D-Ala2-GIP在制备促进血管再生产品中的应用

d-ala
2-gip在制备促进血管再生产品中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及d-ala
2-gip在制备促进血管再生产品中的应用。


背景技术：

2.血管遍及人体各组织及器官，其最主要的功能为血液的运输，是人体最重要的器官之一，机体通过血液的循环来维持每一个器官及组织正常运作及代谢。机体血管系统的形成主要依赖于血管生成和血管新生。血管新生是指通过内皮祖细胞和内皮细胞的增殖、迁移，从先前存在的血管中以出芽或者非出芽(如套叠)的方式生成新的毛细血管。血管新生是一个涉及多种细胞和分子的复杂过程，对于机体稳态及许多生理、病理过程都是不可缺少的，例如胚胎发育、组织再生、伤口愈合、炎症、肿瘤进展等。研究表明，在缺血性脑梗死灶周围可见大量的新生毛细血管，而且随着新生毛细血管数量的增加，脑梗死的预后越好。此外，新生的血管对脑梗死后内源性的恢复过程是重要的，干扰血管生成会使得脑缺血的预后变得更加严重。有文献报道，外周坐骨神经损伤修复中，新生血管为施万细胞迁移提供引导和桥梁，促进损伤修复。通过抑制血管生成信号来破坏体内新形成的血管会影响施万细胞迁移的方向性，导致神经修复缺陷。某些疾病患者(如糖尿病伤口、冠状动脉阻塞等)由于自身无法正常的进行血管再生进而导致伤口无法愈合。因此，促进血管再生的治疗方法在多种疾病中是很有前途的。已有的研究通常是使用生长因子(如vegf、fgf等)来刺激血管再生，虽然生长因子可以刺激细胞的分裂，促进细胞迁移以及形成管状构造，但是存在不少缺点：生长因子分子量过大，在异种生物中可能会诱发免疫反应，同时易变性，生产及使用成本高。因此，寻找新的促血管再生药物就显得很有必要了。
3.葡萄糖依赖性促胰岛素肽(gip)由肠上皮k细胞合成并分泌。gip的分泌主要受营养物质的调节，而gip的主要作用是葡萄糖依赖性刺激胰腺b细胞的胰岛素分泌。最近有研究发现在神经发育以及神经再生方面gip同样发挥作用。研究表明：除了主要的肠道功能外，gip及其受体gipr在哺乳动物脑和脊髓中均有表达。在gipr缺失的小鼠中观察到坐骨神经夹伤后轴突再生受损，这都提示gip/gipr信号的不仅仅发挥代谢调控的功能。d-ala
2-gip多肽是在天然gip的基础上将第二个氨基酸ala替换为右旋氨基酸，可延长体内半衰期，长时间发挥功能。发明人在前期研究中发现d-ala
2-gip除了能够促进神经生长外还能够促进血管再生，可为缺血性血管疾病患者带来福音，而目前尚未有报道d-ala
2-gip多肽在血管再生方面的应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供d-ala
2-gip在制备促进血管再生产品中的应用。
5.在本发明中，所述d-ala
2-gip为以下序列之一：
6.序列1.y(d-ala)egtfisdysiamdkihqqdfvnwllaqk(seq_1)
7.序列2.y(d-ala)egtfisdysiamdkirqqdfvnwllaqk(seq_2)
8.序列3.y(d-ala)egtfisdysiamdkirqqdfvnwllaqr(seq_3)
9.序列4.y(d-ala)egtfisdysiamdkihqqdfvnwllaqkgkkndwkhnitq(seq_4)
10.序列5.y(d-ala)egtfisdysiamdkirqqdfvnwllaqkgkkndwkhnltq(seq_5)
11.序列6.y(d-ala)egtfisdysiamdkirqqdfvnwllaqrgkksdwkhnitq(seq_6)。
12.通过体外培养原代人脐静脉血管内皮细胞，发明人发现使用d-ala
2-gip处理，可以显著诱导并促进huvec细胞迁移和小管样结构的形成；主动脉环血管形成实验显示d-ala
2-gip刺激显著促进了主动脉环出芽。另外，通过建立大鼠坐骨神经损伤模型，d-ala
2-gip给药处理，免疫荧光结果显示d-ala
2-gip组的新生血管显著多于对照组；同时，抑制gip/gipr信号通路阻碍了损伤后的血管再生。综上所述，d-ala
2-gip可作为血管再生促进剂治疗缺血类疾病。d-ala
2-gip给药方式可以是联合生物材料进行局部缓释，也可以进行整体用药(如静脉注射)，均能达到类似的治疗效果。
13.本发明通过实验充分证明作为葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(gip)的长效类似物，d-ala
2-gip静脉注射或损伤处局部给药均能显著增加损伤处血管新生，进而促进损伤修复，而阻断gipr活化则能抑制血管再生。同时，本发明通过实验发现d-ala
2-gip能够有效促进血管内皮细胞huvecs的迁移和小管样结构的生成，促进大鼠动脉环出芽，因此可以将d-ala
2-gip用于制备血管再生试剂。d-ala
2-gip作为内源性多肽的类似物，具有更长的半衰期，其安全性良好，特异性好，能够穿透血脑屏障在大脑缺血性疾病中发挥重要作用。相比于通常使用的血管生长因子，d-ala
