糖基转移酶突变体及其在生物合成莱鲍迪苷M中的应用的制作方法

glycosyltransferase srugt76g1”。该研究详细阐释了二萜类化合物糖基转移酶srugt76g1的底物识别与催化的分子机制，发现该酶能识别多种二萜及其他小分子化合物生成相应的糖基化产物，然而，srugt76g1可以适应多种甜菊糖底物，如甜菊糖甙、莱鲍迪苷a和莱鲍迪苷d，且选择性较低，这是由于其具有宽大的糖基受体结合口（糖结合囊）。但该现有技术也同时公开了thr284是决定底物识别专一性与产物特异性的关键位点，突变体srugt76g1-t284s可以通过中间产物莱鲍迪苷 d选择性催化莱鲍迪苷 a合成莱鲍迪苷 m，经检测，突变体ugt76g1-t284s可提高其对莱鲍迪苷 d的活性约1-1.5倍。然而，虽然突变体ugt76g1-t284s在一定程度上提高了活性，但仍无法达到规模化生产的程度。
6.

技术实现要素：
为了进一步改造糖基转移酶ugt76g1，提高其提高生物酶催化莱鲍迪苷d制备莱鲍迪苷m的产率，并提供一种生物合成莱鲍迪苷m的方法，该方法莱鲍迪苷m的转化率高，适于莱鲍迪苷m的工业化生产。
7.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种糖基转移酶突变体，所述突变体是在seq id no:1所示的糖基转移酶ugt76g1氨基酸序列的基础上含有如下至少一个位点的突变:h82、l85、m88、l126、t146、n196、i199、l200、i203、t284。
8.进一步的，所述突变体是在seq id no:1所示的糖基转移酶ugt76g1氨基酸序列的基础上含有如下至少一个位点的突变: l85、m88、l126、n196、i199、l200、t284。
9.优选的，突变体是在seq id no:1所示的糖基转移酶ugt76g1氨基酸序列的基础上含有如下至少一个位点的突变: m88、l126、i199、l200、t284，且至少其中一个突变位点为t284。
10.进一步的，所述h82、l85、m88、l126、t146、n196、i199、l200、i203、t284中至少一个位点的突变选自h82a、l85a、m88l、l126f、t146s、n196a、i199f、l200a、i203a、t284s中至少一个位点的残基的取代。
11.根据本发明的实施方案，所述突变体与seq id no:1所示的氨基酸序列具有70％以上的同源性。
12.本发明还提供了一种表达基因，所述基因编码上述糖基转移酶突变体。
13.本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体中连接上述表达基因。
14.进一步的，所述重组载体中连接权利要求4所述的表达基因和蔗糖合酶基因。
15.本发明还提供生物合成莱鲍迪苷m的方法，以莱鲍迪苷d为底物，以重组菌株为转化菌株，生物合成莱鲍迪苷m。
16.所述重组菌株是将连接有糖基转移酶突变体基因的重组载体在感受态细胞中进行转化得到的重组菌株；或是将连接有糖基转移酶突变体基因和蔗糖合酶基因的重组载体在感受态细胞中进行转化得到的重组菌株。
17.所述重组载体为质粒，优选为pet28a或petduet。
18.所述感受态细胞为e.coli bl21（de3）或e.coli rosetta（de3），优选为e.coli bl21（de3）。
19.进一步的，所述生物合成莱鲍迪苷m的方法，具体包括以下步骤：
1）将权利要求5或6的重组载体转化入感受态细胞中，得到重组菌株；2）将步骤1）得到的重组菌株在液体培养基中进行诱导表达，收集菌体；3）将步骤2）得到的菌体加入含有莱鲍迪苷d的催化反应体系中进行转化，得到转化液，对转化液进行分离纯化，得到产物莱鲍迪苷m。
20.优选的，所述诱导表达采用的诱导剂为异丙基-β
‑ꢀdꢀ‑
硫代半乳糖苷(iptg)。
21.在本发明的一种实施方案中，所述反应体系包括：50-60mm tris-hcl，ph 7.5-8.5，0.1-1.0 mm udp，200-900mm蔗糖，5-60g/l reb d，20-120g/l菌体，25-45℃反应1-24h。
22.优选的，所述反应体系包括：55mm tris-hcl，ph 8.0，0.8 mm udp，500mm蔗糖，20g/l reb d，50g/l菌体，30℃反应24h。
