一种治疗脑胶质瘤的纳米基因组合物及其制备方法

1.本发明属于生物医学工程技术领域，尤其涉及一种治疗脑胶质瘤的纳米基因组合物及其制备方法。


背景技术：

2.胶质母细胞瘤(glioblastoma,gb)是最常见的原发性恶性脑肿瘤，占胶质瘤的57％，占原发性恶性中枢神经系统肿瘤的48％，也是星形细胞肿瘤中恶性程度最高的脑胶质瘤。
3.胶质母细胞瘤放射治疗的目的是在保留周围正常脑组织的同时，能够给予肿瘤的最大放射剂量，但由于血脑屏障的存在，目前大部分的用于治疗脑胶质瘤的药物都无法到达肿瘤组织发挥作用。此外，目前的用于治疗脑胶质瘤的药物并不能保护肿瘤周围的正常脑组织。所以，研发一种既可通过血脑屏障，又可靶向胶质母细胞瘤的药物是当前提高胶质母细胞瘤放射治疗的当务之急。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种治疗脑胶质瘤的纳米基因组合物及其制备方法，以解决上述技术问题之一。
5.本发明目的之一在于提供一种治疗脑胶质瘤的纳米基因组合物，由牛血清蛋白负载的二氧化锰粒子、plga、dspe-peg3000和dspe-peg-angiopep2为原料合成；纳米基因组合物的平均粒径为122.18
±
31.3nm。
6.优选地，牛血清蛋白负载的二氧化锰粒子由牛血清蛋白和高锰酸钾为原料合成。
7.本发明目的之二在于提供：上述纳米基因组合物的制备方法，包括以下步骤：
8.s1、采用构建牛血清蛋白负载的二氧化锰粒子：
9.(1)制备牛血清蛋白溶液；
10.(2)在牛血清蛋白溶液中加入0.5-1ml高锰酸钾标准溶液(20mmol/l)，在200-300rpm持续搅拌下反应3-8min；
11.(3)将上述得到的试液置于离心式过滤器中，在2000-3000rpm转速下离心10-20min，再加入超纯水3-7ml，在2000-3000rpm转速下离心10-20min，以彻底清除未结合的游离牛血清蛋白，得到牛血清蛋白负载的二氧化锰粒子；
12.s2、构建纳米基因组合物：
13.(1)采用n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶解plga、dspe-peg3000和dspe-peg-angiopep2，分别配制得到plga溶液、dspe-peg3000溶液和dspe-peg-angiopep2溶液，浓度均为15-25mg/ml；采用dmf溶解阳离子g0-c14，得到goc14溶液，浓度为3-8mg/ml；
14.(2)将plga溶液、dspe-peg3000溶液、dspe-peg-angiopep2溶液和goc14溶液按照体积比＝8:(2-4):(2-4):(1-2)混合；
15.(3)将上述混合液与0.5-1.4nmol cy5-mirna-138mimics(0.1nmol/μl)、s1制得的
牛血清蛋白负载的二氧化锰粒子10-25μl混合，形成工作液；
16.(4)在剧烈搅拌下，将工作液逐滴加入到3-10ml超纯水中，形成纳米基因组合物；
17.s1以牛血清蛋白(bovine serum albumin,bsa)作为生物模板，利用蛋白表面的还原型基团原位还原高锰酸钾(即bsa和高锰酸钾反应)，制备得到牛血清蛋白负载的二氧化锰粒子。s2是在水相中自组装形成纳米基因组合物。
18.本发明的原理和有益效果在于：
19.1、本发明提供的纳米基因组合物对胶质母细胞瘤有显著的放疗增敏作用，同时可抑制肿瘤的增殖，并增强肿瘤细胞的凋亡，实现对胶质母细胞瘤的多方位治疗，为临床胶质母细胞瘤/脑细胞瘤的治疗提供有潜在应用前景的新药物和新方法。
20.本发明提供的纳米基因组合物包括：抑制肿瘤生长的mirna-138、用于治疗胶质母细胞瘤/脑细胞瘤的药物牛血清蛋白负载的二氧化锰(mno2)粒子、负载药物并递送药物的基因传递载体plga、亲水性和非离子性聚合物聚乙二醇(polyethylene glycol,peg)、靶向配体angiopep2。
21.本发明提供的纳米基因组合物将mirna-138包载在plga内，以避免mirna-138被体内rna酶所降解，同时利用angiopep2的靶向性，将纳米基因组合物靶向递送到胶质母细胞瘤/脑细胞瘤的肿瘤组织中。
22.本发明提供的纳米基因组合物在减轻肿瘤缺氧，增加细胞对x射线照射敏感的同时，将mirna-138递送入脑，实现胶质母细胞瘤的多方位综合治疗。
23.qpcr结果证实：纳米基因组合物可以很好地将mirna-138传递到细胞内，并成功表达，使u87细胞内的mirna显著高表达。
24.本发明选择mirna-138、用于治疗脑胶质瘤的药物牛血清蛋白负载的二氧化锰、plga、peg、靶向配体angiopep2合成纳米基因组合物的原因在于：
25.mirna-138在胶质母细胞瘤临床标本和细胞系中均呈现出明显下调，并且过表达mirna-138可有效地使胶质母细胞瘤细胞在体外的增殖性和体内的致瘤性得到抑制。同时，已经有研究发现mirna-138在肺癌细胞放射增敏过程中的强效作用。但是，基因在体内的有效传递仍然极大的限制基因治疗在临床中的应用。plga因其高安全性和缓释性而被认为是一种良好的基因传递载体，也可以提高细胞的摄取。本发明构建的纳米基因组合物通过阴阳粒子间的静电作用将mirna-138包裹在其内部，使mirna-138免受rna酶的降解。
26.聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactide-co-glycolide),plga)是目前应用广泛的可生物降解聚合物之一，其水解后可形成两种内源性的单体即乳酸和乙醇酸，很容易通过krebs循环被机体代谢，因此，plga在药物递送或用做生物材料同时，具有全身毒性最小的优势。plga由具有不同的分子量和共聚物组成，已被fda和欧洲药物管理局(ema)批准用于人体。由于其分子量及共聚物的比例不同，其降解时间可以从几个月到几年不等。
