一种用于检测四种蔬菜病毒的RT-PCR试剂盒及应用

一种用于检测四种蔬菜病毒的rt-pcr试剂盒及应用
技术领域
1.本发明涉及一种用于检测四种蔬菜病毒的rt-pcr试剂盒及应用，属于植物病毒检测技术领域。


背景技术：

2.2011年以来，蔬菜产量和产值均超过粮食作物。蔬菜种植规模的扩大，以及大棚种植的发展，使病毒病的发生逐渐增多，蔬菜病毒病逐渐成为蔬菜生产的第一大病害，病毒病每年对蔬菜产业造成巨大损失。
3.植物病毒病已成为制约我国植物产业稳定发展的重要病害。通过对主要病毒性植物病害应用绿色防治技术，农药使用量可减少50%，消除田间杂草和有毒植物残留，培育无毒幼苗，控制害虫等方式可以有效控制植物病毒病（史晓斌等, 2020）。蔬菜病毒病的田间识别特征主要为:叶片有明脉、花叶、坏死斑点等症状；果实上出现坏死斑点；植株出现矮化畸形（易图永, 2015）。
4.目前，我国种植的蔬菜品种很多。在2019年由中国农业科学院牵头完成的蔬菜病毒调查中，茄科、葫芦科、十字花科和豆科蔬菜共检出病毒63种。全国蔬菜病毒普查显示，黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，cmv）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，tmv）、马铃薯y病毒（potato virus y，pvy）、马铃薯s病毒（potato virus s，pvs）、蚕豆萎蔫病毒（broad bean wiltvirus-2，bbwv-2）、芜菁花叶病毒（trunip mosaic virus，tumv）等病毒的寄主范围很广，能够侵染包括茄科、葫芦科、豆科、十字花科等科蔬菜。其中bbwv-2、tumv、cmv、tmv为检出率较高的优势病毒，并且以上4种病毒在全国各地几乎均有检出。zymv病毒检出率也相对较高，但其地域分布不及bbwv-2、tumv、cmv、tmv等4种病毒广泛（刘勇等, 2019）。在所有蔬菜作物中，cmv已超过tmv成为主要优势病毒，全国检出率最高，在多种植物中检出率最高，其次是tmv、tumv和bbwv-2等多种病毒（刘勇等, 2019）。


