一种基于零维纳米结构的光学成像及生物检测方法

1.本发明涉及光学纳米成像技术领域，具体涉及一种基于零维纳米结构的光 子成像及生物检测方法。


背景技术：

2.发展一种直接、超灵敏、快速检测病原体的方法至关重要。由于 阿贝衍射极限的限制，在可见光范围内传统光学显微镜成像极限约为 200纳米。这表明传统光学显微镜在可见光范围内无法对亚波长尺度 物体成像。因此，病毒颗粒或其他纳米级物体无法通过传统光学显微 镜成像可视化。表面等离子体技术和表面增强拉曼光谱方法是目前常 用基于光与物质之间相互作用的光学检测方法，但上述两种方法的检 测仪器复杂、检测成本相对较高。荧光成像方法也常用于生物检测， 但其需要对待检测物质进行荧光标记，检测效率受到光漂白限制且需 要一个可激发荧光的光源。此外，常用的光学检测方法还有比色法， 但比色法灵敏度低，误差相对较大。目前的光学检测方法由于其技术 限制，对纳米级物质表征的实际应用还存在巨大的挑战。


技术实现要素：

3.为了改善上述技术问题，本发明提供一种光学检测方法，包括如下步骤：将 羧基修饰的纳米颗粒悬浊液置于基底上，通过自组装方法得到零维纳米颗粒阵 列，加入活化剂活化，然后使用抗体修饰活化后的零维纳米颗粒阵列，得到可检 测对应抗原的零维纳米颗粒阵列结构；再将含有纳米级抗原物质的待测样品与 抗体修饰的零维纳米颗粒阵列结构混合，孵育，通过光学显微镜成像，并基于散 射光颜色变化测定待测样品中的抗原。
4.根据本发明的实施方案，所述自组装方法得到零维纳米颗粒阵列的方法，包 括将羧基修饰的纳米颗粒悬浊液置于基底上，然后在基底上覆盖表面经氟硅烷 处理的疏水硅柱模板，在模板结构的诱导下，悬浊液中的纳米颗粒自组装得到所 述零维纳米颗粒阵列。
5.根据本发明的实施方案，所述纳米颗粒材质可以是金属也可以是非金属。例 如为聚苯乙烯纳米颗粒。优选地，所述纳米颗粒的粒径为300～320nm，示例性 为310nm。
6.根据本发明的实施方案，所述羧基修饰的纳米颗粒采用的含羧基化物质比 例为100-150ueq/g。
7.根据本发明的实施方案，所述羧基修饰的纳米颗粒的合成方法，可以采用本 领域已知的纳米颗粒的修饰方法，例如共聚法。
8.根据本发明的实施方案，所述基底可以是刚性基底，也可以是柔性的聚合物 基底。例如为硅基底或柔性pet膜基底。
9.根据本发明的实施方案，所述光学检测方法，还包括对零维纳米颗粒阵列进 行烧结，以增强羧基修饰的纳米颗粒与基底的连接性。优选地，所述烧结的温度 为100～120℃，示例性为100℃、110℃、120℃；所述烧结的时间为20～40min，示 例性为20min、30min、40min。
10.根据本发明的实施方案，所述活化剂可以为碳二亚胺(edc)、n-羟基琥珀 酰亚胺(nhs)和二甲基乙酰胺(dmac)中的至少一种；优选地，所述活化剂 为edc和nhs两种。示例性地，所述活化剂为edc和nhs的混合溶液。例如，所 述活化剂为由edc和nhs的固体粉末配置的混合溶液。
11.根据本发明示例性的实施方案，所述活化剂为0.05mol/l的碳二亚胺(edc) 和0.2mol/l的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的混合溶液。每片零维纳米阵列结构需 使用200μl活化溶液。
12.根据本发明，所述抗体可以为多种类型抗体，其可以与纳米级抗原物质进行 特异性结合，例如可以为抗igm抗体、抗igg抗体、抗sig抗体等。
13.本发明中，所述抗体可以为荧光标记抗体，也可为非荧光标记抗体。
14.根据本发明的实施方案，所述抗体修饰的方法可以采用本领域已知的各种 抗体修饰方法，例如静电吸附法，化学配位法和化学键合法；根据本发明示例 性的实施方案，所述方法为化学键合法。例如，将活化后的产物置于抗体溶液中 孵育，得到所述纳米检测探针。
