一种马来酸的制备方法

1.本发明属于生物催化及生物制造领域，具体涉及一种利用光/酶催化氧化糠醛制备马来酸的方法。


背景技术：

2.糠醛(furfural)可以通过半纤维素水解/脱水得到，被美国能源部认定为最具竞争力的生物基平台化合物之一(chemical society reviews,2012,41,8075)。糠醛经多步氧化级联反应可转化为马来酸(maleic acid，ma)，这种二元羧酸是合成食品添加剂、香料及药物、杀虫剂、高分子材料的重要中间体。当前，工业上ma主要通过催化氧化正丁烷或苯等石油基化学品得到，具有原料不可再生、反应条件激烈、选择性不高及环境不友好等缺点。随着化石燃料的日益枯竭，通过催化转化生物基平台化合物如糠醛来生产马来酸具有重要意义。
3.当前，从糠醛出发制备马来酸的方法多为化学催化法。alonso-fagundez等以vo
x
/al2o3为固体催化剂，o2为氧化剂在320℃下将气态糠醛转化为马来酸酐，产率为73％(chemsuschem,2012,5,1984)。malibo等报道了一种v2o5/sno2纳米催化剂用于催化氧化糠醛生成ma，h2o2为氧化剂，65℃时水相中糠醛转化率和ma收率分别为99％和60％(chemistryselect,2020,5,6255)。guo等研究了磷钼酸催化剂在水/有机双相体系中利用o2氧化糠醛合成ma(journal of physical chemistry c,2011,115,17516)。在110℃下，水相体系中ma产率仅为38％，选择性为44％。通过加入有机溶剂形成双相体系后，最优条件下ma产率略微减少但选择性提高到69％。li等构建了一种高效简单的ma合成体系，以甲酸作为溶剂和催化剂，h2o2为氧化剂，60℃时糠醛氧化生成ma产率最高，达到95％(green chemistry,2017,19,914)。化学法往往需要苛刻的反应条件如高温高压，酸、碱、金属催化剂、卤素元素、有机溶剂等的使用，存在设备成本高，耗能大，选择性欠佳，环境不友好等问题。
4.光能是一种环保、资源丰富且可再生的清洁能源，光催化受光引发可在温和条件下产生活泼反应中间体，为化学反应提供动力，较传统化学催化更为低碳环保、可持续。酶催化具有反应条件温和，绿色高效，高选择性等优点。结合光催化和酶催化，可以整合各自优势，实现高附加值化合物的绿色、高效制备(chemical society reviews,2021,50,13449)。例如，zachary等报道了光催化剂(fmn或ir-16)与烯烃还原酶协同反应，使烯烃异构化的同时还原碳碳双键，生成高价值的对映体纯产物(nature,2018,560,355)。zhang等将光有机氧化催化与生物催化结合，实现了简单烷烃的不对称c-h键功能化(european journal of organic chemistry,2019,80)。
5.目前,有关光/生物催化氧化糠醛合成ma的报道较少。其中，thiyagarajan等开发了以糠醛为原料两步光/酶催化ma合成的工艺(acs sustainable chemistry&engineering,2020,8,10626)，但需要对中间产物hfo进行分离纯化，因为第一步反应(甲醇)与第二步反应的溶剂(缓冲液)不同。huang等开发的三步光/生物催化ma合成工艺存在
各个催化体系ph不兼容性问题(green chemistry.2021,23,8604)，在进行最后一步漆酶/tempo催化5-羟基-2(5h)-呋喃酮(5-hydroxy-2(5h)-furanone，hfo)氧化前需要将ph调至5.0；光/生物催化氧化糠醛合成ma需分步进行，严重降低了整个工艺的合成效率。因此，迫切需要开发简单、绿色高效的ma合成工艺。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种在温和条件下催化氧化hfo合成马来酸的生物催化剂；并基于该生物催化剂，提供一种绿色、高效从糠醛出发合成马来酸的方法。
7.本发明的目的通过以下技术方案实现：
8.一种马来酸的制备方法，包括如下步骤：
9.(1)将醛脱氢酶、nka
‑ⅱ
