一种空间分辨的神经系统器官芯片及其构建方法和应用

1.本发明属于器官芯片领域，具体涉及一种神经系统器官芯片及其构建方法和应用。


背景技术：

2.大脑中有多种神经元，这些神经元构成复杂的网络，同时被血脑屏障保护，免受外界毒物或者药物的伤害。
3.因为这些生理特征在大脑内纠集交缠在一起，导致人们得到的神经药理学或者毒理学的数据难以得到解释，人们只能发现这些毒物或者药物导致的宏观症状，但很难弄清楚内在机制或者毒物或药物对各种神经元分别的毒性或者药理作用。
4.器官芯片技术可以模拟大脑，而且在体外，容易操控，有可能解决这一问题，但是传统的脑芯片结构过于简单，通常只包括一个血脑屏障和一种神经元，不能模拟大脑的复杂性，因此很难利用其研究药物对大脑内多种神经元的毒性和药理作用。


技术实现要素：

5.本发明旨在解决传统神经毒理学和药理学结果难以解释的问题，提供了一种神经系统器官芯片及其构建方法和应用。本发明的基本思想是在芯片内将复杂的神经元网络变形为多个相连的神经元区域，每个区域包含一种或多种神经元，这些神经元在芯片内仍然可以相互作用，就像在脑中一样，但是毒物或者药物对每种神经元的作用可以单独考察，这样可以得到丰富的数据，解释传统神经毒理学和药理学所观察到的现象。
6.按照本发明的技术方案，所述神经系统器官芯片，包括多个神经元培养区域、多个其他脑细胞培养区域和多个血脑屏障区域；
7.所述多个神经元培养区域相互连通，形成神经元网络，每个神经元培养区域培养一种或多种神经元细胞；
8.所述神经元网络内部或者外周设有多个相连的其他脑细胞培养区域，每个其他脑细胞培养区域培养一种或多种脑细胞；
9.所述多个血脑屏障区域位于所述多个神经元培养区域的上方。
10.本发明神经系统器官芯片中，各培养区域相连通，能够实现了多种神经元的共培养，能够有利于神经元细胞的功能表达，同时设置了血脑屏障区域，以模拟神经血管单位中的血脑屏障，进一步增强了功能蛋白的表达。
11.进一步的，所述神经元细胞选自多巴胺能神经元细胞、胆碱能神经元细胞、肾上腺素能神经元细胞、胎能神经元细胞、氨基酸神经元细胞、运动神经元细胞、感觉神经元细胞、中间神经元细胞、多极神经元细胞、双极神经元细胞、假单极神经元细胞、长轴突神经元细胞、短轴突神经元细胞；
12.所述其他脑细胞为脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞。
13.在一个实施例中，所述培养区域包括相互连通的多巴胺能神经元培养区域和胆碱
能神经元培养区域，以及分别连通所述多巴胺能神经元培养区域和胆碱能神经元培养区域的两个脑血管内皮细胞培养区域；
14.所述血脑屏障区域为两个，分别位于所述多巴胺能神经元培养区域和胆碱能神经元培养区域的上方。
15.进一步的，所述神经元细胞和脑细胞来源于哺乳动物或者干细胞分化。
16.进一步的，所述神经元细胞培养区域、其他脑细胞培养区域和血脑屏障区域的各种细胞培养采用二维或三维培养。
17.进一步的，包括上层基板、中层基板和下层基板，
18.所述上层基板上设有带进出液口的上层细胞培养通道(贯穿通道)；
19.所述中层基板上设有多个带进出液口的中层细胞培养通道(贯穿通道)，其在水平面上的投影与所述上层细胞培养通道在水平面上的投影相互交叉(优选为垂直)；相邻中层细胞培养通道之间通过微栅栏等结构相互联通；
20.所述下层基板上、在中层细胞培养通道与上层细胞培养通道水平面投影交叉处的位置，设有多个神经元和其他脑细胞的培养区域；
21.所述上层基板和中层基板之间夹设模拟的血脑屏障。
22.具体的，所述进出液口用于内灌入培养液；
23.所述上层细胞培养通道的进出液口位于上层细胞培养通道的两端，为直径大于上层细胞培养通道宽度的圆形通孔；
