一种第三咽囊内胚层的培养方法及应用

1.本技术涉及生物技术领域，尤其是涉及一种第三咽囊内胚层的培养方法及应用，更具体地，涉及一种人多能干细胞来源的第三咽囊内胚层的培养方法及其应用。


背景技术：

2.咽器官在胚胎发育过程中源自咽内胚层，包括甲状腺，胸腺，甲状旁腺和后腮体。胸腺和甲状旁腺则是由第三咽囊内胚层所形成。胸腺是位于胸部心脏正上方的双叶器官，负责t细胞的阳性和阴性选择，使成熟的t细胞进入外周血循环并发挥免疫功能。胸腺上皮细胞(thymic epithelial cells,tecs)是胸腺的主要功能成分，其来源于第三咽囊内胚层。在胚胎发生过程中，胸腺-甲状旁腺器官发生是一个高度动态的过程，而第三咽囊必须经历一系列复杂的形态发生事件才能从咽部分离并变成不同的器官结构域。最终，胸腺向下迁移上纵隔朝向心脏，而甲状旁腺则保留在颈部。所有这些事件的发生都在相对较短的时间内进行。
3.有研究表明，在c57bl/6小鼠的胚胎e9.5-10.5天从肠管内胚层衍生的上皮层外翻形成第三咽囊(the third pharyngeal pouch，3pp)。在第三咽囊中，上皮被神经嵴衍生的间充质细胞所包裹，而它们之间通过分泌可溶性因子，细胞外基质和其他相互作用来诱导第三咽囊内胚层的形成规范。例如，bmp4信号在胸腺和甲状旁腺的早期形成中起着不可替代的作用。由于第三咽囊内胚层是胸腺发育过程中的中间阶段，样本较难获取。因此，若想研究第三咽囊内胚层阶段的发育，则需要在体外建立一个由多能干细胞分化成为第三咽囊内胚层的细胞模型。目前，鲜有在体外利用人多能干细胞构建第三咽囊内胚层(the third pharyngeal pouch endoderm，3ppe)的相关技术报道。
4.有报道将人胚胎干细胞(hesc)诱导分化为胸腺上皮祖细胞样细胞(teplcs，thymic epithelial progenitor-like cells)，此方案中应用胸腺器官的发生顺序调节activin、retinoic acid(ra)、bmp和wnt信号，此分化过程全程使用x-vivo10培养基。在内胚层分化阶段(第一阶段)，hescs在activina作用下持续3天，然后细胞被重新铺板并继续分化2天。在第三咽囊内胚层分化阶段(第二阶段)，使用ra和iwr1将内胚层细胞分化成为第三咽囊内胚层。该方案通过流式细胞术检测得到71.2％的hoxa3和epcam双阳性细胞和67.7％的tbx1和epcam双阳性细胞。然而，在该分化体系中第三咽囊内胚层的效率不高，这纯度不高的第三咽囊内胚层会影响到后期胸腺上皮的分化效率和细胞纯度，并且，在体外仅能从人多能干细胞分化为胸腺上皮样祖细胞，细胞功能不全，需要依靠体内环境才能进一步成熟为胸腺上皮细胞。
5.因此，本技术优化并建立一种第三咽囊内胚层的培养方法，为第三咽囊内胚层的机制研究和其分化为胸腺上皮细胞的应用提供技术支持和保障。


技术实现要素：

6.本技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种人多能干细胞来源
的第三咽囊内胚层的培养方法及其应用，本技术新设计出一种第三咽囊内胚层定向诱导分化培养基，额外添加化学小分子和细胞因子，从而提高第三咽囊内胚层的分化效率以及胸腺上皮细胞的成熟度，这将为从人多能干细胞定向分化的第三咽囊内胚层，进而分化为成熟的胸腺上皮细胞提供一个新分化思路。
7.为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：
8.第一目的，本技术提供了一种第三咽囊内胚层定向诱导分化培养基，所述第三咽囊内胚层定向诱导分化培养基包括分化培养基a和分化培养基b；
9.所述分化培养基a为分化培养基a1和分化培养基a2，所述分化培养基a1包括以下组分：x-vivo 20培养基、activin a、wnt3a和rock抑制剂y-27632；所述分化培养基a2包括以下组分：x-vivo 20培养基、activin a和b27；
10.所述分化培养基b包括以下组分：dmem-f12培养基、b27、ra、sb431542、bmp4和iwp2。
11.本技术通过小分子化合物y-27632，sb-431542，iwp2，维甲酸ra以及细胞因子activin a，wnt3a，bmp4的组合搭配使用将人多能干细胞分化为第三咽囊内胚层细胞。首先，使用activin a，wnt3a、b27和rock抑制剂y-27632的组合将人多能干细胞分化为定形内胚层(definitive endoderm，de)，然后使用细胞因子bmp4和化学小分子sb431542，iwp2以及ra定向诱导第三咽囊内胚层。
