小鼠抗兔CD5单克隆抗体及其应用的制作方法

小鼠抗兔cd5单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种小鼠抗兔cd5单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.流式细胞分选具有可以通过不同荧光标记进行高通量细胞分选的特点，能够在短时间对几十万到几千万的细胞群进行分选，通过b细胞表面膜结合免疫球蛋白和特异性荧光标记抗原筛选得到的靶b细胞，进行分离及体外单细胞rna提取和扩增，得到重组抗体序列信息，可以大大提高从免疫动物中得到特定抗原抗体序列的速度。因此，基于流式细胞分选进行单个b细胞分离的抗体开发方案能够提高抗体开发效率。
3.目前，单个b细胞体外培养、通过微流控技术进行单个b细胞筛选是常用的两种单个b细胞分选方案，这两种方式都不需要通过筛选t细胞，获得抗原结合阳性的b细胞。因此，开发基于流式细胞分选进行兔单个b细胞分离的抗体开发方案需要使用相应的兔t细胞分选标志物抗体，从而保证获得的b细胞纯度。其次，目前也有报道的小鼠抗兔cd5单克隆抗体，但基本掌握在国外公司(如bd，bio-rad等)，因此基于小鼠杂交瘤技术开发自主的抗兔cd5抗体需求迫切。
4.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的第一目的在于提供一种小鼠抗兔cd5单克隆抗体。
6.本发明的第二目的在于提供上述小鼠抗兔cd5单克隆抗体在cd5+t细胞群分选中的应用。
7.本发明的第三目的在于提供一种cd5+t细胞群的标记物。
8.本发明的第四目的在于提供一种杂交瘤细胞。
9.本发明的第五目的在于提供一种小鼠抗兔cd5单克隆抗体的制备方法。
10.第一方面，本发明提供了一种小鼠抗兔cd5单克隆抗体，所述小鼠抗兔cd5单克隆抗体的可变区包括：具有如seq id no.1所示氨基酸序列的互补决定区cdr1-vh、具有如seq id no.2所示氨基酸序列的互补决定区cdr2-vh、具有如seq id no.3所示氨基酸序列的互补决定区cdr3-vh、具有如seq id no.4所示氨基酸序列的互补决定区cdr1-vl、具有如seq id no.5所示氨基酸序列的互补决定区cdr2-vl和具有如seq id no.6所示氨基酸序列的互补决定区cdr3-vl。
11.作为进一步技术方案，所述可变区包括具有如seq id no.7所示氨基酸序列的重链可变区vh。
12.作为进一步技术方案，所述可变区包括具有如seq id no.8所示氨基酸序列的轻链可变区vl。
13.第二方面，本发明提供了上述小鼠抗兔cd5单克隆抗体在cd5+t细胞群分选中的应用。
14.作为进一步技术方案，所述cd5+t细胞群包括兔外周血淋巴细胞中的cd5+t细胞群。
15.第三方面，本发明提供了一种cd5+t细胞群的标记物，所述标记物包括上述小鼠抗兔cd5单克隆抗体和荧光染料；
16.所述小鼠抗兔cd5单克隆抗体与荧光染料偶联。
17.作为进一步技术方案，所述荧光染料包括ifluor488或ifluor594。
18.第四方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞表达上述小鼠抗兔cd5单克隆抗体。
19.作为进一步技术方案，所述杂交瘤细胞由小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合得到；
20.所述小鼠脾细胞表达所述小鼠抗兔cd5单克隆抗体。
21.第五方面，本发明提供了上述小鼠抗兔cd5单克隆抗体的制备方法，包括：在小鼠腹腔内培养上述杂交瘤细胞，然后分离得到所述小鼠抗兔cd5单克隆抗体。
22.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
23.本发明提供了一种小鼠抗兔cd5单克隆抗体，经发明人研究发现，该单克隆抗体特异性强，灵敏度高，能够特异性识别cd5+t细胞群，进而用于cd5+t细胞群的分选。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
25.图1为实施例1提供的sds-page结果；
26.图2为实施例4提供的兔cd4的过表达细胞株wb结果；
27.图3为实施例4提供的兔cd5的过表达细胞株wb结果；
28.图4为实施例4提供的兔cd4的过表达细胞株fc结果；
29.图5为实施例4提供的兔cd5的过表达细胞株fc结果；
30.图6为实施例5提供的流式检测结果；
31.图7为实施例9提供的流式竞争实验结果；
32.图8为实施例9提供的流式效价实验结果。
具体实施方式
33.下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
34.需要说明的是，抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端
结构域。重链的可变结构域可以被称为“vh”。轻链的可变结构域可以被称为“vl”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区由被三个称为“互补决定区”或“cdr”的高变区打断的构架区构成。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐cdr的作用，所述cdr主要负责与抗原的结合。
