虾青素在制备缓解酒精诱导的肝细胞钙超载及线粒体功能障碍药物中的应用

：
1.本发明属于防治肝细胞钙超载及线粒体功能技术领域，涉及一种虾青素在制备缓解酒精诱导的肝细胞钙超载及线粒体功能障碍药物中的应用。虾青素能够缓解酒精诱导的肝细胞钙超载和线粒体功能障碍，能够减轻细胞内胞质和线粒体ca
2+
升高和改善线粒体功能障碍。


背景技术：

[0002][0003]
酒精会促使体内产生一系列有害的毒性产物，进而导致细胞内钙离子浓度异常升高，从而改变细胞的生理活动。正常情况下，钙离子对于维持神经、肌肉和骨骼健康至关重要，但当机体内钙离子的平衡被打破时，就可能出现钙紊乱的情况，进而加速疾病的进展。
[0004]
线粒体是细胞的能量供应器，在维持细胞结构和功能稳定中发挥重要作用。研究发现机体中的线粒体含量极其丰富，例如每个肝细胞约有1000-2000个线粒体。其中线粒体功能障碍逐渐被认为是促进酒精诱导的全身疾病发生发展的重要作用方式。
[0005]
虾青素是一种具有超强抗氧化能力的天然化合物，它具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎、调节免疫反应、预防皮肤损伤等；目前已在水产养殖、化妆品、生物制药等多个领域有商业应用。由于独特的分子结构，虾青素可以插入细胞膜表面的磷脂双分子层结构，且因为具有亲水和亲脂的双重特性可增强机体吸收速率和作用范围。
[0006]
当前研究表明，虾青素具有良好的安全性，且由于虾青素不能在人体合成，只能靠饮食摄取，所以早在2003年，虾青素就被fda批准为膳食补充剂。但目前还未见关于虾青素用于改善酒精诱导的肝细胞钙超载及线粒体功能障碍的相关报道。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，提供一种具有显著疗效、且无毒副作用的营养素即虾青素在改善酒精诱导的肝细胞钙超载及线粒体功能障碍上的应用。
[0008]
为了实现上述目的，本发明提供一种虾青素在制备防治酒精诱导的肝细胞钙超载及线粒体功能障碍药物中的应用，虾青素能够改善酒精诱导的线粒体形态结构、减少ros的生成、增加atp的产生、提高nad
+
/nadh的比例、维持线粒体膜电位稳定、抑制线粒体凋亡以及有效改善胞质钙离子和线粒体钙离子升高。
[0009]
所述线粒体功能包括：线粒体超微结构的改变，线粒体能量生成减少、线粒体膜电位丧失，线粒体凋亡、线粒体和胞质钙超载。
[0010]
本发明涉及的虾青素是从北京索莱宝科技有限公司购买,别名：β-胡萝卜素-4,4'-二酮[索莱宝标注]，其纯度≥96％；分子式为c
40h52
o4，cas登录号为472-61-7。
[0011]
本发明首先利用人源肝癌细胞huh-7细胞系构建酒精诱导的肝细胞损伤模型，并通过激光共聚焦显微镜观察虾青素对线粒体膜电位的影响来初步确定虾青素对酒精刺激
下细胞中线粒体的作用。随后，继续建立动物模型进一步观察虾青素对酒精暴露大鼠线粒体功能的影响，并实施透射电镜、流式细胞术、免疫荧光等实验方法进行观察确定。研究发现：与酒精模型组相比，虾青素干预改善了线粒体超微结构、减少了ros的产生、升高了nad
+
/nadh比值、增加了atp的合成、稳定了线粒体膜电位、减轻了线粒体凋亡、缓解了胞质ca
2+
和线粒体ca
2+
升高。这些指标一致提示酒精诱导线粒体功能障碍被虾青素所逆转。
[0012]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果。
[0013]
(1)本发明将虾青素制备成用于改善酒精诱导肝细胞钙超载和线粒体功能障碍的药物，能够减轻胞质和线粒体ca
2+
升高、改善线粒体形态结构、增加atp的生成、维持线粒体膜电位的稳定、抑制线粒体凋亡。与其他可食用的抗氧化营养素相比，如维生素c、维生素e为纯粹的水溶性或脂溶性维生素，虾青素由于独特的化学结构且具有脂溶性和水溶性的双重特性，疗效显著。
