多肽生长因子PSK的一种合成方法与流程

多肽生长因子psk的一种合成方法
技术领域
1.本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及到植物生长因子psk-α及的psk-β一种新的合成制备路线。


背景技术：

2.psk(phytosulfokine)是1996年由日本科学家matsubayashi和sakagami在芦笋叶肉细胞的条件培养基中分离并鉴定出结构的磺化生长因子，由约80个氨基酸长的前体蛋白经酪氨酸残基的翻译后磺化和蛋白水解加工而产生，剪切修饰后成熟的psk以两种形式存在：psk-α(phytosulfokine-α)和psk-β(phytosulfokine-β)，其中psk-α结构为tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-gln-oh，psk-β的结构为tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-oh。
3.科学界经过多年的研究发现，psk多肽的前体蛋白在不同种植物中例如水稻、大豆、油菜、玉米、拟南芥都有存在，其结构高度保守，在整株植物中的叶、顶端分生组织和胚轴中都发现了psk的表达，说明psk在高等植物中是广泛存在且其受体覆盖这些植物的所有部位。
4.跟大部分的有天然氨基酸构成的多肽相比，psk的tyr上的酚羟基被磺化，这种结构的变化极大的增强了多肽与蛋白某些位点之间的结合能力，使得这种多肽具有了非磺化多肽不具有的一些活性。研究表明，纳摩尔级浓度的psk就可以对植物产生非常明显的作用，它能刺激黄瓜的果肉胚芽及旁根的发育，促进百日草叶肉细胞的分化，延长棉花的纤维长度，催熟水果并刺激花粉发芽及花粉管的延长，全方位增强叶根花果的发育，在农业上实现多种作物增产20-30%。
5.psk多肽还能激发植物的免疫系统以抵抗病原体的入侵，从而达到防治灰霉病、黄化曲叶病毒等植物病害的作用。仅以灰霉病这种全球性的真菌性病害为例，全球多达235种蔬菜、果树以及其他植物会受到灰霉菌的侵害，引起有些植物50%的减产，而psk能够帮助植物有效的抵抗真菌侵扰的困扰。
6.正是因为具有这些令人瞩目的作用，使得psk在农业生产上具有良好的产业化期待，根据农业上使用的特点，其大规模产业化显得尤为迫切。
7.关于psk的制备，目前大部分报道的方法是采用生物重组法，其操作难度大且成本高，仅能提供实验室研究的需要量。matsubayashi等报道了一种全固相化学合成方法(biochemical and biophysical research communications 225,209
–
214(1996))，主要是利用传统的固相方法合成了boc-tyr-ile-tyr-thr(tbu)-gln(trt)-hmp树脂或者boc-tyr-ile-tyr-thr(tbu)-hmp树脂，然后利用dmf-so3在固相上进行多肽磺化后得到boc-tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr(tbu)-gln(trt)-hmp树脂或者boc-tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr(tbu)-hmp树脂,再利用95%tfa将多肽从树脂上裂解下来并脱除保护基团，经过纯化就可以得到psk。正如同该文献提及，tyr酚羟基上的磺基在tfa条件下非常不稳定，在从树脂上切割下来的过程及后处理过程中，因为有tfa的存在，psk非常容易变质，纯化难度大，导致该工艺最终只有约21%的收率，由于该工艺成本高、收率低，很难实现量产。
8.要想实现该产品的社会价值及经济产业价值，开发一种能够规避磺基在tfa中暴露的工艺就非常重要，同时该工艺要能提高收率，降低成本，方便产业化放大生产。


技术实现要素：

9.本发明所解决的问题就是针对现有工艺的不足，提供天然植物多肽生长因子psk产业化的工艺路线。
10.产品的生产主要是通过以下技术方案实现的。其特点是：利用固相法或者液相法合成得到非磺化多肽（五肽和四肽），再利用一种比较易得的气体so2f2对多肽酪氨酸上的酚羟基进行高选择性的磺酰氟化得到关键中间体，该中间体在碱性条件下水解后可以得到高纯度的psk。