[0035]“构架”或“fr”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为cdr的那些区域之外的区域。每个抗体可变结构域构架可以被进一步细分成被cdr分隔开的毗邻区域(fr1、fr2、fr3和fr4)。
[0036]
通常情况下，重链和轻链的可变区vl/vh可由以下编号的cdr与fr按如下组合排列连接获得：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。
[0037]
在本发明中，cdr1-vh、cdr2-vh和cdr3-vh分别指重链可变区的三个高变区，相应的，cdr1-vl、cdr2-vl和cdr3-vl分别指轻链可变区的三个高变区。
[0038]
第一方面，本发明提供了一种小鼠抗兔cd5单克隆抗体，所述小鼠抗兔cd5单克隆抗体的可变区包括：具有如seq id no.1所示氨基酸序列的互补决定区cdr1-vh、具有如seq id no.2所示氨基酸序列的互补决定区cdr2-vh、具有如seq id no.3所示氨基酸序列的互补决定区cdr3-vh、具有如seq id no.4所示氨基酸序列的互补决定区cdr1-vl、具有如seq id no.5所示氨基酸序列的互补决定区cdr2-vl和具有如seq id no.6所示氨基酸序列的互补决定区cdr3-vl。
[0039]
上述可变区的各个序列如表1所示：
[0040]
表1
[0041]
cdr1-vhtytmsseq id no.1cdr2-vhyisngggstyysdtvkgseq id no.2cdr3-vhsyyghytvdyseq id no.3cdr1-vlrasksvstsgysymhseq id no.4cdr2-vllvsnlesseq id no.5cdr3-vlaqnlelpwtseq id no.6
[0042]
经发明人研究发现，小鼠抗兔cd5单克隆抗体特异性强，灵敏度高，能够特异性识别cd5+t细胞群，进而用于cd5+t细胞群的分选。
[0043]
在一些优选的实施方式中，所述可变区包括具有如seq id no.7所示氨基酸序列的重链可变区vh。
[0044]
可变区的重链可变区vh的氨基酸序列如下：
[0045]
evqlqesggglvqpggslklscaasgftfstytmswvrqtpekrlewvayisngggstyysdtvkgrftisrdnakntlylqmsslksedtamyycarsyyghytvdywgqgttltvssakttppsvyplapgsaaqtnsmvtlgclvkgyfpepvtvtwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvpsstwpsetvtcnvahpasstkvdkkivprdcgckpcictvpevssvfifppkpkdvltitltpkvtcvvvdiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenykntqpimdtdgsyfvysklnvqksnweagntftcsvlheglhnhhtekslshspgk(seq id no.7)。
[0046]
在一些优选的实施方式中，所述可变区包括具有如seq id no.8所示氨基酸序列的轻链可变区vl。
[0047]
可变区的轻链可变区vl的氨基酸序列如下：
[0048]
divmtqspaslavslgqratisyrasksvstsgysymhwnqqkpgq
[0049]
pprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlrisrveaedvgvyycaqnle
[0050]
lpwtfgggtkleikradaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdi
[0051]
nvkwkidgserqngvlnswtdqdskdstysmsstltltkdeyerhnsy
[0052]
tceathktstspivksfnrnec(seq id no.8)。
[0053]
第二方面，本发明提供了上述小鼠抗兔cd5单克隆抗体在cd5+t细胞群分选中的应用。
[0054]
本发明提供的小鼠抗兔cd5单克隆抗体特异性强，灵敏度高，能够特异性识别cd5+t细胞群，因此，能够用于cd5+t细胞群的分选。
[0055]
在一些优选的实施方式中，所述cd5+t细胞群包括兔外周血淋巴细胞、兔脾脏、兔淋巴结等相关组织免疫细胞中的cd5+t细胞群。
[0056]
第三方面，本发明提供了一种cd5+t细胞群的标记物，所述标记物包括上述小鼠抗兔cd5单克隆抗体和荧光染料；
[0057]
所述小鼠抗兔cd5单克隆抗体与荧光染料偶联。
[0058]
本发明提供的标记物能够用于cd5+t细胞群的特异性标记。
[0059]
在一些优选的实施方式中，所述荧光染料包括但不限于ifluor488或ifluor594，或者采用本领域技术人员所熟知的其他荧光染料。
[0060]
第四方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞表达上述小鼠抗兔cd5单克隆抗体。
[0061]
该杂交瘤细胞能够用于小鼠抗兔cd5单克隆抗体的生产。
[0062]