24.所述中层细胞培养通道的进出液口位于中层细胞培养通道的两端，为贯穿上层基板和中层基板的、直径大于中层细胞培养通道宽度的圆形通孔。
25.进一步的，所述上层基板、中层基板和下层基板采用透明材质，如塑料、玻璃或石英，在一个实施例中，采用的是pmma(聚甲基丙烯酸甲酯)。
26.进一步的，所述中层基板的厚度不小于5mm。
27.进一步的，所述多个中层细胞培养通道平行设置，为便于进出液口的开设，多个平行的中层细胞培养通道相互错开。
28.进一步的，所述通道交流栅栏结构包括若干平行、间隔设置的微通道，具体的微通道的宽度与相邻为通道之间的距离相近或一致。
29.进一步的，所述下层基板上的多个神经元和其他脑细胞的培养区域，设置有细胞培养用多孔膜。
30.进一步的，所述模拟的血脑屏障包括多孔膜、接种在所述多孔膜上表面的脑血管内皮细胞、以及接种在所述多孔膜下表面的星状胶质细胞。该模拟血脑屏障通过中层基板贯穿通道与下层基板上的多巴胺神经元培养区域和胆碱能神经元培养区域相互联通。
31.本发明的第二方面提供了上述神经系统器官芯片的构建方法，包括以下步骤，
32.提供具有上层细胞培养通道和对应进出液口的上层基板、具有多个培养通道和对应进出液口的中层基板、以及下层基板；
33.将所述中层基板堆叠在所述下层基板上，向所述多个培养通道中分别接种神经元细胞或脑细胞；
34.将所述上层基板堆叠在所述中层基板上，在上层细胞培养通道与中层两个神经元培养通道相投影交叉的位置设有(夹设)多个模拟的血脑屏障；
35.通过进出液口向上层和中层的培养通道内灌注相应的细胞培养基，所述神经系统器官芯片开始运行，并发挥功能，得到成品神经系统器官芯片。
36.具体的，本发明构建方法利用重力驱动芯片内的流体，提供模拟血脑屏障所需要的剪切力，营养和氧气供给，以及提供胆碱能神经元、多巴胺能神经元和脑血管内皮细胞所需的营养和氧气供给。
37.进一步的，将所述中层基板堆叠在所述下层基板上前，在所述下层基板上的多个神经元和其他脑细胞的培养区域，放置细胞培养多孔膜。
38.进一步的，所述下层基板、中层基板和上层基板的四角对应位置开有固定孔，堆叠完成后，向固定孔中插入固定件(如玻璃棒等)，实现三层基板的固定。
39.进一步的，在接种神经元细胞(如多巴胺能神经元细胞或胆碱能神经元细胞)前，先将对应培养通道内用基质胶(如matrigel基质胶)包被。
40.进一步的，所述培养通道为平行设置的四个，所述四个培养通道内依次接种脑血管内皮细胞、多巴胺能神经元细胞、胆碱能神经元细胞和脑血管内皮细胞/星状胶质细胞
41.本发明的第三方面提供了上述神经系统器官芯片，或上述构建方法构建得到的神经系统器官芯片在神经药理学、毒理学研究，以及药物筛选中的应用。
42.本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：(1)相较于传统的单血脑屏障，单种神经元，本发明芯片中神经系统的功能明显增强，包括特异性蛋白的表达，轴突的长度都显著变高；(2)由于仿生性增强，而且全是人源细胞，使得该款神经芯片可以跳过动物实验，直接比较准确地预测药物在人身上的神经药理学和毒理学。
附图说明
43.图1为实施例1中神经系统器官芯片的组装结构示意图。
44.图2为实施例1中神经系统器官芯片接种人脑微血管内皮细胞衍生细胞系hcmec/d3细胞、星状胶质细胞衍生细胞系ha细胞、ipsc分化得来多巴胺能神经元细胞和ipsc分化得来胆碱能神经元细胞后的效果图。
45.图3为实施例2中不同种神经细胞相互作用的结果图。
46.图4为实施例3中lps对实施例1器官芯片神经毒性检测的结果图。
47.图5为实施例4中乌头碱对实施例1器官芯片神经毒性检测的结果图。
48.图6为实施例5中石斛碱对神经炎症的保护作用。
49.图7为实施例6中石斛碱对乌头碱损伤的神经保护作用
