一种药物组合物在制备抗白念珠菌药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种药物组合物在制备抗白念珠菌药物中的应用。


背景技术：

2.白念珠菌是一种真菌，当人体免疫力低下时致病，会引起浅部、深部感染，甚至威胁生命。据估计，全球每年有超过25万名患者发生侵袭性念珠菌病，其死亡率超过40％。尽管目前已经发现了100多种念珠菌，但白念珠菌仍然被视为最常见的条件致病性菌种，80％的念珠菌感染与白念珠菌有关，其约占重症监护病房感染的19％。因此，白念珠菌感染常常会给社会以及经济带来沉重的负担。
3.目前市面上用于白念珠菌治疗的药物主要为唑类和多烯类药物，然而这些药物在不同程度上存在抗菌谱窄、毒副性大等缺点；除此之外，随着抗真菌药物的长期大量使用，白念珠菌的耐药现象越来越突出。白念珠菌出现耐药性可能与以下原因有关：
4.(1)改变靶标分子：改变靶蛋白的结构从而降低药物敏感性或者过表达靶蛋白，从而导致药物失效，如erg11基因的突变导致唑类药物靶酶的氨基酸序列发生改变，从而使唑类药物失效。
5.(2)细胞内药物含量的降低：通过降低细胞渗透性或者增强细胞膜外排泵活性，从而减少细胞内药物的含量，如白念珠菌细胞中胞嘧啶渗透酶的活性降低，可以减少对5-fc的吸收，导致耐药性的产生。
6.(3)改变代谢途径：真菌可以通过改变代谢途径来增强对药物的耐药性，如对多烯类化合物的耐药性主要是通过麦角甾醇生物合成基因的功能缺失突变而耗尽麦角甾醇，从而产生了替代性甾醇，这些甾醇不能有效地与多烯类相互作用，因此对抗真菌药敏感性降低。
7.(4)细胞壁适应性改变：fks1蛋白是葡聚糖合成酶复合体的一个催化亚单位，其编码基因发生突变，很可能导致其对棘白菌素的敏感性降低。
8.(5)白念珠菌生物膜的形成：白念珠菌生物膜能够减少药物进入到细胞内，从而增加对常用的抗真菌药(如氟康唑)的耐药性。
9.虽然目前对于抗白念珠菌药出现耐药性的机制有所了解，但是在原有抗真菌药的基础上通过影响耐药机制来增强抗真菌效果或者逆转耐药性的方法比较少。因此通过探索新的小分子化合物的增强常用抗真菌药的抗真菌效果，从而达到提高治疗白念珠菌感染的效果是目前抗白念珠菌行之有效的手段。


