一种阳原驴体尺性状分子标记及其检测方法与应用

1.本发明涉及分子生物学领域，具体说是一种阳原驴体尺性状分子标记及其检测方法与应用。


背景技术：

2.阳原驴产于河北省西北部，是经过长期风土驯化形成的一个中型役肉兼用品种，体质结实，肢体匀称，有巨大的肉用潜力，已被列入《国家畜禽遗传资源品种目录》。近些年，阳原驴种质资源退化、流失、混杂严重，生产性能不突出，已无法满足驴产业的发展需求，急需开展品种选育。伴随着全基因组测序技术的发展，定位、分离、克隆出与驴产肉、产奶、产皮等相关的功能基因并用来提高驴的重要经济性能是驴产业可持续发展的重要途径。然而，目前针对阳原驴的选育工作尚未开展。分子育种技术作为高效培育优质阳原驴的首选方案，筛选和鉴定与重要经济性状密切相关的分子标记及功能基因，逐步实现基因组选择，这对于阳原驴遗传资源的保护与开发利用以及我国驴产业的转型升级都具有重要的现实意义。


技术实现要素：

3.针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种阳原驴体尺性状分子标记及其特异性引物对。通过分析p2ry10基因多态性及其与阳原驴体尺性状的相关性，进而找到与阳原驴体尺性状显著相关的分子标记，以应用于阳原驴专门化品系选育，加快其选育近程。
4.为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
5.一种阳原驴体尺性状分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.1所示，其中第991bp处存在一个snp位点，此处碱基为g或a，该突变导致阳原驴体尺性状分子的g/a多态性。
6.用于上述分子标记的特异性引物对，其特征在于，其核苷酸序列为：
7.正向引物：5’tgcccacatcatacctacgc 3’；
8.反向引物：5’tcttcatctgtaaacaagcccct 3’。
9.本发明的另外一个目的在于提供一种检测阳原驴体尺性状分子标记的方法。
10.为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
11.3.一种检测权利要求1所述分子标记的方法，其特征在于，包括如下步骤：
12.步骤1，提取实验驴只群体中个体的基因组dna并检测其完整性；
13.步骤2，利用权利要求2所述的特异性引物对，以实验驴只个体的基因组dna为模板，进行pcr扩增，获得pcr扩增产物后进行凝胶电泳；
14.步骤3，对步骤2所述凝胶电泳后的产物进行直接测序；
15.步骤4，将步骤3的测序结果与权利要求1中所述分子标记进行对比分析，统计snp位点在阳原驴群体中的基因型；
16.步骤5，对实验驴只群体中所有个体的多态位点基因型与该个体的体尺性状进行关联性分析并建立分析模型。
17.进一步，步骤2中所述pcr扩增反应体系为：模板dna 2.0ml(＜1μg)，正向2.0ml，反向引物2.0ml，2
×
tsingke master mix 25.0ml，ddh2o 19.0ml。
18.进一步，步骤2中所述的pcr扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终末延伸5min，产物在4℃保存。
19.进一步，步骤5中所述的分析模型为如下式所示：
20.y＝m+g+a+l+e；
21.其中，y为测定表型值；m为群体均值；g为基因型效应；a为年龄效应；l为场区效应；e为随机残差。
22.本发明的第三个目的在于提供一种阳原驴体尺性状分子标记的应用。
23.为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
24.一种权利要求1所述分子标记的应用，其特征在于，应用上述分子标记对阳原驴进行育种，其育种目的为挑选体尺性状较好的阳原驴品种。
25.本发明所述的一种阳原驴体尺性状分子标记及其检测方法与应用，其有益效果为：
26.阳原驴p2ry10基因外显子1 snp(g991a)的基因型与体高、体长、胸围极显著相关，与管围显著相关。其中，在体高和胸围方面，aa基因型显著高于ga和gg，ga显著高于gg；在体长和管围方面，aa基因型显著高于ga和gg，ga与gg无显著差异。总的来说，阳原驴p2ry10基因aa基因型体尺显著高于gg和ga基因型。初步推测p2ry10基因外显子1区域snp(g991a)可作为阳原驴体尺性状选育潜在的分子遗传标记。
附图说明
27.本发明有如下附图：
28.图1阳原驴血液基因组dna和目标基因的凝胶电泳检测结果：(a)阳原驴血液基因组dna电泳结果；(b)p2ry10基因外显子1目标区域pcr扩增电泳结果
29.图2阳原驴不同个体p2ry10基因外显子1部分序列比对
30.图3p2ry10基因snp位点的基因分型
具体实施方式
31.以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
32.本发明通过分析p2ry10基因多态性及其与阳原驴体尺性状的相关性，进而找到了与阳原驴体尺性状显著相关的分子标记，以加快阳原驴专门化品系选育进程。基于前期阳原驴体尺性状全基因组关联分析的结果，筛选出p2ry10基因进一步研究，选用265头阳原成年母驴，从驴血中提取dna，pcr扩增后将产物直接测序，对群体中的snp位点进行基因分型和关联分析。结果表明：p2ry10基因外显子1区域内检测到一个snp位点(g991a)，阳原驴群体内g基因频率0.362，a基因频率0.638。基因型与体高、体长、胸围存在极显著相关关系(p＜0.01)，与管围存在显著相关关系(p＜0.05)：在体高和胸围方面，aa基因型显著高于ga和gg(p＜0.05)，ga显著高于gg(p＜0.05)；在体长和管围方面，aa基因型显著高于ga和gg(p＜
0.05)，ga与gg间无显著差异(p＞0.05)。综上，认为阳原驴群体中p2ry10基因外显子1区域中的snp(g991a)可作为与阳原驴体尺性状选育的潜在分子遗传标记。
33.具体操作步骤详述如下：
34.以张家口桑阳牧业有限公司和张家口农华牧业有限公司提供的265头成年母驴为研究对象，在前腔静脉处采集约5ml新鲜血液，轻缓注入edta抗凝管内并颠倒混匀，置于-20℃冰箱内冷冻保存。测定体高、体长、胸围、管围，记录年龄。
35.根据tianamp genomic dna kit(dp-304)步骤对上述血液样本进行dna提取，用nanodrop 2000测量dna浓度及od值，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测dna完整性。
36.根据设计特异性引物对(如表1所示)，以实验驴只个体的基因组dna为模板，进行pcr扩增。
37.表1驴p2ry10基因的特异性引物及退火温度
[0038][0039]
pcr反应体系为50.0ul：模板dna 2.0ul(＜1μg)，上游引物2.0ul，下游引物2.0ul，2
×
tsingke master mix 25.0ul，ddh2o 19.0ul。
[0040]
pcr反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终末延伸5min，产物在4℃保存。pcr产物在1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
[0041]
经检测，从血液样本中提取的dna浓度在30～60ng
·
ml-1
，od值在1.7～1.9，1％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，条带清晰明亮无杂带(见图1(a))，dna质检合格，可用于后续的pcr反应。对p2ry10基因的第一段外显子区域进行扩增，pcr产物用1.5％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，产物大小与预期一致，条带清晰明亮，无非特异性扩增条带(见图1(b))，产物可用于直接测序。
[0042]
将pcr后的产物直接测序，测序由上海生工生物工程技术有限公司完成，用dnaman和chromaspro软件对测序结果进行比对分析，统计snp位点在阳原驴群体中的基因型。
[0043]
对测序结果进行序列比对，发现阳原驴p2ry10基因外显子1区域内第991位碱基由g突变为a(见图2)。采用annovar软件对snp位点进行注释，该位点为同义突变。根据基因分型结果(见图3)可知，该群体中p2ry10基因在此位点存在3种基因型gg、ga和aa。基因型频率和基因频率统计结果见表2，其中aa为优势基因型，基因型频率为0.442，a为优势等位基因，基因频率为0.638。
[0044]
表2阳原驴p2ry10基因snp位点的基因型频率和基因频率
[0045][0046]
用excel统计个体的基因型并计算基因型频率和基因频率。用r软件对试验驴群多态位点的基因型与体尺性状进行关联性分析并建立模型。
[0047]
分析模型：y＝m+g+a+l+e
[0048]
其中，y为测定表型值；m为群体均值；g为基因型效应；a为年龄效应；l为场区效应；e为随机残差。
[0049]
由表3可以看出，阳原驴p2ry10基因外显子1 snp(g991a)的基因型与体高、体长、胸围极显著相关(p＜0.01)，与管围显著相关(p＜0.05)。其中，在体高和胸围方面，aa基因型显著高于ga和gg(p＜0.05)，ga显著高于gg(p＜0.05)；在体长和管围方面，aa基因型显著高于ga和gg(p＜0.05)，ga与gg无显著差异(p＞0.05)。总体来说，不同基因型阳原驴体尺性状差异显著，aa基因型体尺显著高于gg和ga基因型。
[0050]
表3阳原驴不同基因型与体尺性状的关联分析
[0051][0052]
注：同行数据后所标字母相异表示差异显著(p＜0.05)，所标字母相同表示差异不显著(p＞0.05)。
[0053]
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