50.图8为实施例7中芯片上fitc-葡聚糖渗透率
51.附图标记说明：1-下层基板、2-中层基板、3、上层基板、2a-第一培养通道、2b-第二培养通道、2c-第三培养通道、2d-第四培养通道、2e-第一二培养通道交流栅栏结构、2f-第二三培养通道交流栅栏结构、2g-第三四培养通道交流栅栏结构、3a-第一培养通道进出液口、3b-第二培养通道进出液口、3c-第三培养通道进出液口、3d-第四培养通道进出液口、3e-上层细胞培养通道、3f-上层细胞培养通道进出液口。
具体实施方式
52.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以
更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
53.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
54.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
55.实施例1
56.如图1所示，一种神经系统器官芯片，具体来说是一种可用于药物神经毒理和药理学共培养4种人脑细胞的微流控芯片。该芯片整体尺寸为30mm*30mm*15mm，包括一层pmma(聚甲基丙烯酸甲酯)加工的下层基板1、一层pmma加工的中层基板2，一层pmma加工的上层基板3。
57.其中，中层基板2上开有四个平行的培养通道，分别为第一培养通道2a、第二培养通道2b、第三培养通道2c、第四培养通道2d，其尺寸均为2mm*12mm。相邻培养通道之间通过通道交流栅栏结构相连通，共三个通道交流栅栏结构，分别为第一二培养通道交流栅栏结构2e、第二三培养通道交流栅栏结构2f和第三四培养通道交流栅栏结构2g，其均由若干长1.5mm，宽150μm，间隔150μm的微通道构成。
58.上层基板3上、对应四个培养通道的两端，开有四组培养通道进出液口，分别为第一培养通道进出液口3a、第二培养通道进出液口3b、第三培养通道进出液口3c、第四培养通道进出液口3d；并开设有上层细胞培养通道3e，以及对应上层细胞培养通道3e两端的上层细胞培养通道进出液口3f。上层细胞培养通道3e的尺寸为2mm*16mm，四组培养通道进出液口以及上层细胞培养通道进出液口3f均为半径1.8mm的圆柱形通孔。
59.如图2所示，第一培养通道2a和第四培养通道2d内接种hcmec/d3细胞和附着在表面的ha细胞，第二培养通道2b用matrigel基质胶包被后接种ipsc分化得来多巴胺能神经元细胞，第三培养通道2c用matrigel基质胶包被后接种ipsc分化得来胆碱能神经元细胞，上层细胞培养通道3e中放置接种hcmec/d3细胞和ha细胞的多孔膜静置后，从第一培养通道进出液口3a、第二培养通道进出液口3b、第三培养通道进出液口3c、第四培养通道进出液口3d中灌入市售神经元细胞完全培养基，从上层细胞培养通道进出液口3f中灌入市售内皮细胞完全培养基。
60.实施例2
61.本实施例采用实施例1中的器官芯片模型(不含接种细胞和模拟血脑屏障)，研究不同种类神经细胞相互作用的结果。具体的，在器官芯片模型的中层基板培养通道内接种单种类神经元细胞不联合血脑屏障模块，得到单多巴胺能神经元芯片和单胆碱能神经元芯片；接种多巴胺能神经元细胞和胆碱能神经元细胞不联合血脑屏障模块，得到双神经元芯片；以及实施例1中的器官芯片(血脑屏障-神经芯片)，研究不同种类神经细胞相互作用。
62.在三种芯片运行正常后，检测第二培养通道2b中多巴胺能神经元轴突长度、第二培养通道2b中多巴胺能神经元功能蛋白th荧光强度、第三培养通道2c中胆碱能神经元轴突长度、第三培养通道2c中胆碱能神经元功能蛋白chat荧光强度，表征不同种类神经细胞相互作用的结果，结果如图3所示，单独胆碱能神经元细胞和多巴胺能神经元细胞芯片中细胞表达chat、th的荧光强度最低，两种神经元共培养后，功能蛋白的荧光强度和轴突长度增
