一株产反式-2-癸烯酸的食窦魏斯氏菌及其应用

1.本发明属于生物领域，具体涉及一株产反式-2-癸烯酸的食窦魏斯氏菌(weissella cibaria食窦魏斯氏菌)及其应用。


背景技术：

2.反式2-癸烯酸分子式为，是中链α,β-不饱和脂肪酸中的一类，可作为神经类药物、香料、保健品等重要产品的中间体、其应用价值十分广泛。
3.研究表明反式2-癸烯酸及其衍生物对治疗神经性疾病具有特殊的疗效，可以用于药物研制，例如被用作合成蜂王浆的重要活性因子10-羟基-2-癸烯酸。10-羟基-2-癸烯酸具有重要的抑菌、抗癌和免疫调节等活性，而在自然环境中，10-羟基-2-癸烯酸仅存在于工蜂的上颌骨腺中，因此，反式2-癸烯酸的生物合成将为未来10-羟基-2-癸烯酸的生物合成途径奠定基础。除医药用途外，反式2-癸烯酸在材料方面也具有较大的用途，如可以使用2-癸烯酸作为铅配体来合成高质量的纳米棒材料。
4.目前，市面上的反式2-癸烯酸均为化学法生产，且价格昂贵约为3万/kg。因此进一步研究反式2-癸烯酸高效且绿色的合成方式对于其应用价值的进一步开发探究具有重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明提供的从浓香型白酒大曲中筛选获得一株产反式-2-癸烯酸的食窦魏斯氏菌，可用于为10-羟基-2-癸烯酸合成提供前体物质，以及研究代谢途径，推进反式-2-癸烯酸的生物合成工艺。
6.因此，本发明提供一株产反式-2-癸烯酸的食窦魏斯氏菌，已于2022年6月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号：cgmcc no.25147，分类名称为食窦魏斯氏菌(weissella cibaria食窦魏斯氏菌。
7.本发明还提供所述食窦魏斯氏菌在产反式-2-癸烯酸的应用。
8.具体地，将所述食窦魏斯氏菌在发酵培养基中，以产生反式-2-癸烯酸。
9.优选地，发酵培养条件35-38℃静置培养，培养时长为1-4天，ph值为7.0。
10.更优选地，所述食窦魏斯氏菌的接种量为1.5-2.5％(所选择接种的菌液中菌株浓度达到107cfu/ml)。
11.在一个实施方式中，所述发酵的培养基的组成为：每升培养基中含有16g葡萄糖，10g胰蛋白胨，2.5g酵母粉，5g牛肉膏，3.85g牛脑，4.9g牛心，0.5g吐温80，1g柠檬酸铵，2.5g氯化钠，2.5g无水乙酸钠，0.05g硫酸镁，0.025g硫酸锰，1.25g磷酸氢二钠，1g磷酸氢二钾。
12.此外，还包括进一步提取反式-2-癸烯酸的步骤。优选地，采用顶空固相微萃取法，取发酵液离心获得的上清液，加入顶空瓶中，加入饱和nacl溶液，将制备好的样品于50-70℃保温平衡4-6min后，用50/30μmdvb/car/pdms萃取头在50-70℃萃取40-60min得到。
13.本发明还提供一种制备反式-2-癸烯酸的方法，其将所述食窦魏斯氏菌在发酵培
养基中进行发酵，以产生反式-2-癸烯酸，以及提取反式-2-癸烯酸的步骤。
14.优选地，发酵培养的条件35-38℃静置培养，培养时长为1-4天，ph值为7.0。
15.本发明提供的食窦魏斯氏菌具有发酵产反式-2-癸烯酸的能力，来源于浓香型白酒的大曲，可稳定表达反式-2-癸烯酸，培养条件简单，可用于为10-羟基-2-癸烯酸合成提供前体物质，以及研究代谢途径，推进反式-2-癸烯酸的生物合成工艺。
附图说明
16.图1为实施例2中菌株所产的反式-2-癸烯酸gc-ms分子碎片质谱图。
17.图2为实施例2中反式-2-癸烯酸标准品gc-ms分子碎片质谱图。
18.菌株保藏信息：
19.本发明的食窦魏斯氏菌已于2022年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。该菌株的保藏编号为cgmcc no.25147，其分类命名为食窦魏斯氏菌weissella cibaria。
具体实施方式
20.下面通过具体实施例对本发明做进一步的阐述，以期更好的理解本发明，但不构成对本发明的限制。
21.实施例中涉及的培养基配方：
22.mrs液体培养基：葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉4g/l，牛肉浸粉5g/l，吐温80 1g/l，柠檬酸三铵2g/l，醋酸钠5g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸锰0.05g/l，磷酸氢二钾1g/l，ph6.0，115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。