12.采用上述第三咽囊内胚层定向诱导分化培养基可以将人多能干细胞定向诱导分化为第三咽囊内胚层，其分化效率达到90％以上，保证了可分化较均质的胸腺上皮细胞，而现有技术的分化效率仅为70％。并且，本技术的分化培养基b用iwr1小分子更换为iwp2进行内胚层细胞分化，提高了分化效率。
13.作为本技术所述第三咽囊内胚层定向诱导分化培养基的优选实施方式，所述分化培养基a1包括以下浓度的组分：x-vivo 20培养基、100ng/ml activin a、50ng/ml wnt3a和10μm rock抑制剂y-27632；所述分化培养基a2包括以下组分：x-vivo 20培养基、100ng/ml activin a和0.5％ b27；
14.所述分化培养基b包括以下浓度的组分：dmem-f12培养基、0.5％ b27、1μm ra、10μm sb431542、20ng/ml bmp4和2.5μm iwp2。
15.本技术将人多能干细胞如人胚胎干细胞(hescs)或者人诱导多功能干细胞(hipscs)定向诱导分化为第三咽囊内胚层细胞。本技术通过不同浓度的化学小分子和生长因子搭配，确立一个高效诱导分化第三咽囊内胚层的方法。
16.与现有方法相比，采用上述浓度的第三咽囊内胚层定向诱导分化培养基培养获得第三咽囊内胚层的细胞纯度能达到90％以上；采用iwr1小分子更换为iwp2进行内胚层细胞分化，提高了分化效率；第三咽囊内胚层细胞可进一步分化为成熟的胸腺上皮细胞；第三咽囊内胚层来源的胸腺上皮细胞在体外具有促进t细胞发育的能力。
17.第二目的，本技术提供了一种用于诱导人多能干细胞分化为第三咽囊内胚层的试剂盒，所述试剂盒包括上述第三咽囊内胚层定向诱导分化培养基。
18.第三目的，本技术提供了一种第三咽囊内胚层的培养方法，包括以下步骤：
19.s1、将人多能干细胞置于上述分化培养基a中诱导分化培养，获得定形内胚层；
20.s2、将步骤s1获得的定形内胚层置于上述分化培养基b中诱导分化培养，获得第三
咽囊内胚层。
21.作为本技术所述第三咽囊内胚层的培养方法的优选实施方式，所述步骤s1中，第一天，先将人多能干细胞置于分化培养基a1中培养，隔天，将人多能干细胞置于分化培养基a2中培养，培养四天。
22.本技术提供了第三咽囊内胚层的培养方法，使用分化培养基a培养人多能干细胞，培养时间为4天，完成定形内胚层分化阶段；紧接着定形内胚层在分化培养基b的作用下经历5天分化成为第三咽囊内胚层细胞。
23.第四目的，本技术提供了上述培养方法制备的第三咽囊内胚层在定向分化为胸腺上皮细胞中的应用。
24.使用本技术的培养方法可分化出成熟的皮质胸腺上皮细胞和髓质胸腺上皮细胞。而现有技术在体外可以分化为胸腺上皮样祖细胞，需要借助小鼠体内微环境才能进一步成熟。
25.作为本技术所述应用的优选实施方式，所述第三咽囊内胚层在分化为胸腺上皮细胞过程中，将第三咽囊内胚层在含有bmp4、wnt3a、sb431542、ra、fgf8、fgf10、肝素钠、l-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐和b27的dmem-f12培养基中培养。
26.作为本技术所述应用的优选实施方式，将第三咽囊内胚层在含有10ng/ml bmp4、50ng/ml wnt3a、10μm sb431542、1μm ra、50ng/ml fgf8、5ng/ml fgf10、10ng/ml肝素钠、50μg/ml l-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐和0.5％ b27的dmem-f12培养基中培养。
27.本技术优化出一种由第三咽囊内胚层细胞诱导分化为成熟的功能性胸腺上皮细胞的方法，采用了在dmem-f12培养基中添加经过大量筛选后确定的特定化学小分子和细胞因子，如ra，肝素，sb431542，fgf8，fgf10，wnt3a，bmp4等。
28.第五目的，本技术提供了上述培养方法制备的第三咽囊内胚层定向分化为胸腺上皮细胞与造血干细胞共培养的方法，包括以下步骤：
29.使用含有4％ b27、30μm l-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、5ng/ml flt3l、5ng/ml il7、10ng/ml scf、10ng/ml dll4和1％谷氨酰胺的1640培养基重悬培养造血干细胞，然后加入胸腺上皮细胞进行共培养。
