使用生物传感器的氧化还原酶的电化学测定方法以及其中使用的生物传感器与流程

1.本公开涉及使用生物传感器对氧化还原酶的量进行电化学测定的方法、以及在该方法中使用的生物传感器。


背景技术：

2.生物传感器是一种分子测量装置，其使用配置有酶等生物体物质的检测部、以及电极这样的转换器(信号转换器件)，并用于测定以葡萄糖为代表的各种生物体内的分析对象物。
3.作为使用生物传感器来测定葡萄糖浓度的方法，一般进行利用了酶的电化学测量。作为能够高精度地测定葡萄糖浓度的方法之一，报告有应用了科特雷尔式(cottrell)的各种方法(日本专利特开平3-293556号公报、日本专利第2651278号公报、日本专利第2702286号公报、日本专利第2901678号公报、日本专利第4018748号公报、日本专利第5244116号公报)。科特雷尔式是与电极的大小和形状相应的扩散方程式之一。已知相较于电子移动的同时生成的扩散所生成的范围(～数百μm)，葡萄糖传感器等生物传感器的电极厚度小，因此向电极施加电位时的电流响应并不是恒定的，而是随着科特雷尔式而与时间的平方根成反比地衰减(以t-1/2
衰减)。
4.日本专利第2901678号公报中公开了如下方法：为了防止因使用者产生的测定值的差异并对分析对象物的量进行测定，在具有电极的测定用单元内将分析对象物与试剂(氧化剂和酶等)混合并使它们反应，进行孵育直到该酶反应结束为止，然后向电极施加电压来测定科特雷尔电流。
5.另一方面，为了使科特雷尔电流(遵循科特雷尔式的衰减)成立，需要在施加电压后实质上不存在物质浓度变化的状态、即酶反应实质上结束。因此，在日本专利第2901678号公报中公开的方法中，存在需要确保一定的反应时间、到测定为止需要时间的问题。
6.为了解决该问题，在日本专利第5244116号公报中，提出了使用不伴随科特雷尔衰减的电化学工艺来测定葡萄糖。科特雷尔衰减的衰减常数为-0.5(恒定)。日本专利第5244116号公报中公开了如下内容：预先决定酶反应未结束的短反应(孵育)时间中的衰减常数，基于该衰减常数和具有瞬态衰减的输出信号，决定样品中分析对象物的浓度。
7.近年来，报告了对葡萄糖以外的生物体物质的浓度进行电化学测量的方法(yu xiang et al.,nature chemistry,2012,3(9):697-703；tian lan et al.,methods mol biol.2015,1256,99-109；naveen k.singh et al.,biosensors and bioelectronics,2021,180,113111；tian lan et al.,biotechnology advances,2016,34(3)331-341；jinhee lee et al.,electrochemistry,2015,83(12)1085-1090；yoshihiko nonaka et al.,electrochemistry,2012,80(5)363-366；koichi abe etal.,electrochemistry,2012,80(5)348-352；nasa savory et al.,urakami foundation memoirs,2014,vol.21 136-142)。yu xiang等、tian lan等(2015)、naveen k.singh等、以及tian lan等(2016)公
开了如下内容：通过氧化还原酶将蔗糖转换为葡萄糖，通过葡萄糖计(bgm)等进行测量。
8.另一方面，在样品中分析对象物的浓度与葡萄糖相比为低浓度或极低浓度的情况下，存在与测定葡萄糖的情况相比无法得到足够灵敏度的问题。因此，jinhee lee等报告了为了提高灵敏度而修饰电极的方法、使大量的电子传递酶局部存在的方法等。yoshihiko nonaka等和koichi abe等报告了如下方法：为了测定血液中的血管内皮细胞生长因子(vegf)的浓度，使用葡萄糖脱氢酶(gdh)作为检测酶，测量gdh的响应电流，将分析对象物的浓度转换为gdh。


技术实现要素：

9.本发明人等在为了提供能够使用生物传感器对生物体物质的浓度进行电化学测定的方法而反复进行了研究的过程中，新发现了如下问题：如yoshihiko nonaka等、koichi abe等以及nasa savory等那样，利用适配体等将浓度为低浓度或者极低浓度的分析对象物转换为氧化还原酶，并对氧化还原酶的量进行电化学测量的情况下，产生的响应电流微小，因此无法得到足够的灵敏度。进一步地，本发明人等发现，特别是yoshihiko nonaka等、koichi abe等以及nasa savory等使用的介体为1种(单介体)，在使用生物传感器的测定中存在无法得到足够灵敏度的问题。
10.本公开在一个方式中，提供在氧化还原酶的量的电化学测定中能够以高灵敏度进行测定的方法、以及在该方法中使用的生物传感器。
11.作为一个方式，本公开涉及一种使用生物传感器对氧化还原酶的量进行电化学测定的方法，其中，
12.所述生物传感器包括：
13.导电部，包含2个以上的电极；以及
14.试剂层，与所述导电部接触配置，并包含所述氧化还原酶的底物和2种以上的介体，