11.工艺步骤主要包括以下内容：步骤1，合成tyr-ile-tyr-thr-gln-oh或者tyr-ile-tyr-thr-oh。步骤2，将步骤1中所得到的多肽上酚羟基进行定点修饰得到tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-gln-oh或者tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-oh。步骤3：水解步骤2所得化合物得到psk-α[tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-gln-oh]或者psk-β[tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-oh]。
[0012]
采用固相方法合成多肽tyr-ile-tyr-thr-gln-oh或者tyr-ile-tyr-thr-oh，以wang树脂或者ctc树脂作为起始树脂，固相树脂取代度为0.3-1.3mmol/g；缩合试剂的使用，为dic、dcc、hbtu、hatu、pybop、pyaop、tbtu，所采用的碱为nmm、diea、tea；选择tfa为多肽裂解溶剂，清除剂选择水、tes、tis、edt、dodt中的一种或任意组合。
[0013]
采用固相合成方法时，所使用的氨基酸为：
①
合成tyr-ile-tyr-thr-gln-oh所选用的保护氨基酸分别为fmoc-gln(trt)-oh, fmoc-thr(tbu)-oh,fmoc-tyr(r)-oh,fmoc-ile-oh,p
1-tyr(r)-oh,其中r为tbu或者h，p1为boc或者fmoc；
②
合成tyr-ile-tyr-thr-oh所选用的保护氨基酸分别为fmoc-thr(tbu)-oh, fmoc-tyr(r)-oh,fmoc-ile-oh,p
1-tyr(r)-oh,其中r为tbu或者h，p1为boc或者fmoc；
[0014]
选择液相法来合成tyr-ile-tyr-thr-gln-oh，采用逐步法或者片段法，其特征为：逐步法采用h-gln(trt)-otbu作为起始原料，从右往左连接；片段法采用1+4，2+3，3+2，4+1的策略。选择液相法来合成tyr-ile-tyr-thr-oh，采用逐步法或者片段法，其特征为：逐步法采用h-thr(tbu)-otbu作为起始原料，从右往左连接；片段法采用1+3，2+2，3+1的策略。
[0015]
步骤2中专一性酚羟基酰氟化试剂为so2f2，tyr-ile-tyr-thr-gln-oh转化为tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-gln-oh，tyr-ile-tyr-thr-oh转化为tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-oh。
[0016]
磺酰氟化溶剂为水、乙腈、四氢呋喃、二氧六环、二氯甲烷、n-甲基吡咯烷酮、二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种或者几种混合物。碱为硼砂、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、氨水、氢氧化钠、dmap、pbs、tea、nmm、diea其中的一种或者几种混合物。碱摩尔当量为多肽的2-5倍，溶剂与反应原料的体积质量比为5-20:1。
[0017]
合成psk-α[tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-gln-oh]或者psk-β[tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-oh]所用的试剂为碳酸铯、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、dbu或者碳酸锂，所用的溶剂为乙二醇或者丙二醇，碱摩尔当量为多肽的2-5倍，溶剂与反应原料的体积质量比为
3-10:1。
[0018]
用高效液相色谱法进行纯化，选用c8或者c18做为色谱柱填料，选用醋酸作为流动相介质。
[0019]
整个反应的中间控制可以采用树脂茚三酮显色法、tlc茚三酮显色法或者hplc方法。
[0020]
本发明通过现有工业上最常用的保护氨基酸来合成多肽后，利用易得的so2f2气体对多肽上的特定羟基进行专一化磺酰氟化反应，反应后过量的气体不会在反应液中残留，反应由一种物质完全转化为另外一种物质，再利用常见的碱和环境友好的试剂将磺酰氟化的中间体进行水解得到产物，整个工艺条件温和，能够有效的避免磺化多肽生长因子在酸性条件下特别是浓tfa条件下不稳定的问题。整个反应转化率高，原料易得，使得整个工艺的成本很低，反应条件温和，非常有利于产业化。