[0014]
(2)虾青素无毒副作用，对于动物生长速度、摄食意愿没有负面影响，安全性高。
[0015]
综上，本发明首次将虾青素能够用于改善酒精诱导肝细胞钙超载和线粒体功能障碍，能够通过改善线粒体形态结构、增加atp的生成、维持线粒体膜电位的稳定、抑制线粒体凋亡达到改善线粒体功能障碍的目的，开发了虾青素新的应用，也为改善线粒体功能障碍开辟了新的有效手段。
附图说明：
[0016]
图1为本发明实施例提供的虾青素对400mm酒精刺激下线粒体膜电位影响的实验结果示意图。
[0017]
图2为本发明实施例提供的虾青素对400mm酒精刺激下细胞胞质ca
2+
影响的实验结果示意图。
[0018]
图3为本发明实施例提供的虾青素对400mm酒精刺激下细胞线粒体ca
2+
影响的实验结果示意图。
[0019]
图4为本发明实施例提供的虾青素对酒精暴露大鼠肝脏线粒体超微结构影响的实验结果示意图。
[0020]
图5为本发明实施例提供的虾青素对酒精暴露大鼠肝脏ros产生影响的实验结果示意图，其中a是不同组别的立体叠加直方图结果，b是不同组别的结果图，c为统计分析图。
[0021]
图6为本发明实施例提供的虾青素对酒精暴露大鼠肝脏线粒体门户蛋白和线粒体凋亡因子影响的实验结果示意图。
[0022]
图7为本发明实施例提供的虾青素对酒精暴露大鼠肝脏胞质ca
2+
影响的实验结果示意图，其中a为不同组别结果图，b为不同组别的叠加直方图结果，c为统计分析图。
[0023]
图8为本发明实施例提供的虾青素对酒精暴露大鼠肝脏线粒体ca
2+
影响的实验结果示意图，其中a为不同组别结果图，b为不同组别的叠加直方图结果，c为统计分析图。
[0024]
*是与空白对照组相比较，p《0.05；#是与酒精模型组相比较，p《0.05。
具体实施方式：
[0025]
下面通过具体实施例并结合附图对本发明给予进一步补充说明。
[0026]
实施例1：
[0027]
本实施例涉及虾青素对酒精刺激下huh-7细胞ca
2+
及线粒体膜电位影响的体外实验，具体实验过程如下：
[0028]
1.细胞培养
[0029]
细胞复苏：从液氮罐中取出冻存的huh-7细胞，迅速放入37.5℃的水浴锅中，不断摇晃，使其尽快解冻，待其完全溶解前，迅速移至细胞房；用体积浓度为75％的酒精对细胞冻存管擦拭消毒，随后移至超净工作台，拧开冻存管，吸出细胞至15ml离心管中，加入2ml含10％胎牛血清的huh-7细胞专用培养基，随后在800g条件下，离心5min；随后吸出并弃去上层清液，并加入5ml的huh-7细胞专用培养基，用移液枪将其吹打均匀后，吸出细胞悬液转移至t 25cm2培养瓶中，放入37℃,5％ co2培养箱中培养。huh-7细胞专用培养基购买于普诺赛生命科技有限公司，货号为cm-0120。huh-7细胞专用培养基成分为dmem、10％胎牛血清、1％p/s。次日上午8:00，更换一次培养液，继续放入37℃培养箱中培养，复苏后的前三天换2至3次培养基。
[0030]
细胞传代：待细胞长至95％左右时，吸出旧的培养液，加入1ml的pbs，轻轻摇晃，洗涤细胞，然后弃去pbs；加入1ml胰酶消化酶，放入37℃培养箱中孵化1min左右；轻轻拍打培养瓶，肉眼观察大部分细胞脱落即可停止消化，随后加入2ml的细胞专用培养基终止消化，同时用移液枪吹打数次，将瓶壁上的细胞冲洗下来；将细胞悬液吸出，移至15ml离心管中，随后在800g下离心5min，弃去上层清液；继续加入2ml的细胞专用培养基，吹打均匀，分至新的培养瓶中，补足新的培养基，移至37℃培养箱中继续培养。
[0031]
2.cck8法筛选最佳酒精浓度
[0032]
用不同浓度酒精刺激huh-7细胞24h后，使用cck8法检测细胞活力进而筛选出最佳酒精浓度，从而建立体外细胞模型。实验分组：空白组(只加培养基)；对照组及5个实验组(酒精终浓度为100mm、200mm、400mm、800mm、1600mm)。接种好细胞后，实验组每孔加入乙醇工作液10μl，每组设置3个平行孔；使用cck8法检测细胞活力，选择半抑制浓度(ic