30.使用本方法分化出的胸腺上皮细胞能够在体外促进造血干细胞向cd3阳性t细胞的分化，并能产生成熟的cd4阳性t细胞和cd8阳性t细胞。而现有技术则是与小鼠源骨髓基质细胞op9进行共培养，产生的t细胞对未来的临床应用有一定的阻碍。
31.综上，本技术提供了第三咽囊内胚层以及胸腺上皮细胞培养分化方法，并对各个分化阶段所得的细胞产物进行分化效率、功能的检测，如基因的表达量检测、细胞流式检测特异性标记物以及体内体外促进t细胞分化功能检测等。
32.与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：
33.本技术提供了人多能干细胞来源的第三咽囊内胚层的培养方法及其应用，采用本技术的第三咽囊内胚层定向诱导分化培养基培养获得第三咽囊内胚层的细胞纯度能达到90％以上；采用iwr1小分子更换为iwp2进行内胚层细胞分化，提高了分化效率；第三咽囊内胚层细胞可在体外分化出成熟的mhc-ii和epcam双阳性的、包括皮质胸腺上皮细胞和髓质胸腺上皮细胞的功能性胸腺上皮细胞，采用通过筛选确定的添加物，调控多种传导信号实现；第三咽囊内胚层来源的胸腺上皮细胞在体外具有促进t细胞发育的能力。
34.本技术通过建立胸腺上皮细胞和造血干细胞的新型共培养方法，证明在体外分化的胸腺上皮细胞具有支持t细胞发育的功能；在体外促进造血干细胞分化为成熟的t细胞，并产生cd4阳性t细胞、cd8阳性t细胞。因此，第三咽囊内胚层细胞来源的胸腺上皮细胞为体外制备可适用于临床治疗的成熟的t细胞提供了技术支持和保障。
35.综上本技术建立从人多能干细胞定向诱导分化第三咽囊内胚层的方法有助于对胚胎第三咽囊内胚层发育的机制研究，并且第三咽囊内胚层可定向诱导成为在体外具有促进t细胞发育功能的胸腺上皮细胞，这在未来大规模培养t细胞以及在t细胞免疫治疗领域具有广泛应用的潜能。
附图说明
36.图1为实施例1获得的定形内胚层细胞分化第4天时的细胞形态图(比例尺＝100μm)；
37.图2为实施例1中细胞流式检测多能性标志物oct4阳性细胞的数量结果图；
38.图3为实施例1中qrt-pcr检测分化第0天到第4天定形内胚层标志基因的相对表达水平结果图；
39.图4为实施例1中qrt-pcr检测分化第0天到第4天中胚层标志基因的相对表达水平结果图；
40.图5为实施例1中细胞流式检测分化第2天和第4天时sox17阳性细胞的比例结果图；
41.图6为实施例1中细胞流式检测在分化后第2天和第4天时cxcr4阳性细胞的比例结果图；
42.图7为实施例1中细胞流式检测分化后第2天和第4天时cxcr4和sox17双阳性细胞的比例结果图；
43.图8为实施例1中分化第4天时定形内胚层标记物foxa2(绿色)、ssea4(红色)和dapi(蓝色)的免疫染色图像(比例尺＝100μm)；
44.图9为实施例2中qrt-pcr检测在分化后第4天至第9天的3ppe标记基因相对表达水平结果图；
45.图10为实施例2中细胞流式检测在分化第7天和第9天时six1阳性细胞的比例结果图；
46.图11为实施例2中细胞流式检测six1和epcam双阳性细胞的比例结果图；
47.图12为实施例2中3ppe标记物epcam(红色)和six1(绿色)的双重免疫荧光染色图像(dapi用于染细胞核(蓝色)，比例尺＝100μm)；
48.图13为实施例2中细胞流式检测在分化第7天和第9天时pax9的阳性细胞比例结果图；
49.图14为实施例2中细胞流式检测在分化第7天和第9天时pax9和epcam的双阳性细胞比例结果图；
50.图15为实施例2中3ppe标记物epcam(红色)和pax9(绿色)的双重免疫荧光染色图像(dapi用于染细胞核(蓝色)，比例尺＝100μm)；
51.图16为实施例3中细胞流式检测髓质胸腺上皮细胞标记基因k5和aire的阳性细胞
比例结果图；
52.图17为实施例3中髓质胸腺上皮细胞标记基因mhc-ii(红色)和aire(绿色)的双重免疫荧光染色图像(dapi用于染细胞核(蓝色)，比例尺＝50μm)；
53.图18为实施例3中细胞流式检测皮质胸腺上皮细胞标记基因k8和cd205以及epcam的阳性细胞比例结果图；
54.图19为实施例3中皮质胸腺上皮细胞标记物k8(绿色)的免疫染色图像(dapi用于染色细胞核(蓝色)，比例尺＝20μm)；
55.图20为实施例4中胸腺上皮细胞与hsc共培养后，通过细胞流式检测成熟cd4sp和cd8sp t细胞的分化比例结果图(总活细胞出现在7aad阴性门中)；
56.图21为实施例4中共培养系统(在7aad阴性cd45阳性细胞上门控)中，通过细胞流式检测成熟cd3+tcrαβ+t细胞的频率结果图；
57.图22为实施例4中t细胞标记物cd3的免疫荧光染色图像(绿色)；
