一种胶质瘤预后标志物tRF-16及其应用

一种胶质瘤预后标志物trf-16及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种胶质瘤预后标志物trf-16及其应用。


背景技术：

2.胶质瘤是一种由神经胶质细胞恶化发展而来的中枢神经系统肿瘤，是目前发病率最高的原发性颅脑肿瘤。据美国脑肿瘤注册中心统计，胶质瘤约占所有中枢神经系统肿瘤的四分之一，占所有颅脑恶性肿瘤的80％，预后比较差，其中恶性胶质瘤的中位生存期仅为12.1～14.6月。近年来，胶质瘤在我国的发病率呈现明显增加的趋势，已成为34岁以下肿瘤患者死亡第二位原因，35-54岁肿瘤患者死亡第三位原因。胶质瘤因病死率高、平均生存期短的特点，一直是中枢神经系统恶性肿瘤治疗中的一大难题，目前采用的手术切除及放、化疗等传统疗法并未明显改善胶质瘤患者的预后。因此，阐明胶质瘤的发病机制具有重要的理论和实践意义。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供检测标志物trf-16在胶质瘤组织中表达量的试剂在制备胶质瘤预后制剂的应用，可以解决上述背景技术中提出的问题。
4.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：检测标志物trf-16在胶质瘤组织中表达量的试剂在制备胶质瘤预后制剂的应用。
5.进一步的，标志物trf-16在胶质瘤细胞及组织中高表达。
6.进一步的，一种胶质瘤预后标志物trf-16的应用的实施方法，包括如下步骤：
7.s1:检测trf-16在样品中的表达，其中样品包括正常脑细胞和胶质瘤细胞；
8.s2:对胶质瘤标本进行trf-16表达的检测和分析；
9.s3:对样品胶质瘤细胞进行感染；
10.s4:将s3感染后的胶质瘤细胞进行克隆形成实验；
11.s5:将s3感染后的胶质瘤细胞进行细胞增殖实验；
12.s6:将s3感染后的胶质瘤细胞进行细胞凋亡实验；
13.s7:将s3感染后的胶质瘤细胞裸鼠皮下成瘤实验。
14.进一步的，一种胶质瘤预后试剂盒，能够检测胶质瘤组织中的标志物trf-16的含量，包含有用于检测标志物trf-16的含量的pcr引物。
15.进一步的，pcr引物序列为tccctggtggtctagt。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
17.本发明能够有效的验证trf-16敲减能促进胶质瘤细胞凋亡，抑制胶质瘤细胞增殖和致瘤能力，调节胶质瘤细胞周期，trf-16敲减能够诱导胶质瘤细胞凋亡，对于阐明胶质瘤的发病机制具有重要的理论和实践意义，trf-16在胶质瘤发生发展中发挥重要作用，从而为胶质瘤的治疗提供一个潜在的治疗靶点。
附图说明
18.图1为采用real-time pcr技术检测脑胶质瘤细胞株u87mg、t98g、u118、ln382、a172、u251和shg44以及人脑正常胶质细胞heb中trf-16的相对表达示意图；
19.图2为采用real-time pcr技术检测不同病理分期分级的脑胶质瘤标本中trf-16的相对表达的示意图；
20.图3为kaplan-meier生存曲线和对数秩检验生存的示意图；
21.图4为u251和a172细胞中敲除trf-16后在进行克隆实验的克隆数量记录的示意图；
22.图5为u251和a172细胞中敲除trf-16后在进行cck8记录的示意图；
23.图6为采用流式细胞仪检测u251和a172细胞中敲除trf-16后细胞的凋亡细胞百分率的示意图；
24.图7为采用裸鼠皮下成瘤技术检测敲除trf-16后胶质瘤细胞的体内致瘤能力的示意图。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.检测标志物trf-16在胶质瘤组织中表达量的试剂在制备胶质瘤预后制剂的应用。
27.一种胶质瘤预后试剂盒，能够检测胶质瘤组织中的标志物trf-16的含量，包含有用于检测标志物trf-16的含量的pcr引物，其序列号如表1所示。
