ALDH18A1在制备抗尤文氏肉瘤的药物中的应用

aldh18a1在制备抗尤文氏肉瘤的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及aldh18a1在制备抗尤文氏肉瘤的药物中的应用。


背景技术：

2.尤文肉瘤是一种强侵袭性恶性肿瘤，发病率居儿童骨肿瘤第二位。目前尤文肉瘤的治疗仍依赖于多学科联合治疗，将高强度化疗与手术/放疗相结合，以控制疾病的原发部位和转移性病变。尽管局限性尤文肉瘤患者5年生存率已经达到70-80％，但转移及复发患者5年生存率仍不足30％。作为一种强侵袭性、高复发率的恶性肿瘤，急需寻找新的治疗靶点。
3.作为一种有明确致癌因素的肿瘤，尤文肉瘤的致癌因子ews-fli1融合基因以相分离的形式激活下游靶基因，导致广泛的表观遗传学重塑，并驱动大量代谢重编程过程。作为一种基因突变率较低的肿瘤，尤文肉瘤缺乏可行的替代治疗靶点。因此，其致癌融合蛋白驱动的遗传转录调节是尤文肉瘤靶向治疗的新方向。表观遗传与肿瘤代谢作为肿瘤中一对相互串扰、密不可分的重要特征近年来备受关注，或许是尤文肉瘤靶向治疗的新方向。研究表明脯氨酸代谢中的副代谢效应介导的大量脯氨酰羟基化在表观遗传修饰中扮演重要角色，而乙醛脱氢酶18成员a1(aldehyde dehydrogenase 18family member a1，aldh18a1)作为谷氨酸、精氨酸及脯氨酸代谢的关键酶，在尤文肉瘤进展中扮演的角色尚不清楚，有待研究。
4.基于此，研究aldh18a1在尤文肉瘤中的表达和预后意义以及调控的生物学过程，对于揭示尤文肉瘤的转录调控机制、寻找新的尤文肉瘤治疗靶标具有重要意义。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种aldh18a1抑制剂在制备抗尤文氏肉瘤的药物中的应用。
6.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.1、aldh18a1抑制剂在制备抗尤文氏肉瘤的药物中的应用。
8.本发明优选的，所述aldh18a1的氨基酸序列如ncbi参考序列号np_001310342.1所示。
9.本发明优选的，所述aldh18a1抑制剂为以aldh18a1基因或其转录本为抑制靶标或沉默靶标的dsrna、反义核酸、shrna、微小rna，或者能表达或形成所述dsrna、反义核酸、shrna、微小rna的构建物。
10.本发明优选的，所述shrna的正义链为seq id no.3所示，所述shrna的反义链为seq id no.4所示。
11.本发明优选的，所述shrna的正义链为seq id no.5所示，所述shrna的反义链为seq id no.6所示。
b)。
具体实施方式
31.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
32.实施例1、aldh18a1的表达水平与尤文肉瘤患者的关系
33.为研究aldh18a1(氨基酸序列如ncbi参考序列号np_001310342.1所示)的表达水平与尤文肉瘤患者之间的关系，利用geo数据集中尤文肉瘤基因表达谱数据集(gse17674)，比较aldh18a1在人尤文肉瘤组织和人正常肌肉组织中的表达情况，结果如图1所示。结果显示，aldh18a1在尤文肉瘤组织中高表达。
34.实施例2、aldh18a1的表达水平与尤文肉瘤患者生存预后的关系
35.为研究aldh18a1的表达水平与尤文肉瘤患者的生存预后的关系，使用geo数据集，通过kaplan-meier和cox回归分析尤文肉瘤患者中aldh18a1的预后判断意义。在gse17674、gse17679、gse63155数据集中，结合患者临床生存信息和aldh18a1 mrna表达量，绘制roc曲线，根据约登指数定义aldh18a1高低表达状态，kaplan-meier生存曲线分析aldh18a1的表达水平与尤文肉瘤患者的生存预后的关系，结果如图2，a-c所示。结果显示，aldh18a1高表达可作为尤文肉瘤患者预后的预测标志。
36.实施例3、尤文肉瘤中aldh18a1高表达患者的通路富集情况
37.为研究尤文肉瘤中aldh18a1高表达患者的通路富集情况，利用wgcna算法在gse17618数据集中寻找与aldh18a1高表达密切相关基因集，并进行go富集分析，筛选(筛选标准：fdr《0.25,p《0.05)通路的富集情况，结果如图3，a-b所示。结果显示，细胞分裂相关通路在aldh18a1高表达的尤文肉瘤患者中高度富集。