附图说明
[0021]
图1：tyr-ile-tyr-thr-gln-oh的hplc谱图
[0022]
图2：tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-gln-oh的hplc谱图
[0023]
图3：tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-gln-oh的hplc谱图
[0024]
图4：tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-gln-oh的ms谱图
[0025]
图5：tyr-ile-tyr-thr-oh的hplc谱图
[0026]
图6：tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-oh的hplc谱图
[0027]
图7：tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-oh的hplc谱图
具体实施方式
[0028]
为了将本发明中工艺技术方案及其优点阐述得更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0029]
本实施例描述了psk-α和psk-β两种结构的活性因子的生产工艺，由于两种物质的结构类似，本文在描述其中一种结构合成方案也一样适用于另外一种物质。
[0030]
本发明所采用的简称对比如下：
[0031]
实施例1：tyr-ile-tyr-thr-gln-oh的固相法合成
[0032]
氨基酸树脂的制备：将fmoc-gln(trt)-oh(6.1g,10mmol)加入到二氯甲烷中（50ml）中，搅拌溶解，将ctc树脂（1.00mmol/g,5g,5mmol）加入到上述反应液中，加入diea（3.2g，25mmol）,将反应溶液放置在室温下搅拌反应3小时后，加入甲醇(4ml)，继续反应15分钟后将反应液抽干，用二氯甲烷洗涤（100mlx3）后，再用mtbe(100mlx2)洗涤后，抽干得到fmoc-gln(trt)-ctc树脂7.8g，通过吸光光度计法测得取代度为0.62mmol/g。
[0033]
第一个氨基酸的脱保护：将fmoc-gln(trt)-ctc树脂（7.8g,4.84mmol）悬浮于dmf(50ml)中，溶胀1小时后，实行fmoc脱保护，在树脂中加入20%哌啶的dmf溶液（60ml），搅拌下反应30分钟后，抽干反应溶液，用dmf(60mlx5)洗涤后进行下一步偶联反应。
[0034]
第二个氨基酸的偶联：在树脂中加入fmoc-thr(tbu)-oh(3.8g,9.68mmol),hobt（1.3g,9.68mmol）和nmm(1.5g,14.5mmol)后搅拌，加入hbtu(3.48g,9.2mmol)后搅拌反应1
小时后，用茚三酮方法检测反应已经结束，继续反应10分钟后抽干反应液，用dmf（100mlx4）洗涤。
[0035]
第二个氨基酸的脱保护：在树脂中加入20%的哌啶的dmf溶液（60ml），搅拌下反应30分钟后，抽干反应液，用dmf（60mlx5）洗涤。
[0036]
第三个氨基酸的偶联：在树脂中加入fmoc-tyr(tbu)-oh(4.4g,9.68mmol),hobt（1.3g,9.68mmol）和nmm(1.5g,14.5mmol)后搅拌，加入hbtu(3.48g,9.2mmol)后搅拌反应1小时后，用茚三酮方法检测反应已经结束，继续反应10分钟后抽干反应液，用dmf（100mlx4）洗涤。
[0037]
第三个氨基酸的脱保护：在树脂中加入20%的哌啶的dmf溶液（60ml），搅拌下反应30分钟后，抽干反应液，用dmf（60mlx5）洗涤。
[0038]
第四个氨基酸的偶联：在树脂中加入fmoc-ile-oh(3.4g,9.68mmol),hobt（1.3g,9.68mmol）和nmm(1.5g,14.5mmol)后搅拌，加入hbtu(3.48g,9.2mmol)后搅拌反应1小时后，用茚三酮方法检测反应已经结束，继续反应10分钟后抽干反应液，用dmf（100mlx4）洗涤。
[0039]
第四个氨基酸的脱保护：在树脂中加入20%的哌啶的dmf溶液（60ml），搅拌下反应30分钟后，抽干反应液，用dmf（60mlx5）洗涤。
[0040]