技术实现要素：

10.为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种药物组合物在制备抗白念珠菌药物中的应用。
11.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
12.本发明的第一方面是提供一种抗白念珠菌的药物组合物，该药物组合物包括dp44mt和抗真菌药；该抗真菌药选自唑类抗真菌药、多烯类抗真菌药、棘白菌素类抗真菌药和氟胞嘧啶中一种或多种。
13.进一步地，上述唑类抗真菌药选自氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑中的一种或多种。
14.进一步地，上述多烯类抗真菌药为两性霉素b和/或制霉菌素。
15.进一步地，上述棘白菌素类抗真菌药选自卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净中的一种或多种。
16.本发明的第二方面是提供上述药物组合物在制备抗白念珠菌药物中的应用。
17.本发明的第三方面是提供上述药物组合物在制备预防和/或治疗白念珠菌引起的疾病的药物中的应用。
18.进一步地，上述白念珠菌引起的疾病为皮肤念珠菌病、粘膜念珠菌病或内脏及中枢神经念珠菌病。
19.进一步地，上述白念珠菌引起的疾病选自皮肤炎症、甲沟炎、肛周炎、腹股沟炎、阴道炎、口角炎、鹅口疮，白念珠菌引发的肺炎、肠胃炎、心内膜炎、脑膜炎和脑炎。
20.进一步地，上述药物的剂型为外用剂型、注射剂型或口服剂型。
21.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
22.本发明通过棋盘实验验证了dp44mt能够增强常用抗真菌药的抗生物膜形成作用，并且增强常用抗真菌药的成熟生物膜破坏作用，进而增强常用抗真菌药的抗真菌效果，减少白念珠菌耐药性的形成，从而为念珠菌病新的治疗方式奠定理论基础。
具体实施方式
23.下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
24.实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
25.实施例1
26.本实施例验证了dp44mt能够增强常用抗真菌药的抗生物膜形成作用，具体的实验步骤和结果如下：
27.1.生物膜形成棋盘实验
28.将活化的白念珠菌用pbs清洗三遍之后，用rpmi1640培养基将菌液浓度稀释至1
×
106cfu/ml，然后平铺到96孔板里，每孔200μl。然后将96孔板放至37℃恒温培养箱里培养90min，记为粘附阶段。待其培养90min之后，取出96孔板，弃去上清，用无菌pbs清洗一遍，然后加入不含或含试剂的rpmi1640培养基，放至37℃恒温培养箱恒温培养24小时，记为增殖阶段。
29.生物膜形成棋盘实验：在生物膜形成的增殖阶段加入不同浓度的混合试剂。
30.①
dp44mt和两性霉素b(amphotericin b,amp)的棋盘实验：dp44mt浓度为2μg/ml至0.008μg/ml，amp浓度为4μg/ml至0.0625μg/ml。
31.②
dp44mt和制霉菌素(nystatin,nys)的棋盘实验：dp44mt浓度为2μg/ml至0.008μ
g/ml，nys浓度为8μg/ml至0.125μg/ml。
32.③
dp44mt和唑类的棋盘实验：dp44mt浓度为2μg/ml至0.03125μg/ml，唑类浓度为64μg/ml至0.25μg/ml。
33.2.xtt减低实验
34.2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺酸苯基)-2h-四唑-5-羧基苯胺(2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2h-tetrazolium-5-carboxanilide，xtt)检测是一种比色法，通过测量四唑盐试剂xtt的还原来检测代谢活性。在生物膜培养时间达到24小时之前的半小时准备新鲜的0.5mg/mlxtt和0.32mg/ml吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate，pms)，涡旋均匀后将两者按9:1的比例混合，然后涡旋均匀，避光放置。待生物膜培养时间达到24小时时，弃去培养基，然后用pbs清洗三遍去除培养基，然后每孔加入100μlxtt-pms混合液，37℃避光孵育2小时。2小时之后，测od
450
。当od值变为原来的20％或更小时的最低试剂浓度记为最低生物膜形成抑制浓度(minimum biofilm inhibitory concentration，mbic)。
35.3.分数抑制浓度指数(fractional inhibitory concentration index，fici)的计算
36.两种试剂之间的相互作用fici模型来分析。fici的计算公式为：fici＝ficia+ficib，其中ficia的计算方法为mica单/mica联，ficib的计算方法为micb单/micb联。mic
(试剂单)
＝试剂单独使用时的mbic或mbec，mic
(试剂联)
＝试剂联合应用时的的mbic或mbec。其中，fici≤0.5为协同作用；0.5＜fici≤1为相加作用；1＜fici＜4为无相互作用；fici≥4为拮抗作用。
37.结果如下表1所示，mbic
(amp单)
为2μg/ml，mbic
(amp联)
为0.5μg/ml，mbic
(dp44mt单)
为1μg/ml，mbic
(dp44mt联)
为0.008μg/ml，fici为0.258，因此具有协同的作用。mbic
(nys单)
为8μg/ml，mbic
(nys联)
为4μg/ml，mbic
(dp44mt单)
为1μg/ml，mbic
(dp44mt联)
为0.5μg/ml，fici为1，因此具有相加的作用。mbic
(唑类单)
为大于64μg/ml，mbic
(唑类联)
为0.25μg/ml，mbic
(dp44mt单)
为1μg/ml，mbic
(dp44mt联)
为0.5μg/ml，fici为0.503，因此具有相加的相互作用。
38.表1dp44mt与抗真菌药抗白念珠菌生物膜形成的相互作用
[0039][0040][0041]
实施例2
[0042]
本实施例验证了dp44mt能够增强常用抗真菌药的成熟生物膜破坏作用，具体的实验步骤和结果如下：
[0043]
如上所述，白念珠菌在37℃培养24小时形成生物膜之后，弃去培养基，然后用pbs清洗三遍。加入配好的含有不同浓度试剂的含试剂或不含试剂rpmi1640培养基到含生物膜的孔中，再在37℃恒温培养24小时。
[0044]
①
dp44mt和amp的棋盘实验：dp44mt浓度为256μg/ml至1μg/ml，amp浓度为4μg/ml至0.0625μg/ml。
[0045]
②
dp44mt和nys的棋盘实验：dp44mt浓度为256μg/ml至1μg/ml，nys浓度为64μg/ml至1μg/ml。
[0046]
xtt减低实验用作测定试剂破坏白念珠菌成熟生物膜的最低生物膜破坏浓度(minimum biofilm eradication concentration,mbec)，然后计算分数抑制浓度指数。
[0047]
结果如下表2所示，mbec
(amp单)
为4μg/ml，mbec
(amp联)
为0.5μg/ml，mbec
(dp44mt单)
大于256μg/ml，mbec
(dp44mt联)
为128μg/ml，fici为0.375，因此amp与dp44mt具有协同增加破坏成熟生物膜的作用。mbec
(nys单)
为8μg/ml，mbec
(nys联)
为2μg/ml，mbec
(dp44mt单)
大于256μg/ml，mbec
(dp44mt联)
为128μg/ml，fici为0.5，因此nys与dp44mt也具有协同增加破坏成熟生物膜的作用。
[0048]
表2dp44mt与抗真菌药破坏白念珠菌成熟生物膜的相互作用
[0049][0050]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