15.所述介体包括第一介体和第二介体，所述第一介体是用于将由所述底物与所述氧化还原酶之间的反应生成的电子传递到第二介体的介体，所述第二介体是用于将从所述第一介体传递的电子传递到所述电极的介体，
16.所述方法包括：
17.使含有氧化还原酶的试样与所述试剂层接触；
18.接触后，通过进行规定时间的孵育，使所述电子蓄积于所述第二介体；
19.孵育后，在所述电极之间施加电压；
20.测定通过所述电压的施加而产生的电信号；以及
21.基于所述电信号，计算所述氧化还原酶的量。
22.作为其他方式，本公开涉及一种使用生物传感器对氧化还原酶的量进行电化学测定的方法，其中，
23.所述生物传感器包括：
24.导电部，包含2个以上的电极；以及
25.试剂层，包含所述氧化还原酶的底物和2种以上的介体，并与所述导电部接触配置，
26.所述介体包括第一介体和第二介体，所述第一介体是用于将由所述底物与所述氧化还原酶之间的反应生成的电子传递到第二介体的介体，所述第二介体是用于将从所述第一介体传递的电子传递到所述电极的介体，
27.所述方法包括：
28.使含有所述氧化还原酶的试样与所述生物传感器的所述试剂层接触；
29.接触后，在所述电极之间施加电压(第一施加)；
30.测定通过所述第一施加而产生的电信号(第一测定)；
31.基于通过所述第一测定获得的电信号，计算孵育时间；
32.以计算获得的时间进行孵育；
33.孵育后，在所述电极之间施加电压(第二施加)；
34.测定通过所述第二施加而产生的电信号(第二测定)；以及
35.基于通过第二测定获得的电信号，计算所述氧化还原酶的量。
36.作为其他方式，本公开涉及一种用于对氧化还原酶进行电化学测定的的生物传感器，包括：
37.导电部，包含2个以上的电极；以及
38.试剂层，包含所述氧化还原酶的底物和2种以上的介体，并与所述导电部接触配置，
39.所述介体包括第一介体和第二介体，所述第一介体是用于将由所述底物与所述氧化还原酶之间的反应生成的电子传递到第二介体的介体，所述第二介体是用于将从所述第一介体传递的电子传递到所述电极的介体，
40.所述生物传感器是本公开的测定方法中使用的生物传感器。
41.根据本公开，在一个方式中，能够提供在氧化还原酶的量的电化学测定中能够以高灵敏度进行测定的方法以及其中使用的生物传感器。
附图说明
42.图1的a～e是示出本公开的一个实施方式中的生物传感器的制造方法的一个示例的工序图，示出各工序中的生物传感器的示意图。
43.图2是图1的e的i-i线剖视图。
44.图3的a～e是示出本公开的一个实施方式中的生物传感器的制造方法的一个示例的工序图，示出各工序中的生物传感器的示意图。
45.图4是图3的e的ii-ii线剖视图。
46.图5是示出实验例1的结果的一个示例的图表。示出通过使用含有底物(葡萄糖)和介体(1-甲氧基-5-乙基酚嗪硫酸乙酯盐(1-mpes)和钌化合物)且制备成葡萄糖氧化还原酶(gdh)终浓度为0～12.5nm的反应液进行5分钟孵育来评价的可测定的gdh的浓度范围的结果。
47.图6是示出实验例2的结果的一个示例的图表。示出通过使用含有底物(葡萄糖)、介体(1-mpes和钌化合物)和gdh(终浓度为0.56、5.56或55.56nm)的反应液进行5、10或15分钟的孵育来评价的孵育(存储)时间与响应电流值之间的关系的结果。
48.图7是示出实验例3的结果的一个示例的图表。示出通过使用含有底物(葡萄糖，终
浓度为2～200mm)、介体(1-mpes和钌化合物)和gdh的反应液进行5分钟的孵育来评价的反应液中底物浓度与响应电流值之间的关系的结果。
49.图8是示出实验例4的结果的一个示例的图表。示出通过使用含有底物(葡萄糖)、介体(1-mpes和/或钌化合物)和gdh(终浓度：0～10nm)的反应液进行5分钟的孵育来评价的反应液中存在的介体种类与响应电流值之间的关系的结果。
50.图9是示出实验例5的结果的一个示例的图表。示出通过使用含有底物(葡萄糖)、介体(1-mpes和钌化合物)和gdh的反应液进行5分钟的孵育来评价的反应液中1-mpes的浓度与响应电流值之间的关系的结果。
51.图10是示出实验例6的结果的一个示例的图表。示出如下结果：使用能够识别并结合腺苷、且用gdh标记的腺苷dna适配体，对通过该适配体与待测体中的分析对象物(腺苷)之间的反应而从腺苷dna适配体游离的gdh标记适配体中因gdh的氧化还原酶反应生成的响应电流值进行测量，由此确认到能够检测分析对象物(腺苷)。
52.图11是示出实验例7的结果的一个示例的图表。示出通过进行第一施加(预施加)来按每个测定待测体决定(计算)孵育(存储)时间、并以计算出的时间进行孵育而得到的响应电流值的测定结果。
具体实施方式
53.本发明人等为了提供能够使用生物传感器对反应液中氧化还原酶的量以高灵敏度进行电化学测定的方法，反复进行了研究。在其研究的过程中，本发明人等确认到：难以用1个介体来满足有效接受由氧化还原酶与底物之间的反应生成的电子以及持续储存所接受的电子这两方面，在单介体中无法充分得到灵敏度。因此，发现了如下见解，并基于该见解想到了本公开的方法：作为配置于生物传感器的介体，组合使用电子存储能力高的介体(第二介体)以及迅速接受由氧化还原酶与底物之间的反应生成的电子并能够向第二介体传递的介体(第一介体)来促进底物与氧化还原酶的氧化还原酶反应，将使通过反应生成的电子存储在第二介体中，由此能够对氧化还原酶的量以高灵敏度进行电化学测定。