技术实现要素：

5.本发明针对上述问题，提供了一种用于检测四种蔬菜病毒的rt-pcr试剂盒及应用。本发明的试剂盒可以实现同时检测黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，cmv）、蚕豆萎蔫病毒（broadbean wilt virus-2，bbwv-2）、芜菁花叶病毒（trunip mosaic virus，tumv）、小西葫芦黄化花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus，zymv）这四种侵染蔬菜的病毒，本发明提供了一种新的、同时鉴别多种蔬菜病毒的快速检测手段。本发明的技术方案如下：一种用于检测四种蔬菜病毒的rt-pcr试剂盒，所述rt-pcr试剂盒包含四对引物：zymv-d-f，如seq id no.1所示；zymv-d-r，如seq id no.2所示；tumv-d-f，如seq id no.3所示；tumv-d-r，如seq id no.4所示；
bbwv-2-d-f，如seq id no.5所示；bbwv-2-d-r，如seq id no.6所示；cmv-d-f，如seq id no.7所示；cmv-d-r， 如seq id no.8所示；所述四种蔬菜病毒分别为zymv、tumv、bbwv-2和cmv。
6.优选的，所述引物可以独立包装或正向引物、反向引物分别混装。
7.进一步的，所述rt-pcr试剂盒中还包含：2xpcr mix和ddh2o。
8.进一步的，所述rt-pcr试剂盒为多重rt-pcr试剂盒，优选的，所述多重rt-pcr试剂盒包含分别混装的正向引物、反向引物；其中，zymv-d-f、tumv-d-f、bbwv-2-d-f、cmv-d-f正向引物的配比为5：15：4：3；zymv-d-r、tumv-d-r、bbwv-2-d-r、cmv-d-r反向引物的配比为5：15：4：3。
9.本发明还提供了一种同时检测四种蔬菜病毒的方法，包括如下步骤：（1）提取待测样品的总rna，反转录获得样品cdna；（2）采用上述rt-pcr试剂盒中的四对引物，以样品cdna为模板进行多重pcr反应，获得扩增产物；（3）对扩增产物进行电泳检测，若扩增产物中出现738bp大小的条带，则样品中含有zymv；若扩增产物中出现388bp大小的条带，则样品中含有tumv；若扩增产物中出现533bp大小的条带，则样品中含有bbwv-2；若扩增产物中出现964bp大小的条带，则样品中含有cmv。
10.优选的，步骤（2）中，多重pcr反应的反应体系为20
µ
l，包含：模板2
µ
l、混合后正向引物（f）1
µ
l、混合后反向引物（r）1
µ
l、2 x pcr mix10
µ
l、ddh2o4
µ
l。
11.优选的，步骤（2）中，多重pcr反应的条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
12.本发明的有益效果：（1）本发明的rt-pcr试剂盒能同时检测zymv、tumv、bbwv-2和cmv四种病毒，该rt-pcr试剂盒种包含四对特异性引物，能够分别特异性结合四种病毒的rna反转录成的cdna，准确检测待测植株是否感染这四种病毒之一、之二、之三或全部。
13.（2）本发明还提供了能同时检测zymv、tumv、bbwv-2和cmv四种病毒的检测方法，所述检测方法快速、简便、经济、稳定，只需提取待测植株的总rna，反转录获得cdna，然后采用本发明提供的引物组合，以cdna为模板进行pcr反应，最后利用电泳检测pcr产物，根据产物大小，即可判断待测植株是否感染这四种病毒，操作简便易行，一份样品只需一次pcr即可对四种病毒进行检测，减少了操作次数，避免了交叉感染，同时还减少了试剂、引物、模板、及耗材等的使用量，节约了时间，达到了简便、经济、快速和准确的检测要求，可以用于蔬菜病毒的快速筛查等。
附图说明
14.图1为通过多重rt-pcr对样品中蔬菜病毒病种类检测结果图；图2为通过单重rt-pcr对样品中蔬菜病毒病种类检测结果图；图3为实施例1、对比例1和对比例2针对大白菜样品中蔬菜病毒病种类检测结果
图；图4为实施例1、对比例3针对大白菜样品中蔬菜病毒病种类检测结果图。
具体实施方式
15.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
16.本发明中，从青岛周边蔬菜大棚及田间发病的植物采集样本，主要采集具有褪绿黄化、叶面卷曲等症状的植物样本，其中各样品田间症状有花叶、斑驳、皱缩、畸形、矮化等；然后分别提取植物的总rna，置于-80℃备用。