58.图23为对比例1中qrt-pcr检测分化第4天时中胚层标记基因的相对表达水平结果图；
59.图24为对比例1中qrt-pcr检测分化第4天时内胚层标记基因的相对表达水平结果图；
60.图25为对比例1-3分化的流程图；
61.图26为对比例1-3分化过程中第5、7和9天细胞形态的动态变化图像(比例尺＝100μm)；
62.图27为对比例1-3qrt-pcr检测3ppe标记基因的相对表达水平结果图；
63.图28为对比例5-9的胸腺上皮细胞分化培养基配方；
64.图29为通过qrt-pcr(左图)和细胞流式(右图)检测采用实施例3、对比例5-9培养基获得的胸腺上皮细胞转录调节因子foxn1的表达结果图；
65.图30为通过qrt-pcr和细胞流式检测实施例3、对比例5-9培养基获得的成熟胸腺上皮细胞标记物hla-dra(mhc ii类分子)(左图)和epcam(右图)的表达结果图；
66.图31为qrt-pcr检测实施例3、对比例5-9培养基获得的髓质胸腺上皮细胞标记物k5和aire的表达结果图。
具体实施方式
67.为更好的说明本技术的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本技术作进一步说明。
68.在以下实施例和对比例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
69.本技术提供了一种人多能干细胞来源的第三咽囊内胚层的培养方法，包括两个阶段，先将人多能干细胞(hpscs)定向诱导分化为定形内胚层(de)，再定向诱导分化第三咽囊内胚层(3ppe)。
70.实施例1、一种人多能干细胞(hpscs)定向诱导分化为定形内胚层(de)的方法
71.本实施例提供了一种人多能干细胞(hpscs)定向诱导分化为定形内胚层(de)的方法，包括以下步骤：
72.1)细胞分化：
73.吸弃培养基后加入1毫升无钙镁pbs清洗人多能干细胞(hpscs)，加入3毫升含有10μm的y-27632的定形内胚层分化培养基a1放置培养箱中。
74.2)配置定形内胚层分化培养基：
75.配制定形内胚层分化培养基a1(x-vivo20培养基中加入100ng/ml activin a，50ng/ml wnt3a)和定形内胚层分化培养基a2(x-vivo20培养基中加入0.5％b27，100ng/ml activin a)。
76.3)细胞换液：
77.吸弃培养基后加入1毫升无钙镁pbs清洗步骤2)的人多能干细胞(hpscs)，加入3毫升定形内胚层培养基a2放置培养箱中，每天换液一次。
78.4)细胞收获：
79.培养到第4天时，对定形内胚层细胞进行流式细胞分析，免疫荧光和qrt-pcr进行检测。吸弃培养基后加入1毫升无钙镁pbs清洗上述的人多能干细胞，随后加入1ml tryple
tm
express酶室温消化或4％多聚甲醛固定。
80.在定形内胚层分化阶段，也是细胞分化第4天，对定形内胚层细胞进行形态观察和检测。从形态上看，定形内胚层细胞边界清晰，形态大小均一，单层排列，胞质呈灰褐色(图1)。
81.为了进一步表征分化的定形内胚层细胞，在分化第2天和第4天分别收集细胞进行检测。发现多能干性基因oct4阳性比例逐渐降低(图2)。定形内胚层基因cxcr4、gata4、sox17、cer1、foxa2的mrna表达水平都随着分化天数的增加而逐渐升高(图3)，而中胚层基因bra的表达水平先升高后降低(图4)。
82.在蛋白水平上，定形内胚层sox17阳性细胞的比例从16.1％增加到18.0％(图5)，cxcr4阳性细胞的比例由62.5％增加到92.1％(图6)。而cxcr4和sox17双阳性细胞的比例则从14.7％增加到17.8％(图7)。同时，免疫荧光表征显示，大多数细胞在分化第4天表达定形内胚层标记物foxa2(图8)。
83.实施例2、一种定形内胚层(de)定向诱导分化第三咽囊内胚层(3ppe)的培养方法
84.本实施例提供了一种定形内胚层(de)定向诱导分化第三咽囊内胚层(3ppe)的培养方法，包括以下步骤：
85.1)细胞分化方法：
86.于人多能干细胞分化第4天时，使用tryple
tm
express enzyme(1x)(gibco)重悬de细胞(实施例1获得)，重新接种在铺有matrigel包被的孔板上。
87.2)配置第三咽囊内胚层分化培养基：
88.配制第三咽囊内胚层分化培养基b(dmem-f12培养基，补充0.5％ b27，1μm ra，10μm sb431542，20ng/ml bmp4，2.5μm iwp2。)
89.3)细胞换液：