27.plga纳米粒子通过液相胞饮作用和网格蛋白介导的内吞作用被细胞内吞，在孵育后数分钟内即可迅速逃离溶酶体而进入细胞质，其原因是纳米颗粒可与囊泡膜之间相互作用，导致囊泡膜出现一过性的局部不稳定，致使纳米颗粒脱离溶酶体而逃逸至胞浆中。机体会将疏水颗粒识别为异物。网状内皮系统(reticulo-endothelial system,res)可将血流中的这些物质清除，并在肝脏或脾脏中消化吸收。这一过程是利用纳米颗粒给药过程中最重要的生物屏障之—。存在于血清中的调理素蛋白与纳米粒结合所形成的调理颗粒与巨噬
细胞相粘附，随后通过吞噬作用使其内化。为了解决这些局限性，本发明亲水性和非离子性聚合物聚乙二醇表面修饰plga，从而使res不能识别的牛血清蛋白负载的二氧化锰粒子。另外，“聚乙二醇化”使纳米基因组合物的血液循环半衰期增加了数个数量级，并且peg也具有良好的生物相容性。
28.angiopep-2：低密度脂蛋白受体相关蛋白1(lrp1)不仅在血脑屏障上高表达，更重要其还在胶质瘤细胞上高表达。angiopep2是一种含有19个氨基酸的靶向肽，与lrp1具有很高的结合亲和力，因此对血脑屏障和胶质瘤细胞具有双重靶向性。所以，angiopep-2在本发明构建的纳米基因组合物中被用作靶向配体。
29.由于血脑屏障的存在，使得大部分放疗增敏药物不能透过血脑屏障到达肿瘤组织内部发挥其作用，合成有效跨越血脑屏障的纳米粒子进行高精度的脑肿瘤治疗无疑具有极重要的临床意义，有望对传统的脑肿瘤治疗产生革命性的影响，提高胶质瘤精准治疗的临床发展。
30.众多治疗胶质瘤的手段中，放疗的地位十分重要，放疗利用x射线照射损伤肿瘤细胞dna。虽然，高能射线能穿透脑深部杀死浸润性癌细胞，但由于肿瘤的缺氧微环境和胶质母细胞瘤固有的放射抗性，放疗的疗效通常会减弱。肿瘤组织通常以缺氧为特征。因此，缺氧是放疗面临的主要障碍之一。提高肿瘤组织局部氧含量是提高放疗效果重要手段之一。mno2可通过分解h2o2，迅速改善缺氧微环境。因此，二氧化锰是一种很有前途的放射增敏剂，可以进一步提高放射治疗的效率。但是由于血脑屏障的存在，mno2到达中枢神经系统严重受阻，影响了其发挥放疗增敏性的效果。因此，本发明提供的能够有效跨越血脑屏障的纳米基因组合物有效解决了这一临床难题。
31.2、本发明提供的纳米基因组合物主要通过(the enhanced permeability and retention,epr)效应向肿瘤组织靶向给药。构建过程的参数：纳米基因组合物具有亲水表面且粒径小于200nm对于提升epr效应是非常必要的，这可能是由于纳米基因组合物在血波中的停留时间增加。
32.在plga表面的peg修饰，降低了纳米基因组合物与血液循环中的血清蛋白作用，避免了纳米基因组合物被res所吞噬，保证了其在体内有较长的滞留时间。
33.另外，肾脏能够过滤小于20nm的颗粒，而肝脏能够捕获大于200nm的颗粒。因此，合适的纳米基因组合物粒径应该在20-200nm之间，本发明提供的纳米基因组合物的平均粒径为122.18
±
31.3nm，可以保证其在体内的稳定性。
34.3、纳米基因组合物穿过细胞膜，进入溶酶体，而溶酶体内ph值很低，含有大量的水解酶，且一般情况下，纳米基因组合物一但内化就会在内质网或者溶酶体内，因此，为了避免纳米基因组合物被溶酶体酶或酸所消化，纳米基因组合物的溶酶体逃逸功能非常重要。实验证实，本发明提供的纳米基因组合物可以很好的同溶酶体分离，具有很好的溶酶体逃逸能力。
35.4、鉴于发明构思及设计上的合理性，本发明提供的纳米基因组合物显著扩大了各组成成分的生物利用度，达到了预料不到的技术效果。
附图说明
36.图1为纳米基因组合物的粒径分布；
37.图2为纳米基因组合物的zeta电位；
38.图3为纳米基因组合物的透射电镜图
39.图4为纳米基因组合物的细胞毒性；
40.图5为纳米基因组合物的摄取及溶酶体逃逸；
41.图6为u87细胞对纳米基因组合物的摄取(***p≤0.05)；
42.图7为u87细胞中mirna-138的表达情况(***p≤0.05)；
43.图8为纳米基因组合物对u87细胞hif-1a的影响(***p≤0.05)；
44.图9为cck8检测纳米基因组合物对u87细胞的放疗增敏作用(***p≤0.05)；
45.图10为细胞凋亡检测纳米基因组合物对u87细胞的放疗增敏作用(***p≤0.05)；
46.图11为免疫荧光检测u87细胞γh2ax的表达(***p≤0.05)；
47.图12为western blot检测u87细胞γh2ax的表达(***p≤0.05)；
48.图13为纳米基因组合物对u87细胞ros影响(**p≤0.05)；
49.图14为脑微血管内皮细胞纯度鉴定；
50.图15为两种纳米基因组合物在不同时间点的血脑屏障转运能力(**p≤0.05)；
51.图16为小动物活体成像系统评价纳米基因组合物靶向性(**p≤0.05)；a.荧光素酶表达的u87细胞在注射荧光素底物溶液10min后的生物发光；b.离体小鼠大脑的cy5荧光图像；
52.图17为激光共聚焦显微镜评价纳米基因组合物靶向能力；
53.图18为纳米基因组合物的药代动力学研究；
54.图19为纳米基因组合物对荷瘤小鼠的放疗增敏(***p≤0.05)；
55.图20为不同处理组的荷瘤裸鼠生存分析；
56.图21为he检测纳米基因组合物对荷瘤裸鼠的毒性；
57.图22为纳米基因组合物对hif-1a的影响；
58.图23为纳米基因组合物对ki67、γh2ax和tunnel的影响。
具体实施方式
59.下面通过具体实施方式进一步详细说明：
60.实施例1-一种治疗脑胶质瘤的纳米基因组合物
61.1、制备方法
62.s1、构建牛血清蛋白负载的二氧化锰粒子
63.(1)称量100mg牛血清蛋白粉末(购买自美国sigma公司)置于样品瓶中，加18ml超纯水溶解；
64.(2)在牛血清蛋白溶液中加入1ml高锰酸钾标准溶液(20mmol/l)，在250rpm持续搅拌下反应5min；
