一种耐酸酵母工程菌株、构建方法及其应用与流程

1.本发明属于生物工程技术领域，具体为一种耐酸酵母工程菌株、构建方法及其应用。


背景技术：

2.乳酸是三大有机酸之一，乳酸及其衍生物被广泛用于食品、医药、化工等诸多领域。近年来随着可降解生物塑料聚乳酸在食品包装、医疗器械、以及个人护理产品等领域的应用，聚乳酸合成的单体——光学纯l-乳酸的市场需求增长迅速。聚乳酸是一种新型的生物基塑料，具有良好的生物降解性、生物相容性、热稳定性和易加工等优点，可以制成一次性餐具、包装材料、骨科内固定材料、免拆手术缝合线等产品。目前聚乳酸市场份额约占生物基可降解塑料的70％，预计未来将以15％～25％的速度增长。光学纯l-乳酸是聚乳酸聚合的单体，微生物发酵法是l-乳酸的商业化生产方法。由于发酵产物l-乳酸对菌株的抑制作用，在发酵过程中需要添加中和剂来调节ph值。不仅增加分离提取的难度，而且生成的硫酸钙造成了严重的污染。目前大部分的l-乳酸生产菌株均需要在中等偏酸的条件下(ph5.0-6.0)生产乳酸，发酵过程需要添加大量的中和剂。因此，开发获得低ph发酵、无中和剂的l-乳酸生产菌株及其发酵工艺具有重要的现实意义。
3.酵母菌具有较强的耐酸特性，可以在ph值低于3.0的条件下生长。然而酵母菌不具有乳酸生成能力，需要利用代谢工程手段改造代谢途径，使其具有乳酸生成能力。中国专利cn112410233a公布了利用重组假丝酵母菌生产d-乳酸的方法，但是上述发酵过程需要添加caco3、nh4oh、naoh等中和剂。中国发明专利cn113430127a公布了利用酿酒酵母工程菌生产l-乳酸的方法，该工程菌可以耐受较低的ph值(ph2.44)。l-乳酸产量为29.55克每升，不适用于工业化生产。