23.进一步的，在步骤（3）中，采用间歇加料的方式添加莱鲍迪苷d，分别在0 h、0.5h、1.5h和2.5 h添加5g/l莱鲍迪苷d。
24.有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明通过对糖基转移酶ugt76g1定向进化得到突变体，提高了酶活性及催化效率，并采用突变体和蔗糖合酶atsusy进行级联反应，以reb d为底物合成reb m，提高了reb m的产率，催化合成产率可达90%以上，为reb m的工业化生产提高了基础。
25.附图说明：图1 为部分突变体的转化率对比图。
26.具体实施方式：本发明是经过深入的创造性研究，针对ugt76g1与底物结合口袋的关键氨基酸残基进行突变，研究提高其催化活性的ugt76g1突变体，在此基础上公开了一组特别位置氨基酸残基突变的突变体。“底物结合口袋”是指糖基转移酶ugt76g1的空间结构中与底物发生相互作用的位置。
27.本发明的糖基转移酶突变体是在糖基转移酶ugt76g1氨基酸序列的基础上，含有如下至少一个位点的突变:h82、l85、m88、l126、t146、n196、i199、l200、i203、t284。糖基转移酶ugt76g1的氨基酸序列如seq id no:1所示，核苷酸序列如seq id no:2所示。
28.本发明的一种实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含h82、l85、m88、l126、t146、n196、i199、l200、i203、t284中任意一个位点的突变。优选的，所述氨基酸序列包含l85、m88、l126、n196、i199、l200、t284中任意一个位点的突变。
29.在本发明的另一种实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含h82、l85、m88、l126、t146、n196、i199、l200、i203、t284中任意两个位点的突变。优选的，所述氨基酸序列包含l85、m88、l126、n196、i199、l200、t284中任意两个位点的突变。进一步的，上述突变位点中，其中一个突变位点为t284、l200中任意一个。优选的，所述突变体的氨基酸序列包含如下两个位点的突变：t85/ t284、m88/ t284、l126/ t284、t146/ t284、i203/ t284、t284/ l200、m88/ l200或i199/ l200。更进一步的，所述突变体的氨基酸序列包含上述两个位点的突变，且其中一个突变位点为t284。优选的，所述突变体的氨基酸序列包含如下两个位点的突变：m88/ t284、l126/ t284、i203/ t284或t284/ l200。
30.在本发明的另一种实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含h82、l85、m88、
l126、t146、n196、i199、l200、i203、t284中任意三个位点的突变。优选的，所述氨基酸序列包含m88、l126、n196、i199、l200、t284中任意三个位点的突变。进一步的，上述突变位点中，其中一个突变位点为t284、l200中任意一个。优选的，所述突变体的氨基酸序列包含如下三个位点的突变：l85/m88/ t284、m88/ t146/ t284、m88/ l126/ t284、m88/i203/ t284、m88/ l200/t284、m88/ i199/ t284、i199/ l200/t284、l126/ i199/ l200或i199/ i203/l200。更进一步的，所述突变体的氨基酸序列包含上述三个位点的突变，且其中一个突变位点为t284。优选的，所述突变体的氨基酸序列包含如下两个位点的突变：m88/ t146/ t284、m88/ l126/ t284、m88/i203/ t284、m88/ l200/t284或m88/ i199/ t284。