在一些优选的实施方式中，所述杂交瘤细胞由小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合得到；
[0063]
所述小鼠脾细胞表达所述小鼠抗兔cd5单克隆抗体。
[0064]
第五方面，本发明提供了上述小鼠抗兔cd5单克隆抗体的制备方法，包括：在小鼠腹腔内培养上述杂交瘤细胞，然后分离得到所述小鼠抗兔cd5单克隆抗体。
[0065]
该小鼠抗兔cd5单克隆抗体的制备方法简单高效，成本低。
[0066]
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
[0067]
实施例1免疫原制备
[0068]
cd5蛋白是一种单次跨膜的糖蛋白，主要表达在t细胞细胞膜表面。兔cd5分子中24-488为胞外区段，通过真核表达得到浓度和纯度符合免疫要求的兔cd5胞外全长蛋白。
[0069]
细胞转染和蛋白纯化：
[0070]
试剂：expi293
tm
表达系统试剂盒(thermo，a14635)，镍nta琼脂糖凝胶，pbs缓冲液。
[0071]
耗材：96孔深孔板，移液器吸头。
[0072]
设备：恒温摇床，电动移液器。
[0073]
步骤a)：将expi293f培养基提前置于37℃水浴锅温育。显微镜下观察细胞状态和expi293f细胞生长情况，根据当天细胞生长量及后续转染实验所需，确定当天细胞扩增实验传代比例，一般转染前一天转接密度控制在2x106活细胞/ml左右。取出co2细胞摇床中的
细胞液，计数后，计算出所需转接的细胞量。根据转接的细胞量选择最适规格的细胞摇瓶，一般培养体积不超过摇瓶体积的1/3，不低于摇瓶体积的1/5。根据细胞密度加入预热好的expi293培养基使细胞终密度在2x106活细胞/ml左右，用于第二天的转染操作。
[0074]
步骤b)：转染当日，将expi293培养基，室温避光提前预热。确定好需要转染的细胞量，准备相应数量的细胞摇瓶。根据细胞计数操作确定细胞密度，加入预热好的培养基稀释细胞，使其细胞终密度为3x106活细胞/ml，用移液器按1ml/孔分装到深孔板中，小心放入细胞摇床：37℃、8％co2、900rpm、80％湿度培养。取相应数量的细胞摇瓶，按照1ml细胞中1ug dna+60ul opti-mem(冷的试剂)的比例分装到培养板中，可用移液枪吹打混匀(抗体推荐比例hc:lc＝1:2)。另取最适体积的离心管，按照1ml细胞中3.2ul expifectamine 293+60ul opti-mem(冷的试剂)的比例稀释足量转染试剂，轻轻颠倒混匀后室温静置5mins。5mins后将稀释的转染试剂移至一次性储液槽中，用移液器移至96孔细胞培养板的相应位置，静置10-20mins。用移液器将静置后的expifectamine 293/兔cd5表达质粒复合物加入到细胞悬液中，小心放入摇床：37℃、8％co2、900rpm、80％湿度培养。转染后次日18-22h，1ml添加6ul enhancer1和60ul enhancer 2。4-7天后收获上清用于重组蛋白纯化。
[0075]
步骤c)：重组蛋白中含有组氨酸标签(his-tag)，通过镍柱进行纯化：细胞上清通过0.45um过滤器后，加入镍nta琼脂糖凝胶，放置4度进行孵育结合。洗脱后的重组蛋白通过超滤管或透析方式置换程pbs缓冲液，通过sds-page考染鉴定(如图1)，兔cd5重组蛋白在page胶中有明显特异性条带，分子量在55kda附近，蛋白纯度和浓度达到免疫要求。
[0076]
实施例2小鼠免疫和血清采取
[0077]
小鼠免疫操作：
[0078]
试剂：佐剂，75％酒精。
[0079]
耗材：注射器。
[0080]
样品：兔cd5重组蛋白。
[0081]
步骤a)：动物选择：兔子采用balb/c，雌鼠，体重18-22g左右，周龄在6-8周左右，选择被毛光滑，活动自如的健康动物。
[0082]
步骤b)：实验前准备：小鼠做好标记。
[0083]
步骤c)：将抗原从-20℃冰箱中拿出，常温溶解，避免反复冻融。并将注射器做好标记，写上项目号和动物号。
[0084]
步骤d)：抽取抗原(抗原完全混匀)，抗原浓度为0.5mg/ml，小鼠免疫剂量为0.1ml/只。
[0085]
步骤e)：抽取佐剂，佐剂和抗原为1:1体积比抽取。首免采用完全佐剂，二免和三免采用不完全佐剂。抽取时，佐剂要充分混合均匀后再抽入注射器。
[0086]
步骤f)：二个注射器用针筒连接管对接后进行完全乳化，乳化标准为：乳化好的免疫原滴入37℃水中不分散为合格。
[0087]
步骤g)：免疫：小鼠采用皮下多点注射。免疫时间：免疫间隔时间为14天。小鼠经过三次免疫后第7天采小样血进行效价检测。
[0088]
步骤h)：采小样血清的步骤：采血者的左手拇指及食指压迫小鼠的颈部两侧，从背部较紧地握住小鼠颈部，使眼眶后静脉丛充血。小鼠整体抓在手里时，确保小鼠身体保持直线姿势。右手使采血器与鼠面成45℃的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再
转180度使斜面对着眼眶后界。刺入深度大约2～3mm。当感到有阻力时即停止推进，如果没有出血则轻微转动采血器。一次性采血200ul，取血后用无菌棉擦拭创口，微微用力按压以止血，确认小鼠状态无异常后方可放回笼中。
[0089]
步骤i)：将采集的血清小样通过离心机离心10分钟，转速为10000rpm。离心后取上清，冻在-20℃冰箱备用。