第五个氨基酸的偶联：在树脂中加入boc-tyr(tbu)-oh(4.4g,9.68mmol),hobt（1.3g,9.68mmol）和nmm(1.5g,14.5mmol)后搅拌，加入hbtu(3.3g,9.2mmol)后搅拌反应1小时后，用茚三酮方法检测反应已经结束，继续反应10分钟后抽干反应液，用dmf（100mlx4）洗涤再用mtbe（60mlx2）洗涤后，抽干得到干燥状态的boc-tyr(tbu)-ile-tyr(tbu)-thr(tbu)-gln(trt)-ctc树脂。
[0041]
肽树脂的裂解：在该树脂中加入裂解液（tfa:tis:h2o=95:2.5:2.5，200ml），在室温下搅拌反应2小时后过滤，用乙醚（200ml）沉淀后洗涤得到tyr-ile-tyr-thr-gln-oh 3.2g，收率96.4%，纯度98.1%。
[0042]
实施例2：tyr-ile-tyr-thr-oh的固相法合成
[0043]
氨基酸树脂的制备：将fmoc-thr(tbu)-oh(13g,33mmol)加入到二氯甲烷中（180ml）中，搅拌溶解，将ctc树脂（1.1mmol/g,15g,16.5mmol）加入到上述反应液中，加入diea（10.6g，82.5mmol）,将反应溶液放置在室温下搅拌反应3小时后，加入甲醇(15ml)，继续反应15分钟后将反应液抽干，用二氯甲烷洗涤（200mlx3）后，再用mtbe(100mlx2)洗涤后，抽干得到fmoc-thr(tbu)-ctc树脂20.3g，通过吸光光度计法测得取代度为0.77mmol/g。
[0044]
第一个氨基酸的脱保护：将fmoc-thr(tbu)-ctc树脂（12.99g,10mmol）悬浮于dmf(50ml)中，溶胀1小时后，实行fmoc脱保护，在树脂中加入20%哌啶的dmf溶液（200ml），搅拌下反应30分钟后，抽干反应液，用dmf(60mlx5)洗涤后进行下一步偶联。
[0045]
第二个氨基酸的偶联：在树脂中加入fmoc-tyr(tbu)-oh(9.2g,20mmol),hobt（2.7g,20mmol）和nmm(2.2g,20mmol)后搅拌，加入hbtu(7.2g,19mmol)后搅拌反应1小时后，用茚三酮方法检测反应已经结束，继续反应10分钟后抽干反应液，用dmf（200mlx4）洗涤。
[0046]
第二个氨基酸的脱保护：在树脂中加入20%的哌啶的dmf溶液（250ml），搅拌下反应30分钟后，抽干反应液，树脂用dmf（200mlx5）洗涤。
[0047]
第三个氨基酸的偶联：在树脂中加入fmoc-ile-oh(7.1g,20mmol),hobt（2.7g,20mmol）和nmm(2.2g,20mmol)后搅拌，加入hbtu(7.2g,19mmol)后搅拌反应1小时后，用茚三
酮方法检测反应已经结束，继续反应10分钟后抽干反应液，用dmf（250mlx4）洗涤。
[0048]
第三个氨基酸的脱保护：在树脂中加入20%的哌啶的dmf溶液（200ml），搅拌下反应30分钟后，抽干，用dmf（250mlx5）洗涤。
[0049]
第四个氨基酸的偶联：在树脂中加入boc-tyr(tbu)-oh(6.8g,20mmol),hobt（2.7g,20mmol）和nmm(2.2g,20mmol)后搅拌，加入hbtu(7.2g,19mmol)后搅拌反应1小时后，用茚三酮方法检测反应已经结束，继续反应10分钟后抽干反应液，用dmf（200mlx4）洗涤再用mtbe（200mlx2）洗涤后，抽干得到干燥状态的boc-tyr(tbu)-ile-tyr(tbu)-thr(tbu)
ꢀ‑
ctc树脂。
[0050]
肽树脂的裂解：在该树脂中加入裂解液（tfa:tis:h2o=95:2.5:2.5，200ml），在室温下搅拌反应2小时后过滤，用乙醚（300ml）沉淀后洗涤得到tyr-ile-tyr-thr-oh 5.5g，收率98.6%，纯度99.3%。
[0051]
实施例3：tyr-ile-tyr-thr-gln-oh的液相片段法合成法(以3+2片段法为例)
[0052]
片段一[boc-tyr(tbu)-ile-tyr(tbu)-oh]的合成：用冰水浴控温10-20℃，将boc-tyr(tbu)-oh（33.7g,0.1mol），hosu（6g,0.12mol）溶于thf（300ml），溶清后滴加dcc（12.8g,0.12mol）的thf（50ml）溶液，滴加过程控温10-20℃。滴加完毕后撤去冰水浴，室温反应2-3h，以hplc监控反应，当hplc显示原料小于1%，停止反应，过滤，滤饼用冷thf洗涤（50mlx2）。滤液浓缩至50ml，滴加250ml乙醚析出固体，过滤，滤饼保持在40℃烘干得boc-tyr(tbu)-osu 43g。