31.在本发明的另一种实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含h82、l85、m88、l126、t146、n196、i199、l200、i203、t284中任意四个位点的突变。优选的，所述氨基酸序列包含m88、l126、n196、i199、l200、t284中任意四个位点的突变。进一步的，上述突变位点中，其中一个突变位点为t284、l200中任意一个。优选的，所述突变体的氨基酸序列包含如下三个位点的突变：m88 /l126/ t146/ t284、m88/ l126/ i199/t284、m88 l126/ /i203/ t284、l126/ n196/l200/t284或l126/ n196/ i199/ l200。
32.进一步的，所述h82、l85、m88、l126、t146、n196、i199、l200、i203、t284中至少一个位点的突变选自h82a、l85a、m88l、l126f、t146s、n196a、i199f、l200a、i203a、t284s中至少一个位点的残基的取代。
33.在一些具体的实施方式中，突变体为：ugt76g1-l85a、ugt76g1-m88l、ugt76g1-l126f、ugt76g1-i199f、ugt76g1-l200a、ugt76g1-i203a、ugt76g1-t284s；ugt76g1-l85a/t284s、ugt76g1-m88l/ t284s、ugt76g1
‑ꢀ
i199f/t284s、ugt76g1
‑ꢀ
m88l/l200a；ugt76g1-l85a/ m88l/ t284s、ugt76g1
‑ꢀ
m88l/ l126f/ t284s、ugt76g1
‑ꢀ
m88l/l126f/l200a、ugt76g1
‑ꢀ
m88l/ l200a/ t284s、ugt76g1
‑ꢀ
l126f/ i199f/ l200a; ugt76g1-m88l/ l126f/ t146s/ t284s、ugt76g1
‑ꢀ
m88l/l126f/ i199f/ t284s、ugt76g1
‑ꢀ
l126f/ n196a/ l200a等。
34.根据本发明的实施方案，所述突变体与seq id no:1所示的氨基酸序列具有70％以上的同源性。具体的实施方式中，所述同源性或序列相同性可以是90％以上，优选95％以上。
35.本文中通过突变位点的位置编号和该位点的氨基酸种类表达突变位点及其取代，例如m88l表示与seq id no:1比对，在对应于seq id no:1第88位置的甲硫氨酸被亮氨酸所取代。本发明当中，采用“/”表示突变位点的组合，例如“m88l/l200a”表示第88位置的甲硫氨酸被亮氨酸所取代和第200位的亮氨酸均被丙氨酸所取代，包含两个突变位点，为双突变体。同理，“m88l/l126f/l200a”表示相应的三个位点同时发生突变，为三突变体。
36.本发明还提供了一种表达基因，所述基因编码上述糖基转移酶突变体。
37.本发明中，糖基转移酶突变体表达基因可插入到重组载体中，常用的重组载体均适用于本发明，本发明中重组载体为质粒，优选为pet28a或petduet。
38.本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体中连接上述表达基因。
39.进一步的，所述重组载体中连接权利要求4所述的表达基因和蔗糖合酶基因。
40.在本发明的具体实施例中，糖基转移酶突变体在大肠杆菌中表达、纯化：通过pcr，将野生型ugt76g1基因从克隆载体中扩增并亚克隆至蛋白表达载体petduet-1中。以
ugt76g1基因表达载体为模板，通过pcr引物引入突变，经过pcr扩增，构建突变体蛋白表达载体。测序正确的突变体在大肠杆菌bl21(de3)中进行异源表达。糖基转移酶突变体的酶活检测方法可以运用本领域公知的技术。在本发明的具体实施例中，使用相同条件的酶反应体系对不同突变体蛋白进行体外酶活性测试，反应后经hplc检测产物生成，通过比较突变体与野生型糖基转移酶ugt76g1对莱鲍迪苷d的转化率，分析突变体的催化活性。
41.本发明还提供生物合成莱鲍迪苷m的方法，以莱鲍迪苷d为底物，以重组菌株为转化菌株，生物合成莱鲍迪苷m。
42.所述重组菌株是将连接有糖基转移酶突变体基因的重组载体在感受态细胞中进行转化得到的重组菌株；或是将连接有糖基转移酶突变体基因和蔗糖合酶基因的重组载体在感受态细胞中进行转化得到的重组菌株。
43.所述感受态细胞为e.coli bl21（de3）或e.coli rosetta（de3），优选为e.coli bl21（de3）。