54.本公开的测定方法与在上述背景技术中提到的专利文献(日本专利特开平3-293556号公报、日本专利第2651278号公报、日本专利第2702286号公报、日本专利第2901678号公报、日本专利第4018748号公报和日本专利第5244116号公报)中公开的葡萄糖测定装置这样的一般生物传感器的区别如下。
55.在一般的生物传感器中，为了顺利地进行作为测定对象的分析对象物(葡萄糖)与氧化还原酶之间的反应以及与之相伴的电子传递，相对于试样中的分析对象物(葡萄糖)的浓度范围具备足够量“氧化还原酶”和“介体”。在一般的葡萄糖传感器中，在具备配置有足够量“氧化还原酶”和“介体”的电极的传感器中，使分析对象物(葡萄糖)与氧化还原酶反应，对通过该反应从葡萄糖游离的电子经由介体传递到电极而产生的响应电流值进行测定，由此进行葡萄糖的定量。即，在施加电压时，处于分析对象物与氧化还原酶之间的酶反应实质上结束的状态，或者处于酶反应能够以决定分析对象物浓度的程度进行、且从分析对象物(葡萄糖)向介体的电子传递实质上结束或充分进行的状态。
56.与此相对，在本公开的测定方法中，“氧化还原酶”为测定对象，生物传感器至少具备氧化还原酶的“底物”、以及用于对由该反应生成的电子进行存储的“介体(第二介体)”。
即，在本公开的测定方法中使用的生物传感器中，实质上不具备足够量的氧化还原酶。并且，在本公开的测定方法中，将作为测定对象的氧化还原酶与底物以规定时间反应，将通过该反应生成的电子经由第一介体存储到第二介体中，测定在存储后在电极之间施加电压而产生的电信号(响应电流值)。即，在本公开的测定方法中，作为测定对象的氧化还原酶与底物之间的反应在底物不枯竭的时间范围内孵育规定时间。换言之，仅在底物中的一部分与氧化还原酶反应的状态的时间范围内的某个规定时间内结束孵育。而且，与以往使用了一般的生物传感器的方法相比，在基于施加了规定时间的电压的结果所获得的电信号来计算氧化还原酶的量这一点上，本发明的测定方法具有区别。即，根据本公开的测定方法，进行氧化还原酶与底物的连续反应，通过该反应生成的电子由第一介体迅速接受并向第二介体传递，并存储在第二介体中，由此即使在反应液中的氧化还原酶的量例如为pm级(例如，1～10pg/l等)这样的极低浓度的情况下，也能够以高检测灵敏度进行测定。此外，氧化还原酶与底物的反应依赖于时间而进行，因此反应量、即电子传递的量依赖于氧化还原酶的量。因此，通过将孵育时间设为规定时间，能够计算氧化还原酶的量。
57.[测定方法]
[0058]
在一个方式中，本公开涉及使用生物传感器对氧化还原酶的量进行电化学测定的方法。在一个或多个实施方式中，本公开的测定方法包括：使用至少具备包含后述的第一介体和第二介体的至少2种以上的介体、以及氧化还原酶的底物的生物传感器，为了将由底物与氧化还原酶之间的连续反应生成的电子经由第一介体存储于第二介体而进行了规定时间的孵育之后，施加电压并测定由此生成的电信号。
[0059]
在一个或多个实施方式中，本公开中的“将电子存储在第二介体中”也可以称为第二介体通过接受电子而成为还原型，并由该还原型的第二介体蓄积。
[0060]
本公开中的“电化学测定方法”是使用电化学方法的测定方法，在一个或多个实施方式中，对于反应液中的测定对象物(氧化还原酶)，可举出将与该浓度对应的变化在电极上转换为电信号并输出的测定。作为电化学方法，在一个或多个实施方式中，可举出计时安培法、计时库伦法和循环伏安法等。作为本公开中的电信号，在一个或多个实施方式中，可举出对施加电压的响应电流值、以及对施加电压的响应电压值等。
[0061]
[生物传感器]
[0062]
本公开的方法中使用的生物传感器具有包含2个以上的电极的导电部和与导电部接触配置的试剂层。试剂层包含氧化还原酶的底物和2种以上的介体，该介体至少包括第一介体和第二介体，第一介体用于将由所述底物与所述氧化还原酶之间的反应生成的电子向第二介体传递，第二介体用于将从所述第一介体传递的电子向所述电极传递。在一个或多个实施方式中，本公开的方法中使用的生物传感器包括基材，所述导电部和试剂层配置在基材上。
[0063]
[氧化还原酶]
[0064]
作为氧化还原酶，在一个或多个实施方式中，可举出葡萄糖脱氢酶(gdh)、葡萄糖氧化酶(god)、胆固醇氧化酶、醌血红素乙醇脱氢酶(quinohemo ethanol dehydrogenase)、山梨醇脱氢酶、d-果糖脱氢酶、d-葡萄糖苷-3-脱氢酶、纤维二糖脱氢酶、乳酸氧化酶(lod)、乳酸脱氢酶(ldh)和尿酸脱氢酶等。
[0065]
关于氧化还原酶，在一个或多个实施方式中，作为辅酶(也称为催化亚单元或催化
结构域)可以具有黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，fad)、吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，pqq)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，nad)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，nadp)。作为具有辅酶的氧化还原酶，在一个或多个实施方式中，可举出fad-gdh、pqq-gdh、nad-gdh和nadp-gdh等。