技术实现要素：

4.基于背景技术中所提到的问题，本发明的目的在于提供一种耐酸酵母工程菌株、构建方法及其应用。
5.一种耐酸酵母工程菌株，所述耐酸酵母工程菌株为凝结芽孢杆菌的乳酸脱氢酶基因ldh以打靶片段的形式插入到敲除丙酮酸脱羧酶基因pkpdc的库德里阿兹氏毕赤酵母中进行重组表达获得。
6.优选地，所述耐酸酵母工程菌株于2023年04月23日保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc，保藏编号为cctcc m 2023587。
7.优选地，所述构建方法具体为：构建质粒pwspk对库德里阿兹氏毕赤酵母的丙酮酸脱羧酶基因pkpdc进行敲除，将来自凝结芽孢杆菌的乳酸脱氢酶基因ldh以打靶片段的形式插入到敲除丙酮酸脱羧酶基因pkpdc的库德里阿兹氏毕赤酵母中进行重组即可得到耐酸酵母工程菌株。
8.优选地，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌dsm1。
9.优选地，所述质粒pwspk的构建方法为：在丙酮酸脱羧酶pkpdc基因的上下游分别设计引物pkpdc-f(5
’‑
gaagtcaacgaagatggtgagattgatgg-3’)与pkpdc-r(5
’‑
gctccgagagtgaggcgagacgtc-3’)，以库德里阿兹氏毕赤酵母的基因组为模板扩增出片段并测序，得到基因pkpdc序列，预测丙酮酸脱羧酶基因pkpdc合适的n20位点，构建质粒pwspk。
10.优选地，所述打靶片段由基因pkpdc的上游1000bp，基因ldh以及基因pkpdc的下游1000bp通过overlap pcr技术得到。
11.优选地，所述基因pkpdc的上游1000bp命名为pdc-uparm，由引物pdc-uparm-f(5
’‑
gttgttaccgaagcagggtttgatttc-3’)与pdc-uparm-r(5
’‑
gcaccgatattgtaatgacatctgaatgtaaaatgaac-3’)扩增得到。
12.优选地，所述基因ldh以凝结芽孢杆菌dsm1基因组为模板，由引物ldh-f(5
’‑
ttacattcagatgtcattacaatatcggtgcc-3’)与ldh-r(5
’‑
agcaaaacataaaaatatgaaaaaagtcaatcgtattgcag-3’)扩增得到。
13.优选地，所述基因pkpdc的下游1000bp命名为pdc-downarm，由引物pdc-downarm-f(5
’‑
cgattgacttttttcatatttttatgttttgctgtg-3’)与pdc-downarm-r(5
’‑
caggtggctcagctgttgcagg-3’)扩增得到。
14.优选地，所述的耐酸酵母工程菌株或由耐酸酵母工程菌株构建方法构建的耐酸酵母工程菌株能够用于l-乳酸的生产。
15.有益效果：本发明所述的耐酸酵母工程菌株在l-乳酸发酵过程不需要添加中和剂，即可实现乳酸的清洁生产。
附图说明
16.图1为本发明中重组菌l-乳酸发酵曲线图；
17.图2为本发明中重组菌l-乳酸发酵液液相色谱图。
具体实施方式
18.以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何限定。
19.实施例1
20.1.菌株筛选
21.1.1初筛
22.称取酒厂附近土地样品1g溶于100ml灭菌生理盐水中，震荡30分钟，得到样品悬液。在无菌条件下梯度稀释不同倍数，分别吸取各稀释倍数的菌悬液0.1ml涂布于筛选培养基平板上(葡萄糖20克每升，蛋白胨20克每升，酵母粉10克每升，琼脂2克每升)，30℃恒温培养24h后，观察菌落形态、透明度、黏度等特征，挑取菌落进行划线纯化，编号保存。
23.1.2复筛
24.将划线得到的纯菌落接种于液体培养基(葡萄糖20克每升，蛋白胨20克每升，酵母粉10克每升)，30℃，220转每分钟，培养17小时。以1％(v/v)接种量接种于筛选培养基中(葡萄糖200克每升，蛋白胨20克每升，酵母粉10克每升，ph 3.8),30℃，220转每分钟，摇瓶培养24小时，检测菌株生长情况od
600
，葡萄糖消耗情况和产物生成情况。
25.1.3菌株鉴定
26.利用真菌基因组dna提取试剂盒提取菌株基因组dna，以通用引物ns1(5
’‑
gtagtcatatgcttgtctc-3’)与ns4(5
’‑
cttccgtcaattcctttaag-3’)对菌株18s rdna进行pcr扩增。扩增条件为：
27.95℃预变性10min；95℃变性10s，52℃退火20s，72℃延伸1min，循环30次；72℃终延伸10min。
28.pcr产物送到北京睿博兴科公司进行测序，测序拼接结果在ncbi网站进行blast比对分析。
29.1.4筛选结果
30.在酒厂土样中筛选获得23株酵母菌，经过高糖低ph复筛培养基筛选，获得一株生长状况最好的菌株，命名为pkz e1。通过18s rdna测序，鉴定为库德里阿兹氏毕赤酵母(pichia kudriavzevii)，已于2023年04月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 2023587。
31.2.重组菌株构建
32.2.1.改造乙醇合成途径，构建具有l-乳酸合成能力的酵母工程菌
33.在ncbi数据库中查找到pichia kudriavzevii的丙酮酸脱羧酶基因pkpdc，在基因的上下游分别设计引物pkpdc-f(5
’‑
gaagtcaacgaagatggtgagattgatgg-3’)与pkpdc-r(5
’‑
gctccgagagtgaggcgagacgtc-3’)，以p.kudriavzevii的基因组为模板扩增出片段并测序，得到基因pkpdc序列。
34.利用chopchop网站预测基因pkpdc合适的n20位点，构建质粒pwspk用以敲除该基因。同时将来自凝结芽孢杆菌dsm1的乳酸脱氢酶基因ldh插入到基因pkpdc的基因位点。打靶片段由基因pkpdc的上游1000bp，基因ldh以及基因pkpdc的下游1000bp通过overlap pcr得到。基因pkpdc的上游1000bp命名为pdc-uparm，由引物pdc-uparm-f(5
’‑
gttgttaccgaagcagggtttgatttc-3’)与pdc-uparm-r(5
’‑
gcaccgatattgtaatgacatctgaatgtaaaatgaac-3’)扩增得到，以凝结芽孢杆菌dsm1基因组为模板，由引物ldh-f(5