65.(3)将上述试液得到的置于100kd的离心式过滤器(购买自美国millipore公司)中，在2500rpm转速下离心15min，再加入超纯水5ml，在2500rpm转速下离心15min，以彻底清除未结合的游离牛血清蛋白；
66.(4)将上述得到的试液用超纯水定容至1ml，得到牛血清蛋白负载的二氧化锰粒子。
67.本步骤以牛血清蛋白(bovine serum albumin,bsa)作为生物模板，利用蛋白表面的还原型基团原位还原高锰酸钾(即bsa和高锰酸钾反应)，制备得到牛血清蛋白负载的二氧化锰粒子。
68.s2、构建纳米基因组合物：
69.(1)采用n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶解plga、dspe-peg3000和dspe-peg-angiopep2(均购买自西安瑞禧生物科技有限公司)，分别配制得到plga溶液、dspe-peg3000溶液和dspe-peg-angiopep2溶液，浓度均为20mg/ml；采用dmf溶解x阳离子g0-c14(具体制备步骤参见cn112940077a)，得到goc14溶液，浓度为5mg/ml；
70.(2)将plga溶液、dspe-peg3000溶液、dspe-peg-angiopep2溶液和goc14溶液按照体积比＝40:14:16:9混合，本实施例优选plga溶液400μl，dspe-peg3000 140μl，dspe-peg-angiopep2溶液160μl，goc14溶液90μl；本步骤形成两亲性脂质体，亲水性angiopep-2朝外。
71.(3)将上述混合液与1nmol cy5-mirna-138mimics(0.1nmol/μl)、s1制得的牛血清蛋白负载的二氧化锰粒子20μl混合，形成工作液；本步骤的两亲性脂质体将mirna-138和二氧化锰粒子包载在内。cy5-mirna-138mimics是制备负载mirna-138组合物，包含示踪剂携带mirna-138的microrna，由广州锐博生物科技有限公司协助设计构建。
72.(4)在剧烈搅拌下(1000rmp/min)，将工作液逐滴加入到5ml超纯水中，形成纳米基因组合物；
73.将纳米基因组合物转移至超滤管中，以2500rmp离心浓缩，随后加5ml的超纯水离心洗涤2次，去除游离的化合物及过剩的有机溶剂。
74.本步骤是在水相中自组装形成纳米基因组合物。
75.以下实验使用spss统计软件进行统计分析。计量数据先行正态性检验及方差齐性检验，符合正态分布且方差齐的数据以均数
±
标准差描述，两组间差异比较采用两独立样本t检验，三组间数据比较采用one-sample anova分析，p≤0.05为有统计学差异。
76.实验一：表征纳米基因组合物
77.(1)纳米基因组合物的粒径分布及zeta电位的测定：采用马尔文纳米粒度电位仪对所合成的纳米组合物进行测定，检测温度为25℃，散射角为90
°
，取纳米基因组合物样品，用超纯水稀释至合适的浓度后加入样品池中，每样品重复测试3次。
78.纳米基因组合物的粒径分布数据及zeta电位结果如图1、图2所示。根据测量结果可知纳米基因组合物的平均粒径为122.18
±
31.3nm，平均zeta电位为-2.78
±
2.85mv，平均pdi为0.246
±
0.19。
79.(2)采用透射电子显微镜(transmission electron microscopy,tem)观察纳米基因组合物的形态：吸取纳米基因组合物分散液10μl缓慢滴在铜网上，沉淀5min，再使用滤纸从边缘吸去浮液；在室温下，干燥5min，随后上机观察纳米组合物的形态，大小及分布(操作电压100kv)。
80.实验结果如图3所示，纳米基因组合物呈椭圆形或圆形，未见其存在聚集，分布均一，且粒径与动态光散射(dynamic light scattering,dls)法测得的结果基本一致。
81.实验二：检测纳米基因组合物中cy5-mirna-138mimics的包载率
82.(1)将纳米基因组合物分散液用超纯水定容到1ml，取10μl稀释后的纳米基因组合物分散液与200μl dmso混合；(2)另取10μl cy5-mirna-138mimics溶液(0.1nmol/μl)与200
μl dmso混合作为标准品；(3)使用多功能酶标仪测量cy5-mirna-138mimics荧光强度(fluorescence intensity,fi)，cy5-mirna-138mimics ee％计算为ee％＝(fi纳米基因组合物/fi标准品)
×
100％。
83.实验结果显示，纳米基因组合物中cy5-mirna-138mimic为26
±
0.1％。
84.实验三：纳米基因组合物在胶质母细胞瘤细胞系的放疗增敏作用
85.1、细胞培养：u87细胞(购买自上海富衡生物有限公司)用含有10％牛胎血清的deme高糖培养基，在5％ co2、37℃细胞培养箱内培养。细胞状态良好用于实验。
86.2、cck8测定纳米基因组合物的细胞毒性：(1)取对数生长期u87细胞，计数完成后，以dmem完全培养液制成细胞悬液，以5
×
103cells/well密度种至96孔板中；(2)将接种好的96孔板置于细胞培养箱内培养，培养条件5％ co2、37℃，时间为24h；(3)24h后，弃原培养基并用无菌pbs洗净死细胞，将加有不同体积的纳米基因组合物分散液的dmem完全培养基(含10％ fbs)依次加入96孔板中，纳米基因组合物的体积为别为0、0.5、1.5、3、5、7、10μl，设置3个复孔。空白对照孔中仅加入等体积的dmem完全培养基，随后将96孔板置于细胞培养箱，培养条件5％ co2、37℃，时间12h；(4)12h后，向每孔中加入10μl cck-8溶液(购买自上海翊圣生物科技有限公司)，置于细胞培养箱继续培养，培养条件5％co2、37℃，时间4h；(5)用多功能酶标仪测定在450nm处的od值。