50
)作为酒精刺激细胞发生毒性损伤的最佳浓度。结果如表1所示。
[0033]
cck8法检测细胞活力：先用0.1％胰蛋白酶溶液消化细胞，制备单细胞悬液。使用细胞计数仪测定单细胞悬液中的细胞数量，然后在96孔板中接种细胞悬液(100μl/孔)，并按照实验分组加/不加酒精干预。随后将培养板放在37℃培养箱中培养24h；次日，在显微镜下观察细胞形态；若无明显异常，即向每孔加入10μl cck-8溶液；待96孔板在37℃培养箱中孵育2h后，用酶标仪测定450nm波长处各孔的吸光度。
[0034]
活力计算：细胞活力(％)＝[a(实验组)-a(空白组)]/([a(对照组)-a(空白组)])
×
100
[0035]
a(空白组)：没有细胞、具有培养基和cck-8溶液的孔的吸光度；
[0036]
a(对照组)：没有酒精、具有细胞、cck-8溶液的孔的吸光度；
[0037]
a(实验组)：含有酒精、含有细胞、cck-8溶液的孔的吸光度。
[0038]
表1不同浓度酒精刺激对huh-7细胞活力的影响。
[0039]
组别na值细胞活力(％)空白组30.20-对照组30.82-100mm乙醇30.82100.39
200mm乙醇30.6572.53400mm乙醇30.4845.15800mm乙醇30.2913.641600mm乙醇30.233.85
[0040]
从表1可以看出，乙醇浓度在200-1600mm范围内对于huh-7细胞的细胞活力有抑制作用；且随着乙醇浓度的升高，huh-7细胞的细胞活力逐渐降低。其中乙醇在400mm时，对huh-7细胞的细胞活力抑制达到45.67％。由此，将后续实验乙醇干预浓度定为400mm。
[0041]
3.cck8法筛选虾青素的最佳浓度。
[0042]
参考既往的文献资料，制备20-200μm不同浓度虾青素水溶液，干预huh-7细胞24h，观察虾青素对huh-7细胞活力的影响。结果如表2所示。
[0043]
表2不同浓度虾青素处理对huh-7细胞活力的影响
[0044]
组别na值细胞活力(％)空白组30.19-对照组30.50-20μm虾青素30.51100.7140μm虾青素30.57119.8780μm虾青素30.60129.86100μm虾青素30.58123.21200μm虾青素30.56118.50
[0045]
从表2可以看出，在10-200μm浓度范围内，虾青素对于huh-7细胞的细胞活力均有提高作用，但并未呈现随着浓度升高而升高的趋势。
[0046]
4.虾青素对酒精刺激下huh-7细胞活力的影响实验。
[0047]
根据上述试验，确定在100-1600mm酒精浓度刺激下细胞发生毒性损伤的最佳酒精浓度。根据上述实验，确定虾青素在20-200μm干预范围内对细胞增殖活力无损伤的最适浓度。依据实验所得浓度结果，将虾青素与酒精刺激下的huh-7细胞进行共培养24h，观察虾青素对酒精刺激下huh-7细胞活力的影响，结果如表3所示。
[0048]
表3不同浓度虾青素与400mm酒精共培养对huh-7细胞活力的影响
[0049]
组别na值细胞活力(％)空白组30.15-对照组30.60-20μm虾青素+400mm乙醇30.5587.9440μm虾青素+400mm乙醇30.5691.2480μm虾青素+400mm乙醇30.4873.63100μm虾青素+400mm乙醇30.4566.37200μm虾青素+400mm乙醇30.4362.73
[0050]
从表3可以看出，400mm乙醇刺激huh-7细胞24h后，不同浓度虾青素对于huh-7细胞的细胞活力具有提高作用。
[0051]
5、虾青素对酒精刺激下huh-7细胞线粒体膜电位的影响实验。
[0052]