44.进一步的，所述生物合成莱鲍迪苷m的方法，具体包括以下步骤：1）将权利要求5或6的重组载体转化入感受态细胞中，得到重组菌株；2）将步骤1）得到的重组菌株在液体培养基中进行诱导表达，收集菌体；3）将步骤2）得到的菌体加入含有莱鲍迪苷d的催化反应体系中进行转化，得到转化液，对转化液进行分离纯化，得到产物莱鲍迪苷m。
45.优选的，所述诱导表达采用的诱导剂为异丙基-β
‑ꢀdꢀ‑
硫代半乳糖苷(iptg)。
46.在本发明的一种实施方案中，所述反应体系包括：50-60mm tris-hcl，ph 7.5-8.5，0.1-1.0 mm udp，200-900mm蔗糖，5-60g/l reb d，20-120g/l菌体，25-45℃反应1-24h。
47.优选的，所述反应体系包括：55mm tris-hcl，ph 8.0，0.8 mm udp，500mm蔗糖，20g/l reb d，50g/l菌体，30℃反应24h。
48.进一步的，在步骤（3）中，采用间歇加料的方式添加莱鲍迪苷d，分别在0 h、0.5h、1.5h和2.5 h添加5g/l莱鲍迪苷d。
49.本文中，“莱鲍迪苷d”和“reb d”、“莱鲍迪苷m”和“reb m”均具有相同含义，可互换使用。
50.下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
51.实施例1野生型ugt76g1表达载体的构建以密码子优化的ugt76g1基因克隆载体为模板，使用特异引物对(加载bamhi与hindiii位点，表1)扩增ugt76g1基因。使用t4连接酶将pcr产物连接至bamhi/hindiii双酶切的载体pet28a中，所获得的表达载体pet28a-ugt76g1经测序验证。
52.表1、野生型ugt76g1表达载体构建使用的引物引物名称序列（（5
’→3’
））76g1fcgcggatccatggaaaacaaaaccgaa76g1rcccaagcttttacagagaagagatgta
实施例2突变体表达载体的构建利用pcr扩增技术，以野生型表达载体pet28a-ugt76g1为模版，进行碱基定点突变，转化至dh5α感受态细胞，挑选克隆测序验证，相应的引物见表2所示。
53.表2.突变体表达载体构建使用的引物实施例3突变体蛋白的表达与纯化将实施例2制备的测序正确的突变体表达载体分别转化至大肠杆菌bl21(de3)，在含有100mg/l氨苄青霉素的2
×
yt培养基中，37℃培养。当细胞浓度达到od6000.6-0.8时，18℃的条件下采用0.1mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导蛋白表达8h。收集细胞，以0.1g/ml的比例进行裂解缓冲，裂解缓冲体系为：50mmtris-hcl，ph8.0，300mmnacl，10mm咪唑和10%甘油。采用高压均质器对细胞进行破碎，对粗样品进行离心，离心力为40,000
×
g，30min；采用ni-nta柱进行蛋白纯化，然后浓缩至10mg/ml备用。
54.实施例4突变体酶活性测定测定野生型ugt76g1糖基转移酶以及糖基转移酶突变体的催化活性：取实施例3得到的酶以及野生型ugt76g1糖基转移酶，将2.5mm上述酶和2mmrebd分别添加在反应体系中，35℃孵育10min，反应体系为：5mmudpg，50mmtris-hcl，ph8.0，200μl。反应结束后用10倍体积的20%乙腈水溶液稀释，90℃加热2min，样品6000g离心10min，上清液用0.45μm滤膜过滤，hplc分析产物生成情况。根据hplc检测结果，比较不同突变体的催化活性，图1展示了一些催化效果较为显著的突变体的转化率对比。
55.液相仪器为agilent1260，色谱柱为c18柱（silgreenhplccolumn250
×
4.6mm）。液相色谱条件为：柱温40
°
c，流速1ml/min，使用流动相b相水，c相乙腈，采用线性梯度洗脱法：0min95%b+5%c，10min55%b+45%c，15min0%b+100%c，16min95%b+5%c，20min95%b+5%c。
56.实施例5重组菌株的构建从突变体、双突变体和三突变体中选择相对酶活较高的突变体作为关键突变体：