另取一个1000ml三口玻璃瓶，加入h2o（40ml）后，将h-ile-oh（15.7g，0.12mol）加入搅拌。再将boc-tyr(tbu)-osu（43g,0.099mol）用thf（380ml）溶清，滴加入反应液中。最后将diea（25.8g，0.2mol）滴加入反应液中。继续反应3h后在反应液中加入水（300ml）及二氯甲烷（300ml），将两项进行分离,水相用饱和柠檬酸水调ph为3.9,用二氯甲烷(60ml)萃取一次,将收集的有机相再用饱和食盐水(60ml)洗一次,无水mgso4干燥，蒸干溶剂得到白色固体boc-tyr(tbu)-ile-oh 50.2g。将得到的boc-tyr(tbu)-ile-oh继续用dcc和hosu进行活化，将tyr(tbu)-oh连接到肽序列上得到片段一boc-tyr(tbu)-ile-tyr(tbu)-oh 59g，片段一的合成收率77.3%。
[0053]
片段二[thr(tbu)-gln(trt)-otbu]的合成：将fmoc-thr(tbu)-oh（39.7g,0.1mol），gln(trt)-otbu（46.6g，0.105mol）加入到二氯甲烷（500ml）搅拌，搅拌溶解后，将dic（15g,0.12mol）,hobt(16.2g,0.12mol)加入到反应中，继续反应3h。反应液中加入水（300ml），搅拌后两项溶液进行分离，水相用饱和柠檬酸水调ph为3.9,用二氯甲烷(60ml)萃取一次,将所有收集的有机相再用饱和食盐水(300ml)洗一次,无水mgso4干燥，蒸干溶剂得到白色固体fmoc-thr(tbu)-gln(trt)-otbu 82g。将fmoc-thr(tbu)-gln(trt)-otbu加入到二氯甲烷（1000ml）中，控制温度在20-30℃，滴加哌啶（23.2g.0.27mol）,滴加完成后在室温下搅拌反应2小时，停止反应，用饱和食盐水（500mlx5）洗涤反应溶液后，将有机相干燥旋干得到thr(tbu)-gln(trt)-otbu 59.5g，收率99%。
[0054]
片段一和片段二的偶联：boc-tyr(tbu)-ile-tyr(tbu)-oh（59g，0.088mol）与thr(tbu)-gln(trt)-otbu(52.9g,0.088mol)两个片段加入到二氯甲烷(600ml)中，向反应溶液中加入dic（12.8g,0.1mol），hobt(13.5g,0.1mol)后，反应在室温条件下搅拌2.5小时后停止反应，有机相用饱和食盐水（300mlx2）,0.2n盐酸溶液(300mlx3)及饱和碳酸氢钠溶液（300mlx3）洗涤后干燥旋干，得到白色泡沫状固体，将白色固体加入到95%tfa（800ml）的溶
液中，搅拌1小时后，将溶液旋干得到tyr-ile-tyr-thr-gln-oh 58.1g，收率96.8%。
[0055]
实施例4：tyr-ile-tyr-thr-oh的液相逐步合成法
[0056]
tyr(tbu)-thr(tbu)-otbu的合成：将fmoc-tyr(tbu)-oh（91.9g,0.2mol）, thr(tbu)-otbu（48.6g,0.21mol）溶解于二氯甲烷（750ml）中，加入edci(46g,0.24mol),hobt(32g,0.24mol)，控制温度在10-20℃，将nmm（24g,0.24mol）滴加到反应液后将温度升到20-30℃并搅拌12小时，hplc中控检测fmoc-tyr(tbu)-oh已经反应完成，将反应液中加入饱和食盐水（500ml），分液除去水后，将有机相分别用饱和柠檬酸溶液（500ml），饱和碳酸氢钠溶液（500ml）洗涤后用饱和食盐水（300ml）洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠（20g）进行干燥，将有机相进行减压蒸馏得到fmoc-tyr(tbu)-thr(tbu)-otbu 123g,收率91.4%，纯度96.5%。将fmoc-tyr(tbu)-thr(tbu)-otbu（60g,0.089mol）溶解于dmf（500ml）中，控制反应温度在0-10℃，在搅拌的情况下将哌啶（100ml）滴加到反应液中，滴加完全后将反应液升温到20-30度反应1个小时，tlc检测反应已经完成，在搅拌的情况下，将反应溶液倒入到600ml的水中，白色固体析出，过滤反应溶液，将固体用水洗涤（300ml*4）后，用乙酸乙酯（800ml）溶解，有机相用无水硫酸钠干燥后旋干，得到白色粉末状固体为tyr(tbu)-thr(tbu)-otbu 38.7g,收率96.8%，纯度97.1%。
[0057]