大孔吸附树脂固定化的曙红y(ey)加入含有糠醛及氧化型辅酶的缓冲液中，进行光照反应；
10.(2)当糠醛基本完全转化后，再加入半乳糖氧化酶和添加剂进行光照反应，得到马来酸；所述添加剂为辣根过氧化物酶、过氧化氢酶和硫酸铜。
[0011][0012]
优选地，步骤(1)中的醛脱氢酶来源于pseudomonas aeruginosa，所述醛脱氢酶用量为0.5～2.0mg/ml。
[0013]
优选地，步骤(1)中所述曙红y的添加量为糠醛摩尔量的2～10％；曙红y与nka
‑ⅱ
大孔吸附树脂按质量比1：3
±
1固定化。
[0014]
优选地，步骤(1)中所述糠醛在缓冲液中的终浓度为10-100mm；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，ph 7.0。
[0015]
优选地，步骤(1)中所述氧化型辅酶为nadp
+
，终浓度为0.2～2.0mm。
[0016]
优选地，步骤(1)、(2)所述光照的光源为绿光，功率为30
±
20w，光照反应条件为温度25
±
10℃、转速150-250rpm。
[0017]
优选地，步骤(1)反应的时间为4～8h；步骤(2)反应的时间为12～72h。
[0018]
优选地，步骤(2)中半乳糖氧化酶来源于fusarium graminearum，为突变体m
3-5
、m4和m
5-1
。
[0019]
优选地，所述半乳糖氧化酶采用0.5～5.0mg/ml纯酶或5～20mg/ml无细胞萃取液冻干粉。
[0020]
优选地，步骤(2)中所述添加剂为0.01～1mg/ml辣根过氧化物酶、0.1～5mg/ml过氧化氢酶和0.01～2mm硫酸铜。
[0021]
本发明与现有的技术相比，具有如下的优点：
[0022]
1)提供了一种生物催化剂半乳糖氧化酶，可以在温和条件下高选择性地催化氧化hfo合成马来酸。
[0023]
2)利用nka
‑ⅱ
大孔吸附树脂固定化ey作为光催化剂，不仅能保证糠醛不发生开环
反应，而且能有效减少催化剂间的相互失活作用、克服了游离ey环境不友好的缺点，在反应结束后可以通过简单的离心回收光催化剂，既可实现催化剂的重复利用，又易于产物的分离纯化。
[0024]
3)本发明建立了以生物基糠醛为底物合成马来酸的绿色途径，解决了催化体系不兼容的问题，反应条件温和、选择性高、操作简便，有利于减少对石油基资源的依赖。
附图说明
[0025]
图1为糠醛，糠酸，hfo，ma的结构图。
[0026]
图2为大孔吸附树脂固定化曙红y的形态图。
[0027]
图3为实施例18制得样品分析的液相色谱图。
具体实施方式
[0028]
通过实施例进一步说明本发明，但不局限于实施例。
[0029]
nka
‑ⅱ
大孔吸附树脂购自郑州勤实科技有限公司。
[0030]
半乳糖氧化酶突变体m
3-5
、m4及m
5-1
已在文献“birmingham w r,toftgaard p a,dias g m,et al.toward scalable biocatalytic conversion of5-hydroxymethylfurfural by galactose oxidase using coordinated reaction and enzyme engineering.nature communications,2021,12(1):4946”中公开。
[0031]
醛脱氢酶来源于pseudomonas aeruginosa，已在文献“dai j-r,sha j-t,zong m-h,li n.catalytic promiscuity of horseradish peroxidase:aerobic oxidative regeneration of oxidized nicotinamide cofactors.chemcatchem,2023,e202300330”中公开。
[0032]
实施例1
[0033]
大孔吸附树脂固定化ey的制备：将nka
‑ⅱ
大孔吸附树脂先后在乙腈(50ml)和甲醇(50ml)中浸泡30min并过滤，待有机试剂挥发干净后在60℃恒温干燥箱中干燥。在40ml蒸馏水中加入树脂1g，300mg ey，混合均匀后在30℃、100rpm下吸附10h。过滤树脂，用蒸馏水多次清洗后干燥，即得大孔吸附树脂固定化的曙红y(ey@nka)。