87.细胞毒性活力(％)＝[a(nps)-a(空白)]/[a(对照)-a(空白)]
×
100
[0088]
实验结果如图4所示：从图4中可以看出，不同体积纳米基因组合物分散液孵育后的u87细胞存活率很高，并未出现明显的细胞死亡现象，纳米基因组合物充分混合的溶液与细胞培养基体积比达到1:10时，u87细胞的存活仍然高于90％，由此可见制备所得纳米基因组合物并没有明显的细胞毒性。
[0089]
3、用激光共聚焦显微镜分析细胞对纳米基因组合物的摄取能力及溶酶体逃逸实验：(1)对数生长期u87细胞按1
×
104cells/wells的密度接种至3.5cm共聚焦专用小皿中，置于5％ co2、37℃细胞培养箱过夜培养；(2)丢弃原有培养基，将75μl纳米基因组合物分散液与1ml完全培养基混合后，将混合液加入培养皿中，置于细胞培养箱培养12h；(3)用pbs清洗u87细胞3次后用4％多聚甲醛固定20min；(4)弃去固定液后，溶酶体红色荧光探针室温下避光孵育30min；(5)pbs清洗3次，dapi室温染色5min；(6)pbs清洗2次后，采用激光共聚焦显微镜，观察，拍照。
[0090]
实验结果如图5所示，在激光共聚焦镜下观察，在纳米基因组合物与u87细胞孵育6h后，cy5蓝色荧光与溶酶体探针的红色荧光即出现共定位；这种共定位在12h达到最高点，表明纳米基因组合物在被细胞摄取后进入了溶酶体。随着孵育时间的延长，可以看到cy5标记的纳米基因组合物逐渐和红色溶酶体分离，表明纳米基因组合物可以很好的被u87细胞摄取并从溶酶体中逃逸出来，并不会被溶酶体消化或降解。
[0091]
实验四：用流式细胞仪分析细胞对纳米基因组合物的摄取
[0092]
取对数生长期u87细胞，计数后，按1
×
105cells/wells的密度接种至6孔板中，置于细胞培养箱过夜培养，培养条件5％ co2、37℃；(2)丢弃原有培养基，将150μl纳米基因组合物分散液与2ml dmem完全培养基混合后，将混合溶液加入培养皿中，置于细胞培养箱培养12h；对照孔仅加2ml dmem完全培养基；(3)用移液枪吸去6孔板中培养基，pbs洗涤细胞，0.25％胰酶消化，收集细胞后，用500μl pbs重悬；(4)用流式细胞仪进行检测。
[0093]
实验结果如图6所示，u87细胞可以很好摄取纳米基因组合物。
[0094]
实验五：rna提取及qrt-pcr检测纳米基因组合物u87细胞mirna-138表达的影响
[0095]
取对数生长期u87细胞，细胞计数后，按1
×
105cells/wells的密度接种至6孔板中，置于细胞培养箱过夜培养，培养条件5％ co2、37℃；(2)丢弃原有培养基，将150μl纳米基因组合物分散液与2ml dmem完全培养基混合后，将混合液加入培养皿中，置于细胞培养箱培养12h；对照孔仅加2ml dmem完全培养基；(3)细胞总rna提取：6孔板细胞中加入trizol试剂，轻轻晃动6孔板，使trizol均匀分布于细胞表面，使细胞充分裂解，随后用移液器将裂解液转移至无rna酶ep管中，并在室温下静置5min后，加入200μl氯仿(trizol体积的1/5)，剧烈震荡15s，避免使用涡旋，使液体乳化呈现粉白色。室温下静置5min，在低温高速离心机中离心(12000rmp，4℃，20min)。此时，ep管内溶液出现三个分层：上层为无色上清的rna层、中间为白色蛋白层、最下层为粉色有机层。用移液器小心收集无色上清并置于新ep管内，加入等体积异丙醇，轻柔地上下颠倒数次以混匀溶液，在室温下静置10min。低温高速离心机中离心(12000rmp，4℃，10min)后可在ep管底部看到rna沉淀，丢弃上清，缓慢加入1ml 75％酒精，轻柔上下颠倒，低温高速离心机中离心(12000rmp，4℃，10min)后丢弃上清，重复该步骤1次。室温下干燥10min，加入depc水溶解rna，nanodrop微量紫外可见光分光光度计检测rna纯度及浓度。(4)mirna逆转录：按照锐博公司的bulge-looptm mirna qrt-pcr primer试剂盒说明采用特异性的茎环状引物进行逆转录反应。mirna引物由锐博公司设计提供。反应体系如下表1所示：
[0096]
表1反应体系
[0097]
reagent10μl体系totalrnatemplate(1μg)xμlbulge-looptmmirnartprimer1μl5xreversetranscriptionbuffer2μlrtasemix2μlrnase-freeh2oupto10μl
[0098]
将上述反应物混匀后，瞬时离心后置于pcr仪中，反应条件为：40℃，60min，70℃，10min。反应结束后立即快速将cdna产物取出，置于冰上备用或在-20℃保存。mirna荧光定量pcr反应：以cdna为模板，检查mirna-138在不同处理组的u87细胞中的表达情况。引物由锐博公司设计提供。反应体系如下表2所示：
[0099]
表2反应体系
[0100]
reagent20μl体系2
×
sybrgreenmix10μlcdna2μlbulge-loop
tm
mirnaforwardprimer2μlbulge-loop
tm
reverseprimer2μlddh2oupto20μl
[0101]
轻柔将上述反应体系混匀(避免激烈涡旋振荡)，采用三步法进行检测，反应程序如下表3所示：
[0102]
表3反应体系
[0103][0104]
使用定量pcr仪器quantstudio5进行荧光定量pcr反应，检测各样品的ct值，所有样品均重复检测3次，按如下公式进行计算，以2-δδct值表示mirna的相对表达量。nps为纳米粒子。
[0105]
δδct＝[ct(mirna-138)-ct(u6)]
nps-[ct(mirna-138)-ct(u6)]
对照
[0106]
实验结果如图7所示：由该结果可以看出，将纳米基因组合物加入至u87细胞后，致使mirna-138表达量明显升高，说明外源性的mirna-138已经由纳米基因组合物载入细胞，并成功表达。
