谱，1：s/d灭活后样品, m：蛋白marker指示剂；图8：实施例1中重组呼吸道合胞病毒f蛋白完整纯化流程电泳检测图谱，由左至右泳道依次为，1：阴离子层析捕获前样品，m：蛋白marker指示剂， 2：阴离子层析捕获流穿液，3：阴离子层析捕获峰收集，4-5：复合弱阳离子层析捕获峰收集，6：疏水层析流穿液，7：最终重组呼吸道合胞病毒f蛋白；图9：实施例1中最终重组呼吸道合胞病毒f蛋白高效液相（分子排阻法）检测图谱。
具体实施方式
32.本发明公开了重组呼吸道合胞病毒f蛋白的纯化方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
33.在本发明中，重组呼吸道合胞病毒f蛋白为表达后能够形成三聚体结构并维持在较稳定的融合前体状态的重组呼吸道合胞病毒f蛋白。
34.本技术的重组呼吸道合胞病毒f蛋白的纯化方法，包括如下步骤：（1）灭活，采用s/d灭活法对澄清液进行病毒灭活。
35.母液配制：在10~30mm 磷酸缓冲液加入tritonx-100使终浓度为8%~12%（ph6.8~7.5），即为灭活剂母液；灭活：向澄清液中加入灭活剂母液，使tritonx-100终浓度为0.3%~0.7%，混匀后，置于20~26℃（室温），灭活1~2h，即为灭活液。
36.（2）阴离子柱层析层析填料名称：选用带有-ch2n+(ch3)3季铵基团的阴离子交换填料，如unigel 80q, q bestarose ff等：柱平衡：用10~30mm 磷酸缓冲液（ph6.8~7.5）平衡5~10个柱体积；上样：将灭活液，使用10~30mm 磷酸缓冲液（ph6.8~7.5）调节电导率至不高于8.0ms/cm后进行上样；复平衡：上样结束后，用10~30mm 磷酸缓冲液（ph6.8~7.5）复平衡5~8个柱体积；洗脱：用含有不低于0.15m nacl的10~30mm 磷酸缓冲液（ph6.8~7.5）洗脱，uv280达到100~200mau开始收集洗脱峰，至uv280下降至300~200mau停止收峰；灭活液经阴离子层析柱纯化，目的蛋白以结合、洗脱模式收集，第一步捕获，纯度达到75%以上。
37.（3）复合弱阳离子层析层析填料名称：选用带有苯环和羧基的复合弱阳离子交换填料，如diamond mmc mustang，capto mmc impres等；柱平衡：用10~30mm 磷酸缓冲液（ph6.8~7.5）平衡8~10个柱体积；上样：将第一步柱纯化液，使用10~30mm 磷酸缓冲液（ph6.8~7.5）调节电导率至不高于15.0ms/cm后进行上样，若电导率低于15.0ms/cm，则无需调节；复平衡：上样结束后，用10~30mm 磷酸缓冲液（ph6.8~7.5）复平衡5~8个柱体积；洗脱：用含有不低于0.20m nacl的10~30mm 磷酸缓冲液（ph6.8~7.5）洗脱，uv280达到100~200mau开始收集洗脱峰，至uv280下降至200~300mau停止收峰；第一步柱纯化液经第二步柱纯化，目的蛋白以结合、洗脱模式收集，第二步中度纯化，纯度达到85%以上。
38.（4）疏水层析（流穿模式）层析填料名称：选用带有phenyl苯基的疏水填料，如diamond phenyl mustang，monomix mc-hic phenyl等；柱平衡：使用含有400mm~550mm nacl的10~30mm 磷酸缓冲液（ph6.8~7.5）平衡8~10个柱体积；上样：将第二步柱纯化液，使用含有4000mm~5000mm nacl的10~30mm 磷酸缓冲液（ph6.8~7.5），调节电导率至40.0ms/cm~55.0ms/cm后上样，uv280达到100~200mau开始收集流穿峰；复平衡：上样结束后，使用含有400mm~550mm nacl的10~30mm 磷酸缓冲液（ph6.8~7.5）复平衡8~10个柱体积，uv280下降至100~300mau停止收集流穿峰；第二步柱纯化液经第三步柱纯化，聚集体蛋白与填料结合，目的蛋白以流穿模式收集，第三步精纯，纯度达到98%以上。