23.mrs固体培养基：在mrs液体培养基基础上添加15g/l的琼脂，115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。
24.发酵培养基：葡萄糖16g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母粉2.5g/l，牛肉膏5g/l，牛脑3.85g/l，牛心4.9g/l，吐温80 0.5g/l，柠檬酸铵1g/l，氯化钠2.5g/l，无水乙酸钠2.5g/l，硫酸镁0.05g/l，硫酸锰0.025g/l，磷酸氢二钠1.25g/l，磷酸氢二钾1g/l，ph 6.0，115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。
25.实施例1：菌株的分离纯化
26.1)分离方法：取20g泸州老窖浓香型白酒大曲样品，放入装有180ml无菌蒸馏水的锥形瓶中，恒温摇床振荡10min将样品充分打散、混匀。取1ml样品悬液，采用倍比稀释法，稀释至10-2
～10-7
，从每个梯度的稀释液中吸取100μl，均匀涂布于mrs固体培养基平板上，平行制备两块平板，倒置，放于37℃厌氧下培养36-48h，并及时观察。
27.2)划线纯化：将长出菌落的平板取出，挑取不同菌落形态的单菌落，进行二次划线，直至纯化出所有单菌落。
28.3)菌种保藏：将纯化完成后的每种菌株的单菌落挑入5mlmrs液体培养基中，置于37℃厌氧下静置培养20-24h，吸取1ml菌液至保菌管中，加入0.5ml60％的无菌甘油溶液，重悬，置于-80℃保存。
29.实施例2：产反式-2-癸烯酸能力检测
30.(1)准备待测菌液：
31.筛选得到的菌株甘油保存管溶解后，分别将其接种于mrs液体培养基中，并于37℃下静置培养20h，得到待测菌液。
32.(2)gc-ms检测反式-2-癸烯酸方法：
33.采用顶空固相微萃取法：取上清液，加入顶空瓶中，加入饱和nacl溶液，将制备好的样品于60℃保温平衡5min后，用50/30μmdvb/car/pdms萃取头在60℃萃取50min，萃取结束后在gc进样口250℃解吸5min。化合物检索结果与nist标准谱库进行匹配，相似度达到80％以上确认为目的化合物。
34.gc-ms检测色谱条件：
35.气相色谱条件：hp-innowax色谱柱(60m
×
0.25mm
×
0.25μm)；升温程序：起始温度40℃，保持5min，以4℃/min升到100℃，再以6℃/min升至230℃，
36.保持10min，载气为高纯氦气(1.0ml/min)；进样口温度250℃，不分流。
37.质谱条件：电子电离源，电子能量70ev；电子倍增器电压350v；离子源温度230℃；传输线温度250℃；质量范围40～450m/z。
38.以上述方法检测进行复筛，以获得一株具有产反式-2-癸烯酸能力的菌株，选择该菌株做进一步研究。
39.实施例3：分子鉴定
40.对目标菌株进行扩培后取对数生长期新鲜菌液，离心收集菌体，采用细菌基因组抽提试剂盒提取基因组dna。采用芽孢杆菌通用引物27f/1541r扩增其16s rdna全长序列，具体如下：
41.27f(5
′‑
agagtttgatcctggctcag-3
′
)
42.1541r(5
′‑
aaggaggtgatccagcc-3
′
)
43.①
反应体系(50μl)
[0044][0045]
②
反应程序
[0046][0047]
pcr产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离检验，电压约11v/cm，电泳时间20min。
[0048]
pcr产物的纯化按上海生工生物技术公司的小量胶回收pcr产物纯化试剂盒说明