[0066]
作为氧化还原酶，在一个或多个实施方式中，可举出米曲霉(aspergillus oryzae)型fad-gdh(黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶)等。作为米曲霉型fad-gdh，在一个或多个实施方式中，可以使用日本专利特开2013-083634号公报中公开的米曲霉型fad-gdh。该文献的内容作为构成本公开的一部分而被引用。
[0067]
[底物]
[0068]
底物可以根据作为测定对象的氧化还原酶的种类适当决定。作为底物，在一个或多个实施方式中，可举出葡萄糖、胆固醇、山梨糖醇、d-果糖、纤维二糖、乳酸及尿酸等。在一个或多个实施方式中，在生物传感器的试剂层中配置有足够量的底物。
[0069]
关于试剂层中底物的配合量(试剂层的每1cm3)，从抑制底物与氧化还原酶之间的反应成为限速并促进反应来提高测定灵敏度的观点出发，在一个或多个实施方式中，为4.4nmol以上，优选为8.8nmol以上、13.2nmol以上、17.6nmol以上或22.0nmol以上，更优选为26.4nmol以上。试剂层中底物的配合量(试剂层的每1cm3)的上限不受到特别限定，在一个或多个实施方式中，为220nmol以下、176nmol以下、132nmol以下、88nmol以下或44nmol以下。
[0070]
关于试剂层中底物的配合量(孵育时的底物浓度)，从抑制底物与氧化还原酶之间之间的反应成为限速并促进反应来提高测定灵敏度的观点出发，在一个或多个实施方式中，相对于与试剂层接触的试样的量，含量(孵育时的底物浓度)为10mm以上，优选为20mm以上、30mm以上、40mm以上或50mm以上，更优选为60mm以上。试剂层中底物的配合量(孵育时的底物浓度)的上限不受到特别限定，在一个或多个实施方式中，为500mm以下、400mm以下、300mm以下、200mm以下或100mm以下。
[0071]
在一个或多个实施方式中，孵育时的底物浓度也可以根据作为测定对象的氧化还原酶的量来决定。在不受到特别限定的一个或多个实施方式中，在作为测定对象的氧化还原酶的量(预测为试样中含有的量)为0.01nm～60nm的情况下，孵育时的底物浓度为10mm以上，优选为20mm以上、30mm以上、40mm以上或50mm以上，更优选为60mm以上。
[0072]
与试剂层接触的试样的量可以适当确定，在一个或多个实施方式中，为1μl～20μl左右。
[0073]
[介体]
[0074]
一个或多个实施方式中，介体可举出钌化合物、1-甲氧基-pes(1-甲氧基-5-乙基酚嗪硫酸乙酯盐，1-methoxy-5-ethylphenazinium ethylsulfate，1-mpes)、1-甲氧基-pms(1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐，1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate，1-mpms)、苯二胺化合物、醌化合物、铁氰化物、辅酶q0(2,3-二甲氧基-5-甲基-对苯醌，2,3-dimethoxy-5-methyl-p-benzoquinone)、天青a氯化物(3-氨基-7-二甲基氨基吩噻嗪-5-鎓氯化物，3-amino-7-(dimethylamino)phenothiazin-5-ium chloride)、酚藏花红(3,7-二
氨基-5-苯基吩嗪氯化物，3,7-diamino-5-phenylphenanziniumchloride)、6-氨基喹喔啉(6-aminoquinoxaline)和四硫富瓦烯(tetrathiafulvalene)等。
[0075]
作为钌化合物，在一个或多个实施方式中，可以使用作为氧化型钌配合物而存在于反应体系中、且作为介体(电子传递体)而发挥功能的钌化合物。钌配合物的配体的种类不受到特别限定。作为钌化合物，在一个或多个实施方式中，可举出由下述化学式表示的氧化型钌配合物。
[0076]
[ru(nh3)5x]
n+
[0077]
作为x，可举出nh3、卤素离子、cn、吡啶、烟酰胺或h2o，其中，优选nh3或卤素离子。作为卤素离子，在一个或多个实施方式中，可举出cl-、f-、br-和i-。式中的
n+
表示由x的种类决定的氧化型钌(iii)络合物的价数。作为钌配合物，在一个或多个实施方式中，可以使用日本专利特开2018-013400号公报中公开的钌配合物。该文献的内容作为构成本公开的一部分而被引用。作为钌化合物，在一个或多个实施方式中，可举出[ru(nh3)6]
2+
或[ru(nh3)6]
3+
等钌六胺等。作为钌化合物，在一个或多个实施方式中，可举出[ru(nh3)6]cl3等。
[0078]
作为苯二胺化合物，在一个或多个实施方式中，可举出n,n-二甲基-1,4-苯二胺(n,n-dimethyl-1,4-phenylenediamine)和n,n,n',n'-四甲基-1,4-苯二胺二盐酸盐(n,n,n',n'-tetramethyl-1,4-phenylenediamine dihydrochloride)等。