[0090]
实施例3血清效价检测
[0091]
小鼠血清针对免疫原效价通过间接elisa方法检测，血清1:8100稀释条件下od450nm值超过1.0的小鼠即为免疫合格，可进行下一步操作。
[0092]
血清阶段间接elisa操作：
[0093]
试剂：羊抗鼠-hrp(华安生物:ha1006)、tmb底物(sigma:t2885)、tris(上海生工：a501492)、甘氨酸(上海生工：gb0235)、bsa(上海生工：a500023-0100)、吐温-20(上海生工：a600560)、nahco3(上海生工：a610482-0500)；na2co3、na2hpo4·
12h2o、nah2po4·
2h2o、柠檬酸、丙三醇、dmso、浓硫酸购自杭州双木化工；双氧水、edta购自上海生工，国产分析纯。
[0094]
耗材：酶标板(杭州生友)。
[0095]
设备：电热恒温培养箱(上海森信：drp-9162型)、酶标仪器(md:cmax plus)。
[0096]
步骤a)：包被：兔cd5重组蛋白用包被缓冲液稀释至1μg/ml，50μl/well的量加入到酶标板中，盖好盖子，4℃包被过夜。
[0097]
步骤b)：封闭：甩干孔中液体，100μl/well的量往酶标板中加入1％bsa/tbs，放入37℃电热恒温培养箱中恒温封闭1h。
[0098]
步骤c)：加样：甩干孔中液体，将不同稀释比例的血清50μl/well的量加入到酶标板。盖好盖子，放入37℃恒温培养箱孵育45min。
[0099]
步骤d)：加入二抗：甩干一抗混合液，按180μl/well的量往酶标板中加入洗涤液(1
×
tbst)，洗涤酶标板2次。1％ bsa将羊抗鼠-hrp稀释至工作浓度(1:10000)，50μl/well的量加入到酶标板中，盖好盖子，放入37℃恒温培养箱孵育30min。
[0100]
步骤e)：显色、终止并读数：弃去孔中液体，按180μl/well的量往酶标板中加入洗涤液，洗涤酶标板3次；于各反应孔中加入50μl新配制的tmb显色底物，37℃恒温孵育10min；随后加入50μl/well的终止液终止反应，并在酶标仪上测定450nm处的od值。
[0101]
结果显示(如表2)，三只小鼠效价(1:8100)均达到要求。
[0102]
表2
[0103]
[0104][0105]
实施例4慢病毒感染技术获得rabbit cd4；cd5过表达细胞株和细胞株验证
[0106]
抗体筛选的目的是得到具有流式应用的单克隆细胞株，因此通过慢病毒感染技术构建得到兔cd5的过表达细胞株，同时构建了兔cd4的过表达细胞株用于筛选得到cd5特异性抗体分泌的杂交瘤细胞株。
[0107]
过表达单克隆细胞株的构建操作
[0108]
试剂：青霉素链霉素(双抗)100x(上海源培)；高糖dmem(上海源培)；opti-mem
tm
i reduced serum medium(thermo)；胎牛血清(四季青)；vigofect高效真核转染试剂；50mm细胞培养级二甲基亚砜dmso(索宝)；聚凝胺；胰蛋白酶-edta消化液(0.25％)含酚红(hyclone)；磷酸盐缓冲液(pbs)(上海源培)。
[0109]
耗材：6孔细胞培养板(thermo-labserv)；96孔细胞培养板(thermo-labserv)；24孔细胞培养板(thermo-labserv)；100mm细胞培养皿(thermo-labserv)；冻存管-1.5ml(avantech)；离心管-15ml(bd)；离心管-50ml(bd)；glutamax(gibco)；一次性低吸附滤头-0.22um-(黄色)(milipore)；2ml一次性注射器-国产；1.5ml离心管ep管；10ul、200ul、1000ul枪头。
[0110]
设备：co2培养箱(thermo：bb150)；12孔排枪(eppendorf)；生物安全柜(博科生物：bsc-1500iia2-x)；4℃冰箱(中科美菱：yc-260l)；水浴锅(博讯：hhs-21-4)；离心机(thermo：st16)。
[0111]
步骤a)：构建兔cd4和兔cd5全长flag标签的过表达质粒，载体选择pqcxip，全长序列如下所示。
[0112]
rabbit cd4-flag：
[0113]
nrriyfqclllvlplallpaatwgktvvrgkagaivelpcqssqkrnsvfnwkhanqvkilgnqgsssssfwlkgnsplsnrveskknmwdqgsfplvikdlrmddsgtyicevgdkkmevellvfrltanpntrllhgqsltltlegpsvgspsvqwkspenkiietgptcsmpklrlqdsgtwschlsfqdqnkleldikiivlgfpkasatvykkegeqvefsfplnfedeslsgelmwqvdgassaqswvsfsledrkvsvqkilpdlkiqmskglplsltlpqalhryagsgnlsltldkgklhqqvslvmlkvtqvknkltcevlgpidpkmklslkledqeakvstqkmvqvldpkagtwqcllssgdqvlleskadvlatglshqqptllagalggtaglvlfaglciyccvkcrhrrhqaqrmsqikkllsekktcqcphrlqktynlldykddddk(seq id no.9)。
[0114]