28.表1：pcr引物
29.trf-16tccctggtggtctagt
30.请参阅图1-图7，一种胶质瘤预后标志物trf-16的应用，包含以下步骤，其步骤如下：
31.s1:检测trf-16在样品中的表达，其中样品包括正常脑细胞和胶质瘤细胞；
32.将不同胶质瘤细胞株(u87mg、t98g、u118、ln382、a172、u251和shg44)以及人脑正常胶质细胞(heb)铺于细胞6孔板，置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养，待细胞长满，提取各细胞的总rna，应用real-time pcr技术对样品的trf-16进行检测。
33.s2:对胶质瘤标本进行trf-16表达的检测和分析；
34.收集经病理确诊的不同病理分级和恶性程度的胶质瘤组织标本各50例以及50例因脑外伤行减压术后的正常脑组织标本，根据who神经系统肿瘤分类病理标准，
ⅰ‑ⅱ
级为低恶性度胶质瘤，
ⅲ‑ⅳ
级为高恶性度胶质瘤，提取各组织标本的总rna，应用real-time pcr技术对人脑胶质瘤组织和正常脑组织中的trf-16进行检测；
35.结合临床生存期随访数据，以患者直接或间接因胶质瘤疾病“死亡”作为终点事件，计算3年累计生存概率；根据各样本trf-16的real-time pcr表达量数据将样本分为高表达组和低表达组，以回访时间作为x轴以累计概率作为y轴绘制生存曲线，分析trf-16表达与胶质瘤患者临床预后的相关性。
36.s3:对样品胶质瘤细胞进行感染；
37.对trf-16表达高的胶质瘤细胞株u251和a172进行慢病毒感染。
38.实施例一：将s3感染后的胶质瘤细胞进行克隆形成实验；
39.将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数；以每孔100、200、300个细胞的梯度密度分别接种于3个细胞6孔板中，并轻轻转动，使细胞分散均匀；置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养14天后，经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养；弃去上清液，用pbs清洗2次；加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分钟；然后去固定液，加适量结晶紫染色液染色15分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥；观察染色和克隆大小，计数并计算克隆形成率。
40.实施例二：将s3感染后的胶质瘤细胞进行细胞增殖实验；
41.运用cck8法检测细胞增殖，预计检测5天；将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；将对照组细胞和trf-16敲减组细胞分别接种到96孔细胞培养板(每孔8
×
103个细胞)，设置3个复孔。细胞贴壁后用赫赛汀(5.0μg/ml)处理；
42.分别于处理的不同时间点每孔加入10μl cck8试剂，37℃孵育1h，于酶标仪测定450nm吸光度，绘制细胞增殖曲线，计算标准差，t-test分析得到p值，判断是否有显著性差异(p《0.05，说明有显著性差异)。
43.实施例三：将s3感染后的胶质瘤细胞进行细胞凋亡实验；
44.运用annexinv-apc单染法检测细胞凋亡，两实验组细胞各接种3个孔于细胞6孔板；待细胞生长状态良好，胰酶消化，离心；在室温下用pbs洗涤(1500rpm/min，离心5min)；
45.用500μl binding buffer重悬细胞，加入10μl annexin-v medium buffer及1μl annexinv荧光抗体，常温避光孵育15mi n后离心；用pbs洗涤后，500μl binding buffer重悬细胞，在1h内用流式细胞术检测并进行数据分析。
46.实施例四：将s3感染后的胶质瘤细胞裸鼠皮下成瘤实验；