15.根据本发明，所述抗原是对抗igm抗体、抗igg抗体、抗sig抗体等具有特异 性亲和力的抗原，其可以为病毒，也可以为其他纳米级生物颗粒，例如可以为各 种细胞分泌的外泌体囊泡等。
16.根据本发明示例性的实施方案，所述待测样品为血液或痰液。
17.根据本发明的实施方案，每片零维纳米颗粒阵列，需100～500μl(示例性为 200μl)待检测样品溶液。
18.根据本发明的实施方案，所述含有纳米级抗原物质的待测样品与抗体修饰 的零维纳米颗粒阵列结构混合(即将含有纳米级抗原物质的待检测样品滴加到 抗体修饰的零维纳米颗粒阵列结构上)使抗原与抗体修饰的零维纳米颗粒阵列 结构表面的抗体发生特异性识别反应，以使抗原通过抗体吸附在零维纳米颗粒 结构表面。
19.根据本发明的实施方案，所述孵育的温度可以为25～37℃，示例性为25℃； 所述孵育的时间可以为15-60min，示例性为15min。
20.根据本发明的实施方案，所述光学显微镜含有可以接收光的物镜以及可以 成像的相机。
21.根据本发明的实施方案，所述光学显微镜成像中，还包括倾斜的入射光。
22.本发明中，倾斜的入射光是指入射光的角度大于等于70
°
，示例性为70
°
、75
°
、 80
°
，优选为70
°
。
23.根据本发明的实施方案，入射光的波长范围是350nm-1100nm。
24.根据本发明的实施方案，所述散射光颜色变化可通过图像处理软件获取光 学图像的像素点的灰度值进行比较。
25.本发明首先通过活化剂活化羧基修饰的纳米颗粒表面的羧基，活化后的羧 基修饰的纳米颗粒的羧基与抗体中的氨基连接，得到表面修饰有特异性抗体的 零维纳米颗粒阵列；再将含有纳米级抗原物质的待测样品结合至表面修饰有特 异性抗体的零维纳米颗粒阵列结构上，通过光学显微镜成像，并基于散射光颜色 变化测定待测样品中的抗原。
26.根据本发明的实施方案，所述光学检测方法，包括如下步骤：
27.(1)将羧基修饰纳米颗粒悬浊液置于基底上，通过自组装方法得到零维纳 米颗粒阵列；
28.(2)将步骤(1)中的零维纳米颗粒阵列结构进行烧结，以增强颗粒与基底 的连接性；
29.(3)将烧结后的零维纳米结构浸泡在nhs(n-hydroxysulfosuccinimide)和 edc(n-ethyl-n
’‑
(dimethylaminopropyl)carbodiimide)混合溶液中活化纳米颗粒 表面羧基，后将其置于抗体溶液中使其羧基与抗体中氨基连接，以使纳米颗粒表 面可连接上特异性抗体；
30.(4)将含有纳米级抗原物质的待检测样品滴加到步骤(3)中得到的表面修 饰特异性抗体的零维纳米颗粒阵列结构上，使抗原与零维颗粒阵列结构表面的 抗体发生特异性识别反应；
31.(5)将步骤(4)中的得到的样品置于光学显微镜的载物台上，入射光倾斜 照射在零维颗粒阵列结构表面，物镜接收散射光，相机进行光学成像；
32.(6)对步骤(5)中得到的光学图像通过图像处理软件获取像素点的灰度值。
33.本发明还提供上述光学检测方法在病理检测、体外诊断、免疫识别等中的应 用。例如，用于纳米尺度物体的检测。
34.本发明还提供了一种试剂盒，其包含零维纳米颗粒阵列。
35.本发明还提供了一种生物传感器，其包含零维纳米颗粒阵列。
36.本发明还提供了一种试剂盒和/或生物传感器在病理检测、体外诊断、免疫 识别等中的应用。例如，用于纳米尺度物体的检测。
37.本发明的有益效果:
38.暗场成像法中，由于散射截面的改变会影响物体整体散射行为，通过增强对 物质散射光的收集，分析散射光行为变化表征纳米尺度物体的成像方法逐渐得 到发展。基于此，本发明制备了一种单纳米颗粒阵列的光子结构，该结构可大量 制备，表面可修饰多种生物物质，在无标记检测纳米尺度物质方面具有重要的应 用前景。具体而言：