[0034]
实施例2
[0035]
醛脱氢酶和半乳糖氧化酶的纯化方法：按每1g湿菌体加入10ml结合缓冲液，重悬菌体，使菌体分散均匀。用超声破碎仪破碎细胞，期间细胞悬液始终保持置于冰水浴中。破碎结束后低温高速离心收集上清即为粗酶液。采用中高压层析系统，镍亲和层析柱对粗酶液进行纯化，脱盐柱进一步脱盐，得目的蛋白用于反应。
[0036]
实施例3
[0037]
在2ml磷酸盐缓冲液(100mm、ph 7.0)中，加入10mm hfo，0.1mg/ml半乳糖氧化酶突变体m
3-5
，0.01mm硫酸铜，0.1mg/ml过氧化氢酶，充分混合后置于35℃，150rpm恒温振荡器中反应。反应24h后，马来酸产率为7％。
[0038]
实施例4
[0039]
在2ml磷酸盐缓冲液(100mm、ph 7.0)中，加入10mm hfo，0.5mg/ml半乳糖氧化酶突变体m
3-5
，0.01mm硫酸铜，0.01mg/ml辣根过氧化物酶和0.1mg/ml过氧化氢酶，充分混合后置
于35℃，150rpm恒温振荡器中反应。反应24h后，马来酸产率为77％。
[0040]
实施例5
[0041]
在2ml磷酸盐缓冲液(100mm、ph 7.0)中，加入20mm hfo，5mg/ml半乳糖氧化酶突变体m
3-5
，2mm硫酸铜，1mg/ml辣根过氧化物酶和5mg/ml过氧化氢酶，充分混合后置于35℃，150rpm恒温振荡器中反应。反应24h后，马来酸产率为92％。
[0042]
实施例6
[0043]
在2ml磷酸盐缓冲液(100mm、ph 7.0)中，加入20mm hfo，2mg/ml半乳糖氧化酶突变体m4，0.2mm硫酸铜，1mg/ml辣根过氧化物酶和2mg/ml过氧化氢酶，充分混合后置于35℃，150rpm恒温振荡器中反应。反应24h后，马来酸产率为97％。
[0044]
实施例7
[0045]
在2ml磷酸盐缓冲液(100mm、ph 7.0)中，加入20mm hfo，2mg/ml半乳糖氧化酶突变体m
5-1
，0.2mm硫酸铜，1mg/ml辣根过氧化物酶和2mg/ml过氧化氢酶，充分混合后置于35℃，150rpm恒温振荡器中反应。反应24h后，马来酸产率为99％。
[0046]
实施例8
[0047]
半乳糖氧化酶无细胞萃取液冻干粉(cfe)的制备：将重组菌接种到lb抗性液体培养基，于37℃下过夜培养得到种子液，然后取1ml种子液加入到lb抗性液体培养基，于37℃，180rpm条件下培养至菌液od
600
为0.6～0.8时，加入iptg诱导。诱导培养结束后，低温高速离心收集菌体细胞。每1g湿菌体用10ml磷酸盐缓冲液稀释成菌液，超声破碎，低温高速离心得到无细胞萃取粗酶液。粗酶液于-80℃冻存后，真空冻干制成无细胞萃取液冻干粉。
[0048]
实施例9
[0049]
在2ml磷酸盐缓冲液(100mm、ph 7.0)中，加入10mm hfo，1mg/ml半乳糖氧化酶突变体m
3-5 cfe，0.1mm硫酸铜，0.02mg/ml辣根过氧化物酶和0.35mg/ml过氧化氢酶，充分混合后置于35℃，150rpm恒温振荡器中反应。反应24h后，马来酸产率为36％。
[0050]
实施例10
[0051]
在2ml磷酸盐缓冲液(100mm、ph 7.0)中，加入10mm hfo，20mg/ml半乳糖氧化酶突变体m
3-5 cfe，2mm硫酸铜，1mg/ml辣根过氧化物酶和5mg/ml过氧化氢酶，充分混合后置于35℃，150rpm恒温振荡器中反应。反应12h后，马来酸产率为99％。
[0052]
实施例11
[0053]
在2ml磷酸盐缓冲液(100mm、ph 7.0)中，加入20mm糠酸，5mg/ml半乳糖氧化酶突变体m
3-5 cfe，0.1mm硫酸铜，0.02mg/ml辣根过氧化物酶，0.35mg/ml过氧化氢酶，和实施例1制备的ey@nka，其添加量为糠酸摩尔量的2％，放置于30w 530nm-540nm绿光(led灯)下，在25℃、250rpm下反应，反应24h后，马来酸产率为62％。
[0054]