rabbit cd5-flag：
[0115]
gsqppplaavsllgmlvtsclgwsswdepgflanltnshspcqgqlevyttgswhtvcsrswgmnsegwkdpwkasklcqqlhcgealavgpfphfnkprnqlfcmglpgsfancsrisqchslglvcleprkttppptspppe
ttpqptapprlqlvpgprglhcagvvefyrgslggticaeaqdknedlgkfvcatlqcgslkevtaveaagelggrrplpirwgiqnasctsleqcfrriqpqdgrralalvcsdfqpkvqsrlvggssicegtaevrqgprwaalchnssakgtarweelcqeqqcgivnsyyvldtgkkaawgfscpqeklsqchelrekkanckrvfvtcqdpnpagpaakavasiilalvllavllvvcgplayrklvkkfrqkkqrqwigptemsqnmsfhrnhtattvrsqagnptashvdneysqpprnsrlsaypalegalhrsstqpdnssdsdydlhaaqrldykddddk(seq id no.10)。
[0116]
步骤b)：慢病毒包装实验：转染实验前24小时，将293t细胞传至6孔板中。实验当天将vigofect工作液加入到含有总量为2.5ug的质粒中，轻轻混匀，所得的转染工作液在室温放置15min。轻轻混匀后逐滴加入到细胞培养基中，置37℃，5％co2培养箱中。
[0117]
步骤c)：慢病毒感染实验:慢病毒感染细胞实验前24小时，将hela(人宫颈癌细胞)传至6孔板中。慢病毒感染实验当天，将新鲜培养基(+聚凝胺)和病毒上清加入细胞中。
[0118]
步骤d)：puromycin筛选实验：慢病毒感染48h后使用puromycin处理。每天观察细胞，两天后细胞会大量死亡，根据死亡细胞的量换液(含puromycin的筛选培养基)。对照细胞系在puromycin处理后完全死亡，另外实验组感染孔中细胞大量存活并长到一定密度后，进行细胞单克隆化。
[0119]
步骤e)：单克隆化实验：将多克隆细胞株进行重悬计数，2倍梯度稀释(每个梯度3列)，一周内挑出12个有单克隆的细胞孔。96孔中细胞长至70％-90％后，将12个克隆胰酶消化重悬浮后转移至24孔中。24孔板中细胞长至70％-90％后，1分2传代，一份用于单克隆鉴定，另一份等待鉴定结果后，挑选克隆扩大冻存。
[0120]
步骤f)：通过wb(western blot)和fc(flow cytometry)进行单克隆验证实验：
[0121]
wb：去上清，pbs洗2遍，100％细胞加入200μl loading，用枪头搅动至完全接触均匀，收集至ep管中进行wb检测，一抗为flag标签抗体。
[0122]
fc：去上清，pbs洗2遍，细胞重悬浮后，分别孵育小鼠抗兔cd4/cd5阳性抗体，用于进行流式检测。
[0123]
参照细胞状态和wb/fc检测结果最终选择hela-rcd4-flag 5#和hela-rcd5-flag 6#用于后续克隆验证(wb结果如图2和图3；fc结果如图4和图5)。
[0124]
需要说明的是，图2-图5中，1#-12#为组别编号。
[0125]
实施例5细胞融合技术获得鼠杂交瘤单克隆细胞株
[0126]
取上述经过抗原脾内注射的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(sp2/0,atcc)按7:1的比例在无血清的imdm培养基中混匀后，1,500rpm离心3min后去除培养基，将混匀后的细胞在37℃水浴中加入1ml peg(分子量1500)融合剂，融合1min，用无血清的imdm培养基终止融合后1,200rpm离心3min，弃去上清后沉淀用hat培养基悬浮，分装到96孔细胞板中，放置于37℃，5％co2的细胞培养箱中培养。
[0127]
细胞培养箱中培养3天后，用hat培养基换液一次，第7天用ht培养基加液，等到融合细胞覆盖孔底5％-20％时，以兔cd5重组蛋白为包被抗原通过常规间接elisa方法筛选阳性孔，共获9个阳性孔。对9个孔中的克隆上清进行流式检测，筛选出8个呈特异性的细胞株，进行有限稀释法克隆，获得1株能较好的分泌抗兔cd5特异性单抗的杂交瘤细胞株b1。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。
[0128]
细胞上清阶段间接elisa方法：
[0129]
试剂：羊抗鼠-hrp(华安生物:ha1006)、tmb底物(sigma:t2885)、tris(上海生工：
a501492)、甘氨酸(上海生工：gb0235)、bsa(上海生工：a500023-0100)、吐温-20(上海生工：a600560)、nahco3(上海生工：a610482-0500)；na2co3、na2hpo4·
12h2o、nah2po4·
2h2o、柠檬酸、丙三醇、dmso、浓硫酸购自杭州双木化工；双氧水、edta购自上海生工，国产分析纯。
[0130]
耗材：酶标板(杭州生友)。
[0131]
设备：电热恒温培养箱(上海森信：drp-9162型)、酶标仪器(md:cmax plus)。
[0132]
间接elisa操作
[0133]
步骤a)：重组兔cd5蛋白用包被缓冲液稀释至1μg/ml，50μl/well的量加入到酶标板中，盖好盖子，4℃包被过夜。