加，在脑芯片上与血脑屏障细胞共培养后，功能蛋白的表达进一步增强，轴突也进一步伸长，说明芯片上不同种类神经细胞共培养有利于神经元细胞的功能表达。
63.实施例3
64.本实施例采用实施例1中的器官芯片，以lps(脂多糖)诱导的神经损伤为例，芯片运行正常以后，向上层细胞培养通道进出液口3f中加入浓度为50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml的lps，24h后检测第二培养通道2b中多巴胺能神经元轴突长度、第三培养通道2c中胆碱能神经元轴突长度，表征不同浓度的lps对脑神经的损伤模型，结果如图4所示，在lps的损伤作用下，芯片体外脑模型中两种神经元的轴突长度明显变短，并且具有剂量依赖性。
65.实施例4
66.本实施例采用实施例1中的器官芯片，以乌头碱诱导的神经损伤为例，芯片运行正常以后，向上层细胞培养通道进出液口3f中加入浓度为5μg/ml、20μg/ml和50μg/ml的乌头碱，24h后检测第二培养通道2b中多巴胺能神经元轴突长度、第二培养通道2b中多巴胺能神经元功能蛋白th荧光强度、第三培养通道2c中胆碱能神经元轴突长度、第三培养通道2c中胆碱能神经元功能蛋白chat荧光强度，表征不同浓度的乌头碱对脑神经的损伤模型，结果如图5所示，在乌头碱的损伤作用下，芯片体外脑模型中两种神经元的轴突长度明显变短，功能蛋白th和chat荧光强度减低，并且具有剂量依赖性。
67.实施例5
68.本实施例采用实施例1中的器官芯片，利用该芯片评价基于lps诱导的脑神经损伤模型的中药石斛神经保护活性。芯片运行正常以后，向上层细胞培养通道进出液口3f中加入浓度为100ng/ml的lps和浓度为2μg/ml、20μg/ml和50μg/ml的石斛碱，24h后检测第二培养通道2b中多巴胺能神经元轴突长度、第三培养通道2c中胆碱能神经元轴突长度，以此评价中药石斛对lps诱导的脑神经损伤的保护作用，如图6所示。
69.实施例6
70.本实施例采用实施例1中的器官芯片，利用该芯片评价基于乌头碱诱导的脑神经损伤模型的中药石斛神经保护活性。芯片运行正常以后，向上层细胞培养通道进出液口3f中加入浓度为20μg/ml的乌头碱和浓度为2μg/ml、20μg/ml和50μg/ml的石斛碱，24h后检测第二培养通道2b中多巴胺能神经元轴突长度、第三培养通道2c中胆碱能神经元轴突长度，以此评价中药石斛对乌头碱诱导的脑神经损伤的保护作用，如图7所示。
71.实施例7
72.本实施例采用实施例1中的器官芯片模型，利用该芯片评价体外血脑屏障模型屏障功能。芯片运行正常后，向上层细胞培养通道进出液口3f中加入浓度为5mg/ml的分子量70kd和5kd的fitc-葡聚糖，1h后从第一培养通道进出液口3a、第二培养通道进出液3b、第三培养通道进出液口3c、第四培养通道进出液口3d取液检测培养液中的荧光度，计算两种分子大小的fitc-葡聚糖在脑芯片中的渗透率，以此评价体外血脑屏障模型屏障功能，如图8所示。
73.综上，本发明神经系统器官芯片可以高度模拟人的大脑，应用于药物的神经毒理和药理学。
74.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变