将huh-7细胞依据不同的处理分为对照组(无特殊处理)、酒精模型组(含有400mm
酒精)、虾青素干预组(含有400mm乙醇和40μm虾青素)、甘利欣干预组(含有400mm乙醇和60μm甘利欣)、cccp(羰基氰化物间氯苯腙)组(10μm)、cccp和虾青素联合干预组(10μm cccp和40μm虾青素)。首先需要制备jc-1染色工作液，按照说明书的要求进行配制。其中6孔板每孔需要1ml的jc-1染色工作液，即取适量的jc-1溶液，按照相应的稀释比例加入jc-1染色缓冲液进行稀释，随后使用移液枪反复吹打混匀；待细胞经过不同的处理完成后，吸取并弃去旧的培养基，加入pbs对细胞进行洗涤；随后加入jc-1染色工作液，充分混匀后，在37℃细胞培养箱中孵育20分钟；孵育完成后，吸除上清，用jc-1缓冲液洗涤2次；随后加入dapi染液在培养箱中孵育8分钟，随后用pbs洗涤3次，并用细胞固定液将细胞固定，随后使用激光共聚焦显微镜下对细胞的荧光强度进行观察和测定；其中jc-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的荧光探针，在线粒体膜电位较高时，jc-1聚集在线粒体基质，形成聚合物，产生红色荧光。当线粒体膜电位较低时，jc-1不能聚集在线粒体基质中，表现为jc-1单体。此外，细胞核用dapi染料进行染色，表现为蓝色荧光。cccp是一种细胞凋亡诱导剂，对于大多数细胞用10μm cccp处理20分钟后线粒体膜电位会完全丧失，jc-1染色后呈现明显的绿色荧光。细胞核用dapi染料染色，呈现蓝色荧光。结果如图1所示。
[0053]
从图1可以看出，与正常对照组相比，酒精模型组和cccp组绿色荧光明显增强，红色荧光明显降低；这说明酒精刺激显著降低huh-7细胞线粒体膜电位。与酒精模型组和cccp组相比，虾青素组绿色荧光明显减弱且红色荧光明显增强，这说明虾青素的干预能有效改善huh-7细胞线粒体膜电位。说明虾青素能够有效改善酒精诱导的线粒体膜电位。
[0054]
6.激光共聚焦测定虾青素对酒精刺激下huh-7细胞胞质钙离子的影响。
[0055]
检测胞质钙离子水平的荧光探针为fluo4-am，从索莱宝生物科技有限公司购买，其货号为ca1190。首先将huh-7细胞依据不同处理分为对照组(无特殊处理)、酒精模型组(含有400mm乙醇)、虾青素干预组(含有400mm乙醇和40μm虾青素)和甘利欣干预组(含有400mm乙醇和60μm甘利欣)。细胞培养条件与上述部分相同。之后根据说明书制备5μmfluo-4 am工作液：先向fluo-4 am溶液中加入等体积的20％的pluronic f127溶液，并使用hbss平衡盐溶液稀释fluo-4 am溶液，进而制备5μm的fluo-4 am工作液；待细胞融合成单层约70％左右时，将fluo-4 am工作液加入细胞，在37℃下培养20min；然后加入5倍体积的含有1％胎牛血清的hbss平衡盐溶液，继续培养40min。再用hepes缓冲液洗涤细胞3次，加入4％的多聚甲醛固定液，覆盖细胞，固定10-15min，随后使用pbs洗3次，每次5min。之后便弃去pbs，使用dapi溶液室温下孵育8min，随后继续使用pbs洗3次，每次5min。使用激光共聚焦显微镜(型号：tcs sp8，徕卡)检测huh-7细胞胞质钙离子的荧光强度。仪器参数设置：激发波长为488nm，接收波长为500-550nm。在40
×
物镜下，所有图像在同一条件下采集，图片采集完后，使用lsm软件分析细胞内ca
2+
荧光信号强度。fluo-4 am是一种常用于检测细胞内ca
2+
浓度的探针，在激光共聚焦显微镜下呈现绿色荧光。细胞核用dapi染料染色，呈现蓝色荧光。结果如图2所示。
[0056]
从图2可以看出：酒精模型组绿色荧光强度明显强于正常对照组，而虾青素干预组和甘利欣干预组中该荧光强度明显减轻。得到结论：虾青素可以减轻酒精刺激下huh-7细胞中的胞质ca
2+
的信号强度。