39.本发明提供了一种基于零维纳米结构的光学成像及生物检测方法，通过在 零维单纳米颗粒阵列表面进行功能化官能团连接抗体从而特异性检测抗原。其 中：病毒颗粒结合在零维单纳米颗粒表面可改变整体的散射截面，进而改变整体 的散射光行为，散射光的变化可通过普通光学显微镜捕捉。相较于传统方法，本 发明方法为无需复杂标记的非标记检测方法，因而对待检测样品无破坏性。同时 本发明方法通过抗体-抗原的特异性结合，使检测方法更加简便快速准确，在病 理检测、体外诊断、免疫识别等方面具有重要意义。
附图说明
40.图1是本发明实施例1中单颗粒纳米结构应用于病毒检测的原理示意图。
41.图2是本发明实施例1中单个纳米颗粒表面吸附有病毒颗粒的光学检测示意 图。
42.图3是本发明实施例1中单个纳米颗粒表面吸附有病毒颗粒检测前、检测后 的光学照片。
43.图4中a1～a4、b1～b4、c1～c4分别是本发明实施例2中溶液自组装法得到的不 同个数二氧化硅颗粒环绕聚苯乙烯纳米颗粒点阵结构的扫描电镜照片、暗场显 微镜光学照
片、斜入射条件下暗场显微光学照片。
44.图5是使用imagej软件对本发明实施例2中单颗粒纳米结构应用于纳米颗粒 检测得到的光学图片的红绿蓝三通道灰度值分析后的折线图。
45.图6中i)、ii)、iii)分别是本发明实施例3中在零维纳米结构表面修饰荧光抗体 后的荧光照片以及单纳米颗粒修饰抗体前(单纳米颗粒)、修饰抗体后(孵育抗 体)的光学照片和扫描电镜照片对比图。
46.图7中(a)、(b)分别是本发明实施例4中检测过程示意图和不同浓度下的 病毒检测结果。
具体实施方式
47.下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当 理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保 护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护 的范围内。
48.除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通 过已知方法制备。
49.实施例1
50.将10μl 0.01mg/ml羧基修饰聚苯乙烯纳米颗粒悬浊液(购于辉质生物科技 有限公司)滴涂在面积为1cm2的洁净光滑的亲水硅基底上后，覆盖上表面经氟硅 烷处理的疏水硅柱模板，通过模板结构诱导的溶液自组装法得到零维单纳米颗 粒点阵结构，纳米颗粒的粒径为310nm，折射率为1.59。
51.如图1所示，将得到的零维单纳米颗粒点阵结构浸泡在200μl 0.05mol/l n-羟 基硫代琥珀酰亚胺(n-hydroxysulfosuccinimide sodium salt简称nhs)和 0.2mol/l 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-(3-dimethylaminopropyl)
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3-ethylcarbodiimide hydrochloride简称edc)的混合溶液中活化聚苯乙烯表面羧 基，之后将活化羧基后的零维单纳米颗粒点阵结构置于10μg/ml流感病毒抗体 溶液中,25℃下孵育抗体一小时。将修饰有抗体的零维单纳米颗粒点阵结构置于 含有相应流感病毒(抗原浓度：106pfu ml-1
)的血清溶液(或将零维单纳米颗 粒点阵结构置于由患者体内提取的用0.01mol/l pbs缓冲溶液(ph 7.2-7.4)稀释 10倍的痰液中完成抗体和抗原的特异性识别反应)，识别反应结束后将结构置于 光学显微镜的载物台上，以氙灯为外接入射光光源，入射角为70
°