[0107]
实验六：细胞免疫荧光检测纳米基因组合物对u87细胞中hif-1a的影响
[0108]
1、实验设计：(1)将无菌盖玻片置于6孔板中，将u87细胞悬液接种于盖玻片上，置于细胞培养箱过夜培养，培养条件5％ co2、37℃；(2)丢弃原有培养基，将纳米基因组合物充分混合的溶液与dmem完全培养基混合液加入至孔板中，对照孔仅加dmem完全培养基，置于细胞培养箱培养，培养条件5％ co2、37℃，时间12h；(3)丢弃6孔板中液体，pbs洗涤3次，4％多聚甲醛室温下固定30min；(4)pbs清洗3次，用0.1％tritonx-100室温下孵育15min透膜；(5)加山羊血清室温下封闭30min；(6)丢弃山羊血清，加入hif-1a一抗(1:200)，4℃过夜；(7)丢弃hif-1a一抗，pbs清洗3次；(8)加入cy3标记山羊抗兔igg二抗(1:500)，室温孵育1h；(9)弃去二抗，避光条件下pbs清洗3次；(10)dapi染核5min，室温避光；(11)pbs清洗3次。封片剂封片；(12)bx63全自动智能荧光显微镜观察并拍照。
[0109]
实验结果如图8所示，纳米基因组合物孵育u87细胞明显使hif-1a的表达降低证实所制备的纳米基因组合物可以改善肿瘤细胞的缺氧情况。
[0110]
实验七：cck8检测纳米基因组合物对u87细胞放疗增敏作用
[0111]
1、实验设计：(1)取对数生长期u87细胞，细胞计数后，用dmem完全培养基制成细胞悬液，以5
×
103cells/well密度接种到96孔板中，将接种好的96孔板置于细胞培养箱内过夜培养，培养条件5％co2、37℃；(2)弃原有培养基，将纳米基因组合物分散液与dmem完全培养基混合液加入至孔板中，对照孔仅加dmem完全培养弃，置于5％ co2、37℃细胞培养箱培养12h；(3)给予细胞0gy、4gy、8gy的辐照后，继续培养24h；(4)向每孔中加入10μl cck-8溶液，继续培养4h；(5)用多功能酶标仪测定在450nm处的od值。
[0112]
细胞活力(％)＝[a(nps)-a(空白)]/[a(对照)-a(空白)]
×
100
[0113]
实验结果如图9所示。在非辐照组，单纯给纳米基因组合物组的u87细胞活性为90.70
±
1.68％，差异具有统计学意义。在辐照组中，本实验比较了在4gy及8gy的剂量下，纳米基因组合物组及对照组u87细胞的活性：辐照剂量为4gy时，单纯辐照组的u87细胞活性为93.49
±
4.88％；而纳米基因组合物组的u87细胞活性为61.73
±
11.26％。在辐照剂量为8gy时，单纯辐照组的u87细胞活性为95.4
±
2.93％；而纳米基因组合物组的u87细胞活性为
45.9
±
0.84％，具有统计学差异。
[0114]
实验八：细胞凋亡试剂盒检测纳米基因组合物对u87细胞放疗增敏作用
[0115]
细胞凋亡试剂盒购买自江苏凯基生物技术股份有限公司。
[0116]
1、实验设计：(1)取对数生长期u87细胞，细胞计数后，用dmem完全培养基制成细胞悬液，以5
×
105cells/well接种到6孔板中，将接种好的6孔板置于细胞培养箱内过夜培养，培养条件5％ co2、37℃；(2)弃原培养基，将纳米基因组合物分散液与dmem完全培养基混合液加入至孔板中，对照孔仅加dmem完全培养基，置于5％ co2、37℃细胞培养箱培养12h；(3)给予细胞0gy、4gy的辐照后，继续培养24h；(4)用不含edta的胰酶消化后离心(2000rmp，5min)收集细胞，用pbs洗涤细胞2次后收集1-5
×
105cells；(5)加入500μl bingding buffer重悬细胞；(6)加入5μl annexin v-egfp混匀；(7)加入5μl propidium iodide混匀；(8)室温、避光的条件下使上述溶液反应15min；(9)用流式细胞仪检测荧光阳性细胞(ex＝488nm；em＝530nm)。
[0117]
实验结果如图10所示：在非辐照组，纳米基因组合物组的细胞凋亡率为10.6
±
1.19％，而对照组的细胞凋亡率为6.4
±
0.78％。在辐照组中，本实验比较了在4gy的剂量下，纳米基因组合物组及对照组u87细胞的活性：单纯辐照组的u87细胞凋亡率为7.4
±
2.00％；而纳米基因组合物组的u87细胞凋亡率为19.6
±
5.56％，p值小于0.05，有统计学意义。
[0118]
实验九：免疫荧光检测u87细胞γh2ax的表达情况以评价纳米基因组合物对u87细胞放疗增敏作用
[0119]
1、实验设计：(1)无菌盖玻片放入6孔板中，将u87细胞悬液接种于盖玻片上，置于5％ co2、37℃细胞培养箱过夜培养；(2)丢弃原有培养基，将纳米基因组合物分散液与dmem完全培养基混合液加入至孔板中，对照孔仅加dmem完全培养基，置于5％ co2、37℃细胞培养箱培养12h；(3)给予细胞0gy，4gy的辐照后，将孔板置于细胞培养箱继续培养24h；(4)用移液枪吸去6孔板中液体，用pbs清洗3次，随后用4％多聚甲醛室温固定30min；(5)弃去4％多聚甲醛，pbs清洗3次，室温下，用0.1％tritonx-100孵育15min；(6)弃去0.1％tritonx-100后，加即用型山羊血清室温下封闭30min；(7)弃去山羊血清，加入γh2ax一抗(1:200)，置于4℃冰箱过夜，γh2ax是双链dna断裂的标志性蛋白；(8)弃去γh2ax一抗，pbs清洗3次；(9)加入alexa fluor 488标记山羊抗兔igg二抗(1:500)，室温避光条件下孵育1h；(10)弃去二抗，避光条件下pbs清洗3次；(11)室温避光条件下，dapi染核5min；(12)弃去dapi，pbs清洗3次，封片剂封片；(13)bx63全自动智能荧光显微镜观察并拍照。
[0120]
实验结果如图11所示，可以看出纳米基因组合物组的γh2ax表达明显高于对照组，可以进一步证实纳米基因组合物可以增加u87细胞对放疗的敏感性。