[0134]
步骤b)：甩干孔中液体，100μl/well的量往酶标板中加入1％bsa/tbs，放入37℃电热恒温培养箱中恒温封闭1h。
[0135]
步骤c)：甩干孔中液体，将融合后的杂交瘤细胞上清50μl/well的量加入到酶标板，以iv血清作为阳性对照。盖好盖子，放入37℃恒温培养箱孵育30min。
[0136]
步骤d)：甩干一抗混合液，按180μl/well的量往酶标板中加入洗涤液(1
×
tbst)，洗涤酶标板2次。1％ bsa将羊抗鼠-hrp稀释至工作浓度(1:10000)，50μl/well的量加入到酶标板中，盖好盖子，放入37℃恒温培养箱孵育30min。
[0137]
步骤e)：显色、终止并读数：弃去孔中液体，按180μl/well的量往酶标板中加入洗涤液，洗涤酶标板3次；于各反应孔中加入50μl新配制的tmb显色底物，37℃恒温孵育5min；随后加入50μl/well的终止液终止反应，并在酶标仪上测定450nm处的od值。
[0138]
细胞上清阶段流式检测操作：
[0139]
试剂：羊抗鼠-ifluor488(华安生物:ha1006)、磷酸盐缓冲液(pbs)，ph7.2(上海源培)。
[0140]
耗材：96孔细胞培养板(thermo-labserv)；离心管-15ml(bd)；1.5ml离心管ep管；10ul、200ul、1000ul枪头。
[0141]
设备：流式细胞仪(安捷伦)；12孔排枪(eppendorf)；4℃冰箱(中科美菱：yc-260l)；离心机(thermo：st16)。
[0142]
步骤a)：收集细胞，并测定细胞总数和细胞活力(通常细胞活力在95％左右且不低于90％)。
[0143]
步骤b)：用预冷的pbs将细胞清洗2次，1500rpm，5min，4℃，甩干。
[0144]
步骤c)：加入一定量预冷的pbs重悬浮细胞，保证细胞密度在5x105-2.5x10
6 cells/ml，以200ul/孔加入到96孔板中。1500rpm，5min，4℃，甩干。
[0145]
步骤d)：加入50ul细胞上清或用预冷pbs适当稀释的一抗，4℃孵育1h。
[0146]
步骤e)：用预冷的pbs将细胞清洗2次，1500rpm，5min，4℃，甩干。
[0147]
步骤f)：加入用预冷的pbs 1:1000稀释的荧光二抗，4℃避光孵育30min。
[0148]
步骤g)：用预冷的pbs将细胞清洗3次，1500rpm，5min，4℃，甩干。
[0149]
步骤h)：用200ul pbs重悬浮细胞，流式细胞仪上机检测。
[0150]
参照细胞状态和流式检测结果(如图6)最终选择b1进行腹水制备。
[0151]
实施例6抗cd5单克隆抗体亚型鉴定
[0152]
将细胞上清与sigma公司的抗balb/c小鼠igg1、igg2a、igg2b、igg3、igm抗体进行酶联免疫吸附试验，用于检测该细胞上清的重链和轻链的亚型。
[0153]
细胞上清亚型检测操作
[0154]
试剂：分型二抗(sigma)、tmb底物(sigma:t2885)、tris(上海生工：a501492)、甘氨酸(上海生工：gb0235)、bsa(上海生工：a500023-0100)、吐温-20(上海生工：a600560)、nahco3(上海生工：a610482-0500)；na2co3、na2hpo4·
12h2o、nah2po4·
2h2o、柠檬酸、丙三醇、dmso、浓硫酸购自杭州双木化工；双氧水、edta购自上海生工，国产分析纯。
[0155]
耗材：酶标板(杭州生友)。
[0156]
设备：电热恒温培养箱(上海森信：drp-9162型)、酶标仪器(md:cmax plus)。
[0157]
步骤a)：重组兔cd5蛋白用包被缓冲液稀释至1μg/ml，50μl/well的量加入到酶标板中，盖好盖子，4℃包被过夜。
[0158]
步骤b)：甩干孔中液体，100μl/well的量往酶标板中加入1％bsa/tbs，放入37℃电热恒温培养箱中恒温封闭1h。
[0159]
步骤c)：甩干孔中液体，将b1克隆细胞上清50μl/well的量加入到酶标板。盖好盖子，放入37℃恒温培养箱孵育30min。
[0160]
步骤d)：甩干一抗混合液，按180μl/well的量往酶标板中加入洗涤液(1
×
tbst)，洗涤酶标板2次。1％ bsa将分型二抗稀释至工作浓度(1:3000)，50μl/well的量加入到酶标板中，盖好盖子，放入37℃恒温培养箱孵育30min。
[0161]
步骤e)：显色、终止并读数：弃去孔中液体，按180μl/well的量往酶标板中加入洗涤液，洗涤酶标板3次；于各反应孔中加入50μl新配制的tmb显色底物，37℃恒温孵育5min；随后加入50μl/well的终止液终止反应，并在酶标仪上测定450nm处的od值。
[0162]
检测结果表明：杂交瘤细胞株b1分泌的抗兔cd5重组蛋白单抗抗体亚型为igg1重链和kappa轻链(如表3)。
[0163]
表3
[0164][0165][0166]
实施例7采集和纯化抗cd5单克隆抗体
[0167]
8周龄左右balb/c小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡，7-10天后腹腔注入约1
×
106个杂交瘤细胞，7-10天后可见小鼠腹部明显膨大，用采血针头采集腹水，10，000rpm/min离心3min，收集上清液即为单克隆抗体腹水，接着将收集的单克隆抗体腹水进行纯化，得到抗兔cd5重组蛋白单克隆抗体。