39.（5）除病毒过滤，将纯化液3，依次进行预过滤和除病毒过滤滤膜清洗：无菌水冲洗5~8个膜体积；滤膜润洗：制剂缓冲液润洗3~5个膜体积；使用sartopore 2型囊氏滤器k7预过滤；使用virosart hf除病毒过滤；除病毒过滤后样品，即为除病毒过滤液。
40.（6）uf/df超滤膜包为30kd~50kd超滤膜包（consieve uet pes-fl 0.11m2）；膜包清洗：用纯化水清洗10~15个膜体积，再用0.5m naoh清洗3~5个膜体积，循化不小于20分钟；最后用纯化水清洗10~15个膜体积；膜包润洗：用10~30mm 磷酸缓冲液（ph6.8~7.5）润洗8~10个膜体积；第三步纯化液用30kd~50kd超滤膜包，按照feed flow: 2l/m2/min~ 8 l/m2/ min，tmp: 0.5bar ~ 1.2bar，膜包载量≤ 124 g/m
²
，换液倍数≥ 4，换液至柠檬酸/柠檬酸钠，蔗糖配制的缓冲液；最终原液：换液后添加带有ps80的辅料母液，最终将除病毒过滤液换液至含有柠檬酸/柠檬酸钠，蔗糖及ps80的制剂缓冲液中；
经换液后，纯度保持在98%以上。
41.以下实施例中的重组呼吸道合胞病毒rsv-f蛋白是以申请号为202310866915x的申请中的呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体为例。
42.下面结合实施例，进一步阐述本发明。
43.实施例1：重组呼吸道合胞病毒rsv-f蛋白的纯化工艺
44.采用cho细胞表达的重组呼吸道合胞病毒rsv-f蛋白的生产收获物（细胞收获液，初始纯度小于70%，后称为澄清液），用于重组蛋白的分离纯化，具体步骤如下：（1）灭活，采用s/d灭活法对澄清液进行病毒灭活。
45.母液配制：在20mm 磷酸缓冲液加入tritonx-100使终浓度为10%（ph7.0），即为灭活剂母液；灭活：向澄清液中加入灭活剂母液，使tritonx-100终浓度为0.5%，混匀后，置于26℃（室温），灭活1h，即为灭活液。
46.（2）阴离子柱层析层析填料名称：unigel 80q；柱平衡：用20mm 磷酸缓冲液（ph7.0）平衡6个柱体积；上样：将灭活液，使用20mm 磷酸缓冲液（ph7.0）调节电导率至7.5ms/cm后进行上样；复平衡：上样结束后，用20mm 磷酸缓冲液（ph7.0）复平衡6个柱体积；洗脱：用含有150mm nacl的20mm 磷酸缓冲液（ph7.0）洗脱，uv280达到100mau开始收集洗脱峰，至uv280下降至200mau停止收峰；灭活液经阴离子层析柱纯化，目的蛋白以结合、洗脱模式收集，第一步捕获，纯度达到75%以上，阴离子柱层析样品电泳图谱见图1，电泳图谱显示，重组呼吸道合胞病毒f蛋白捕获明显，阴离子层析适用于重组呼吸道合胞病毒f蛋白的纯化。
47.（3）复合弱阳离子层析层析填料名称： diamond mmc mustang；柱平衡：用20mm 磷酸缓冲液（ph7.0）平衡5个柱体积；上样：将第一步阴离子柱纯化液，使用20mm 磷酸缓冲液（ph7.0）调节电导率至15.0ms/cm后进行上样；复平衡：上样结束后，用20mm 磷酸缓冲液（ph7.0）复平衡5个柱体积；洗脱：用含有200mm nacl的20mm 磷酸缓冲液（ph7.0）洗脱，uv280达到100mau开始收集洗脱峰，至uv280下降至200mau停止收峰；第一步柱纯化液经第二步柱纯化，目的蛋白以结合、洗脱模式收集，第二步中度纯化，纯度达到85%以上，复合弱阳离子柱层析样品电泳图谱见图4，hcp含量检测见表1。