实施例12
[0055]
在2ml磷酸盐缓冲液(100mm、ph 7.0)中，加入20mm糠酸，20mg/ml半乳糖氧化酶突变体m
3-5 cfe，1mm硫酸铜，1mg/ml辣根过氧化物酶，3mg/ml过氧化氢酶，和实施例1制备的ey@nka，其添加量为糠酸摩尔量的10％，放置于30w 530nm-540nm绿光(led灯)下，在35℃、250rpm下反应，反应24h后，马来酸产率为93％。
[0056]
实施例13
[0057]
在2ml磷酸盐缓冲液(100mm、ph 7.0)中，加入20mm糠酸，0.7mg/ml半乳糖氧化酶突
变体m4，0.1mm硫酸铜，0.02mg/ml辣根过氧化物酶，0.35mg/ml过氧化氢酶，和实施例1制备的ey@nka，其添加量为糠酸摩尔量的5％，放置于30w 530nm-540nm绿光(led灯)下，在25℃、250rpm下反应，反应24h后，得到马来酸的产率为91％。
[0058]
实施例14
[0059]
在2ml磷酸盐缓冲液(100mm、ph 7.0)中，加入20mm糠酸，0.7mg/ml半乳糖氧化酶突变体m
5-1
，0.1mm硫酸铜，0.02mg/ml辣根过氧化物酶，0.35mg/ml过氧化氢酶，和实施例1制备的ey@nka，其添加量为糠酸摩尔量的5％，放置于30w 530nm-540nm绿光(led灯)下，在25℃、250rpm下反应，反应24h后，得到马来酸的产率为99％。
[0060]
实施例15
[0061]
在2ml磷酸盐缓冲液(100mm、ph 7.0)中，加入10mm糠醛，0.1mg/ml醛脱氢酶，0.2mm nadp
+
，0.35mg/ml过氧化氢酶，和实施例1制备的ey@nka，其添加量为糠醛摩尔量的5％，放置于30w 530nm-540nm绿光(led灯)下，在15℃、250rpm下反应，反应8h后，hfo产率为37％。
[0062]
实施例16
[0063]
在2ml磷酸盐缓冲液(100mm、ph 7.0)中，加入10mm糠醛，2mg/ml醛脱氢酶，2mm nadp
+
，0.35mg/ml过氧化氢酶，和实施例1制备的ey@nka，其添加量为糠醛摩尔量的5％，放置于30w 530nm-540nm绿光(led灯)下，在25℃、250rpm下反应，反应1h后，hfo产率为47％。
[0064]
实施例17
[0065]
在2ml磷酸盐缓冲液(100mm、ph 7.0)中，加入20mm糠醛，2mg/ml醛脱氢酶，2mm nadp
+
，0.35mg/ml过氧化氢酶，和实施例1制备的ey@nka，其添加量为糠醛摩尔量的5％，放置于30w 530nm-540nm绿光(led灯)下，在25℃、250rpm下反应，反应8h后，hfo产率为94％。
[0066]
实施例18
[0067]
在2ml磷酸盐缓冲液(100mm、ph 7.0)中，加入20mm糠醛，1mg/ml醛脱氢酶，0.5mm nadp
+
，和实施例1制备的ey@nka，其添加量为糠醛摩尔量的5％，放置于30w 530nm-540nm绿光(led灯)下，在25℃、250rpm下反应。反应4h后，加入0.7mg/ml半乳糖氧化酶突变体m4，0.1mm硫酸铜，0.02mg/ml辣根过氧化物酶，0.35mg/ml过氧化氢酶，放置于30w530nm-540nm绿光(led灯)下，在25℃、250rpm下反应，反应32h后，马来酸产率为91％。
[0068]
实施例19
[0069]
在2ml磷酸盐缓冲液(100mm、ph 7.0)中，加入20mm糠醛，1mg/ml醛脱氢酶，0.5mm nadp
+
，和实施例1制备的ey@nka，其添加量为糠醛摩尔量的5％，放置于30w 530nm-540nm绿光(led灯)下，在25℃、250rpm下反应。反应4h后，加入0.7mg/ml半乳糖氧化酶突变体m
5-1
，0.1mm硫酸铜，0.02mg/ml辣根过氧化物酶，0.35mg/ml过氧化氢酶，放置于30w530nm-540nm绿光(led灯)下，在25℃、250rpm下反应，反应32h后，马来酸产率为93％。
[0070]
实施例20
[0071]
在2ml磷酸盐缓冲液(100mm、ph 7.0)中，加入100mm糠醛，2mg/ml醛脱氢酶，2mm nadp