[0121]
实验十：蛋白免疫印迹(western blot)检测不同处理组中u87细胞γh2ax蛋白表达情况以评价纳米基因组合物对u87细胞放疗增敏作用
[0122]
1、细胞总蛋白提取：(1)取对数生长期u87细胞，细胞计数后，用dmem完全培养基制成细胞悬液，以5
×
105cells/well密度接种到6孔板中；将接种好的6孔板置于细胞培养箱内过夜培养，培养条件：5％ co2、37℃；(2)弃原有培养基，将纳米基因组合物分散液与dmem完全培养基混合液加入至孔板中，对照孔仅加dmem完全培养基，置于细胞培养箱培养，培养条件5％ co2、37℃，时间12h；(3)给予细胞0gy、4gy的辐照后，继续培养24h；(4)取适量
ripa，在使用前数min加入蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂，使两者终浓度为1nm；(5)收集细胞后，用冰pbs清洗细胞3次，离心后尽可能吸净上清后加入，移液枪吹打混匀，冰浴摇动30min；(6)bca法测蛋白浓度。
[0123]
2、蛋白免疫印迹法(western blot)：(1)蛋白变性：蛋白样品与loading buffer按一定体积比混匀后，置于沸水中煮5min，-80℃保存；(2)配胶：分离胶：15％；浓缩胶5％；待胶凝固后，将其转移电泳槽中并加入电泳液；(3)上样：按所测得的蛋白浓度计算50μg蛋白溶液的体积，加入上样孔中，两侧加入marker 3μl及1.5μl；(4)电泳：首先用80v恒压电泳，待marker分开后，加压至120v电泳，待溴酚蓝出液平面即可停止电泳；(5)pvdf膜亲水化处理：将膜浸泡于甲醇中2min；随后再浸泡于去离子水中2min；(6)转膜：本实验采用湿转法，根据marker切下含有目标条带的凝胶，在转膜夹中，夹好海绵、滤纸、凝胶、膜、滤纸、海绵，250ma恒定电流转膜30min；(7)免疫杂交：室温下，将转好的pvdf膜置于5％的bsa溶液中封闭4h。随后将剪好的pvdf条带置于稀释好的一抗溶液中，4℃摇床过夜。第二天，用tbst溶液将pvdf条带洗涤3次，每次10min，随后加入稀释好的二抗(1:10000)，室温下孵育1h，用tbst溶液洗涤条带3次，每次10min，tbs洗涤条带1次，10min；(8)ecl发光检检测。
[0124]
实验结果如图12所示，用纳米基因组合物孵育u87细胞12h后，给予细胞辐照，该实验结果与细胞免疫荧光的实验结果相一致。纳米基因组合物联合4gy放疗组的细胞的γh2ax蛋白出现了明显的高表达，说明这一组细胞dna双链断裂情况明显高于其他三组(分别是空白对照组，接受4gy照射的对照组以及纳米抗癌基因复合物联合0gy照射组)，进一步证实纳米基因组合物有放疗增敏作用。
[0125]
实验十一：活性氧检测试剂盒检测纳米基因组合物对u87细胞中过ros的影响
[0126]
1、实验设计：(1)取对数生长期u87细胞按1
×
104cells/wells的密度接种至3.5cm共聚焦专用小皿中，置于细胞培养箱过夜培养，培养条件：5％ co2、37℃；(2)丢弃原有培养基，将75μl纳米基因组合物分散液与1ml完全培养基混合后，将混合液加入培养皿中，置于细胞培养箱培养12h；(3)给予细胞4gy辐照后，继续培养24h；(4)贴壁细胞采用原位装载探针：将dcfh-da按终浓度为10μm以无血清培养基进行稀释。随后弃去原有细胞培养基，每皿加入1ml终浓度为10μm的dcfh-da后，置于37℃细胞培养箱内避光孵育20min。随后以无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以清除未进入细胞内的dcfh-da；(5)检测：直接用激光共聚焦检查且拍照(ex＝488nm，em＝525nm)。
[0127]
实验结果如图13所示，纳米基因组合物组的细胞在辐照后，ros的产生明显增多，说明纳米基因组合物可能是通过产生更多的ros间接增加肿瘤细胞的dna双链断裂。
[0128]
实验十二：合成化合物在荷瘤小鼠体内的放疗增敏作用
[0129]
以下实验使用spss统计软件进行统计分析。计量数据先行正态性检验及方差齐性检验，符合正态分布且方差齐的数据以均数
±
标准差描述，两组间差异比较采用两独立样本t检验，三组间数据比较采用one-sample anova分析，p＜0.05为有统计学差异。生存分析以kaplan-meier法分析。
[0130]
1、大鼠脑微血管片段的分离及脑微血管内皮细胞的培养：(1)10只wistar大鼠，12天龄，于超净台中，颈椎脱臼处死，并置于75％乙醇消毒；(2)于冰上断头取脑，并将取下大脑组织置于无菌冰pbs中；(3)小心除去大脑组织表面的软脑膜、大血管及白质，留下大脑皮质；(4)将大脑皮质用冰pbs洗涤3次，置于dmem完全培养基中，剪碎；(5)将剪碎的组织置于
50ml离心管中，加入0.1％含有30u/ml的dnasei的ii型胶原酶10ml，混匀后37℃孵箱中消化1.5h；(6)消化完成后，将上述混合液，室温离心，1000r/min，10min；(7)丢弃上清，置于20％bsa中4℃，1000g，离心20min；(8)丢弃上清，加入含有20u/ml dnase i的0.1％胶原酶/分散酶，混匀后37℃孵箱中消化1h，随后室温下1000r/min，离心10min；(9)丢弃去上清，沉淀用2ml dmem完全培养基重悬后小心铺于经3000g离心1h后形成的33％连续梯度的percoll上，4℃，1000g离心10min，则可见混合液出现分层，下层为红细胞层，其上层为云絮状的微血管片段富集层，用移液枪小心吸取该层；(10)以deme完全培养基洗涤两次，室温下1000r/min，离心5min；(11)丢弃上清后，用ecm培养基重悬后，加入鼠尾胶包被的培养皿中，置于5％ co2、37℃的培养箱中培养，24h后换液；(12)当细胞生长至融合状态时，常规消化，传代。