48.（4）疏水层析（流穿模式）层析填料名称： diamond phenyl mustang；柱平衡：使用含有500mm nacl的20mm 磷酸缓冲液（ph7.0）平衡6个柱体积；上样：将第二步柱纯化液，使用含有5000mm nacl的20mm 磷酸缓冲液（ph7.0），调节电导率至50.0ms/cm后上样，uv280达到100mau开始收集流穿峰；复平衡：上样结束后，用20mm 磷酸缓冲液（ph7.0）复平衡6个柱体积，uv280下降至
200mau停止收集流穿峰；第二步柱纯化液经第三步柱纯化，聚集体蛋白与填料结合，目的蛋白以流穿模式收集，第三步精纯，纯度达到98%以上，疏水柱层析样品电泳图谱见图3，是聚集体蛋白和杂质去除的关键有效步骤。
49.（5）除病毒过滤，将纯化液3，依次进行预过滤和除病毒过滤滤膜清洗：无菌水冲洗5个膜体积；滤膜润洗：制剂缓冲液润洗4个膜体积；使用sartopore 2型囊氏滤器k7预过滤；使用virosart hf除病毒过滤；除病毒过滤后样品，即为除病毒过滤液。
50.（6）uf/df超滤膜包为50kd超滤膜包（consieve uet pes-fl 0.11m2）；膜包清洗：用纯化水清洗10个膜体积，再用0.5m naoh清洗5个膜体积，循化不小于20分钟；最后用纯化水清洗15个膜体积；膜包润洗：用20mm 磷酸缓冲液（ph7.0）润洗10个膜体积；第三步纯化液用50kd超滤膜包，按照feed flow:5 l/m2/ min，tmp: 0.9bar，膜包载量≤ 100 g/m
²
，换液倍数6倍，换液至柠檬酸/柠檬酸钠，蔗糖配制的缓冲液；最终原液：换液后添加带有ps80的辅料母液，最终将除病毒过滤液换液至含有柠檬酸/柠檬酸钠，蔗糖及ps80的制剂缓冲液中；经换液后，纯度保持在98%以上。
51.在本实施例中，8l细胞收获可获得高纯度蛋白达到3516mg。
52.在本发明中，采用sec-hplc检测蛋白纯度，检测方法为：使用nanochrom biocore sec-300 (5μm，300a
̊
，7.8
×
300mm)色谱柱，在岛津lc-20a系统上进行，流动相为20mm pb+300mm nacl，流速为0.5ml/min，等度洗脱，并通过紫外波长280nm进行检测，将峰面积的百分比用于定量纯度。
53.sec-hplc通过蛋白的分子大小区分，如有聚集体或小分子碎片，会根据分子量的不同体现不同的吸收峰；而rp-hplc则通过疏水性区分，由于有机相的存在，目的蛋白产生了一些未知的变性，导致rp-hplc方法不能反映目的蛋的真实结构，从而使通过该方法进行的纯度检测，聚集体部分无法与正常状态蛋白进行有效区分，导致rp-hplc的纯度偏高；因此，聚集状态不同时sec-hplc可以较好区分，而rp-hplc则不能，针对于容易聚集的蛋白，sec-hplc测得的纯度更易说明蛋白的均一性。
54.纯化终产物经分子体积排阻法sec-hplc检测，纯度大于98%（检测图谱为图9），各关键步骤中间品的纯度及hcp含量如表1，最终蛋白hcp含量88.73 ppm。
55.表1纯化过程关键步骤收率、中间品的纯度及hcp含量
56.本实施例得到的cho细胞表达的重组呼吸道合胞病毒f蛋白纯度高，均一性好，宿主蛋白残留量极低，远低于小于500ppm的要求，可用于制备呼吸道合胞病毒重组蛋白疫苗。
57.对比例1：阳离子层析柱