47.培养感染对照慢病毒和trf-16慢病毒的胶质瘤细胞生长到刚要融合时，用含胰蛋白酶和edta的消化液进行消化，振荡摇晃，脱落后终止消化，收集细胞，加入无血清dmem混匀；
48.若有细胞成团，可用吸管轻轻吹打，使细胞完全分离。离心后用生理盐水洗涤，再用生理盐水配成接种细胞悬液，细胞浓度为2
×
1010个/ml，密封后置于冰水中备用；
49.取裸鼠8只，雌雄不拘，4～5周龄，体重18～22g；取上述胶质瘤细胞悬液0.1ml注入裸鼠颈部侧面与前肢交界处皮下，分笼饲养，注射细胞后30天，利用活体成像技术观察活体成像结果；
50.立即处死后取瘤体，浸泡于福尔马林中，测量各瘤体的最大直径，称取各瘤体的重量；各瘤体经石蜡包埋，4μm切片，进行ki-67抗原的免疫组化染色，显示其在裸鼠瘤体中差异表达情况，注射及操作的整个过程均在spf屏障环境内进行。
51.进一步的，采用real-time pcr技术检测trf-16在正常脑细胞、胶质瘤细胞、不同病理分期分级的胶质瘤组织及癌旁正常脑组织中的表达，然后采用cck8法、克隆形成实验及裸鼠成瘤实验探讨trf-16对胶质瘤细胞增殖和致瘤能力的影响，同时运用流式细胞术分析trf-16对胶质瘤细胞凋亡的影响。
52.综上所述：实验表明与正常脑细胞和组织相比，胶质瘤细胞及组织中trf-16表达显著上调，trf-16的高表达与临床晚期和较差的存活率显著相关，trf-16敲减能促进胶质瘤细胞凋亡，抑制胶质瘤细胞增殖和体内致瘤能力，该发明能够有效的验证trf-16敲减能促进胶质瘤细胞凋亡，抑制胶质瘤细胞增殖和致瘤能力，对于阐明胶质瘤的发病机制具有重要的理论和实践意义，trf-16在胶质瘤发生发展中发挥重要作用，从而为胶质瘤的治疗提供一个潜在的治疗靶点。
53.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
54.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.检测标志物trf-16在胶质瘤组织中表达量的试剂在制备胶质瘤预后制剂的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，标志物trf-16在胶质瘤细胞及组织中高表达。3.如权利要求1所述的应用的实施方法，其特征在于，包括如下步骤：s1:检测trf-16在样品中的表达，其中样品包括正常脑细胞和胶质瘤细胞；s2:对胶质瘤标本进行trf-16表达的检测和分析；s3:对样品胶质瘤细胞进行感染；s4:将s3感染后的胶质瘤细胞进行克隆形成实验。4.如权利要求3所述的应用的实施方法，其特征在于，将s3感染后的胶质瘤细胞进行细胞增殖实验。5.如权利要求3所述的应用的实施方法，其特征在于，将s3感染后的胶质瘤细胞进行细胞凋亡实验。6.如权利要求3所述的应用的实施方法，其特征在于，将s3感染后的胶质瘤细胞裸鼠皮下成瘤实验。7.一种胶质瘤预后试剂盒，其特征在于，能够检测胶质瘤组织中的标志物trf-16的含量，包含有用于检测标志物trf-16的含量的pcr引物。8.如权利要求7所述的胶质瘤预后试剂盒，其特征在于，pcr引物序列为tccctggtggtctagt。

技术总结
一种胶质瘤预后标志物tRF-16及其应用，涉及生物技术领域，为了解决采用的手术切除及放、化疗等传统疗法并未明显改善胶质瘤患者的预后的技术问题，本发明能够有效的验证tRF-16敲减能促进胶质瘤细胞凋亡，抑制胶质瘤细胞增殖和致瘤能力，调节胶质瘤细胞周期，tRF-16敲减能够诱导胶质瘤细胞凋亡，对于阐明胶质瘤的发病机制具有重要的理论和实践意义，tRF-16在胶质瘤发生发展中发挥重要作用，从而为胶质瘤的治疗提供一个潜在的治疗靶点。的治疗提供一个潜在的治疗靶点。的治疗提供一个潜在的治疗靶点。


技术研发人员：杨辉 吕坤 刘小岑 黄浩宇 邬振国
受保护的技术使用者：皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院）
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/8/9