[0131]
2、脑微血管内皮细胞的纯度鉴定：(1)无菌盖玻片放入6孔板中，将脑微血管细胞悬液接种于盖玻片上，置于5％ co2、37℃细胞培养箱培养；(2)用移液枪吸去6孔板中液体，用pbs清洗3次，随后用4％多聚甲醛室温固定30min；(3)弃去4％多聚甲醛，pbs清洗3次，室温下，用0.1％tritonx-100孵育15min；(4)弃去0.1％tritonx-100后，加即用型山羊血清室温下封闭30min；(5)弃去山羊血清，加入vwf一抗(1：200)，置于4℃冰箱过夜；(6)弃去vwf一抗，pbs清洗3次；(7)加入alexa fluor 488标记山羊抗兔igg二抗(1：500)，室温避光条件下孵育1h；(8)弃去二抗，避光条件下pbs清洗3次；(9)室温避光条件下，dapi染核5min；(10)弃去dapi，pbs清洗3次，封片剂封片；(11)bx63全自动智能荧光显微镜观察并拍照。
[0132]
本实验利用大鼠脑皮质成功分离提取脑微血管段，并于ecm内皮专用培养基在细胞培养箱中静置培养，培养条件为37℃、5％ co2，通过细胞免疫荧光检测内皮细胞标志物vwf，验证为建立体外血脑屏障模型所需的脑微血管内皮细胞。实验结果如图14所示，证明细胞培养成功。
[0133]
3、建立体外血脑屏障：(1)用2％的鼠尾胶包被transwell细胞培养小室(聚酯透明膜，孔径0.4μm)；(2)以每小室7.5
×
103个细胞的密度将脑微血管内皮细胞接种于12孔板transwell小室；(3)在接种第15天，将培养基分别加入到上室和下室，形成约0.5cm的液面差，4h后观察液面变化；对照组为空白小室；(4)电阻仪检测跨内皮电阻值(transendothelial electrical resistance,teer)；(5)4h渗漏试验阴性，teer值大于250ω
·
cm2表示血脑屏障建立成功。
[0134]
在体外建立的血脑屏障模型中，在各个检测的时间点，angiopep2修饰的纳米基因组合物的转运效率均高于无angiopep2修饰的纳米基因组合物，差异具有统计学意义，实验结果如图15所示。
[0135]
4、评价纳米基因组合物跨体外血脑屏障转运：(1)用transwell小室模拟的血脑屏障模型评价脂质体组合物的跨血脑屏障转运能力；(2)将angiopep2修饰的纳米基因组合物及无ang修饰的纳米基因组合物加入相应的小室(cy5-mirna-1nmol/ml)，每组设置4个复孔；(3)分别在0.5h、1h、1.5h和2h，从下室中吸取200μl培养基样品，并且马上用新鲜培养基补充；(4)400μl样品用多功能酶标仪检测cy5荧光强度，从而计算出每个时间点不同组合物的跨血脑屏障的转运效率；(5)在整个试验过程中，血脑屏障的完整性用teer电阻仪检测。
[0136]
5、建立裸鼠颅内原位胶质瘤模型：(1)0.1％戊巴比妥腹腔注射麻醉；(2)在立体定位仪上固定裸鼠头部；(3)常规消毒铺巾，沿中缝切开裸鼠头皮，充分暴露裸鼠前囟门；(4)定位：以前囟门为基础，向前1.2mm，矢状缝向右2.0mm；(5)钻开颅骨，不伤及脑膜；(6)微量
注射器抽取准备好的luc-gfp-u87细胞悬液5μl(含1*106个细胞)，并固定在立体定位仪上；(7)经颅骨上的孔将微针头垂直插入硬脑膜下4mm，随后回针1mm，注射速度每分钟1μl；(8)注射完后停针5min后，缓慢拔针；(9)骨蜡封闭创口后，消毒缝合皮肤。
[0137]
6、小动物活体成像：颅内原位胶质瘤模型接种后第10天，6只裸鼠，随机分成2组，通过尾静脉注射纳米基因组合物和无纳米基因组合物(cy5-mirna-138的剂量为1nmol/只)，并于注射后24h，将裸鼠用0.1％戊巴比妥腹腔注射麻醉后放入小动物活体成像系统中，进行观察拍照。
[0138]
为了评估纳米基因组合物在荷瘤裸鼠体内跨血脑屏障及肿瘤靶向能力，分别在小鼠尾静脉注射纳米基因组合物及无纳米基因组合物，24h后，处死裸鼠，灌注取脑后，将脑组织置于小动物活体成像系统检测cy5在小鼠脑部的荧光强度。由图16可以看出，纳米基因组合物组裸鼠脑内荧光强度明显高于无angiopep2修饰的组合物组。这一结果证实所制备的纳米可以成功跨过血脑屏障，在脑内富集。
[0139]
将冰冻制成的脑组织切片用dapi染色液染核，封片后，于激光共聚焦显微镜下观察，拍照，由图17可以看出，angiopep2修饰的纳米基因组合物组，cy5蓝色荧光在绿色荧光u87肿瘤附近及其内部出现了富集，而无angiopep2修饰的组合物组，绿色荧光肿瘤附近几乎看不到蓝色的纳米基因组合物。由此可证实，纳米基因组合物利用angiopep2的对ldlr1受体的亲和力实现了纳米基因组合物在跨越血脑屏障后，靶向肿瘤细胞。
[0140]
实验结果如图18所示，通过向健康小鼠静脉注射纳米基因组合物(cy5-mirna-mimics的剂量为1nmol/小鼠，n＝3)来研究纳米基因组合物的药代动力学。结果显示纳米组合物在血液中的循环半衰期(t
1/2
)约为15min，相比之下，cy5-mirna-138mimics的t
1/2
小于5min。这种较长的循环特性与纳米基因组合物的peg修饰相关。
[0141]
7、纳米基因组合物在体内放疗增敏及抗肿瘤效果：颅内原位胶质瘤模型接种术后裸鼠，随机分为4组，即单纯pbs组，单纯纳米基因组合物组，pbs联合放疗组，纳米基因组合物联合放疗组，每组10只。在术后第10天，活体成像记录肿瘤大小，于术后第12天、14天、16天尾静脉注射pbs及纳米基因组合物，并于注射后12h给予10gy放射治疗，最后一次治疗后第4天，每组裸鼠处死3只，取其心，脑，脾，肺，肾，肝进行he染色。其余裸鼠用于观察一般情况和生存时间。
[0142]
实验结果如图19所示，可以看出纳米基因组合物联合放疗组肿瘤出现了明显的减小。
[0143]