58.将实施例1中阴离子层析柱替换为阳离子层析柱进行层析，其他步骤与实施例1一致。采用nanogel 50 sp填料举例，重组呼吸道合胞病毒f蛋白需在较低ph条件下与阳离子层析柱结合，用20mm hcit-nacit缓冲液（ph5.0）平衡填料；取实施例1制得的灭活液，20%hac调节样品ph至5.0，使用20mm hcit-nacit（ph5.0）调节电导率至7.5ms/cm后进行上样；上样结束后，用20mm hcit-nacit缓冲液（ph5.0）复平衡；用含有150mm nacl的20mm hcit-nacit缓冲液（ph5.0）洗脱，收集洗脱峰后取样；阳离子柱层析样品电泳图谱见图2，电泳图谱显示，重组呼吸道合胞病毒f蛋白有明显的断裂情况，阳离子层析不适合重组呼吸道合胞病毒f蛋白的纯化，所述阳离子包含强阳离子层析填料、弱阳离子层析填料。
59.对比例2：羟基磷灰石层析柱在重组呼吸道合胞病毒f蛋白纯化中的应用
60.将实施例1中复合弱阳离子层析替换为羟基磷灰石层析柱进行层析，其他步骤与实施例1一致。采用biorad cht type ii填料举例，用含50mm nacl的10mm 磷酸缓冲液（ph 7.0）平衡层析柱至基线平稳；将实施例1中第一步阴离子层析柱纯化液，调节至50mm nacl，10mm pb（ph 7.0）后进行上样，使其与羟基磷灰石填料相互作用；上样结束后，含50mm nacl的10mm 磷酸缓冲液（ph 7.0），再次平衡层析柱至基线平稳；使用含200mm nacl的10mm 磷酸缓冲液（ph 7.0）或含50mm nacl的40mm 磷酸缓冲液（ph 7.0）的缓冲液洗脱，收集洗脱峰后取样，羟基磷灰石柱层析样品电泳图谱见图5，羟基磷灰石层析也达到了较好的hcp去除效果，但此步骤需要低盐浓度及低磷酸缓冲液浓度上样，对于样品的稀释需求较大，且在低盐浓度或低磷酸缓冲液浓度条件下，样品与对应抗体结合下降，聚体增加。
61.实施例2：重组呼吸道合胞病毒f蛋白的灭活工艺对比
62.低ph灭活选用低ph灭活的方式对实施例1中的澄清液进行灭活，取实施例1中的澄清液，逐渐调节ph至3.0，室温放置3h后，调节ph至7.0，将调节低ph过程的中间样品进行连续取样，电泳图谱见图6，在调节低ph的过程中，目的蛋白发生了断裂的情况。
63.s/d灭活选用s/d灭活的方式对实施例1中的澄清液进行灭活，灭活母液配制：在20mm 磷酸缓冲液加入tritonx-100使终浓度为10%（ph7.0），即为灭活剂母液；灭活：取实施例1中的澄清液，加入灭活剂母液，使tritonx-100终浓度为0.5%，混匀后，置于室温，灭活1h，取最终经过灭活后的样品，即为灭活液，取样电泳图谱见图7，s/d灭活的样品电泳结果未出现明显断裂。
64.低ph灭活法和s/d灭活法都被广泛应用于灭活实验，两种方法相比，s/d灭活对于重组呼吸道合胞病毒f蛋白抗原没有过大影响，因此，选择s/d灭活作为重组呼吸道合胞病毒f蛋白的灭活工艺。
65.以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种重组呼吸道合胞病毒f蛋白的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、采用s/d灭活法对收集的重组呼吸道合胞病毒f蛋白细胞培养澄清液进行灭活，得到灭活液；s2、对灭活液进行阴离子交换层析，得到纯化液1；s3、对纯化液1进行复合弱阳离子层析，得到纯化液2，其中，复合弱阳离子层析的填料配基带有苯环和羧基；s4、对纯化液2进行疏水层析去除聚集体，得到纯化液3；s5、对纯化液3进行过滤去除病毒，得到除病毒过滤液；s6、对除病毒过滤液进行uf/df，得到纯化的重组呼吸道合胞病毒f蛋白。