’‑
ttacattcagatgtcattacaatatcggtgcc-3’)与ldh-r(5
’‑
agcaaaacataaaaatatgaaaaaagtcaatcgtattgcag-3’)扩增得到基因ldh，基因pkpdc的下游1000bp命名为pdc-downarm，由引物pdc-downarm-f(5
’‑
cgattgacttttttcatatttttatgttttgctgtg-3’)与pdc-downarm-r(5
’‑
caggtggctcagctgttgcagg-3’)扩增得到。
35.将质粒与打靶片段一起通过电转化的方法转入到p.kudriavzevii感受态细胞中，涂布到含有200mg/l zeocin的ypd培养基平板上(葡萄糖20克每升，酵母粉10克每升，蛋白胨10克每升，琼脂20克每升)筛选转化子。获得转化子后用引物pdc-yz-f(5
’‑
acatacgtacaggattgtgtattagtg-3’)与pdc-yz-r(5
’‑
agggaaattgattgagcgcatc-3’)进行菌落pcr验证，得到成功敲除基因pkpdc并插入了基因ldh的菌株，并进行测序验证。
36.成功获得改造菌株以后，将菌株在不含抗生素的ypd培养基中连续传代三次，消除质粒并在含有200mg/l zeocin的ypd培养基上验证无法生长。由此得到p.kudriavzeviiδpdc::ldh的菌株，命名为pkz03。
37.实施例2
38.1.l-乳酸发酵流程及检测方法
39.1.1发酵流程
40.将菌株在无菌条件下接种于装有50毫升种子培养基(葡萄糖50克每升，蛋白胨20克每升，酵母粉10克每升)的三角瓶中，30℃，120转每分钟培养24小时，制得种子培养液。将种子培养液在无菌条件下(接种量为30％，v/v)接入装有3升发酵培养基的5升全自动发酵罐(上海保兴biotech)中，35℃，300转每分钟培养。通气量为1vvm，每3个小时取样一次，测定发酵液中的残糖量和l-乳酸浓度。当发酵过程中总糖消耗速率趋于平稳，结束发酵。
41.2.检测方法及数据计算
42.2.1葡萄糖的测定方法
43.采用sba-40c分析仪。样品离心后收集上清，经适当稀释后由进样针吸取25微升，并注入反应池，底物透过酶膜圈与固定化酶层接触并反应，并产生电流信号，该电流信号与底物的浓度成线性比例关系，经微机控制的信号，可直接显示并打印结果。
44.2.2l-乳酸浓度测定方法
45.采用agilent 1260液相色谱仪，发酵液离心(6000转每分钟，10分钟)，上清液经0.45微米膜过滤后进行高效液相色谱分析。色谱柱为：bio-rad aminex hpx-87h(bio-rad,hercules,ca,usa)，流动相为6mm稀硫酸，检测器为紫外检测器，检测波长210nm，检测温度55℃。利用l-乳酸标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液(发酵体系)中l-乳酸的含量。
46.2.3l-乳酸光学纯度测定方法
47.采用agilent 1260液相色谱仪，配备手性分离柱(日本三菱化学公司，mci gel-crs10w，4.6mm id
×
50mm)。具体操作条件为：2mm的硫酸铜作为流动相，流量0.5ml/min，进样量5μl，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度25℃。分别利用l-乳酸和d-乳酸标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液(发酵体系)中l-乳酸和d-乳酸的含量。
48.2.4计算方法
49.本发明中l-乳酸的光学纯度(ee)按以下公式计算：((l-乳酸产量－d-乳酸产量)
÷
(l-乳酸产量+d-乳酸产量))
×
100％。
50.糖酸转化率定义为(g/g)：(l-乳酸产量(g/l)
÷
底物消耗量(g/l，葡萄糖(g/l))
×
100％。
51.3.产l-乳酸重组菌株发酵验证
52.3.1重组菌株发酵产物对比
53.将筛选获得的菌株接种于高糖低ph培养基(20g/l酵母粉、10g/l蛋白胨、200g/l葡萄糖，ph3.8)中，30℃，220转每分钟，摇瓶培养48小时。葡萄糖残留为0，发酵产物乙醇为115克每升，甘油为60克每升，无乳酸钙生成(表1)。敲除了乙醇合成关键基因pkpdc，得到重组菌株pkz02。将菌株pkz02接种于ypd培养基(20g/l酵母粉、10g/l蛋白胨、20g/l葡萄糖)，30℃，220转每分钟，摇瓶培养48小时。发酵产物无乙醇积累，产物主要为甘油。将来自凝结芽孢杆菌dsm1的乳酸脱氢酶基因(ldh)插入到基因pkpdc的基因位点，得到重组菌株pkz03。将菌株pkz03接种于ypd培养基(20g/l酵母粉、10g/l蛋白胨、20g/l葡萄糖)，30℃，220转每分钟，摇瓶培养48小时。发酵产物主要为乳酸和少量的甘油，无乙醇积累。
54.表1产l-乳酸酵母重组菌株发酵产物
[0055][0056]
3.2重组菌株pkz03不调酸l-乳酸发酵工艺
[0057]
实验步骤：
[0058]
(1)种子培养：将菌株pkz03，在无菌条件下接种ypd液体培养基，30℃，220rpm培养24小时，制得种子培养液；
[0059]
(2)发酵培养：上海保兴biotech 5升发酵罐中加入配制为2.0l但定溶到1.8升的发酵培养基，在发酵培养基中接入400ml种子培养液，整个发酵过程不调控ph值。发酵培养基成分为(克每升)：葡萄糖，50～100；酵母粉，10；蛋白胨，10。30～40℃培养54小时，搅拌转速300转/分，搅拌半径38mm，通气量1vvm。
[0060]
发酵结束时，取发酵液，10,000转/分钟离心5分钟，取上清液，按照上述检测方法，检测发酵液中葡萄糖、d-乳酸和l-乳酸浓度。
[0061]
结果：发酵结果如表2所示。5l发酵罐规模，发酵54小时，l-乳酸浓度达到76克每升(图1)，残留葡萄糖为0。糖酸转化率达到97％，l-乳酸光学纯度为100％，d-乳酸低于检测限(图2)。
[0062]
表2重组菌pkz03不调酸发酵l-乳酸的实验结果
[0063][0064]
观察图1和图2，从测试结果可以看出，在发酵全程不添中和剂调节ph的情况下，该酵母工程菌株可有效生产d-乳酸含量低于检测限的光学纯l-乳酸，且终点l-乳酸浓度远高于其他资料所报道的29.55g/l，具有实际的工业化生产意义。