[0079]
作为醌化合物，在一个或多个实施方式中，可举出1,4-萘醌(1,4-naphthoquinone)、2-甲基-1,4-萘醌(2-methyl-1,4-naphthoquinone，vk3)、9,10-菲醌(9,10-phenanthrenequinone)、1,2-萘醌(1,2-naphthoquinone)、对二甲基醌(p-xyloquinone)、甲基苯醌(methylbenzoquinone)、2,6-二甲基苯醌(2,6-dimethylbenzoquinone)、1,2-萘醌-4-磺酸钠(sodium1,2-naphthoquinone-4-sulfonate)、1,4-蒽醌(1,4-anthraquinone)、四甲基苯醌(tetramethylbenzoquinone)和百里醌(thymoquinone)等。
[0080]
作为铁氰化物，在一个或多个实施方式中，可举出铁氰化钙等。
[0081]
在一个或多个实施方式中，本公开的测定方法中使用的介体的组合能够根据作为测定对象的氧化还原酶的种类、以及导电部的电极的材质等适当决定。
[0082]
作为不受到特别限定的一个或多个实施方式中的第一介体与第二介体的组合，可举出1-mpes与钌化合物的组合、以及1-mpms与钌化合物的组合等。在介体组合中不特别限定的一个或多个实施方式中，可举出第一介体为1-mpes、第二介体为钌化合物的组合。在一个或多个实施方式中，作为钌化合物，可举出[ru(nh3)6]
2+
或[ru(nh3)6]
3+
等钌六胺等。在一个或多个实施方式中，作为钌化合物，可举出[ru(nh3)6]cl3等。
[0083]
作为不受到特别限定的一个或多个实施方式中的第一介质与第二介质的组合，可举出1-mpes与[ru(nh3)6]cl3的组合、以及1-mpms与[ru(nh3)6]cl3的组合等。在介体组合中不受到特别限定的一个或多个实施方式中，可举出第一介体为1-mpes、第二介体为[ru(nh3)6]cl3的组合。
[0084]
在一个或多个实施方式中，试剂层中第一介体和第二介体的配合量可以根据作为测定对象的氧化还原酶的种类、第一介体和第二介体的种类和组合、以及导电部的电极的材质等适当决定。
[0085]
关于试剂层中第一介体的配合量(试剂层的每1cm3)，从抑制由与氧化还原酶之间
的反应生成的电子的传递成为限速并提高测定灵敏度的观点出发，在一个或多个实施方式中，为0.22nmol以上或0.3nmol以上，优选为0.35nmol以上、0.44nmol以上或2.2nmol以上。在不受到特别限定的一个或多个实施方式中，试剂层中第一介体的配合量(试剂层的每1cm3)可以为44nmol以上。试剂层中第一介体的配合量(试剂层的每1cm3)的上限不受到特别限定，在一个或多个实施方式中，为220nmol以下或110nmol以下。
[0086]
即使第一介体与第二介体相比试剂层中配合量为少量，也能够得到足够的测定灵敏度，因此从抑制制造成本的观点出发，试剂层中第一介体的配合量为44nmol以下、22nmol以下、17.6nmol以下、13.2nmol以下、8.8nmol以下或4.4nmol以下。
[0087]
关于试剂层中第一介体的配合量(孵育时的第一介体浓度)，从抑制底物与氧化还原酶之间的反应成为限速并促进反应来提高测定灵敏度的观点出发，在一个或多个实施方式中，相对于与试剂层接触的试样的量，含量为0.5mm以上或0.7mm以上，优选为0.8mm以上、1mm以上或5mm以上。试剂层中第一介体的配合量(孵育时的第一介体浓度)在不受到特别限定的一个或多个实施方式中，可以为100mm以上。试剂层中第一介体的配合量的上限不受到特别限定，在一个或多个实施方式中，为500mm以下或250mm以下。
[0088]
即使第一介体与第二介体相比试剂层中配合量为少量，也能够得到足够的测定灵敏度，因此从抑制制造成本的观点出发，试剂层中第一介体的配合量为100mm以下、50mm以下、40mm以下、30mm以下、20mm以下或10mm以下。
[0089]
关于试剂层中第二介体的配合量(试剂层的每1cm3)，从抑制与第一介体之间的电子传递成为限速并可存储电子来提高测定灵敏度的观点出发，在一个或多个实施方式中，为0.44nmol以上，优选为4.4nmol以上、22nmol以上、30.8nmol以上或35.2nmol以上，更优选为39.6nmol以上或44nmol以上。试剂层中第二介体的配合量(试剂层的每1cm3)的上限不受到特别限定，在一个或多个实施方式中，为220nmol以下或110nmol以下。
[0090]
关于试剂层中第二介体的配合量(孵育时的第二介体浓度)，从抑制与第一介体之间的电子传递成为限速并可存储电子来提高测定灵敏度的观点出发，在一个或多个实施方式中，相对于与试剂层接触的试样的量，含量为1mm以上，优选为10mm以上、50mm以上、70mm以上或80mm以上，更优选为90mm以上或100mm以上。试剂层中第二介体的配合量的上限不受到特别限定，在一个或多个实施方式中，为500mm以下或250mm以下。
[0091]
试剂层也可以含有除了氧化还原酶的底物和介体以外的其他成分。作为其他成分，可举出缓冲剂、表面活性剂和粘合剂等。