进行，测序由上海生工生物技术公司完成。其中，16s rdna序列如seq id no:1：tgcagtcgaacgctttgtggttcaactgatttgaagagcttgctcagatatgacgatggacattgcaaagagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggaaacctacctcttagcaggggataacatttggaaacagatgctaataccgtataacaatagcaaccgcatggttgctacttaaaagatggttctgctatcactaagagatggtcccgcggtgcattagttagttggtgaggtaatggctcaccaagacgatgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacaatgggactgagacacggcccatactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcaacgccgcgtgtgtgatgaagggtttcggctcgtaaaacactgttgtaagagaagaatgacattgagagtaactgttcaatgtgtgacggtatcttaccagaaaggaacggctaaatacgtgccagcagccgcggtaatacgtatgttccaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcagacggttatttaagtctgaagtgaaagccctcagctcaactgaggaattgctttggaaactggatgacttgagtgcagtagaggaaagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctttctggactgtaactgacgttgaggctcgaaagtgtgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccacaccgtaaacgatgagtgctaggtgtttgagggtttccgcccttaagtgccgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcccttgacaactccagagatggagcgttcccttcggggacaaggtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattactagttgccagcatttagttgggcactctagtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggcgtatacaacgagttgccaacccgcgagggtgagctaatctcttaaagtacgtctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagccggtggggtaaccttcgggagccagccgtctaaggtgggacagatgattaggggaagtcgaacaagagcc。
[0049]
测序获得16s rdna片段的基因序列通过ncbi的blast比对，确定菌株种属信息，鉴定其为食窦魏斯氏菌(weissella cibaria)，并命名为食窦魏斯氏菌zqw76(weissella cibaria)。
[0050]
实施例4：食窦魏斯氏菌zqw76形态特征和理化特性
[0051]
1.经实验表明，戊糖片球菌zqw76的培养特性：最适生长温度为37℃，ph值为7，兼性厌氧，有氧、无氧或微氧条件下均可生长。在温度耐受性方面：该菌在37℃条件下长势良好，42℃条件下能够正常生长，45℃和48℃条件下无法生长。
[0052]
2.该菌在37℃厌氧条件下，培养48小时，经api50ch试剂盒鉴定，可分别利用l-阿拉伯糖，d-核糖，d-半乳糖，d-葡萄糖，d-果糖，d-甘露糖，d-纤维二糖，d-麦芽糖，d-海藻糖，d-塔格糖；d-木糖，n-乙酰葡萄糖胺，苦杏仁苷，熊果苷，水杨苷，d-蔗糖，d-龙胆二糖；丙三醇，甘露醇，甲基-αd-吡喃甘露糖苷，七叶灵柠檬酸铁，d-乳糖，d-密二糖，葡萄糖酸钾，2酮基葡萄糖酸钾；赤藓糖醇，d-阿拉伯糖，甲基-αd-吡喃葡萄糖苷等28种单一碳源产酸。其利用能力由强到弱：l-阿拉伯糖，d-核糖，d-半乳糖，d-葡萄糖，d-果糖，d-甘露糖，d-纤维二糖，d-麦芽糖，d-海藻糖，d-塔格糖；d-木糖，n-乙酰葡萄糖胺，苦杏仁苷，熊果苷，水杨苷，d-蔗糖，d-龙胆二糖；丙三醇，甘露醇，甲基-αd-吡喃甘露糖苷，七叶灵柠檬酸铁，d-乳糖，d-密二糖，葡萄糖酸钾，2酮基葡萄糖酸钾；赤藓糖醇，d-阿拉伯糖，甲基-αd-吡喃葡萄糖苷。
[0053]
3.该菌在37℃微好氧条件下，利用mrs液体培养基，静置培养48小时，通过hplc高效液相色谱检测其非挥发性代谢产物，发现该菌可代谢生产乳酸8.8g/l，乙酸0.14g/l，乙