技术特征：
1.一种阳原驴体尺性状分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如seq id n0.1所示，其中第991bp处存在一个snp位点，此处碱基为g或a，该突变导致阳原驴体尺性状分子的g/a多态性。2.用于检测权利要求1所述分子标记的特异性引物对，其特征在于，其核苷酸序列为：正向引物：5’tgcccacatcatacctacgc 3’；反向引物：5’tcttcatctgtaaacaagcccct 3’。3.一种检测权利要求1所述分子标记的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，提取实验驴只群体中个体的基因组dna并检测其完整性；步骤2，利用权利要求2所述的特异性引物对，以实验驴只个体的基因组dna为模板，进行pcr扩增，获得pcr扩增产物后进行凝胶电泳；步骤3，对步骤2所述凝胶电泳后的产物进行直接测序；步骤4，将步骤3的测序结果与权利要求1中所述分子标记进行对比分析，统计snp位点在阳原驴群体中的基因型；步骤5，对实验驴只群体中所有个体的多态位点基因型与该个体的体尺性状进行关联性分析并建立分析模型。4.如权利要求3所述的一种检测分子标记的方法，其特征在于，步骤2中所述pcr扩增反应体系为：模板dna 2.0ml(＜1μg)，正向引物2.0ml，反向引物2.0ml，2
×
tsingke master mix 25.0ml，ddh2o 19.0ml。5.如权利要求3所述的一种检测分子标记的方法，其特征在于，步骤2中所述的pcr扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终末延伸5min，产物在4℃保存。6.如权利要求3所述的一种检测分子标记的方法，其特征在于，步骤5中所述的分析模型为如下式所示：y＝m+g+a+l+e；其中，y为测定表型值；m为群体均值；g为基因型效应；a为年龄效应；l为场区效应；e为随机残差。7.一种权利要求1所述分子标记的应用，其特征在于，应用上述分子标记对阳原驴进行育种，其育种目的为挑选体尺性状较好的阳原驴品种。

技术总结
本发明涉及阳原驴体尺性状分子标记及其检测方法与应用。本发明通过分析P2RY10基因多态性及其与阳原驴体尺性状的相关性，进而找到了与阳原驴体尺性状显著相关的分子遗传标记，以应用于阳原驴专门化品系选育，加快其选育进程。程。程。


技术研发人员：曾申明 宋双
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2022.07.29
技术公布日：2023/9/13