ugt76g1-l126f、ugt76g1-l200a、ugt76g1-l126f/t284s、ugt76g1-m88l/t284s、ugt76g1-m88l/l126f/t284s、ugt76g1-m88l/i199f/t284s、ugt76g1-m88l/l126f/i199f/t284s。
57.上述关键突变体的氨基酸序列和核苷酸序列如下：ugt76g1-l126f，氨基酸序列如seqidno：3所示，核苷酸序列如seqidno：4所示；ugt76g1-l200a，氨基酸序列如seqidno：5所示，核苷酸序列如seqidno：6所示；ugt76g1-l126f/t284s，氨基酸序列如seqidno：7所示，核苷酸序列如seqidno：8所示；ugt76g1-m88l/t284s，氨基酸序列如seqidno：9所示，核苷酸序列如seqidno：10所示；ugt76g1-m88l/l126f/t284s，氨基酸序列如seqidno：11所示，核苷酸序列如seqidno：12所示；ugt76g1-m88l/i199f/t284s，氨基酸序列如seqidno：13所示，核苷酸序列如seqidno：14所示；ugt76g1-m88l/l126f/i199f/t284s，氨基酸序列如seqidno：15所示，核苷酸序列如seqidno：16所示。
58.以petduet-1为载体，在载体的bamhi/hindiii位点插入上述突变基因，获得petduet-ugt76g1，再用pcr方式将ndei/xhoi位点引入蔗糖合酶atsus基因，插入该质粒，构成重组表达质粒petduet-ugt76g1-atsus，将重组质粒导入至大肠杆菌bl21(de3)中进行转化，得到重组菌株。其中，蔗糖合酶atsus的氨基酸序列如seqidno:17所示；蔗糖合酶atsus的核苷酸序列如seqidno:18所示。
59.表3、重组菌株构建使用的引物引物名称序列（（5
’→3’
））susfcgccatatgatggcaaaccctaagctcsusrccgctcgagtcagtcatcggcggttga实施例6生物合成莱鲍迪苷m将实施例4制备得到的重组菌株分别接种到tb培养基中，37℃培养2h，采用0.1mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导蛋白表达12h，收集菌体。将菌体加入催化反应体系中，催化反应体系为：55mmtris-hcl，ph8.0，0.8mmudp，500mm蔗糖，20g/lrebd，50g/l菌体，30℃反应24h，得到转化液。反应结束后，取转化液用20倍体积的20%乙腈水溶液稀释，90℃加热2min，样品6000g离心10min，上清液用0.45μm滤膜过滤，hplc分析产物生成情况。
60.液相仪器为agilent1260，色谱柱为c18柱（silgreenhplccolumn250
×
4.6mm）。液相色谱条件为：柱温40
°
c，流速1ml/min，使用流动相b相水，c相乙腈，采用线性梯度洗脱法：0min95%b+5%c，10min55%b+45%c，15min0%b+100%c，16min95%b+5%c，20min95%b+5%c。
突变体重组菌株ugt76g1-l126fugt76g1-l200augt76g1-l126f/t284sugt76g1-m88l/t284sugt76g1-m88l/l126f/t284sugt76g1-m88l/i199f/t284sugt76g1-m88l/l126f/i199f/t284s
rebm产量（g/l)19.86913.98020.86217.45921.69420.17317.905rebm产率（%)86.8861.1391.2276.3494.8688.2178.29
61.实施例7间歇加料制备莱鲍迪苷m采用实施例6中检测结果最高的，含有ugt76g1-m88l/l126f/t284s突变体的重组菌株，接种到tb培养基中，37℃培养2h，采用0.1mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导蛋白表达12h，收集菌体。将菌体加入催化反应体系中，催化反应体系为：55mmtris-hcl，ph8.0，0.8mmudp，500mm蔗糖，30g/lrebd，50g/l菌体，30℃反应24h，得到转化液。反应结束后，取转化液用20倍体积的20%乙腈水溶液稀释，90℃加热2min，样品6000g离心10min，上清液用0.45μm滤膜过滤，hplc分析产物生成情况，hplc分析方法与实施例6相同。