醇3.36g/l。
[0054]
实施例5：食窦魏斯氏菌zqw76发酵实验
[0055]
将获得的食窦魏斯氏菌zqw76甘油保存管溶解后，按5％接种量接种于10ml装液量的mrs液体培养基中，37℃静置培养24h后按2％接种量接种到发酵培养基中，连续培养2天，检测方法同实施例2中的测定方法，以0.822mg/ml的2-辛醇为内标物，以未添加菌发酵的培养液为空白对照组，计算各组分的含量。食窦魏斯氏菌zqw76在持续发酵2天后，所产反式-2-癸烯酸产量可达2.382mg/l。
[0056]
实施例6：食窦魏斯氏菌zqw76发酵产其他可挥发性代谢产物的实验
[0057]
发酵与检测方法同实施例5。检测结果显示，食窦魏斯氏菌zqw76发酵培养2天后除可产2.382mg/l的反式-2-癸烯酸外，还可产其他23种可挥发性的代谢产物，分别为：乙醇0.530mg/l，异戊醇0.828mg/l，正庚醇1.296mg/l，正辛醇0.076mg/l，1-壬醇0.336mg/l，苯乙醇1.540mg/l，香叶醇0.967mg/l；乙酸15.308mg/l，异戊酸0.359mg/l，己酸1.594mg/l，辛酸1.846mg/l，异辛酸0.404mg/l，壬酸0.469mg/l，正癸酸0.156mg/l；仲辛酮1.451mg/l；苯乙醛0.618mg/l，2,3-二氢-2,2,6-三甲基苯甲醛1.497mg/l；乙酸2-辛酯0.090mg/l，2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯0.366mg/l，乙酸月桂酯0.424mg/l，9-氧代壬酸乙酯0.321mg/l；苯酚0.024mg/l，甲氧基苯肟1.442mg/l。

技术特征：
1.一株产反式-2-癸烯酸的食窦魏斯氏菌（weissella cibaria），其保藏号为cgmcc no.25147。2.如权利要求1所述的食窦魏斯氏菌在产反式-2-癸烯酸中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述食窦魏斯氏菌在发酵培养基中进行发酵，以产生反式-2-癸烯酸。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵培养的条件35-38
°
c静置培养，培养时长为1-4天，ph值为7.0。5.如权利要求3至4任一项所述的应用，其特征在于，所述食窦魏斯氏菌的接种量为1.5-2.5％，所选择接种的菌液中菌株浓度达到107cfu/ml。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵的培养基的组成为：每升培养基中含有16g葡萄糖，10g胰蛋白胨，2.5g酵母粉，5g牛肉膏，3.85g牛脑，4.9g牛心，0.5g吐温80，1g柠檬酸铵，2.5g氯化钠，2.5g无水乙酸钠，0.05g硫酸镁，0.025g硫酸锰，1.25g磷酸氢二钠，1g磷酸氢二钾。7.如权利要求3至6任一项所述的应用，其特征在于，还包括进一步提取反式-2-癸烯酸的步骤。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，采用顶空固相微萃取法，取发酵液离心获得的上清液，加入顶空瓶中，加入饱和nacl溶液，将制备好的样品于50-70℃保温平衡4-6min后，用50/30 μmdvb/car/pdms 萃取头在50-70℃萃取40-60min得到。9.一种制备反式-2-癸烯酸的方法，其特征在于，将如权利要求1所述食窦魏斯氏菌在发酵培养基中进行发酵，以产生反式-2-癸烯酸，以及提取反式-2-癸烯酸的步骤。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，发酵培养的条件35-38
°
c静置培养，培养时长为1-4天，ph值为7.0。

技术总结
本发明属于生物领域，具体涉及一株产反式-2-癸烯酸的食窦魏斯氏菌。所述食窦魏斯氏菌保藏号：CGMCC No.25147，其筛选于浓香型白酒大曲。在一个实验中本发明的食窦魏斯氏菌在持续发酵2天后，所产反式-2-癸烯酸产量可达2.382mg/L，因而可用于为10-羟基-2-癸烯酸合成提供前体物质，以及研究代谢途径，推进反式-2-癸烯酸的生物合成工艺。癸烯酸的生物合成工艺。


技术研发人员：赵秋伟 李寅 于惠 郑蕾
受保护的技术使用者：中国科学院微生物研究所
技术研发日：2023.06.11
技术公布日：2023/9/6