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，s/d灭活法具体包括以下步骤：将收获的澄清液，添加含有非离子表面活性剂的灭活剂母液，使非离子表面活性剂的质量终浓度为0.3%~0.7%，置于20~26℃，灭活1~2h，得到所述灭活液。3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的阴离子交换层析中阴离子交换填料为带有季铵基功能基团的阴离子交换填料。4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的阴离子交换层析具体包括以下步骤：用磷酸缓冲液平衡阴离子交换层析柱至基线平稳；将灭活液调节电导率至不高于8.0ms/cm进行上样；上样结束后，用磷酸缓冲液再次平衡层析柱至基线平稳；使用含nacl的磷酸缓冲液洗脱，收集目的蛋白洗脱液，得到所述纯化液1，其中，nacl的浓度不低于0.05m。5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的复合弱阳离子层析具体包括以下步骤：用磷酸缓冲液平衡层析柱至基线平稳；将纯化液1上样至复合弱阳离子层析柱；上样结束后，用磷酸缓冲液再次平衡层析柱至基线平稳；使用含nacl的磷酸缓冲液洗脱，收集目的蛋白洗脱液，得到所述纯化液2，其中，nacl的浓度不低于0.10m。6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的疏水层析包括以下步骤中的一种：使用含nacl的磷酸缓冲液平衡层析柱至基线平稳，其中，nacl的浓度不高于0.55m；将纯化液2调节电导率至不高于55.0ms/cm，上样至疏水层析柱，再以流穿模式收集流穿液，得到所述纯化液3；或，使用含nacl的磷酸缓冲液平衡层析柱至基线平稳，其中，nacl的浓度不低于0.55m；将纯化液2调节电导率至不低于55.0ms/cm，上样至疏水层析柱，上样结束后，使用含nacl的磷酸缓冲液平衡层析柱至基线平稳，其中，nacl的浓度不高于0.50m；使用磷酸缓冲液洗脱，收集目的蛋白洗脱液，得到所述纯化液3。7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的除病毒过滤的具体过程如下：将纯化液3依次进行经过预过滤和除病毒过滤。8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的uf/df的具体包括以下步骤：采用30kda~50kda超滤膜包对除病毒过滤后抗原进行超滤换液，换液倍数≥ 4，获得纯化的重组呼吸道合胞病毒f蛋白。9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述重组呼吸道合胞病毒f蛋白细胞
培养澄清液是通过在cho细胞、293细胞或昆虫杆状病毒中表达重组呼吸道合胞病毒f蛋白后收集的细胞培养澄清液。10.一种权利要求1~9任一项所述纯化方法制备得到的重组呼吸道合胞病毒f蛋白产品。

技术总结
本发明涉及生物医药领域，公开了一种重组呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化工艺方法。采用本发明所述方法，可将重组表达的呼吸道合胞病毒F蛋白高效的分离及纯化，方法简单，重复性好，所获的目的蛋白纯度可高达99.0%，可以有效地应用于规模化生产以F蛋白为抗原的呼吸道合胞病毒重组蛋白疫苗。病毒重组蛋白疫苗。病毒重组蛋白疫苗。


技术研发人员：陈磊 吴超 宋玉姣 华玉娟 顾苏芳 徐加浩 王聪 陈莉 黄佳笛 李安康 李沛哲 王洋洋 丁晓雅 戴敏
受保护的技术使用者：易康生物（苏州）有限公司
技术研发日：2023.07.21
技术公布日：2023/8/24