ile-tyr(tbu)-thr(tbu)-otbu的合成：将fmoc-ile-oh(33.4g,0.095mol)和tyr(tbu)-thr(tbu)-otbu（38.7g,0.086mol）加入到dcm(350ml)中，搅拌至澄清反应溶液，加入edci(19.8g，0.105mol),hobt(14.2g,0.105mol)后将反应溶液控制在10-20℃，将nmm（10.6g,0.105mol）滴加到反应液中，将反应温度升到20-30℃后，反应继续搅拌12小时后，hplc检测到tyr(tbu)-thr(tbu)-otbu已经反应完全，将反应液中加入100mldcm稀释后用饱和的柠檬酸溶液（300ml*2）和饱和碳酸氢钠溶液分别洗涤（300ml*2）后用饱和食盐水400ml洗涤一遍后用无水硫酸钠干燥后，将溶液直接降温到0-10℃并在保持温度的情况下，向反应溶液中滴加哌啶溶液（80ml），滴加完成后，整个反应溶液保持在20-30℃继续搅拌1个小时候，用hplc检测反应已经完成，将反应液用饱和食盐水洗涤4遍后，有机相用无水硫酸钠干燥后减压除去溶剂得到白色固体为ile-tyr(tbu)-thr(tbu)-otbu，45.3g,收率93.4%，纯度95.7%。
[0058]
boc-tyr(tbu)-ile-tyr(tbu)-thr(tbu)-otbu的合成：将boc-tyr(tbu)-oh(29.7g,0.088mol)及ile-tyr(tbu)-thr(tbu)-otbu（45.3，0.08mol）溶解在dcm(750ml)中至澄清溶液，向反应液中加入edci(20.2g,0.11mol),hobt(14.9g,0.11mol)，反应溶液搅拌至澄清，将反应液控温在10-20℃，向反应溶液中滴加nmm（15.1g,0.15mol）,待滴加完成后，将反应温度提高到30℃，将反应液搅拌18个小时后检测反应已经完成，将反应液用饱和柠檬酸溶液（300ml*2）及饱和碳酸氢钠溶液（300ml*2）洗涤后，用饱和食盐水洗涤后，无水硫酸钠干燥后旋干，得到的固体用石油醚（300ml）打浆后过滤，收集到的固体为boc-tyr(tbu)-ile-tyr(tbu)-thr(tbu)-otbu 63g,收率89.2%，纯度96.9%。
[0059]
tyr-ile-tyr-thr-oh的合成：控制反应温度为10-20℃的情况下，向boc-tyr(tbu)-ile-tyr(tbu)-thr(tbu)-otbu（63g，0.07mol）中加入tfa:h2o=95:5的混合溶液，将反应温度升高到30℃，继续搅拌3个小时，将反应液倾倒至800ml的mtbe中，将固体过滤并用mtbe打浆洗涤3遍后，收集并控温在40℃干燥得到白色固体为tyr-ile-tyr-thr-oh 32.3g,收率为82.8%，纯度96.8%。
[0060]
实施例5：tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-gln-oh的合成
[0061]
将实施例1或者实施例3中得到的tyr-ile-tyr-thr-gln-oh（3.3g,4.83mmol）溶解在水（20ml）中，在反应液中加入硼砂（3.6g，9.66mmol），将反应溶液在20-30℃搅拌30分钟后，将反应容器内的空气完全置换为so2f2后，在溶液中缓慢通入so2f2至鼓泡状态，反应在室温下搅拌，逐渐有淡白色的固体析出，每30分钟取样用hplc检测一次，原料反应完成即停止通入气体，终止反应，将反应液用二氯甲烷（30mlx3）提取再用乙酸乙酯（30mlx3）提取，有机相进行收集，用无水硫酸酸钠干燥后减压旋干得到tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-gln-oh 3.9g，收率95.1%，纯度97.6%。
[0062]
实施例6：tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-oh的合成
[0063]
将实施例2或者实施例4中得到的tyr-ile-tyr-thr-oh（2.7g,4.83mmol）溶解在水（20ml）中，在反应液中加入硼砂（3.6g，9.66mmol），反应溶液在20-30℃搅拌30分钟后，将反应容器内的空气完全置换为so2f2后，在溶液中缓慢通入so2f2至鼓泡状态，将反应在室温下搅拌，每30分钟取样用hplc检测一次，原料反应完成即终止反应，将反应液用二氯甲烷（30mlx3）提取再用乙酸乙酯（30mlx3）提取，有机相用无水硫酸酸钠干燥后旋干得到tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-oh 3.3g，收率94.6%，纯度98.1%。