38.实施例4、aldh18a1促进尤文肉瘤细胞的细胞增殖、平板克隆形成能力、成球能力和体内成瘤能力
39.下调aldh18a1表达方法：将表1中的shrna序列，连接于plvshrna-egfp载体上，并与pspax2包装质粒和pmd2.g包膜质粒一同转入到293t细胞中，48h和72h后收集病毒上清，并将病毒上清进行浓缩和纯化。将此慢病毒感染尤文肉瘤细胞系，扩增后用含有2μg/ml的嘌呤霉素的培养基进行培养并筛选稳转株。
40.表1、aldh18a1的shrna的序列信息
41.42.用嘌呤霉素筛选稳定敲低aldh18a1的尤文肉瘤细胞后，分别用荧光定量聚合酶链式反应(qrt-pcr)和western-blot实验在mrna水平和蛋白水平验证敲低效率，结果如图4，a-b所示。结果显示，aldh18a1在mrna水平和蛋白水平敲低成功。
43.下调aldh18a1的表达后，cell counting kit-8(cck-8)、平板克隆形成实验、成球实验及裸鼠皮下移植瘤实验，检测尤文肉瘤细胞增殖、自我更新及体内成瘤能力的变化，结果发现敲低aldh18a1的表达能够显著抑制尤文肉瘤细胞的增殖能力(图4，c-d)；敲低aldh18a1可显著抑制尤文肉瘤细胞的克隆形成能力(图5，a-b)；敲低aldh18a1能够显著降低尤文肉瘤细胞的自我更新能力(图6，a-b)；敲低aldh18a1可显著抑制尤文肉瘤细胞的致瘤性以及移植瘤的生长速度(图7，a-c)。
44.实施例5、aldh18a1对尤文肉瘤细胞ews-fli1致癌蛋白及其下游靶基因的影响
45.通过qrt-pcr检测了干预aldh18a1后尤文肉瘤致癌蛋白ews-fli1下游靶基因表达水平的变化(表2)。结果表明，在a673中敲低aldh18a1的表达后ews-fli1出现下调(图8)，同时ews-fli1下游靶基因明显下调包括parp1、ezh2、ptpl1、ccnd1、vegfa，其中ccnd1、vegfa以及parp1下调最为明显，有趣的是parp1参与ews-fli1转录活性的调节。在sk-n-mc中敲低aldh18a1的表达后ews-fli1下游靶基因明显下调包括parp1。上述结果显示，干预aldh18a1表达后ews-fli1下游靶基因明显下调(图9，a-b)。
46.表2、ews-fli1及其下游靶基因的引物序列信息
[0047][0048]
实施例6、敲低aldh18a1后，对尤文肉瘤细胞中parp1表达的影响
[0049]
为了进一步研究aldh18a1发挥调控作用的分子机制，在gse63155数据集、gse63156数据集和gse17679数据集中将患者以中位数分为高低两组，并进行差异基因分析，对差异基因进行转录因子motif富集分析，富集结果提示：aldh18a1或通过parp1发挥调控作用(parp1：nes值＝4.47；auc值＝0.09)(图10，a)。同时，比较了尤文肉瘤患者中aldh18a1与parp1表达相关性，结果显示两者表达呈正相关(图10，b)。最后在gse17614数据
集中同样发现parp1 mrna表达水平显著上调(图10，c)。上述结果提示，aldh18a1在尤文肉瘤细胞中可能通过parp1发挥其调控作用。
[0050]
上述生物信息学分析结果显示，aldh18a1差异性表达或通过影响parp1发挥调控作用。接下来，在尤文肉瘤细胞系a673和sk-n-mc中下调aldh18a1表达后，检测parp1的表达情况。rt-pcr结果显示，在尤文肉瘤细胞系a673和sk-n-mc中下调aldh18a1后parp1 mrna表达也随之下调(图11，a)。同样，wb结果显示，尤文肉瘤细胞中下调aldh18a1后parp1蛋白水平下调(图11，b)。上述结果进一步提示，aldh18a1在尤文肉瘤细胞中可能通过parp1发挥其调控作用。
[0051]
实施例7、敲低aldh18a1后，对尤文肉瘤细胞中线粒体数量的变化的影响
[0052]
parp1主要在细胞核行使dna损伤修复以及转录调节功能，该过程受到线粒体nad
+
水平的调控。接下来通过检测了在尤文肉瘤细胞中敲低aldh18a1后是否影响线粒体的数量。结果显示，与对照组相比，敲低aldh18a1后mito-tracker red的相对荧光强度显著降低(图12，a-b)。上述结果提示，敲低aldh18a1表达后尤文肉瘤细胞线粒体数量减少，aldh18a1可能通过调控线粒体的数量进而影响parp1。
[0053]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