90.吸弃培养基后加入1毫升无钙镁pbs清洗de细胞，加入3毫升第三咽囊内胚层分化培养基b放置培养箱中。每天换液一次。
91.4)细胞收获：
92.培养过程中，对第三咽囊内胚层细胞进行流式细胞分析，免疫荧光和qrt-pcr进行
检测。弃上清后加入1毫升pbs清洗细胞。随后加入1ml tryple
tm
express酶室温消化或4％多聚甲醛固定。
93.在分化过程中对第0、4、7和9天的细胞进行了qrt-pcr检测。结果发现，第三咽囊内胚层标记基因eya1、pax9、hoxa3和six1的表达水平在分化到第9天时都最高(图9)。除此之外，通过流式细胞分析第三咽囊内胚层标志物six1和上皮细胞表面标志物epcam的细胞比例，第7天six1阳性细胞的比例从31.4％增加到96.6％(图10)。细胞分化第7天时，six1和epcam双阳性的比例从30.4％增加到95.1％(图11)。同时，免疫荧光也可以看到，分化的细胞中大部分表达six和epcam双阳性细胞(图12)。
94.与此同时，通过细胞流式检测显示pax9阳性细胞的比例也从40.0％增加到95.3％(图13)，pax9和epcam双阳性细胞的比例则从39.6％增加到92.5％(图14)。通过免疫荧光染色实验，可以看出大部分细胞同时表达pax9和epcam两种第三咽囊内胚层标志物。(图15)。
95.实施例3、一种人多能干细胞(hpscs)来源的第三咽囊内胚层定向诱导分化胸腺上皮细胞的方法
96.本实施例提供人多能干细胞(hpscs)来源的第三咽囊内胚层定向诱导分化胸腺上皮细胞的方法，包括以下步骤：
97.1)配置胸腺上皮细胞分化培养基：
98.配制胸腺上皮细胞分化培养基，在dmem-f12培养基中以下列浓度添加因子：10ng/ml bmp4、50ng/ml wnt3a、10μm sb431542、1μm ra、50ng/ml fgf8、5ng/ml fgf10、10ng/ml肝素钠、50μg/ml l-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐和0.5％b27。共培养4天，每天更换培养基一次。
99.2)细胞换液：
100.吸弃培养基后加入1毫升无钙镁pbs清洗第三咽囊内胚层细胞(实施例2获得)，加入3毫升胸腺上皮细胞分化培养基放置培养箱中。每天换液一次。
101.3)细胞收获：
102.培养过程中，对胸腺上皮细胞细胞进行细胞流式分析，免疫荧光进行检测。弃上清后加入1毫升pbs清洗细胞。随后加入1ml tryple
tm
express酶室温消化或4％多聚甲醛固定。
103.在蛋白质水平上，使用细胞流式和免疫荧光分析了髓质胸腺上皮细胞k5和aire阳性细胞以及成熟胸腺上皮细胞标志基因mhc-ii的比例(图16-17)，结果表明第三咽囊内胚层细胞有能力分化为髓质胸腺上皮细胞。
104.本技术通过细胞流式和免疫荧光分析发现，皮质胸腺上皮细胞的标记cd205、k8、epcam也存在于该分化系统中(图18-19)。
105.综上，hpscs来源的第三咽囊内胚层有分化为胸腺上皮细胞的潜力，并且该胸腺上皮细胞中不仅包含胸腺皮质上皮细胞，还包含胸腺髓质上皮细胞，这对胸腺细胞在胸腺上皮细胞中的阳性选择和阴性选择中起到了至关重要的作用。
106.实施例4、建立hpscs来源的胸腺上皮细胞与造血干细胞(hsc)共培养体外产生t细胞的方法
107.本实施例提供了上述hpscs来源的胸腺上皮细胞与造血干细胞(hsc)共培养体外产生t细胞的方法，包括以下步骤：
108.s1.配置t细胞分化培养基：
109.配置t细胞分化培养基：在1640培养基中添加4％ b27，30μm l-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐，5ng/ml flt3l，5ng/ml il7，10ng/ml scf，10ng/ml dll4，1％谷氨酰胺。
110.s2.细胞分化：
111.分离脐带血造血干细胞后，使用t细胞分化培养基重悬细胞。与此同时，吸弃胸腺上皮细胞培养基，将造血干细胞加入胸腺上皮细胞(实施例3获得)上进行共培养。
112.s2.细胞换液：
113.收集含有造血干细胞的细胞培养基，离心并使用1毫升无钙镁pbs清洗细胞。随后使用3毫升t细胞分化培养基重悬细胞后加入孔板里。每天换液一次。
114.s3.细胞收获：
115.培养过程中，对悬浮细胞进行细胞流式及免疫荧光检测。收集含有悬浮细胞的培养基，离心并使用pbs清洗细胞，对细胞标记流式抗体或4％多聚甲醛固定。