[0168]
纯化方法：
[0169]
试剂：1
×
pbs(ph7.4)、0.2m甘氨酸(ph 2.7)、1m碳酸氢钠、20％乙醇、1m nacl。
[0170]
耗材：1.5ml离心管、50ml离心管、50ml注射器、ph试纸(1-14)、封口膜、8000-14000da透析袋(夹子)。
[0171]
设备：双道微量注射泵、电脑核酸蛋白检测仪、4℃冰箱、核酸蛋白测定仪。
[0172]
样品：待纯化腹水。
[0173]
腹水纯化步骤：
[0174]
步骤a)：将protein g柱用20ml 1
×
pbs(ph7.4)，流速70ml/h充分清洗。
[0175]
步骤b)：取待纯化的腹水6ml于6个1.5ml离心管(各1ml)中，12000rpm，离心5min。取上清于50ml离心管中，用1
×
pbs稀释至15ml。
[0176]
步骤c)：将稀释过的腹水样品以40ml/h流速上样，重复一次。
[0177]
步骤d)用40ml 1
×
pbs(ph7.4)以70ml/h的流速清洗柱子，连接蛋白检测仪，在电脑上开启图谱收集器，编辑收集样品的信息(项目号，克隆号)并开始。待图谱基线跑至平稳，将柱子转至装有甘氨酸溶液(ph 2.7，0.2m)的注射器上，以40ml/h的速度洗脱抗体，当仪器的示数开始升高时开始收集抗体。
[0178]
步骤e)：在抗体收集过程中以1m的碳酸氢钠及时调节抗体的ph值至7.5，并于纯化记录本上记录洗脱峰的最高峰值。
[0179]
步骤f)：抗体收集完后，调节ph值至7.5，并于纯化记录本上记录洗脱的抗体体积，将收集到的抗体于2l 1
×
pbs中透析，透析好的抗体取到原50ml离心管中，在核酸蛋白测定仪上测定抗体的浓度，4℃冰箱保存。
[0180]
纯化抗体效价检测：以兔cd5重组蛋白为抗原，用间接elisa方法检测单抗抗体的效价，阳性结果判定标准：以p/n值(阳性孔od值/阴性孔od值)大于或等于2.1为阳性，分析结果表明单抗抗体的效价达32ng/ml(如表4)。
[0181]
表4
[0182][0183]
实施例8抗体荧光偶联和直标抗体验证
[0184]
实验所使用的方案是将荧光素偶联到单克隆抗体上，通过抗体带上荧光染料后用于细胞分选实验。
[0185]
试剂：b1抗体，无水dmso，1
×
pbs(ph＝7.4)，1m nahco3(ph8.75)，ifluor488/594。
[0186]
耗材：15ml和50ml进口离心管，1.5ml ep管，移液器吸头，3kd/30kd超滤管。
[0187]
设备：电子分析天平，移液枪，4℃冰箱，-20℃冰箱，混样器，超微量分光光度计，离心机。
[0188]
抗体的荧光标记：
[0189]
步骤a)：接收需求标记的抗体并确认抗体的应用是否合格，确定抗体的buffer信息是否是pbs only。如果buffer符合要求则继续，如果除抗体外还有其他氨基类物质则需重新纯化后再标记。
[0190]
步骤b)：测量抗体的浓度并将抗体浓度调整为2.5mg/ml左右(浓度偏高可以稀释，浓度偏低需用超滤管浓缩)。
[0191]
步骤c)：取合适体积的离心管并用天平称量其重量为m1，用移液枪转移需要标记的抗体入称好重量的离心管中，再次称量其重量m2，则记抗体的体积为(m2-m1)ml，加入2.5*(m2-m1)/100的1m的nahco3混匀待用。
[0192]
步骤d)：从-20度冰箱拿出荧光染料恢复室温20-30分钟，加入无水dmso并充分混匀(ifluor488加入105.81ul；ifluor594加入86.17ul)。
[0193]
步骤e)：吸取溶解好的染料(10倍的抗体总量)加入到抗体溶液中，放置在混样器上避光孵育2小时。
[0194]
步骤f)：用30kd的超滤管4000rpm离心抗体染料混合液除去多余的自由染料，直至离心下来的溶液颜色透明为止。
[0195]
步骤g)：将离心好的标记抗体转移到避光管中并通过超微量分光光度计测量a280及a495，a588，a656的吸光值；计算抗体的真实浓度并将标记的抗体浓度调整为2mg/ml。
[0196]
步骤h)：按体积比1:1的比例加入等体积的保护剂，将抗体定量成1mg/ml。
[0197]
步骤i)：dol值控制：计算标记后抗体的dol值，488染料应该控制dol值在6-9之间；594染料应该控制在3.5-5.5之间。如果dol值达标则加入等体积的荧光标记抗体保护液后
放置在混样器上混匀30min后保存在-20度或者4度冰箱中。
[0198]
实施例9直标抗体流式验证
[0199]
为确定荧光偶联抗体是否能识别兔外周血淋巴细胞中的cd5+t细胞群，以及该抗体的灵敏度和特异性情况，因此需要通过流式实验进行验证。
[0200]
试剂：兔外周血淋巴细胞分离液试剂盒(solarbio：p8760)、红细胞裂解液(solarbio：r1010)、b1-ifluor488、b1-ifluor594、cd5 antibody-fitc、磷酸盐缓冲液(pbs)，ph7.2(上海源培)。
[0201]
耗材：离心管-15ml(bd)；1.5ml离心管ep管；10ul、200ul、1000ul枪头。
[0202]
设备：流式细胞仪(安捷伦)；12孔排枪(eppendorf)；4℃冰箱(中科美菱：yc-260l)；离心机(thermo：st16)。
[0203]