[0064]
实施例7：tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-gln-oh(psk-α)的合成：
[0065]
将tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-gln-oh（3.9g,4.7mmol）溶解在乙二醇（30ml）中，在室温下搅拌至溶解后，控制反应温度在10-20℃，将碳酸铯（9.58g,0.029mol）分批加入到反应液中，溶液逐渐澄清透明，待碳酸铯固体全部加入并溶解后，继续在控温搅拌15分钟后，将控温装置撤去，将反应液在室温条件下搅拌，用hplc监控反应，每30分钟取样一次，直到反应液中的原料含量低于1%，终止反应，整个反应过程需要约3个小时，反应溶液呈现粘稠的状态，取少量用水稀释后用hplc检测其纯度为95.2%。
[0066]
实施例8：tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-gln-oh(psk-α)的纯化：
[0067]
设备：lc6000 220nm
[0068]
体系：流动相a为0.1%醋酸/水；流动相b为0.1%醋酸/乙腈
[0069]
色谱柱：cl6000-sac0025,450mmx25.4mm
[0070]
流速：25ml/分钟
[0071]
将实施例7中的反应液用150ml的水进行稀释后，将样品上样到制备色谱柱中，用流动相a将色谱柱冲洗15分钟后，提高b流动相的含量，在10%-50%用时30分钟，进行梯度洗脱，将符合纯度要求的洗脱液收集后减压旋蒸除去乙腈后，将水溶液冻干即可以得到产品psk-α3.4g，收率85.6%,纯度99.2%。
[0072]
实施例9：tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-oh(psk-β)的合成
[0073]
将tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-oh（3.4g,4.7mmol）溶解在乙二醇（30ml）中，在室温下搅拌至溶解后，控制反应温度在10-20℃，将碳酸铯（9.58g,0.029mol）分批加入到反应液中，溶液逐渐澄清透明，待碳酸铯固体全部加入后，反应液在室温条件下搅拌，用hplc监控反应，每30分钟取样一次，直到反应液中的原料含量低于1%，终止反应整个反应过程需要约3个小时，反应溶液呈现粘稠的状态，取少量用水稀释后用hplc检测其纯度为96.4%。
[0074]
实施例10：tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-oh(psk-β)的纯化
[0075]
设备：lc2100 220nm
[0076]
体系：流动相a为0.1%醋酸/水；流动相b为0.1%醋酸/乙腈
[0077]
色谱柱：cl6000-sac0025,450mmx25.4mm
[0078]
流速：25ml/分钟
[0079]
将实施例7中的反应液用150ml的水进行稀释后，将样品上样到制备色谱柱中，用流动相a将色谱柱冲洗15分钟后，提高b流动相的含量，在10%-40%用时30分钟，进行梯度洗脱，将洗脱液收集后减压旋蒸除去乙腈后，将水溶液冻干即可以得到产品psk-β2.8g，收率82.3%,纯度97.4%。
[0080]
本发明的反应条件温和，总收率高，所使用的实际均为低成本实际，非常利于工业化生产，方便大生产的实现。

技术特征：
1.本发明提供了一种纯天然多肽生长因子psk-α/psk-β的工业化生产工艺，包括以下步骤：步骤(1)：合成多肽tyr-ile-tyr-thr-gln-oh或者tyr-ile-tyr-thr-oh; 步骤(2)：对步骤（1）所得的多肽上酚羟基进行定点修饰得到tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-gln-oh或者tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-oh; 步骤(3)：水解步骤（2）所得化合物得到psk-α[tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-gln-oh]或者psk-β[tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-oh]。