[0092]
作为缓冲剂，在一个或多个实施方式中，可举出磷酸缓冲剂、胺类缓冲剂和具有羧基的缓冲剂等。作为胺类缓冲剂，在一个或多个实施方式中，可举出tris、aces、ches、capso、taps、caps、bis-tris、tapso、tes、tricine和ada等。作为具有羧基的缓冲剂，在一个或多个实施方式中，可举出柠檬酸缓冲剂、磷酸柠檬酸缓冲剂、乙酸-乙酸钠缓冲剂、苹果酸-乙酸钠缓冲剂、丙二酸-乙酸钠缓冲剂和琥珀酸-乙酸钠缓冲剂等。缓冲剂可以是1种，也可以并用2种以上。在一个或多个实施方式中，缓冲剂的ph为6.0～8.0，优选为7.3～7.4。
[0093]
作为表面活性剂，在一个或多个实施方式中，可举出tritonx-100(对叔辛基酚聚氧乙烯醚，(p-tert-octylphenoxy)polyethoxyethanol)、吐温20 (聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯，polyoxyethylene sorbitan monolaurate)、十二烷基硫酸钠、全氟辛烷磺酸、硬脂酸钠、烷基氨基羧酸(或其盐)、羧基甜菜碱、磺基甜菜碱和磷酸甜菜碱等。表面活性剂可
以为1种，也可以并用2种以上。
[0094]
作为粘合剂，在一个或多个实施方式中，可举出树脂粘合剂和层状无机化合物等。作为树脂粘合剂，在一个或多个实施方式中，可举出缩丁醛树脂粘合剂和聚酯树脂粘合剂等。作为层状无机化合物，可以使用wo2005/043146中记载的层状无机化合物。作为层状无机化合物，在一个或多个实施方式中，可举出具有离子交换能力的膨润性粘土矿物等。作为层状无机化合物，在一个或多个实施方式中，可举出膨润土、蒙脱石、蛭石和合成氟云母等。粘合剂可以是1种，也可以并用2种以上。
[0095]
在一个或多个实施方式中，试剂层实质上不含有氧化还原酶。在一个或多个实施方式中，试剂层实质上不含有与试剂层中含有的底物反应的氧化还原酶。本公开中“实质上不含有”是指，在一个或多个实施方式中，试剂层中氧化还原酶的配合量(试剂层的每1cm3)为小于0.1u、小于0.05u或小于0.01u。在本公开中，“u”是酶活性的单位，是指在最佳条件下1分钟内作用于1μmol底物的酶量。
[0096]
[导电部]
[0097]
导电部包含2个以上的电极。在一个或多个实施方式中，电极可以是包含工作电极和对电极的电极对，也可以是包含工作电极、对电极和参比电极的3电极系统的电极对。在一个或多个实施方式中，导电部可以还具有检测极。
[0098]
作为电极的材质，在一个或多个实施方式中，能够使用具有导电性的材质。作为具有导电性的材质，在一个或多个实施方式中，可举出金属材料和碳材料等。作为金属材料，在一个或多个实施方式中，可举出金(au)、铂(pt)、银(ag)、钌(ru)、钯(pd)和镍(ni)合金等。作为镍合金，在一个或多个实施方式中，可举出镍-钒合金、镍-钨合金和镍-钌合金等。作为碳材料，在一个或多个实施方式中，可举出石墨、碳纳米管、石墨烯和介孔碳等。
[0099]
作为电极，在一个或多个实施方式中，可举出通过在基材上将金属材料成膜而形成的薄膜电极等。作为成膜方法，在一个或多个实施方式中，可举出丝网印刷、物理蒸镀(pvd，例如溅射)或化学蒸镀(cvd)等。
[0100]
在一个或多个实施方式中，导电部形成于基材上。作为基材，在一个或多个实施方式中，可以使用绝缘性基材。作为绝缘性基材的材质，在一个或多个实施方式中，可举出热塑性树脂、热固化性树脂、玻璃、陶瓷和纸等。作为热塑性树脂，在一个或多个实施方式中，可举出聚醚酰亚胺(pei)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)和聚乙烯(pe)等。作为热固化性树脂，可举出聚酰亚胺树脂和环氧树脂等。
[0101]
本公开的测定方法包括：使含有氧化还原酶的试样与生物传感器的试剂层接触；接触后，通过进行规定时间的孵育，将由氧化还原酶与底物之间的反应生成的电子经由第一介体蓄积在试剂层中的第二介体；孵育后，在生物传感器的导电部的电极之间施加电压；测定通过电压的施加而产生的电信号；以及基于所测定的电信号，计算氧化还原酶的量。
[0102]
本公开中的“进行孵育”是指进行试样中氧化还原酶与试剂层中底物之间的氧化还原反应，可以包括：将由氧化还原反应生成的电子经由第一介体传递到第二介体；以及将所传递的(接受的)电子蓄积(存储)于第二介体。在本公开中，有时以同义使用“进行孵育”和“存储”。在本公开中，孵育时，在一个或多个实施方式中，实质上不进行用于测定电信号的电压施加。
[0103]
作为本公开的测定方法中的试样接触后的孵育时间，在一个或多个实施方式中，
为1分钟以上，从在第二介体中蓄积更多量的电子并增加所得的电信号的观点出发，为2分钟以上、3分钟以上、4分钟以上、5分钟以上、6分钟以上、7分钟以上或10分钟以上。孵育时间的上限不受到特别限定，在一个或多个实施方式中，可举出试剂层中含有的所有底物通过氧化还原反应而全部电子传递为止的时间等。在孵育时间的上限不受到特别限定的一个或多个实施方式中，为30分钟以下、20分钟以下或15分钟以下。
[0104]