为了进一步评估纳米基因组合物联合放疗的治疗效果，同时监测了荷瘤鼠的生存期。裸鼠行原位成瘤术后24h即可正常饮食，单纯pbs组的裸鼠于第13天开始出现活动减少，并在第17天出现死亡2只，第22天死亡3只，第29天全部死亡；单纯纳米基因组合物组，及纳米基因组合物联合放疗组裸鼠，在给药后均有活动减少，精神烦躁，数秒钟后就恢复。单纯纳米基因组合物组，于给药后25天死亡2只，第28死亡1只，第30天死亡2只，于42天全部死亡。pbs联合放疗组，在给药后第25天死亡3只，第28天死亡3只，第33天全部死亡。而纳米基因组合物组联合放疗组，在术后38天死亡3只，该组裸鼠饮食、大小便等一般状态均好于其他三组，最长生存期为70天。由图20可以看出，单纯pbs组，单纯纳米基因组合物组，pbs联合放疗组，单纯纳米基因组合物联合放疗组的中位生存期(95％可信区间)分别为22(18.096，25.904)、30(27.657，32.343)、28(26.185，29.815)、45(27.543，31.457)，与其他三组比较，
纳米基因组合物联合放疗组的生存期明显延长(p＜0.05)。
[0144]
8、裸鼠灌注取脑：(1)0.1％戊巴比妥腹腔注射麻醉；(2)从胸骨处剪开裸鼠皮肤，充分暴露心脏，注射器插入左心室，止血钳固定；(3)采用组织剪剪破右心耳；(4)随后用注射器灌注冰冻生理盐水20ml，直至肝脏变白，右心耳破洞处流出澄清的液体；(5)随后再用注射器灌注4％多聚甲醛20ml；(6)断头取脑后，同时取其心，脑，脾，肺，肾，置于4％多聚甲醛中4℃保存。
[0145]
实验结果图21所示，在给予pbs组和纳米基因组合物组的荷瘤裸鼠中的重要脏器均未见明显的异常，可以证实纳米基因组合物对于裸鼠并没有细胞毒性，这与细胞实验结果相一致。
[0146]
9、制作冰冻切片：(1)脑组织脱水：按上述方法灌注取脑后，将脑组织置于15％蔗糖4％多聚甲醛溶液中，4℃过夜，待脑组织沉底后，将其转移至30％蔗糖4％多聚甲醛溶液中，4℃过夜后，脑组织沉底后行oct包埋；(2)oct包埋：使用oct包埋盒，用oct铺底冰冻，将脑组织浸润于oct中，随后放入-80℃冰冻保存；(3)切片：使用冰冻切片机连续切片，切片厚度10μm。
[0147]
10、组织学检查：(1)将固定好的裸鼠组织进行蜡块包埋；(2)对组织行连续切片，厚10μm；(3)切片脱蜡：二甲苯i10min；二甲苯ii 10min；无水乙醇中5min；95％乙醇2min；75％乙醇2min；pbs 2min，2次；(4)he染色：苏木素原液染核1min，自来水冲洗停止反应，约5min，再于pbs溶液中反蓝数秒钟；伊红染色液染2min；(5)脱水、透明、封片：上述染好的切片置于95％乙醇2min，共2次；无水乙醇2min，共2次。随后置于二甲苯中，透明5min；结束后中性树胶封片；(6)显微镜下观察，拍照。he检测纳米复合物对荷瘤裸鼠的毒性。实验结果说明pbs组合纳米抗癌基因复合物组重要脏器未见明显异常，没有细胞毒性。he检测纳米复合物对荷瘤裸鼠的毒性。
[0148]
图22为纳米基因组合物对hif-1a的影响，图23为纳米基因组合物对ki67、γh2ax和tunnel的影响。实验结果如图22和图23所示，对荷瘤小鼠大脑行免疫组织化学分析，。本实验提供的纳米组合物能使脑肿瘤细胞中的hif-1a的表达显著降低(图22)，提示该纳米基因组合物能有效改善肿瘤缺氧，同时从图23中可以看出angiopep-2修饰的聚乙二醇化二氧化锰plga-mirna-138纳米基因组合物与rt联合治疗可使肿瘤细胞中γh2ax表达显著升高，提示该纳米基因组合物对胶质母细胞瘤有显著的放疗增敏作用，同时可抑制肿瘤的增殖，并增强肿瘤细胞的凋亡。
[0149]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种治疗脑胶质瘤的纳米基因组合物，其特征在于，由牛血清蛋白负载的二氧化锰粒子、plga、dspe-peg3000和dspe-peg-angiopep2为原料合成；纳米基因组合物的平均粒径为122.18
±
31.3nm。2.根据权利要求1所述的治疗脑胶质瘤的纳米基因组合物，其特征在于，牛血清蛋白负载的二氧化锰粒子由牛血清蛋白和高锰酸钾为原料合成。3.根据权利要求1或2所述的治疗脑胶质瘤的纳米基因组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、采用牛血清蛋白和高锰酸钾构建牛血清蛋白负载的二氧化锰粒子；s2、构建纳米基因组合物：(1)采用n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶解plga、dspe-peg3000和dspe-peg-angiopep2，分别配制得到plga溶液、dspe-peg3000溶液和dspe-peg-angiopep2溶液，浓度均为15-25mg/ml；采用dmf溶解阳离子g0-c14，得到goc14溶液，浓度为3-8mg/ml；(2)将plga溶液、dspe-peg3000溶液、dspe-peg-angiopep2溶液和goc14溶液按照体积比＝8:(2-4):(2-4):(1-2)混合；(3)将上述混合液与0.5-1.4nmol cy5-mirna-138mimics(0.1nmol/μl)、s1制得的牛血清蛋白负载的二氧化锰粒子10-25μl混合，形成工作液；(4)将工作液逐滴加入到3-10ml超纯水中，形成纳米基因组合物。

技术总结
本发明属于生物医学工程技术领域，具体公开了一种治疗脑胶质瘤的纳米基因组合物及其制备方法，由牛血清蛋白负载的二氧化锰粒子、PLGA、DSPE-PEG3000和DSPE-PEG-Angiopep2为原料合成；纳米基因组合物的平均粒径为122.18


技术研发人员：彭英 李小煜 何蕾 张晓旎 陶民 许小丁
受保护的技术使用者：中山大学孙逸仙纪念医院
技术研发日：2023.07.12
技术公布日：2023/9/14