+
，和实施例1制备的ey@nka，其添加量为糠醛摩尔量的10％，放置于30w 530nm-540nm绿光(led灯)下，在25℃、250rpm下反应。反应8h后，加入5mg/ml半乳糖氧化酶突变体m
5-1
，2mm硫酸铜，1mg/ml辣根过氧化物酶，5mg/ml过氧化氢酶，放置于30w 530nm-540nm绿光(led灯)下，在25℃、250rpm下反应，反应72h后，马来酸产率为97％。
[0072]
实施例21
[0073]
在2ml磷酸盐缓冲液(100mm、ph 7.0)中，加入20mm糠醛，1mg/ml醛脱氢酶，0.5mm nadp
+
，和实施例1制备的ey@nka，其添加量为糠醛摩尔量的5％，放置于30w 530nm-540nm绿光(led灯)下，在25℃、250rpm下反应。反应4h后，加入10mg/ml半乳糖氧化酶突变体m
5-1 cfe，0.1mm硫酸铜，0.02mg/ml辣根过氧化物酶，0.35mg/ml过氧化氢酶，放置于30w 530nm-540nm绿光(led灯)下，在25℃、250rpm下反应，反应32h后，马来酸产率为94％。

技术特征：
1.一种马来酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将醛脱氢酶、nka
‑ⅱ
大孔吸附树脂固定化的曙红y加入含有糠醛及氧化型辅酶的缓冲液中，进行光照反应；(2)当糠醛基本完全转化后，再加入半乳糖氧化酶和添加剂进行光照反应，得到马来酸；所述添加剂为辣根过氧化物酶、过氧化氢酶和硫酸铜。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的醛脱氢酶来源于pseudomonas aeruginosa，所述醛脱氢酶用量为0.5～2.0mg/ml。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述曙红y的添加量为糠醛摩尔量的2～10％；曙红y与nka
‑ⅱ
大孔吸附树脂按质量比1：3
±
1固定化。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述糠醛在缓冲液中的终浓度为10-100mm；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，ph 7.0。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述氧化型辅酶为nadp
+
，终浓度为0.2～2.0mm。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)、(2)所述光照的光源为绿光，功率为30
±
20w，光照反应条件为温度25
±
10℃、转速150-250rpm。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)反应的时间为4～8h；步骤(2)反应的时间为12～72h。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中半乳糖氧化酶来源于fusarium graminearum，为突变体m
3-5
、m4和m
5-1
。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述半乳糖氧化酶采用0.5～5.0mg/ml纯酶或5～20mg/ml无细胞萃取液冻干粉。10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述添加剂为0.01～1mg/ml辣根过氧化物酶、0.1～5mg/ml过氧化氢酶和0.01～2mm硫酸铜。

技术总结
本发明属于生物催化及生物制造领域，公开了一种马来酸的制备方法，包括如下步骤：(1)将醛脱氢酶、NKA


技术研发人员：李宁 邹思谋 宗敏华
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：2023.05.15
技术公布日：2023/9/12