[0057]
7.激光共聚焦测定虾青素对酒精刺激下huh-7细胞线粒体钙离子的影响
[0058]
检测线粒体钙离子水平的探针为rhod-2 am，是从翌圣生物科技(上海)股份有限
公司购买，其货号为：40776es。仪器、细胞、耗材及细胞处理与上述胞质钙离子测定一致。首先，需要制备5μm rhod-2 am工作液:利用高质量无水dmso溶解rhod-2 am配制成5mm的储存液，随后于等体积20％ pluronic f127进行混合。随后使用hbss平衡盐溶液将rhod-2am稀释成5μm的工作液。待细胞融合成单层约70％左右时，将rhod-2 am工作液加入细胞，在37℃下培养20min。随后，加入5倍体积的含有1％胎牛血清的hbss平衡盐溶液，继续培养40min。再用hepes缓冲液洗涤细胞3次，加入4％的多聚甲醛固定液，覆盖细胞，固定10-15min，随后使用pbs洗3次，每次5min。之后弃去pbs，使用dapi溶液室温下孵育8min，随后继续使用pbs洗3次，每次5min。即可使用激光共聚焦显微镜(型号：tcs sp8，徕卡)检测huh-7细胞线粒体ca
2+
的影响。仪器参数设置激发波长为549nm，接收波长为550-580nm。在40
×
物镜下，所有图像在同一条件下采集，图片采集完后，使用lsm软件分析线粒体ca
2+
荧光信号强度。rhod-2 am是一种常用于检测线粒体中ca
2+
浓度的探针，在激光共聚焦显微镜观察下呈现红色荧光。细胞核用dapi染料染色，呈现蓝色荧光。结果如图6所示。
[0059]
从图3可以看出：酒精模型组红色荧光强度明显强于正常对照组，而虾青素干预组和甘利欣干预组中该荧光强度明显减弱。得到结论：虾青素能够减轻酒精刺激下huh-7细胞中的线粒体ca
2+
信号强度。
[0060]
实施例2：
[0061]
本实施例涉及虾青素对酒精暴露大鼠的线粒体功能障碍的体内实验，具体实验过程如下：
[0062]
1、动物实验的开展
[0063]
动物实验及分组：60只6-8周龄的雄性sd(sprague-dawley)大鼠，体重为200
±
20g，从北京维通利华有限公司购买，按照每笼5只的标准分笼饲养在青岛大学动物实验中心。所有大鼠饲养于spf(specific pathogen free)级动物实验室，室内每日给予12h的循环光照，室温控制在22
±
2℃，室内相对湿度为60％，室内调节采用自然光源、通风良好，给予标准动物饲料喂养，大鼠可以自由饮水。在适应性喂养一周后，根据体重进行随机分组，分别是正常对照组、酒精模型组、虾青素干预和甘利欣干预组，随后正式开始实验。
[0064]
动物模型的建立：酒精模型是通过分阶段逐步提高酒精浓度，并采用灌胃喂养大鼠的方法来建立。实验周期为12周，前2周酒精浓度为7ml/kg/d，随后每两周根据动物的适应情况调整剂量浓度，确保最后2周提升为12ml/kg/d；最后一次灌胃后禁食12小时，麻醉后处死大鼠。
[0065]
灌胃溶液的配置：由于虾青素是脂溶性化合物，需要溶解于橄榄油中以便更好地透过细胞膜发挥作用，因此，灌胃溶液的配置具体为：(1)正常对照组：生理盐水与橄榄油制成相应悬浮液对大鼠进行灌胃；(2)酒精模型组：酒精与橄榄油制成酒精悬浮液对大鼠进行灌胃；(3)虾青素干预组：将50mg/kg/d虾青素溶于橄榄油中，随后与酒精混合制成酒精悬浮液对大鼠进行灌胃；(4)甘利欣干预组：将200mg/kg/d甘利欣溶于橄榄油，随后与酒精混合制成酒精悬浮液对大鼠进行灌胃。本实例中，橄榄油的剂量确定为每0.01ml橄榄油溶解1mg的虾青素。虾青素干预组和甘利欣干预组的酒精剂量浓度与酒精模型组的酒精剂量浓度保持一致。同时，空白对照组、酒精模型组、甘利欣干预组的橄榄油剂量浓度与虾青素干预组的橄榄油剂量浓度保持一致。
[0066]
2、虾青素对酒精暴露大鼠肝脏atp水平和nad
+
及nadh比值的影响实验
[0067]