步骤a)：通过兔外周血淋巴细胞分离液试剂盒将新鲜兔抗凝血分离得到兔pbmc，经过裂解红细胞后，细胞备用。
[0204]
步骤b)：用预冷的pbs将细胞清洗2次，1500rpm，5min，4℃，甩干。
[0205]
步骤c)：加入一定量预冷的pbs重悬浮细胞，保证细胞密度在1x108cells/ml，以100ul/孔加入到ep管中。
[0206]
步骤d)：将b1-ifluor488按照比例稀释后加入到细胞悬液中，同时将b1-ifluor594按照比例稀释后和cd5 antibody-fitc一起混匀加入到细胞悬液中，室温孵育20min。
[0207]
步骤e)：用预冷的pbs将细胞清洗2次，1500rpm，5min，4℃，甩干。
[0208]
步骤h)：用200ul pbs重悬浮细胞，流式细胞仪上机检测。
[0209]
通过与cd5-fitc阳性抗体和同型对照-ifluor488的竞争实验，表明b1与阳性抗体识别的细胞群是一致的(如图7)，另外b1-ifluor488 1:2000作为使用浓度最好(如图8)。
[0210]
实施例10重轻链可变区测序
[0211]
对鼠杂交瘤单细胞克隆株b1的抗体基因进行测序，得到该克隆的重轻链可变区序列。
[0212]
试剂:tae缓冲液，琼脂糖，核酸染料。
[0213]
耗材:移液器吸头。
[0214]
设备：核酸电泳仪，核酸成像仪。
[0215]
重轻链可变区测序：
[0216]
克隆b1重轻链可变区序列通过pcr(2nd pcr)产物进行测序获得。
[0217]
步骤a)：重链和轻链pcr产物通过核酸电泳，观察到目标条带；
[0218]
步骤b)：通过切胶回收后，送基因测序公司获得克隆b1重链和轻链的可变区核酸和蛋白序列。
[0219]
其中，重链可变区vh的氨基酸序列如seq id no.7所示，轻链可变区vl的氨基酸序列如seq id no.8。
[0220]
进一步获得如表1所示的高变区序列。
[0221]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进
行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种小鼠抗兔cd5单克隆抗体，其特征在于，所述小鼠抗兔cd5单克隆抗体的可变区包括：具有如seq id no.1所示氨基酸序列的互补决定区cdr1-vh、具有如seq id no.2所示氨基酸序列的互补决定区cdr2-vh、具有如seq id no.3所示氨基酸序列的互补决定区cdr3-vh、具有如seq id no.4所示氨基酸序列的互补决定区cdr1-vl、具有如seq id no.5所示氨基酸序列的互补决定区cdr2-vl和具有如seq id no.6所示氨基酸序列的互补决定区cdr3-vl。2.根据权利要求1所述的小鼠抗兔cd5单克隆抗体，其特征在于，所述可变区包括具有如seq id no.7所示氨基酸序列的重链可变区vh。3.根据权利要求1所述的小鼠抗兔cd5单克隆抗体，其特征在于，所述可变区包括具有如seq id no.8所示氨基酸序列的轻链可变区vl。4.权利要求1-3任一项所述的小鼠抗兔cd5单克隆抗体在cd5+t细胞群分选中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述cd5+t细胞群包括兔外周血淋巴细胞中的cd5+t细胞群。6.一种cd5+t细胞群的标记物，其特征在于，所述标记物包括权利要求1-3任一项所述的小鼠抗兔cd5单克隆抗体和荧光染料；所述小鼠抗兔cd5单克隆抗体与荧光染料偶联。7.根据权利要求6所述的标记物，其特征在于，所述荧光染料包括ifluor488或ifluor594。8.一种杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞表达权利要求1-3任一项所述的小鼠抗兔cd5单克隆抗体。9.根据权利要求8所述的杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞由小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合得到；所述小鼠脾细胞表达所述小鼠抗兔cd5单克隆抗体。10.权利要求1-3任一项所述小鼠抗兔cd5单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：在小鼠腹腔内培养权利要求8或9所述的杂交瘤细胞，然后分离得到所述小鼠抗兔cd5单克隆抗体。

技术总结
本发明提供了一种小鼠抗兔CD5单克隆抗体及其应用，涉及生物技术领域。本发明提供的小鼠抗兔CD5单克隆抗体，所述小鼠抗兔CD5单克隆抗体的可变区包括：具有特定氨基酸序列的互补决定区CDR1-VH、CDR2-VH、CDR3-VH、CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL。经发明人研究发现，该单克隆抗体特异性强、灵敏度高，能够特异性识别CD5+T细胞群，进而用于CD5+T细胞群的分选。进而用于CD5+T细胞群的分选。进而用于CD5+T细胞群的分选。


技术研发人员：权利要求书1页说明书14页序列表（电子公布）附图4页
受保护的技术使用者：杭州华安生物技术有限公司
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/9/9