技术特征：
1.aldh18a1抑制剂在制备抗尤文氏肉瘤的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述aldh18a1的氨基酸序列如ncbi参考序列号np_001310342.1所示。3.根据权利要求1所得应用，其特征在于，所述aldh18a1抑制剂为以aldh18a1基因或其转录本为抑制靶标或沉默靶标的dsrna、反义核酸、shrna、微小rna，或者能表达或形成所述dsrna、反义核酸、shrna、微小rna的构建物。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述shrna的正义链为seq id no.3所示，所述shrna的反义链为seq id no.4所示。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述shrna的正义链为seq id no.5所示，所述shrna的反义链为seq id no.6所示。6.根据权利要求1所示的应用，其特征在于，aldh18a1抑制剂在制备延长尤文肉瘤患者生存时间的药物中的应用。7.根据权利要求1所示的应用，其特征在于，aldh18a1抑制剂在制备抑制尤文肉瘤细胞增殖、克隆形成能力、成球能力或体内成瘤能力的药物中的应用。8.根据权利要求1所示的应用，其特征在于，aldh18a1抑制剂在制备抑制尤文肉瘤细胞中ews-fli1融合基因下游靶基因的表达量的药物中应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述下游靶基因为parp1、ezh2、ptpl1、ccnd1、vegfa。10.根据权利要求1所示的应用，其特征在于，aldh18a1抑制剂在制备降低尤文肉瘤细胞中的线粒体数量的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了ALDH18A1在制备抗尤文氏肉瘤的药物中的应用，所述ALDH18A1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，敲低ALDH18A1表达后能够显著抑制尤文肉瘤细胞的增殖能力、克隆形成能力、自我更新能力，抑制尤文肉瘤细胞的致瘤性以及移植瘤的生长速度；本发明初步揭示了ALDH18A1在尤文肉瘤发生和进展扮演着重要角色，为尤文肉瘤的治疗提供了新的候选靶点，ALDH18A1可能通过EWS-FLI1-PARP1正反馈环路而抑制尤文肉瘤增殖和自我更新。而抑制尤文肉瘤增殖和自我更新。而抑制尤文肉瘤增殖和自我更新。


技术研发人员：余时沧 王迪 段江洁 陈俊杰
受保护的技术使用者：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/9/14