所有动物每周记录一次体重，并在麻醉处死前一天记录动物体重，麻醉处死后摘取肝脏，用滤纸拭干，称重。称取不同组别大鼠0.5g肝脏组织，按照1:9(m:v)的比例加入pbs溶液，随后加入3粒研磨珠，在电动研磨机以60脉冲研磨30s，制备肝匀浆上清液以待检测。
[0068]
上述所得肝脏匀浆分别用于检测atp水平及nad
+
和nadh水平，检测结果如表4所示。
[0069]
表4虾青素对酒精暴露大鼠atp生成及nad+/nadh比值的影响。
[0070][0071][0072]
附注：*是与空白对照组相比较，p《0.05；#是与酒精模型组相比较，p《0.05。
[0073]
从表4可以看出：虾青素能够挽救酒精诱导的大鼠细胞内nad
+
和nadh的比值的降低以及atp生成的减少(p《0.05)。与酒精模型组相比，甘利欣干预可以提高atp水平(p《0.05)，但nad
+
/nadh的比值与酒精模型组相比没有统计学意义(p》0.05)。
[0074]
3、虾青素对酒精暴露大鼠肝脏线粒体超微结构的影响实验
[0075]
肝脏线粒体超微结构的观察：处死大鼠后，迅速取出肝脏，用锋利剃须双面刀片切成大小为1mm3的肝组织，快速将组织置于电镜固定液中，先后经过固定、脱水、浸透、包埋后制成超薄切片，进行染色，在透射电镜下观察肝脏中线粒体的超微结构，结果如图2所示。
[0076]
透射电镜分别将肝细胞放大5000倍和10000倍来观察线粒体的超微结构。从图4可以看出：在5000倍的放大倍数下，酒精模型组中呈现明显的脂肪积累，且线粒体体积缩小，数量增多。而在10000倍的放大倍数下，可以更加清晰看出正常对照组线粒体外膜及嵴结构轮廓清晰，线粒体基质明显；而酒精模型组肝脏线粒体体积缩小，大部分线粒体膜和嵴结构出现明显破坏、出现内膜破碎、基质沉积及线粒体dna减少等各种改变。而虾青素干预组的线粒体形态轻微肿胀，嵴组织良好，与内质网排列整齐有序。甘利欣干预组线粒体同样也出现肿胀、甚至出现明显的线粒体空泡化的现象，但线粒体膜和嵴结构未破裂，线粒体和内质网排列结构比酒精模型组更整齐有序。说明虾青素能够有效改善酒精诱导的线粒体形态结构。
[0077]
4、虾青素对酒精暴露大鼠肝脏线粒体ros生成的影响实验
[0078]
流式细胞术用于检测酒精暴露大鼠肝组织ros水平：剪切并称量0.5g新鲜肝脏组织，置于含有1ml预冷pbs的1.5ml离心管中，随后用尖头枪粉碎和研磨，以3000r/min的速度离心5分钟；之后丢弃上清，加入pbs，继续离心；如果再次离心后沉淀物呈红色，则继续此步骤，直至无明显红色为止；离心后，继续丢弃上清，再加入1ml pbs溶液，然后在细胞悬液中加入ros荧光探针；确保工作溶液的密度超过1
×
106个细胞/ml，37℃暗箱孵育30分钟后，使用bd facs aria
tm iii流式细胞分选仪进行分析测定，结果如图3所示。
[0079]
图5a是不同组别ros生成的立体叠加直方图，图5b显示的是流式细胞术检测不同组别ros生成的代表图，图5c是对流式细胞术结果统计分析后的结果。可以看出：酒精模型组的ros生成显著高于正常对照组和虾青素干预组(p《0.05)。说明虾青素能够减轻酒精引起的线粒体ros生成。
[0080]
5、虾青素对酒精暴露大鼠肝脏线粒体凋亡的影响实验
[0081]
免疫荧光测定线粒体凋亡：剪切5
×5×
5mm的新鲜肝脏组织固定于4％多聚甲醛，随后包埋制成石蜡块；再将石蜡块切成约4μm的切片，进行脱蜡、复水，在97℃tris-edta缓冲液中煮沸20分钟提取抗原表位；然后用pbs冲洗三次，并用5％牛血清白蛋白封闭30min；然后再涂抹一抗(tomm20和aif)，4℃孵育过夜；之后，应用相应的荧光二抗体孵育1h；然后再用pbs冲洗，用dapi孵育5min；孵育完成后，再次洗涤，密封，即可置于荧光显微镜下观察。tomm20和aif抗体均购买于博士德生物技术有限公司，货号分别为bm4366和pb9366。tomm20是线粒体中的门户蛋白，在免疫荧光染色中呈现绿色荧光；aif是线粒体中诱导凋亡因子，在免疫荧光染色中呈现红色荧光，细胞核用dapi染料染色，呈现蓝色荧光。结果如图6所示。