116.为了进一步验证胸腺上皮细胞是否能促进t细胞发育，本技术将人造血干细胞cd34+与其共培养，一周后通过细胞流式检测细胞。正如预期的，在cd45和cd3双阳性细胞中有20.5％的t细胞呈双阳性，cd4单阳(sp)t细胞呈59.9％，以及cd8sp t细胞为33.8％。与之相应，tcrαβ阳性cd4sp t细胞的比例达到56.8％，而tcrαβ+cd8sp t细胞比例为31.0％(图20)。成熟的cd3阳性tcrαβ阳性t细胞占总cd45阳性细胞的27.6％(图21)。
117.与此同时，收集悬浮细胞进行免疫荧光染色，结果显示，有部分细胞表达cd3蛋白(图22，dapi用于染细胞核(蓝色)，比例尺＝5μm)。
118.总的来说，本技术证明hescs分化而来的第三咽囊内胚层足以进一步分化为具有功能的胸腺上皮细胞，这为进一步研究第三咽囊内胚层以及胸腺上皮细胞发育的机制研究及应用奠定了夯实的基础。
119.对比例1、一种第三咽囊内胚层的培养方法
120.对比例1提供了一种第三咽囊内胚层的培养方法，包括人多能干细胞(hpscs)定向诱导分化为定形内胚层(de)的步骤和定形内胚层(de)定向诱导分化第三咽囊内胚层(3ppe)的步骤(与实施例2的方法相同)。
121.本对比例的人多能干细胞(hpscs)定向诱导分化为定形内胚层(de)的步骤，包括：
122.s1.细胞分化：
123.吸弃培养基后加入1毫升无钙镁pbs清洗人多能干细胞(hpscs)，加入3毫升含有10μm的y-27632的定形内胚层分化培养基a1放置培养箱中。
124.s2.配置定形内胚层分化培养基：
125.配制定形内胚层分化培养基a1(x-vivo20培养基中含100ng/ml activin a，3μm chir99021)和定形内胚层分化培养基a2(x-vivo20培养基中含0.5％b27，100ng/ml activin a)；
126.s3.细胞换液：吸弃培养基后加入1毫升无钙镁pbs清洗细胞，加入3毫升定形内胚层培养基a2放置培养箱中。每天换液一次。
127.s4.细胞收获：培养到第4天时，对定形内胚层细胞进行qrt-pcr进行检测。吸弃培养基后加入1毫升无钙镁pbs清洗细胞，随后加入1ml tryple
tm
express酶室温消化。
128.与实施例1相比，区别仅在于，定形内胚层分化培养基a1的配方不同，50ng/ml wnt3a替换为3μm chir99021。
129.在内胚层分化过程中，使用qrt-pcr方法对分化第4天的内胚层细胞进行检测，结果显示相对于chir99021和activina组合，中胚层标记基因brachyury的相对表达水平在wnt3a和activina组合显著下调(图23)。然而相对于chir99021和activina组合，定形内胚层标记基因cxcr4、sox17、foxa2和gata4相对表达水平，在wnt3a和activina组合均有明显上调(图24)。
130.因此，wnt3a和activina组合更趋向于定形内胚层分化。
131.对比例2、一种第三咽囊内胚层的培养方法
132.对比例2提供了一种第三咽囊内胚层的培养方法，包括人多能干细胞(hpscs)定向诱导分化为定形内胚层(de)的步骤(与实施例1的方法相同)和定形内胚层(de)定向诱导分化第三咽囊内胚层(3ppe)的步骤。
133.本对比例的定形内胚层(de)定向诱导分化第三咽囊内胚层(3ppe)的步骤，包括：
134.1)细胞分化方法：
135.于人多能干细胞分化第4天时，使用tryple
tm
express enzyme(1x)(gibco)重悬de细胞(实施例1获得)，重新接种在铺有matrigel包被的孔板上。
136.2)配置第三咽囊内胚层分化培养基：
137.配制第三咽囊内胚层分化培养基b(egm2培养基，补充10μm sb431542，2.5μm iwr1，1μm ra，20ng/ml bmp4)。
138.3)细胞换液：
139.吸弃培养基后加入1毫升无钙镁pbs清洗de细胞，加入3毫升第三咽囊内胚层分化培养基b放置培养箱中。每天换液一次。
140.4)细胞收获：
141.培养过程中，对第三咽囊内胚层细胞进行流式细胞分析，免疫荧光和qrt-pcr进行检测。弃上清后加入1毫升pbs清洗细胞。随后加入1ml tryple
tm
express酶室温消化或4％多聚甲醛固定。
142.与实施例2相比，区别仅在于，第三咽囊内胚层分化培养基b的配方不同，dmem-f12培养基替换为egm2培养基，2.5μm iwp2替换为2.5μm iwr1，且不含有0.5％ b27。
143.对比例3、一种第三咽囊内胚层的培养方法