在一个或多个实施方式中，本公开的测定方法中的孵育时间优选为试剂层中含有的底物不会因与作为测定对象的氧化还原酶的反应而枯竭的时间范围。因此，在一个或多个实施方式中，本公开的测定方法也可以包括将孵育时间设定为试剂层中含有的底物不会因与氧化还原酶的反应而枯竭的范围的时间。
[0105]
在本公开中，“底物不会因与氧化还原酶的反应而枯竭的范围的时间”是指试剂层中含有的底物的至少一部分处于能够与氧化还原酶反应的状态、或者与氧化还原酶能够反应的状态的底物存在于试剂层。在一个或多个实施方式中，底物不枯竭的范围的时间可以基于试剂层中含有的底物的含量进行预测。在一个或多个实施方式中，底物枯竭的时间可以基于试剂层中含有的底物的含量来计算。
[0106]
在本公开的测定方法的一个或多个实施方式中，接触后的孵育优选在非施加的状态下进行。在一个或多个实施方式中，本公开的测定方法优选不进行电压的施加直到接触后的规定时间的孵育结束。
[0107]
在一个或多个实施方式中，向电极间的电压的施加可以通过在电极(电极对)间施加一定电压来进行。在不受到特别限定的一个或多个实施方式中，向电极的电压的施加可以通过对电极施加正电压来进行。作为施加于工作电极的电压，在一个或多个实施方式中，相对于对电极为+50mv～+500mv，优选为+100mv～+300mv、+100mv～+250mv或+100mv～+200mv，更优选为+200mv。
[0108]
在一个或多个实施方式中，电信号的测定可以根据将氧化还原酶的量用于测定的方法来决定。
[0109]
在使用计时安培法进行氧化还原酶量的计算的情况下，在一个或多个实施方式中，通过对从施加电压起经过一定时间后的响应电流值进行测定来进行电信号的测定。作为一定时间，在一个或多个实施方式中，可举出施加电压后20秒以下、15秒以下、10秒以下、9秒以下、8秒以下、7秒以下、6秒以下、5秒以下、4秒以下、3秒以下或2秒以下。
[0110]
在使用计时库伦法进行氧化还原酶量的计算的情况下，在一个或多个实施方式中，为了得到响应电流的累计值，电信号的测定通过经时地测定响应电流值来进行。在使用循环伏安法进行氧化还原酶量的计算的情况下，在一个或多个实施方式中，为了得到循环伏安法波形，通过持续测定与扫描中的电压对应的电流值来进行电信号的测定。
[0111]
在一个或多个实施方式中，基于电信号的氧化还原酶的量的计算可以使用计时安培法、计时库伦法和循环伏安法等方法来进行。在使用计时安培法的情况下，在一个或多个实施方式中，预先用校准曲线等求出响应电流值的累计值与测定对象物(氧化还原酶)的量(浓度)的关系，将所测定的响应电流值的累计值应用于校准曲线，由此能够计算出测定对象物的量。
[0112]
在一个或多个实施方式中，本公开的测定方法可以包括：在上述试样与试剂层接触后立即，进行短时间施加(预施加)和测定由该施加产生的电信号。通过预施加和测定由
此产生的电信号，在一个或多个实施方式中，能够根据试样中的氧化还原酶(测定对象物)的量，使孵育(存储)时间变化，因此例如能够缩短测定时间。另外，能够将孵育(存储)后产生的电信号收敛于规定范围内，能够减少对测定装置的负荷。
[0113]
因此，作为其他方式，本公开的测定方法包括：使含有氧化还原酶的试样与生物传感器的试剂层接触；在接触后且上述孵育(存储)之前，在电极之间施加电压(第一施加)；测定通过第一施加而产生的电信号(第一测定)；基于通过第一测定获得的电信号，计算孵育时间；以通过计算获得的时间进行孵育；孵育后，在所述电极之间施加电压(第二施加)；测定通过所述第二施加而产生的电信号(第二测定)；以及基于通过第二测定获得的电信号，计算所述氧化还原酶的量。
[0114]
在一个或多个实施方式中，本公开的测定方法中的第一施加(预施加)能够在使试样与试剂层接触之后立即进行。在一个或多个实施方式中，第一施加(预施加)优选在接触后0.01秒～10秒或0.01秒～5秒内进行。
[0115]
在一个或多个实施方式中，本公开的测定方法中的第一测定(预测定)中的施加时间优选为0.01秒～10秒或0.01秒～5秒左右。
[0116]
本公开的测定方法包括：基于通过第一测定获得的电信号，计算孵育时间。在一个或多个实施方式中，孵育时间的计算(决定)能够基于预先确定的阈值(电信号的值)来进行。在一个或多个实施方式中，阈值可以是1个，也可以是2个以上。在一个或多个实施方式中，阈值可以根据电极的材质和介体的种类适当决定。
[0117]
在不受到特别限定的一个或多个实施方式中，在根据氧化还原酶的浓度将阈值设定为3个阶段(高浓度、中浓度和低浓度)的情况下，在通过第一测定获得的电信号(响应电流值)超过2000na的情况下，由于氧化还原酶的浓度为高浓度，因此将孵育时间决定为1分钟或1分钟以内，在该电信号(响应电流值)为1000na以上且2000na以下的情况下，由于氧化还原酶的浓度为中浓度，因此将孵育时间决定为大于1分钟且小于5分钟(或例如3分钟)，在电信号(响应电流值)小于1000na的情况下，由于氧化还原酶的浓度为低浓度，因此能够将孵育时间决定为5分钟或5分钟以上。
[0118]
[含有氧化还原酶的试样]
[0119]