17.实施例1：一种同时检测四种蔬菜病毒的方法用于检测四种蔬菜病毒的rt-pcr试剂盒，所述rt-pcr试剂盒包含四对引物：zymv-d-f，如seq id no.1所示；zymv-d-r，如seq id no.2所示；tumv-d-f，如seq id no.3所示；tumv-d-r，如seq id no.4所示；bbwv-2-d-f，如seq id no.5所示；bbwv-2-d-r，如seq id no.6所示；cmv-d-f，如seq id no.7所示；cmv-d-r， 如seq id no.8所示；所述rt-pcr试剂盒中还包含：2xpcr mix和ddh2o。
18.rt-pcr试剂盒中包含分别混装的正向引物和反向引物；其中，zymv-d-f、tumv-d-f、bbwv-2-d-f、cmv-d-f正向引物的配比为5：15：4：3；zymv-d-r、tumv-d-r、bbwv-2-d-r、cmv-d-r正向引物的配比为5：15：4：3。
19.rt反应体系（25.0
µ
l）：植物总rna：5.0
µ
l，10mm dntp：2.0
µ
l，混合后反向引物（r）：5.0
µ
l，80℃孵育3 min，冰上2 min；m-mlv：0.5
µ
l，5
×
mlv buffer：5.0
µ
l，rri：0.5
µ
l，剩余用ddh2o（rnase free）补足；42℃，90min。
20.pcr体系（20.0
µ
l）：rt产物，2.0
µ
l，混合后正向引物，1.0
µ
l，混合后反向引物，1.0
µ
l，2
×ꢀ
pcr mix，10
µ
l，dd h2o，4.0
µ
l。反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
21.应用例：使用所采样本进行多重rt-pcr检验，样品一到十分别是菠菜、芥菜1、芥菜2、萝卜1、萝卜2、大白菜、小青菜、芹菜、萝卜3、莴苣、西瓜和黄瓜。结果如图1和图2所示，通过多重rt-pcr对样品中蔬菜病毒病种类检测结果（图1）与通过单重rt-pcr对样品中蔬菜病毒病种类检测结果（图2）一致。样品一在964 bp处检测到条带，有病毒cmv；样品二在388 bp处检测到条带，有病毒tumv存在；样品三在964 bp和388 bp处检测到条带，有病毒cmv和tumv存在；样品四在964 bp、738 bp、533 bp和388 bp处检测到条带，有病毒cmv、zymv、bbwv-2和tumv存在；样品五在964 bp和533 bp处检测到条带，有病毒cmv和bbwv-2存在；样品六在964 bp、
738 bp、533 bp和388 bp处检测到条带，有病毒cmv、zymv、bbwv-2和tumv存在；样品七在964 bp、738 bp和388 bp处检测到条带，有病毒cmv、zymv和tumv存在；样品八在738 bp和533 bp处检测到条带，有病毒zymv和bbwv-2存在；样品九在964 bp和388 bp处检测到条带，有病毒cmv和tumv存在；样品十在533 bp处检测到条带，有病毒bbwv-2存在；样品十一在964 bp和7 38 bp处检测到条带，有病毒cmv和zymv存在；样品十二在964 bp处检测到条带，有病毒cmv存在。该多重rt-pcr检测体系可应用于田间样品的检测。
22.对比例1：zymv-d-f、tumv-d-f、bbwv-2-d-f、cmv-d-f引物的配比为5：15：4：2，其它与实施例1相同。
23.对比例2：zymv-d-f、tumv-d-f、bbwv-2-d-f、cmv-d-f引物的配比为5：15：3：3，其它与实施例1相同。
24.检查样品：大白菜检查方法：（1）提取待大白菜测样品的总rna，反转录获得样品cdna；（2）采用rt-pcr试剂盒中的四对引物，以样品cdna为模板进行多重pcr反应，获得扩增产物；多重pcr反应的反应体系为20
µ
l，包含：模板2
µ
l、混合后正向引物（f）1
µ
l、混合后反向引物（r）1
µ
l、2 x pcr mix10
µ
l、ddh2o4
µ
l；多重pcr反应的条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
25.（3）对扩增产物进行电泳检测，检测结果如图3所示，其中，泳道1中zymv-d-f、tumv-d-f、bbwv-2-d-f、cmv-d-f引物的配比为5：15：4：2（对比例1）；泳道2中zymv-d-f、tumv-d-f、bbwv-2-d-f、cmv-d-f引物的配比为5：15：4：3（实施例1）；泳道3中zymv-d-f、tumv-d-f、bbwv-2-d-f、cmv-d-f引物的配比为5：15：3：3（对比例2）。结果显示，zymv-d-f、tumv-d-f、bbwv-2-d-f、cmv-d-f引物的配比为5：15：4：3时，引物特异性最好，检测待测植株更准确。
26.对比例3：退火温度为57℃，其它部分与实施例1相同，检测结果如图4所示，结果显示，退火温度为55℃，检测效果最好，四条带可以同时清晰显示。57℃时检测引物无法同时检测到4种病毒，其中tumv的条带几乎无法看到。因此，退火温度为55℃时，针对样品中的病毒具有非常明显的特异性。