倾斜入射。物 镜接收入射光和散射光，散射光为零维纳米颗粒和病毒颗粒相互作用的整体散 射光，工作距离为11mm，数值孔径为0.4。
52.图2、3分别是本发明实施例1中零维单纳米颗粒点阵结构应用于流感病毒检 测时的装置示意图和单个纳米颗粒表面吸附流感病毒颗粒前、后的光学照片。如 图3所示，散射光颜色变化和纳米颗粒整体散射截面息息相关。病毒颗粒吸附在 纳米颗粒表面使零维纳米颗粒散射截面的增加，散射光颜色逐渐由黄到红再到 紫。利用普通光学显微镜在外接光源斜入射情况下通过比较结构色差异即可直 接检测真实样本中病毒有无及病毒含量。
53.实施例2
54.根据实施例1将10μl羧基修饰聚苯乙烯纳米颗粒悬浊液(购于辉质生物科 技有限公司，直径：310nm，浓度：0.01mg/ml)滴涂在洁净光滑的面积为1cm2的亲水硅基底上后，覆
盖上表面经氟硅烷处理的疏水硅柱模板，通过模板结构诱 导的溶液自组装法得到零维单纳米颗粒点阵结构，纳米颗粒的粒径为310nm，折 射率为1.59。
55.再将20μl不同浓度二氧化硅纳米颗粒(购于南京彩纳科技有限公司，粒径： 120nm，浓度：0mg/ml，0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.2mg/ml)悬浊液分别滴 加在零维单纳米颗粒点阵结构上，通过溶液自组装法得到不同个数二氧化硅颗 粒环绕聚苯乙烯纳米颗粒点阵结构。
56.图4中a1～a4、b1～b4、c1～c4分别为实施例2中溶液自组装法得到的不同个数 二氧化硅颗粒环绕聚苯乙烯纳米颗粒的点阵结构的扫描电镜照片、暗场显微镜 光学照片、入射光斜入射条件下的光学照片。从图中可以看出：围绕在聚苯乙烯 颗粒周围的二氧化硅小颗粒个数不同，整体散射截面也不同，随着小颗粒二氧化 硅个数的逐渐增加，斜入射方式下散射光颜色逐渐由黄到红再到紫色。而在传统 暗场模式下，聚苯乙烯颗粒周围引入小颗粒二氧化硅纳米颗粒前后，散射光颜色 变化差别不大。因此，在入射光斜入射条件下，聚苯乙烯纳米颗粒点阵可以检测 到引入的二氧化硅纳米颗粒。
57.使用imagej软件对图4中斜入射方式下采集的照片进行红绿蓝三通道分割后 的灰度值进行分析，结果如图5所示。从图中可以看出：随着二氧化硅纳米颗粒 个数增加引起的散射截面的增加能有效改变纳米颗粒整体的散射行为，进而改 变整体的散射光颜色。
58.实施例3
59.根据实施例1将10μl羧基修饰聚苯乙烯纳米颗粒悬浊液(购于辉质生物科 技有限公司，直径：310nm，浓度：0.01mg/ml)滴在洁净光滑的面积为1cm2的 亲水硅基底上后，覆盖上表面经氟硅烷处理的疏水硅柱模板，通过模板结构诱导 的溶液自组装法得到零维单纳米颗粒点阵结构，纳米颗粒的直径为310nm，折射 率为1.59。
60.将得到的零维单颗粒阵列结构置于0.05mol/l n-羟基硫代琥珀酰亚胺(n
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hydroxysulfosuccinimide sodium salt简称nhs)和0.2mol/l 1-(3-二甲氨基丙基)
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3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride简称edc)的混合溶液中活化纳米颗粒表面羧基。