144.对比例3提供了一种第三咽囊内胚层的培养方法，包括人多能干细胞(hpscs)定向诱导分化为定形内胚层(de)的步骤(与实施例1的方法相似，有区别)和定形内胚层(de)定向诱导分化第三咽囊内胚层(3ppe)的步骤(与实施例2的方法相似，有区别)。
145.区别在于，定形内胚层分化培养基a1的配方不同，50ng/ml wnt3a替换为3μm chir99021。第三咽囊内胚层分化培养基b的配方不同，dmem-f12培养基替换为egm2培养基，2.5μm iwp2替换为2.5μm iwr1，且不含有0.5％b27。
146.对比例1-3的分化方法如图25所示。探索了第三咽囊内胚层分化的最有效方法(如本技术实施例1-2)。
147.观察对比例1-3，在分化过程中，本技术可以看到dmem-f12和wnt3a组合分化的细胞形态较为均一(图26，f12+chir为对比例1；egm2+chir为对比例3；egm2+wnt3a为对比例2)，而egm2细胞的培养基有多种形态的细胞产生。
148.于是本技术收集分化第9天的细胞进行qrt-pcr检测，结果显示在dmem-f12+wnt3a
组，第三咽囊内胚层关键转录因子pax8，six1，tbx1，fgf4，pbx1 mrna相对表达水平最高(图27)。因此，本技术确定了从人胚胎干细胞定向诱导分化为第三咽囊内胚层的分化方案。
149.对比例4、一种人多能干细胞(hpscs)来源的第三咽囊内胚层定向诱导分化胸腺上皮细胞的方法(tec-1)
150.与实施例3(tec-2)相比，区别在于，胸腺上皮细胞分化培养基的配方不同，不含有10μm sb431542，其余步骤和实施例3相同。
151.对比例5、一种人多能干细胞(hpscs)来源的第三咽囊内胚层定向诱导分化胸腺上皮细胞的方法(tec-3)
152.与实施例3(tec-2)相比，区别在于，胸腺上皮细胞分化培养基的配方不同，将10μm sb431542替换为2.5μmol/l sant1，其余步骤和实施例3相同。
153.对比例6、一种人多能干细胞(hpscs)来源的第三咽囊内胚层定向诱导分化胸腺上皮细胞的方法(tec-4)
154.与实施例3(tec-2)相比，区别在于，胸腺上皮细胞分化培养基的配方不同，在实施例3的胸腺上皮细胞分化培养基基础上还添加有2.5μmol/l sant1，其余步骤和实施例3相同。
155.对比例7、一种人多能干细胞(hpscs)来源的第三咽囊内胚层定向诱导分化胸腺上皮细胞的方法(tec-5)
156.与实施例3(tec-2)相比，区别在于，胸腺上皮细胞分化培养基的配方不同，不含有50ng/ml wnt3a，其余步骤和实施例3相同。
157.对比例8、一种人多能干细胞(hpscs)来源的第三咽囊内胚层定向诱导分化胸腺上皮细胞的方法(tec-6)
158.与实施例3(tec-2)相比，区别在于，胸腺上皮细胞分化培养基的配方不同，将50ng/ml wnt3a替换为2.5μmol/l sant1，其余步骤和实施例3相同。
159.对比例4-8的具体配方如图28所示。
160.在hescs细胞分化的第13天，收集对比例5-9的细胞进行qrt-pcr检测。结果显示与其它分化方法相比，tec-2这种分化方法中胸腺上皮细胞中关键转录因子foxn1的相对表达量最高，foxn1阳性细胞的比例为10.5％(图29)。
161.作为成熟胸腺上皮细胞的特异性标记mhc-ii在tec-2组分化细胞中显示出表达水平最高，重要的是，成熟胸腺上皮细胞的mhc-ii和epcam双阳性比例为16.8％(图30)。
162.胸腺上皮细胞通常分为皮质上皮细胞和髓质上皮细胞。前者在t细胞的阳性选择中发挥作用，而后者对t细胞进行阴性选择并保留对自身没有免疫原性的t细胞。本技术发现胸腺髓质上皮细胞的特异性标记物k5和自身免疫调节因子aire在tec-2组中表达量最高，并且在分化细胞中具有一定比例(图31)。
163.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本技术的技术方案而非对本技术保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本技术作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本技术的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术技术方案的实质和范围。

技术特征：