动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种神经系统器官芯片，其特征在于，包括多个神经元培养区域、多个其他脑细胞培养区域和多个血脑屏障区域；所述多个神经元培养区域相互连通，形成神经元网络，每个神经元培养区域培养一种或多种神经元细胞；所述神经元网络内部或者外周设有多个相连的其他脑细胞培养区域，每个其他脑细胞培养区域培养一种或多种脑细胞；所述多个血脑屏障区域位于所述多个神经元培养区域的上方。2.如权利要求1所述的神经系统器官芯片，其特征在于，所述神经元细胞选自多巴胺能神经元细胞、胆碱能神经元细胞、肾上腺素能神经元细胞、胎能神经元细胞、氨基酸神经元细胞、运动神经元细胞、感觉神经元细胞、中间神经元细胞、多极神经元细胞、双极神经元细胞、假单极神经元细胞、长轴突神经元细胞、短轴突神经元细胞；所述其他脑细胞为脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞。3.如权利要求1所述的神经系统器官芯片，其特征在于，所述神经元细胞和脑细胞来源于哺乳动物或者干细胞分化。4.如权利要求1所述的神经系统器官芯片，其特征在于，所述神经元细胞培养区域、其他脑细胞培养区域和血脑屏障区域的各种细胞培养采用二维或三维培养。5.如权利要求1-4中任一项所述的神经系统器官芯片，其特征在于，包括上层基板、中层基板和下层基板，所述上层基板上设有带进出液口的上层细胞培养通道；所述中层基板上设有多个带进出液口的中层细胞培养通道，其在水平面上的投影与所述上层细胞培养通道在水平面上的投影相互交叉；相邻中层细胞培养通道之间通过微栅栏结构相互联通；所述下层基板上、在中层细胞培养通道与上层细胞培养通道水平面投影交叉处的位置，设有多个神经元和其他脑细胞的培养区域；所述上层基板和中层基板之间夹设模拟的血脑屏障。6.如权利要求5所述的神经系统器官芯片，其特征在于，所述下层基板上的多个神经元和其他脑细胞的培养区域，设置有细胞培养用多孔膜。7.如权利要求5所述的神经系统器官芯片，其特征在于，所述模拟的血脑屏障包括多孔膜、接种在所述多孔膜上表面的脑血管内皮细胞、以及接种在所述多孔膜下表面的星状胶质细胞。8.一种权利要求5-7中任一项所述的神经系统器官芯片的构建方法，其特征在于，包括以下步骤，提供具有上层细胞培养通道和对应进出液口的上层基板、具有多个培养通道和对应进出液口的中层基板、以及下层基板；将所述中层基板堆叠在所述下层基板上，向所述多个培养通道中分别接种神经元细胞或脑细胞；将所述上层基板堆叠在所述中层基板上，在上层细胞培养通道与中层两个神经元培养通道相投影交叉的位置设有多个模拟的血脑屏障；通过进出液口向上层和中层的培养通道内灌注相应的细胞培养基，得到神经系统器官
芯片。9.如权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述培养通道为平行设置的四个，所述四个培养通道内依次接种脑血管内皮细胞/星状胶质细胞、多巴胺能神经元细胞、胆碱能神经元细胞和脑血管内皮细胞/星状胶质细胞。10.权利要求1-7中任一项所述的神经系统器官芯片，或权利要求8或9所述的构建方法构建得到的神经系统器官芯片在神经药理学、毒理学研究，以及药物筛选中的应用。

技术总结
本发明涉及一种神经系统器官芯片及其构建方法和应用。所述器官芯片包括多个神经元培养区域、其他脑细胞培养区域和血脑屏障区域；所述多个神经元培养区域相互连通，形成神经元网络，每个神经元培养区域培养一种或多种神经元细胞；所述神经元网络内部或者外周设有多个相连的其他脑细胞培养区域，每个其他脑细胞培养区域培养一种或多种脑细胞；所述多个血脑屏障区域位于所述多个神经元培养区域的上方。本发明包含血脑屏障，而且可以将大脑内各种神经元分隔开，同时又保持其相互作用，适用于解释神经毒理和药理学研究所发现的复杂现象，在药物筛选中具有较大的潜力。物筛选中具有较大的潜力。物筛选中具有较大的潜力。


技术研发人员：张秀莉 王萌 曲玥阳 罗勇
受保护的技术使用者：苏州大学
技术研发日：2023.05.16
技术公布日：2023/9/14