[0082]
从图4可以看出：与酒精模型组相比，虾青素组红色荧光明显减弱，说明虾青素抑制了酒精暴露大鼠中线粒体诱导凋亡因子(aif)的产生。该结果说明虾青素能够有效抑制酒精诱导的线粒体凋亡。
[0083]
6、虾青素对酒精暴露大鼠肝脏胞质钙离子和线粒体钙离子的影响实验
[0084]
流式细胞术测定虾青素对酒精暴露大鼠肝脏胞质和线粒体钙离子生成的影响：取各组实验大鼠肝脏组织约0.5g，用hbss平衡盐溶液反复冲洗3次，充分剪碎组织后加入生理盐水移入玻璃匀浆器中适度研磨匀浆，以1000r/min转速离心5min，随后弃去上清，再用200目筛网过滤器，滤液加入质量百分比浓度为0.3％的盐水1ml，立即上下颠倒混匀，随后加入质量百分比浓度为1.5％的盐水2ml，混匀后经1500r/min离心5min，弃上清，反复离心3次，收集肝脏细胞悬浮于hbss平衡盐溶液中，调整细胞浓度为5
×
106个/ml备用。取1ml肝脏细胞悬液，加入fluo-4 am或rhod-2 am溶液至10μmol/l，置二氧化碳培养箱中孵育1h，其间震荡3次；随后，取出细胞悬液，离心，去除多余的染料，再用hbss平衡盐溶液反复洗涤3次，最后用hbss稀释至2ml，使用bd facs aria
tm iii流式细胞分选仪进行分析测定，结果使用flowjo软件进行分析处理。fluo-4 am和rhod-2 am分别购买于碧云天生物技术研究所(货号：s1061s)和翌圣生物科技(上海)股份有限公司(货号：40776es)，工作液的配置方法与上述体外实验中的操作步骤相同。结果如图7和图8所示。
[0085]
图7a显示的是流式细胞术检测不同组别肝脏组织胞质ca
2+
的代表图，图7b为四组流式细胞术代表图重叠后的结果图，图7c是流式细胞术测定结果的统计分析图。可以看出：与正常对照组相比，酒精模型组明显增加了肝组织中的胞质ca
2+
，而虾青素和甘利欣均明显减轻了酒精暴露大鼠肝组织中胞质ca
2+
的生成(p《0.05)。得到结论：虾青素和甘利欣均能够减轻酒精诱导的肝细胞胞质ca
2+
生成。
[0086]
图8a显示的是流式细胞术检测不同组别肝脏组织线粒体ca
2+
的代表图，图8b为四组流式细胞术代表图重叠后的结果图，图8c是流式细胞术测定结果的统计分析图。可以看出：与正常对照组相比，酒精模型组明显增加了肝组织中的线粒体ca
2+
，而虾青素明显减轻了酒精暴露大鼠肝组织中线粒体ca
2+
的生成(p《0.05)，而甘利欣并未明显减轻酒精暴露大鼠肝组织中ca
2+
生成(p》0.05)。该结果说明：虾青素能够减轻酒精诱导的肝细胞线粒体ca
2+
生成。

技术特征：
1.虾青素在制备缓解酒精诱导的肝细胞钙超载及线粒体功能药物中的应用。2.根据权利要求1所述的虾青素在制备缓解酒精诱导的肝细胞钙超载及线粒体功能药物中的应用，其特征在于，虾青素能够改善酒精诱导的肝细胞钙超载，有效减少胞质ca
2+
和线粒体ca
2+
的生成。3.根据权利要求1所述的虾青素在制备缓解酒精诱导的肝细胞钙超载及线粒体功能药物中的应用，其特征在于，虾青素能够改善酒精诱导的线粒体功能障碍，有效改善酒精诱导的线粒体超微结构的改变、atp生成的减少、线粒体膜电位的丧失及线粒体凋亡。

技术总结
本发明属于防治肝细胞钙超载和线粒体功能障碍技术领域，涉及一种虾青素在制备缓解酒精诱导的肝细胞钙超载和线粒体功能障碍药物中的应用。虾青素能够改善酒精诱导的胞质Ca


技术研发人员：王鹏 梁惠 郑娴 张华琦 梁曦 都荣欢
受保护的技术使用者：青岛大学
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/9/9