2.根据权利要求1的合成方法，其特征为：步骤(1)中，采用固相方法合成多肽tyr-ile-tyr-thr-gln-oh或者tyr-ile-tyr-thr-oh，以wang树脂或者ctc树脂作为起始树脂，固相树脂取代度为0.3-1.3mmol/g；缩合试剂的使用，为dic、dcc、hbtu、hatu、pybop、pyaop、tbtu，所采用的碱为nmm、diea、tea；选择tfa为多肽裂解溶剂，清除剂选择水、tes、tis、edt、dodt中的一种或任意组合。3.根据权利要求1和2的合成方法，采用固相合成方法时，其特征为：
①
合成tyr-ile-tyr-thr-gln-oh所选用的保护氨基酸分别为fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-thr(tbu)-oh，fmoc-tyr(r)-oh，fmoc-ile-oh，p
1-tyr(r)-oh，其中r为tbu或者h，p1为boc或者fmoc；
②
合成tyr-ile-tyr-thr-oh所选用的保护氨基酸分别为fmoc-thr(tbu)-oh，fmoc-tyr(r)-oh，fmoc-ile-oh，p
1-tyr(r)-oh，其中r为tbu或者h，p1为boc或者fmoc。4.根据权利要求1的合成方法，步骤(1)中，选择液相法来合成tyr-ile-tyr-thr-gln-oh，采用逐步法或者片段法，其特征为：逐步法采用h-gln(trt)-otbu作为起始原料，从右往左连接；片段法采用1+4，2+3，3+2，4+1的策略。5.根据权利要求1的合成方法，步骤(1)中，选择液相法来合成tyr-ile-tyr-thr-oh，采用逐步法或者片段法，其特征为：逐步法采用h-thr(tbu)-otbu作为起始原料，从右往左连接；片段法采用1+3，2+2，3+1的策略。6.根据权利要求1的合成方法，其特征为：步骤（2）中专一性酚羟基酰氟化试剂为so2f2，tyr-ile-tyr-thr-gln-oh转化为tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-gln-oh，tyr-ile-tyr-thr-oh转化为tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-oh。7.根据权利要求1和6所述的合成方法，其特征为：磺酰氟化溶剂为水、乙腈、四氢呋喃、二氧六环、二氯甲烷、n-甲基吡咯烷酮、二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种或者几种混合物。碱为硼砂、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、氨水、氢氧化钠、dmap、pbs、tea、nmm、diea其中的一种或者几种混合物。碱摩尔当量为多肽的2-5倍，溶剂与反应原料的体积质量比为5-20:1。8.根据权利要求1的合成方法，其特征为：步骤（3）中，合成psk-α[tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-gln-oh]或者psk-β[tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-oh]所用的试剂为碳酸铯、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、dbu或者碳酸锂，所用的溶剂为乙二醇或者丙二醇，碱摩尔当量为多肽的2-5倍，溶剂与反应原料的体积质量比为3-10:1。9.权利要求1和8的合成方法，其特征为：用高效液相色谱法进行纯化，选用c8或者c18做为色谱柱填料，选用醋酸作为流动相介质。

技术总结
本发明提供了一种合成植物多肽生长因子PSK的工艺路线，利用SO2F2与天然氨基酸组成的多肽进行反应，将其酪氨酸侧链上的酚羟基进行定点专一化修饰，得到磺酰氟化多肽，在碱性条件下进一步水解得到PSK产品。该工艺反应条件温和，操作简单，能很好的规避TFA对于磺基的破坏，保证了产品的稳定性及纯度，整个工艺转化率高，产品纯度高，同时制备产品的原料都非常方便易得，非常适合于工业化大生产。非常适合于工业化大生产。


技术研发人员：许金峰 卓壮壮 邱芊 徐韵
受保护的技术使用者：杭州东恒生物医药有限公司
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/9/6