2-gip为小分子多肽，仅含有30-42个氨基酸，易扩散形成浓度梯度有效引导细胞生长迁移，免疫原性小，且合成价格更低，对于更好治疗缺血性疾病患者具有重要意义。
附图说明
14.图1为d-ala
2-gip诱导并促进huvecs迁移的实验结果。
15.图2为d-ala
2-gip促进huvec细胞小管样结构形成的实验结果。
16.图3为d-ala
2-gip促进大鼠主动脉环血管新生的实验结果。
17.图4为d-ala
2-gip促进坐骨神经损伤后血管新生的实验结果。
18.图5为阻断gip/gipr信号抑制血管新生的实验结果。
具体实施方式
19.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
20.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
21.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
22.下述实施例中，所采用的d-ala
2-gip为序列2，本领域的技术人员可以知悉，不同种属间序列会有少数变化，但是其效果相似。
23.实施例1d-ala
2-gip诱导并促进huvecs的迁移
24.1.体外培养人脐静脉血管内皮细胞huvecs备用，培养基使用ecm完全培养基。
25.2.将已经用75％酒精消毒的划痕小室用灭菌的ddh2o冲洗2遍，紫外灯光下吹干后
放于培养皿中，将有粘性的一面朝下粘附在皿底备用。
26.3.将huvecs细胞用0.25％胰酶消化，终止消化后1000rpm离心5min，弃上清。加ecm将细胞重悬，准确计数2*105细胞/ml，然后吸取100μl分别加入划痕小室两边进行贴壁。
27.4.细胞贴壁24h后，拔除小室，1
×
pbs清洗一次。加入ecm培养基，并且加入丝裂霉素c，实验组加入100、500nm的d-ala
2-gip，对照组加入等体积水。
28.5.将细胞放入培养箱继续培养，分别在0h、6h、12h进行拍照，统计分析不同时间实验组与对照组划痕面积的差异。
29.6.将transwell小室放在24孔板上，然后紫外灯光照射15min备用
30.7.消化huvec细胞后离心，用ecm基础培养基重新悬浮细胞，计数将huvec细胞浓度调整为为4
×
105cell/ml。
31.8.在transwell上室内加入100μl细胞悬液，即每个小室种4万个huvec细胞。在transwell下室中加入650μl含有500nm d-ala
2-gip的ecm培养基后，继续培养12h。
32.9.培养结束后，夹出小室，吸干上室里边的培养基后，转移至含有4％ pfa的孔中，固定细胞40min。
33.10.固定结束后取出小室，吸干上室pfa，用同样浸泡方法，用pbs清洗3次，每次5min，在新的孔中加入700μl结晶紫染色液，将小室移到染色液中，染色20min。
34.11.用pbs清洗3次，每次5min。取出小室，吸弃上室多余pbs，用棉棒擦去上室膜表面细胞，在倒置显微镜下拍照，并统计数据。
35.如图1中a和b所示，不同浓度d-ala
2-gip处理组huvec细胞迁移后划痕剩余的面积均明显小于对照组，说明d-ala
2-gip能够促进huvec细胞迁移。图1中c和d显示transwell下室中添加d-ala
2-gip的实验组huvec细胞穿过膜的数量明显增多，说明d-ala
2-gip可以诱导血管内皮细胞以浓度梯度的方式进行迁移。
36.实施例2d-ala
2-gip对于huvec细胞小管样结构的调控
37.1.体外培养人脐静脉血管内皮细胞huvecs备用，培养基使用ecm完全培养基。
38.2.matrigel基质胶在使用前需提前1天拿至4℃冰箱内预冷使其充分融化，防止在加入前凝固。
39.3.96孔板放于表面较为平整的冰盒之上，用已经预冷的枪头吸取45μl基质胶，缓慢吸取基质胶，减少气泡的产生。加入96孔板中，打入后轻轻晃匀将皿底铺满，然后放入细胞培养箱30min等待凝固。
40.4.收集huvec细胞，使用0.25％胰酶消化后，加入终止消化液终止消化细胞，1000rpm常温离心5min，弃掉上层悬液，用新的ecm培养基重悬细胞并准确计数。
41.5.96孔板中基质胶凝固后，先用100μl培养基润洗基质胶，枪头不可以触碰胶体，并且要缓慢加入，防止将胶破坏。
42.6.向96孔板中按照2*104/100μl培养基加入细胞，然后加入不同浓度d-ala
2-gip轻轻晃匀，对照组加入相同体积的水，继续培养5-6h即可看到细胞成管，进行拍照记录。
43.如图2所示，相比于对照组，d-ala
2-gip处理组在基质胶上形成的小管样结构明显增加，说明d-ala
2-gip能够促进血管新生。
44.实施例3d-ala
2-gip促进大鼠主动脉环血管新生
45.1.matrigel基质胶使用前需提前1天拿至4℃冰箱内预冷使其充分融化，防止在加
入前凝固。