技术特征：
1.一种耐酸酵母工程菌株，其特征在于，所述耐酸酵母工程菌株为凝结芽孢杆菌的乳酸脱氢酶基因ldh以打靶片段的形式插入到敲除丙酮酸脱羧酶基因pkpdc的库德里阿兹氏毕赤酵母中进行重组表达获得。2.根据权利要求1所述的耐酸酵母工程菌株，其特征在于，所述耐酸酵母工程菌株于2023年04月23日保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc，保藏编号为cctccm2023587。3.一种如权利要求1或2所述的耐酸酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体为：构建质粒pwspk对库德里阿兹氏毕赤酵母的丙酮酸脱羧酶基因pkpdc进行敲除，将来自凝结芽孢杆菌的乳酸脱氢酶基因ldh以打靶片段的形式插入到敲除丙酮酸脱羧酶基因pkpdc的库德里阿兹氏毕赤酵母中进行重组即可得到耐酸酵母工程菌株。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌dsm1。5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述质粒pwspk的构建方法为：在丙酮酸脱羧酶pkpdc基因的上下游分别设计引物pkpdc-f(5
’‑
gaagtcaacgaagatggtgagattgatgg-3’)与pkpdc-r(5
’‑
gctccgagagtgaggcgagacgtc-3’)，以库德里阿兹氏毕赤酵母的基因组为模板扩增出片段并测序，得到基因pkpdc序列，预测丙酮酸脱羧酶基因pkpdc合适的n20位点，构建质粒pwspk。6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述打靶片段由基因pkpdc的上游1000bp，基因ldh以及基因pkpdc的下游1000bp通过overlap pcr技术得到。7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述基因pkpdc的上游1000bp命名为pdc-uparm，由引物pdc-uparm-f(5
’‑
gttgttaccgaagcagggtttgatttc-3’)与pdc-uparm-r(5
’‑
gcaccgatattgtaatgacatctgaatgtaaaatgaac-3’)扩增得到。8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述基因ldh以凝结芽孢杆菌dsm1基因组为模板，由引物ldh-f(5
’‑
ttacattcagatgtcattacaatatcggtgcc-3’)与ldh-r(5
’‑
agcaaaacataaaaatatgaaaaaagtcaatcgtattgcag-3’)扩增得到。9.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述基因pkpdc的下游1000bp命名为pdc-downarm，由引物pdc-downarm-f(5
’‑
cgattgacttttttcatatttttatgttttgctgtg-3’)与pdc-downarm-r(5
’‑
caggtggctcagctgttgcagg-3’)扩增得到。10.一种如权利要求1-2任一所述的耐酸酵母工程菌株或如权利要求3-9任一所述的构建方法构建的耐酸酵母工程菌株能够用于l-乳酸的生产。

技术总结
本发明属于生物工程技术领域，具体为一株耐酸酵母工程菌株、构建方法及其应用；所述耐酸酵母工程菌株为凝结芽孢杆菌的乳酸脱氢酶基因ldh以打靶片段形式插入到敲除丙酮酸脱羧酶基因pkpdc的库德里阿兹氏毕赤酵母中进行重组表达获得；所述耐酸酵母工程菌株于2023年04月23日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCCM 2023587；所述构建方法具体为：构建质粒pwspk对库德里阿兹氏毕赤酵母的丙酮酸脱羧酶基因pkpdc进行敲除，将来自凝结芽孢杆菌的乳酸脱氢酶基因ldh以打靶片段形式插入到敲除丙酮酸脱羧酶基因pkpdc的库德里阿兹氏毕赤酵母中进行重组即可得到耐酸酵母工程菌株。本发明所提出的耐酸酵母工程菌株在乳酸发酵过程不需要添加中和剂，能够实现乳酸的清洁生产。清洁生产。清洁生产。


技术研发人员：李荣群 刘喆 余莉花 陈熙
受保护的技术使用者：普立思生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.06
技术公布日：2023/9/14