62.其中，30g/lrebd的添加方式为分别在0h、1h、3h、5h、7.0h和8h添加12g/l、8g/l、4g/l、3g/l、2g/l、1g/lrebd。
63.经检测，rebm的产量为32.161g/l，产率为93.75%。
64.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

技术特征：
1.一种糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体是在seq id no:1所示的糖基转移酶ugt76g1氨基酸序列的基础上含有如下至少一个位点的突变:h82、l85、m88、l126、t146、n196、i199、l200、i203、t284。2.根据权利要求1所述的一种糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体是在seq id no:1所示的糖基转移酶ugt76g1氨基酸序列的基础上含有如下至少一个位点的突变: l85、m88、l126、n196、i199、l200、t284；优选的，突变体是在seq id no:1所示的糖基转移酶ugt76g1氨基酸序列的基础上含有如下至少一个位点的突变: m88、l126、i199、l200、t284，且至少其中一个突变位点为t284。3.根据权利要求1所述的糖基转移酶突变体，其特征在于，所述h82、l85、m88、l126、t146、n196、i199、l200、i203、t284中至少一个位点的突变选自h82a、l85a、m88l、l126f、t146s、n196a、i199f、l200a、i203a、t284s中至少一个位点的残基的取代。4.一种表达基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1-3任一项所述的糖基转移酶突变体。5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体中连接权利要求4所述的表达基因。6.如权利要求5所述的一种重组载体，所述重组载体中连接权利要求4所述的表达基因和蔗糖合酶基因。7.一种生物合成莱鲍迪苷m的方法，其特征在于，以莱鲍迪苷d为底物，以重组菌株为转化菌株，生物合成莱鲍迪苷m；所述重组菌株是将权利要求5或6的重组载体在感受态细胞中进行转化得到的重组菌株。8.如权利要求7所述的一种生物合成莱鲍迪苷m的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将权利要求5或6的重组载体转化入感受态细胞中，得到重组菌株；2）将步骤1）得到的重组菌株在液体培养基中进行诱导表达，收集菌体；3）将步骤2）得到的菌体加入含有莱鲍迪苷d的催化反应体系中进行转化，得到转化液，对转化液进行分离纯化，得到产物莱鲍迪苷m。9.如权利要求8所述的一种生物合成莱鲍迪苷m的方法，其特征在于，所述反应体系包括：50-60mm tris-hcl，ph 7.5-8.5，0.1-1.0 mm udp，200-900mm蔗糖，5-60g/l reb d，20-60g/l菌体，25-45℃反应1-24h。10.如权利要求8所述的一种生物合成莱鲍迪苷m的方法，其特征在于，步骤（3）中，采用间歇加料的方式添加莱鲍迪苷d，分别在0 h、0.5h、1.5h和2.5 h添加5g/l莱鲍迪苷d。

技术总结
本发明通过对糖基转移酶UGT76G1定向进化得到突变体，所述突变体是在SEQ ID NO:1所示的糖基转移酶UGT76G1氨基酸序列的基础上含有如下至少一个位点的突变:H82、L85、M88、L126、T146、N196、I199、L200、I203、T284。糖基转移酶突变体提高了酶活性及催化效率，并采用突变体和蔗糖合酶AtSuSy进行级联反应，以Reb D为底物合成Reb M，提高了Reb M的产率，催化合成产率可达90%以上，为Reb M的工业化生产提高了基础。础。础。


技术研发人员：潘月 裴亮
受保护的技术使用者：四川盈嘉合生科技有限公司
技术研发日：2022.03.03
技术公布日：2023/9/13