技术特征：
1.一种抗白念珠菌的药物组合物，其特征在于，包括dp44mt和抗真菌药；所述抗真菌药选自唑类抗真菌药、多烯类抗真菌药、棘白菌素类抗真菌药和氟胞嘧啶中一种或多种。2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述唑类抗真菌药选自氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述多烯类抗真菌药为两性霉素b和/或制霉菌素。4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述棘白菌素类抗真菌药选自卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净中的一种或多种。5.如权利要求1-4任一项所述的药物组合物在制备抗白念珠菌药物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为外用剂型、注射剂型或口服剂型。7.如权利要求1-4任一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗白念珠菌引起的疾病的药物中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述白念珠菌引起的疾病为皮肤念珠菌病、粘膜念珠菌病或内脏及中枢神经念珠菌病。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述白念珠菌引起的疾病选自皮肤炎症、甲沟炎、肛周炎、腹股沟炎、阴道炎、口角炎、鹅口疮，白念珠菌引发的肺炎、肠胃炎、心内膜炎、脑膜炎和脑炎。10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为外用剂型、注射剂型或口服剂型。

技术总结
本发明提供了一种抗白念珠菌的药物组合物，该药物组合物包括Dp44mT和抗真菌药；该抗真菌药选自唑类抗真菌药、多烯类抗真菌药、棘白菌素类抗真菌药和氟胞嘧啶中一种或多种。本发明通过棋盘实验验证了Dp44mT能够增强常用抗真菌药的抗生物膜形成作用，并且增强常用抗真菌药的成熟生物膜破坏作用，进而增强常用抗真菌药的抗真菌效果，减少白念珠菌耐药性的形成，从而为念珠菌病新的治疗方式奠定理论基础。础。


技术研发人员：黄欣 柴小伟
受保护的技术使用者：上海市同济医院
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/9/6