61.将活化羧基后的零维单颗粒阵列结构置于荧光标记的兔抗山羊cy3荧光抗 体(购于博士德生物技术有限公司，10μg/ml)溶液中，25℃条件下孵育1小时 (活化羧基后抗体可以更高效均匀的结合在聚苯乙烯微球表面)。抗体修饰后用 pbst(0.01％tween-20的pbs溶液)洗脱除去表面未结合抗体。将修饰有抗体 的零维单颗粒阵列结构置于荧光显微镜载物台上，汞灯为入射光源，结果如图6 所示。从图6中i)可以看出：修饰荧光抗体前芯片结构(零维单颗粒阵列结构)在 荧光显微镜下无荧光信号，修饰荧光抗体后芯片结构在荧光显微镜下展现出显 著的荧光信号，且荧光信号均匀一致。由此证明，活化后羧基修饰聚苯乙烯纳米 颗粒表面的羧基与修饰荧光抗体表面的氨基连接的方法可在羧基修饰纳米颗粒 表面成功修饰抗体。图6中ii)是单个310nm羧基修饰聚苯乙烯颗粒在入射光斜入 射条件下的光学照片和扫描电镜照片。图6中iii)是在与6中i)相同实验条件下 (25℃条件下孵育1小时)，在310nm羧基修饰聚苯乙烯微球表面修饰流感病毒 抗体后入射光斜入射条件下的光学照片和扫描电镜照片。对比6中ii)和6中iii) 修饰抗体前后零维单颗粒阵列结构斜入射光学照片和扫描电镜照片可得，抗体 修饰对零维纳米结构表面基本无影响。
62.综上可知，对比零维单颗粒阵列结构表面修饰抗体前后的扫描电镜照片及 光学
照片可以发现：抗体修饰对零维单颗粒阵列结构表面基本无影响，且散射光 颜色基本无变化。
63.实施例4
64.根据实施例1将10μl羧基修饰聚苯乙烯纳米颗粒悬浊液(购于辉质生物科技 有限公司，直径：310nm，浓度：0.01mg/ml)滴在洁净光滑的面积为1cm2的亲 水硅基底上后，覆盖上表面经氟硅烷处理的疏水硅柱模板，通过模板结构诱导的 溶液自组装法得到零维单纳米颗粒点阵结构，纳米颗粒的直径为310nm，折射率 为1.59。
65.将得到的零维单颗粒阵列结构置于0.05m n-羟基硫代琥珀酰亚胺(n
‑ꢀ
hydroxysulfosuccinimide sodium salt简称nhs)和0.2m 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙 基碳二亚胺盐酸盐(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride 简称edc)的混合溶液中活化纳米颗粒表面羧基。
66.将活化羧基后的零维单颗粒阵列结构置于流感病毒抗体(甲型h1n1流感病 毒血凝素抗体，10μg/ml,200μl)溶液中，25℃条件下孵育1小时(活化羧基后 抗体可以更高效均匀的结合在聚苯乙烯微球表面)。抗体修饰后的零维单颗粒阵 列结构用1％bsa缓冲溶液25℃条件下封闭30分钟后，用pbst(0.01％tween-20 的pbs溶液)洗脱除去过量bsa。将修饰有抗体的零维单颗粒阵列结构置于含有 相应流感病毒(抗原浓度：0pfu ml-1
，10pfu ml-1
，103pfu ml-1
，106pfuml-1
，200μl)的血清溶液(或将阵列结构置于由流感患者体内提取的用pbs缓 冲溶液稀释10倍的痰液中完成抗体和抗原的特异性识别反应，病毒样本由301医 院提供)中，识别15分钟后将结合了抗原的零维单颗粒阵列结构置于显微镜载物 台上，氙灯为入射光源。如图7中(b)所示，对比零维单颗粒阵列结构表面结合 病毒前后的扫描电镜照片及光学照片发现(自上而下抗原浓度依次为：0pfu ml-1
，10pfu ml-1
，103pfu ml-1
，106pfu ml-1
)，病毒结合在零维单颗粒纳米结 构表面后，能有效地改变散射光颜色，灰度值变化反映了散射光颜色变化强弱。