技术特征：
1.一种用于检测四种蔬菜病毒的rt-pcr试剂盒，其特征在于，所述rt-pcr试剂盒包含四对引物：zymv-d-f，如seq id no.1所示；zymv-d-r，如seq id no.2所示；tumv-d-f，如seq id no.3所示；tumv-d-r，如seq id no.4所示；bbwv-2-d-f，如seq id no.5所示；bbwv-2-d-r，如seq id no.6所示；cmv-d-f，如seq id no.7所示；cmv-d-r， 如seq id no.8所示；所述四种蔬菜病毒分别为zymv、tumv、bbwv-2和cmv。2.根据权利要求1所述的用于检测四种蔬菜病毒的rt-pcr试剂盒，其特征在于，所述引物可以独立包装或正向引物、反向引物分别混装。3. 根据权利要求1所述的用于检测四种蔬菜病毒的rt-pcr试剂盒，其特征在于，所述rt-pcr试剂盒中还包含：2xpcr mix和ddh2o。4.根据权利要求1所述的用于检测四种蔬菜病毒的rt-pcr试剂盒，其特征在于，所述rt-pcr试剂盒为多重rt-pcr试剂盒。5.根据权利要求4所述的用于检测四种蔬菜病毒的rt-pcr试剂盒，其特征在于，所述多重rt-pcr试剂盒包含分别混装的正向引物和反向引物；其中，zymv-d-f、tumv-d-f、bbwv-2-d-f、cmv-d-f正向引物的配比为5：15：4：3；zymv-d-r、tumv-d-r、bbwv-2-d-r、cmv-d-r反向引物的配比为5：15：4：3。6.一种同时检测四种蔬菜病毒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）提取待测样品的总rna，反转录获得样品cdna；（2）采用如权利要求1-5任一项所述rt-pcr试剂盒中的四对引物，以样品cdna为模板进行多重pcr反应，获得扩增产物；（3）对扩增产物进行电泳检测，若扩增产物中出现738bp大小的条带，则样品中含有zymv；若扩增产物中出现388bp大小的条带，则样品中含有tumv；若扩增产物中出现533bp大小的条带，则样品中含有bbwv-2；若扩增产物中出现964bp大小的条带，则样品中含有cmv。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，多重pcr反应的反应体系为20
µ
l，包含：模板2
µ
l、混合后正向引物（f）1
µ
l、混合后反向引物（r）1
µ
l、2 x pcr mix10
µ
l、ddh2o4
µ
l。8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，多重pcr反应的条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

技术总结
本发明涉及一种用于检测四种蔬菜病毒的RT-PCR试剂盒及应用，属于植物病毒检测技术领域。所述RT-PCR试剂盒中包含独立包装或正向引物、反向引物分别混装，所述的四对引物分别为：ZYMV-D-F、ZYMV-D-R；TuMV-D-F、TuMV-D-；BBWV-2-D-F、BBWV-2-D-R；CMV-D-F、CMV-D-R。本发明可判断待测植株是否感染这四种病毒，操作简便易行，一份样品只需一次PCR即可对四种病毒进行检测，减少了操作次数，避免了交叉感染，同时还减少了试剂、引物、模板、及耗材等的使用量，节约了时间，达到了简便、经济、快速和准确的检测要求，可以用于蔬菜病毒的快速筛查等。可以用于蔬菜病毒的快速筛查等。可以用于蔬菜病毒的快速筛查等。


技术研发人员：曹欣然 贾珂晗 郭静静 王子琦 刘杰 安迪卡
受保护的技术使用者：青岛农业大学
技术研发日：2023.07.17
技术公布日：2023/8/24