46.2.96孔板放于表面较为平整的冰盒之上，用已经预冷的枪头吸取45μl基质胶，缓慢吸取基质胶，减少气泡的产生。加入96孔板中，打入后轻轻晃匀将皿底铺满，然后放入细胞培养箱30min等待凝固。
47.3.使用4-5周龄的sd大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，用75％酒精对大鼠腹部消毒，使用剪刀镊子剪开并暴露胸腔后，将内脏和肠道移开，直到看到大鼠的胸主动脉。
48.4.剪取2-3cm的主动脉血管放入预冷的hanks中，尽量去除血液，清洗并剔除干净结缔组织。
49.5.使用灭菌好的刀片将动脉血管切成1-2mm厚的环，转移到新的盛有hanks的皿中。
50.6.取出已经凝固的胶，用培养基将基质胶润洗一次，然后将动脉环轻轻的放在基质胶的表面，在动脉环上方加注入45μl matrigel胶，将动脉覆盖，37℃培凝固30min。
51.7.胶凝固之后，将不同分组的ecm培养基(50、200、500、1000nm d-ala
2-gip)加入到胶的最上层，对照组用水代替d-ala
2-gip，每孔100μl，每2天换液一次。
52.8.每天在倒置显微镜下进行拍照记录。
53.如图3所示，d-ala
2-gip显著增加大鼠主动脉环出芽，促进血管新生。
54.实施例4d-ala
2-gip促进坐骨神经损伤后的血管新生
55.1.坐骨神经横断模型的建立，将体重220g的雌性成年大鼠进行麻醉，腿部备皮，钝性分离组织肌肉，暴露坐骨神经后进行截断，去除长度约为6mm的神经组织，构建坐骨神经横断模型。
56.2.将外径为2mm内径为1mm的硅胶管剪成8mm长度，灭菌后备用。使用硅胶管连接截断的坐骨神经残端，两边各缝入1mm。
57.3.将实验动物分为对照组及实验组，实验组在硅胶管中注入不同浓度的d-ala
2-gip，对照组则用生理盐水，缝合创面后观察至2周。
58.4.分别在术后1周、2周取大鼠坐骨神经，使用4％多聚甲醛固定，24h后使用30％蔗糖脱水，随后进行冰冻切片，切片厚度设置为12μm。
59.5.切片后进行免疫荧光染色，使用cd34标记血管内皮细胞，荧光显微镜拍照观察损伤处血管新生情况。
60.如图4所示，d-ala
2-gip处理组在损伤处血管新生数量显著多于对照组，说明d-ala
2-gip促进血管新生。建立坐骨横断模型后，使用硅胶管连接截断的坐骨神经，将sd大鼠分为实验组和对照组，d-ala
2-gip处理组不在硅胶管中给药而是隔天尾静脉注射d-ala
2-gip(剂量为10-100nm/kg)，2周后收集神经组织，切片染色，拍照统计，结果与前面类似，d-ala
2-gip处理组新生血管更多。
61.实施例5阻断gip/gipr信号抑制血管新生
62.1.坐骨神经横断模型的建立，将体重220g的雌性成年大鼠进行麻醉，腿部备皮，钝性分离组织肌肉，暴露坐骨神经后进行截断，去除长度约为6mm的神经组织，构建坐骨神经横断模型。
63.2.将外径为2mm内径为1mm的硅胶管剪成8mm长度，灭菌后备用。使用硅胶管连接截断的坐骨神经残端，两边各缝入1mm。
64.3.将实验动物分为对照组及实验组，实验组在硅胶管中注入不同浓度的gipr阻断抗体gipg013，对照组则用生理盐水，缝合创面后观察至2周。
65.4.分别在术后1周、2周取大鼠坐骨神经，使用4％多聚甲醛固定，24h后使用30％蔗糖脱水，随后进行冰冻切片，切片厚度设置为12μm。
66.5.切片后进行免疫荧光染色，使用cd34标记血管内皮细胞，荧光显微镜拍照观察损伤处血管新生情况。
67.如图5所示，gipg013处理组在损伤处血管新生数量显著少于对照组，说明阻断gip/gipr信号抑制血管新生。

技术特征：
1. d-ala
2-gip在制备促进血管再生产品中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述d-ala
2-gip为以下序列之一：序列1. y(d-ala)egtfisdysiamdkihqqdfvnwllaqk序列2. y(d-ala)egtfisdysiamdkirqqdfvnwllaqk序列3. y(d-ala)egtfisdysiamdkirqqdfvnwllaqr序列4. y(d-ala)egtfisdysiamdkihqqdfvnwllaqkgkkndwkhnitq序列5. y(d-ala)egtfisdysiamdkirqqdfvnwllaqkgkkndwkhnltq序列6. y(d-ala)egtfisdysiamdkirqqdfvnwllaqrgkksdwkhnitq。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为药物。4.一种血管再生促进药物，以d-ala
2-gip为有效活性成分。

技术总结
本发明公开了D-Ala


技术研发人员：管徒晨 刘炎 刘梅 徐曼 巫荣华
受保护的技术使用者：南通大学
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/9/6