67.以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方 式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种光学检测方法，其特征在于，包括如下步骤：将羧基修饰的纳米颗粒悬浊液置于基底上，通过自组装方法得到零维纳米颗粒阵列，加入活化剂活化，然后使用抗体修饰活化后的零维纳米颗粒阵列，得到可检测对应抗原的零维纳米颗粒阵列结构；再将含有纳米级抗原物质的待测样品与抗体修饰的零维纳米颗粒阵列结构混合，孵育，通过光学显微镜成像，并基于散射光颜色变化测定待测样品中的抗原。2.如权利要求1所述的光学检测方法，其特征在于，所述自组装方法得到零维纳米颗粒阵列的方法，包括将羧基修饰的纳米颗粒悬浊液置于基底上，然后在基底上覆盖表面经氟硅烷处理的疏水硅柱模板，在模板结构的诱导下，悬浊液中的纳米颗粒自组装得到所述零维纳米颗粒阵列。3.如权利要求1或2所述的光学检测方法，其特征在于，所述纳米颗粒材质可以是金属也可以是非金属。4.如权利要求3所述的光学检测方法，其特征在于，所述纳米颗粒为聚苯乙烯纳米颗粒。优选地，所述纳米颗粒的粒径为300～320nm。5.如权利要求1-4任一项所述的光学检测方法，其特征在于，所述光学检测方法，还包括对零维纳米颗粒阵列进行烧结，以增强羧基修饰的纳米颗粒与基底的连接性。优选地，所述烧结的温度为100～120℃；所述烧结的时间为20～40min。6.如权利要求1-5任一项所述的光学检测方法，其特征在于，所述孵育的温度为25～37℃；所述孵育的时间可以为15-60min。优选地，所述光学显微镜含有可以接收光的物镜以及可以成像的相机。优选地，所述光学显微镜成像中，还包括倾斜的入射光。优选地，所述散射光颜色变化可通过图像处理软件获取光学图像的像素点的灰度值进行比较。7.如权利要求1-6任一项所述的光学检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将羧基修饰纳米颗粒悬浊液置于基底上，通过自组装方法得到零维纳米颗粒阵列；(2)将步骤(1)中的零维纳米颗粒阵列结构进行烧结，以增强颗粒与基底的连接性；(3)将烧结后的零维纳米结构浸泡在nhs(n-hydroxysulfosuccinimide)和edc(n-ethyl-n
’‑
(dimethylaminopropyl)carbodiimide)混合溶液中活化纳米颗粒表面羧基，后将其置于抗体溶液中使其羧基与抗体中氨基连接，以使纳米颗粒表面可连接上特异性抗体；(4)将含有纳米级抗原物质的待检测样品滴加到步骤(3)中得到的表面修饰特异性抗体的零维纳米颗粒阵列结构上，使抗原与零维颗粒阵列结构表面的抗体发生特异性识别反应；(5)将步骤(4)中的得到的样品置于光学显微镜的载物台上，入射光倾斜照射在零维颗粒阵列结构表面，物镜接收散射光，相机进行光学成像；(6)对步骤(5)中得到的光学图像通过图像处理软件获取像素点的灰度值。8.权利要求1-7任一项所述的光学检测方法在病理检测、体外诊断、免疫识别等中的应用。优选地，用于纳米尺度物体的检测。9.一种试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1-7任一项所述的零维纳米颗粒阵列。
10.一种生物传感器，其特征在于，其包含权利要求1-7任一项所述的零维纳米颗粒阵列。

技术总结
本发明涉及光学纳米成像技术领域，公开了一种基于零维纳米结构的光学成像及生物检测方法。该方法包括：(1)白光入射光通过斜入射方式照射零维纳米结构阵列，普通光学显微镜作为接收端收集散射光。(2)在零维纳米结构周围引入纳米颗粒会改变整体散射截面，从而引起散射光颜色变化。(3)在可见光区域范围内，散射截面的变化会引起光谱强度和峰位的改变。(4)羧基修饰纳米颗粒与抗体中氨基结合使其表面连接特异性抗体，从而结合特异性待检测物质。待检测物质的引入改变整体散射光行为从而引起散射光颜色变化。通过本发明便捷的检测方法，可实现病原体的特异性检测。本发明检测方法操作简单，成本低，便携，可视化。可视化。可视化。


技术研发人员：苏萌 王华东 张泽英 宋延林
受保护的技术使用者：中国科学院化学研究所
技术研发日：2022.03.03
技术公布日：2023/9/13