1.一种第三咽囊内胚层定向诱导分化培养基，其特征在于，所述第三咽囊内胚层定向诱导分化培养基包括分化培养基a和分化培养基b；所述分化培养基a为分化培养基a1和分化培养基a2，所述分化培养基a1包括以下组分：x-vivo 20培养基、activin a、wnt3a和rock抑制剂y-27632；所述分化培养基a2包括以下组分：x-vivo 20培养基、activin a和b27；所述分化培养基b包括以下组分：dmem-f12培养基、b27、ra、sb431542、bmp4和iwp2。2.如权利要求1所述的第三咽囊内胚层定向诱导分化培养基，其特征在于，所述分化培养基a1包括以下浓度的组分：x-vivo 20培养基、100ng/mlactivin a、50ng/ml wnt3a和10μm rock抑制剂y-27632；所述分化培养基a2包括以下组分：x-vivo 20培养基、100ng/mlactivin a和0.5％b27；所述分化培养基b包括以下浓度的组分：dmem-f12培养基、0.5％b27、1μmra、10μm sb431542、20ng/ml bmp4和2.5μm iwp2。3.一种用于诱导人多能干细胞分化为第三咽囊内胚层的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的第三咽囊内胚层定向诱导分化培养基。4.一种第三咽囊内胚层的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、将人多能干细胞置于如权利要求1所述的分化培养基a中诱导分化培养，获得定形内胚层；s2、将步骤s1获得的定形内胚层置于如权利要求1所述的分化培养基b中诱导分化培养，获得第三咽囊内胚层。5.如权利要求4所述的第三咽囊内胚层的培养方法，其特征在于，所述步骤s1中，第一天，先将人多能干细胞置于分化培养基a1中培养，隔天，将人多能干细胞置于分化培养基a2中培养，培养四天。6.如权利要求4或5所述的培养方法制备的第三咽囊内胚层在定向分化为胸腺上皮细胞中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述第三咽囊内胚层在分化为胸腺上皮细胞过程中，将第三咽囊内胚层在含有bmp4、wnt3a、sb431542、ra、fgf8、fgf10、肝素钠、l-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐和b27的dmem-f12培养基中培养。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，将第三咽囊内胚层在含有10ng/ml bmp4、50ng/ml wnt3a、10μm sb431542、1μm ra、50ng/ml fgf8、5ng/ml fgf10、10ng/ml肝素钠、50μg/ml l-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐和0.5％b27的dmem-f12培养基中培养。9.如权利要求4或5所述的培养方法制备的第三咽囊内胚层定向分化为胸腺上皮细胞与造血干细胞共培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：使用含有4％b27、30μm l-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、5ng/ml flt3l、5ng/ml il7、10ng/ml scf、10ng/ml dll4和1％谷氨酰胺的1640培养基重悬培养造血干细胞，然后加入胸腺上皮细胞进行共培养。

技术总结
本申请涉及生物技术领域，具体公开了一种第三咽囊内胚层的培养方法及应用。采用本申请的分化培养基培养获得第三咽囊内胚层的细胞纯度能达到90％以上；第三咽囊内胚层细胞可在体外分化出成熟的MHC-II和EpCAM双阳性的、包括皮质胸腺上皮细胞和髓质胸腺上皮细胞的功能性胸腺上皮细胞，采用通过筛选确定的添加物，调控多种传导信号实现；第三咽囊内胚层来源的胸腺上皮细胞在体外具有促进T细胞发育的能力。本申请通过建立胸腺上皮细胞和造血干细胞的新型共培养方法，证明在体外分化的胸腺上皮细胞具有支持T细胞发育的功能；在体外促进造血干细胞分化为成熟的T细胞，并产生CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞。CD8阳性T细胞。CD8阳性T细胞。


技术研发人员：段玉友 符莹洁
受保护的技术使用者：广州市第一人民医院（广州消化疾病中心、广州医科大学附属市一人民医院、华南理工大学附属第二医院）
技术研发日：2023.07.17
技术公布日：2023/9/14