在一个或多个实施方式中，本公开的测定方法中的含有氧化还原酶的试样可以是含有氧化还原酶的待测体本身，也可以是待测体中的成分被转换为氧化还原酶的试样。作为待测体，在一个或多个实施方式中，可举出生物体试样等。作为生物体试样，在一个或多个实施方式中，可举出血液和尿以及源自它们的试样、细胞提取试样和细胞培养液等。在一个或多个实施方式中，含有氧化还原酶的试样是用于测定氧化还原酶的量的试样，包括有可能含有氧化还原酶的试样、以及待测体中成分转换而可能含有氧化还原酶(怀疑含有氧化还原酶)的试样等。
[0120]
在一个或多个实施方式中，本公开的测定方法通过将激素和低分子化合物等那样的分析对象物转换为氧化还原酶来制备“含有氧化还原酶的试样”，从而能够高灵敏度地测定该分析对象物。根据本公开的测定方法，在一个或多个实施方式中，通过转换为氧化还原酶，能够以高灵敏度测定极微量浓度的分析对象物。
[0121]
作为将分析对象物转换为氧化还原酶的方法，在一个或多个实施方式中，可举出使用了用氧化还原酶修饰(标记)的适配体这样的分子识别元件的方法。例如，通过使用该
适配体(分子识别元件)与分析对象物结合而使氧化还原酶游离、分离或活性化的物质，能够进行将分析对象物转换为氧化还原酶的测定。例如，若使用以当分析对象物结合时从磁珠游离的方式固定于磁珠的氧化还原酶修饰分子识别元件，则能够使与分析对象物对应的氧化还原酶游离。
[0122]
因此，在一个或多个实施方式中，本公开的测定方法可以包括：将待测体中的分析对象物转换为氧化还原酶，制备含有氧化还原酶的试样。
[0123]
在一个或多个实施方式中，本公开的测定方法也可以包括：在将包含能够使待测体中的分析对象物转换为氧化还原酶的物质的第二试剂层配置于第一试剂层的上游的生物传感器中，将待测体导入到第二试剂层，制备包含氧化还原酶的试样；使制备的该试样与含有氧化还原酶的底物和介体的试剂层(第一试剂层)接触。
[0124]
作为分析对象物，在一个或多个实施方式中，可举出低分子化合物、肽、蛋白质、抗原、激素、免疫细胞、稀有细胞、糖、毒素、病毒粒子和金属等。因此，在一个或多个实施方式中，本公开的测定方法可以用于低分子化合物、肽、蛋白质、抗原、激素、免疫细胞、稀有细胞、糖、毒素、病毒粒子和金属等的定量。在一个或多个实施方式中，本公开的测定方法不用于以在测定中使用的生物传感器的试剂层中含有的氧化还原酶的底物(例如，葡萄糖、胆固醇、乙醇、山梨糖醇、果糖、纤维二糖、乳酸和尿酸等)为对象的测定(例如，定量)。
[0125]
因此，作为其他方式，本公开涉及使用生物传感器对待测体中分析对象物进行电化学测定的方法。本方式的方法中使用的生物传感器包括：导电部，包含2个以上的电极；第二试剂层，包含能够将分析对象物转换为氧化还原酶的物质；以及第一试剂层，与所述导电部接触配置，其中，第一试剂层和第二试剂层配置在流路内，第二试剂层位于第一试剂层的上游。第一试剂层包含所述氧化还原酶的底物和2种以上的介体，介体包括第一介体和第二介体，第一介体用于将由所述底物与所述氧化还原酶之间的反应生成的电子向第二介体传递，第二介体用于将从所述第一介体传递的电子向所述电极传递。本方式的生物传感器中的电极、底物和介体如上所述。
[0126]
在一个或多个实施方式中，第二试剂层和第一试剂层可以在接触配置，也可以分离配置。
[0127]
在一个或多个实施方式中，本方式的测定方法使用含有分析对象物作为待测体的待测体，生物传感器除了具备包含能够将分析对象物转换为氧化还原酶的物质(例如分子识别元件)的第二试剂层以外，能够与上述测定方法同样地进行。
[0128]
[生物传感器的制作方法]
[0129]
在一个或多个实施方式中，本公开的生物传感器可以通过如下方式制作：准备形成有包含2个以上的电极的导电部的基材，在该基材上载置包含氧化还原酶的底物和2种以上的介体的试剂层。
[0130]
试剂层载置于2个以上的电极中的至少工作电极上的一部分。试剂的载置方法不受到特别限定，例如可以通过将试剂的溶液点在电极的一部分并使其干燥来进行。更具体而言，试剂层例如可通过如下方式形成：制备氧化还原酶的底物、2种以上的介体、以及根据需要分散有缓冲剂和粘合剂的分散液，将其分注到电极上并使其干燥。
[0131]
在一个或多个实施方式中，本公开的生物传感器能够以图1的a～e所示的顺序制作。然而，在本公开中，生物传感器的制作方法不限于以下的顺序。
[0132]
如图1的a所示，在基材10上通过溅射形成包含工作电极12、对电极11、参比电极以及检测极(1)13和检测极(2)14的电极系统(导电部)。如图1的a～e所示，通过具备上述那样结构的电极系统，能够用检测极(1)13和对电极11检测到待测体到达了检测极(1)13，进而，能够用检测极(2)14和工作电极12检测到待测体到达了检测极(2)14。由此，也能够根据用检测极(1)13检测到待测体的时间和用检测极(2)14检测到待测体的时间来计算进行了孵育(存储)的时间。
[0133]
接着，形成试剂层15。试剂层15至少载置于工作电极12上的一部分即可，如图1的b所示，试剂层15也可以以与检测极(1)13、对电极11和工作电极12的一部分接触的方式载置。试剂层15至少包含氧化还原酶的底物和2种以上的介体，可根据需要制备分散有缓冲剂和粘合剂的试剂液(分散液)，将其载置(分注)于检测极(1)13、对电极11和工作电极12上，并进行干燥而形成。另外，也可以在随后形成的位于流路末端的部分(例如，检测极(2)14)形成止水部17。在一个或多个实施方式中，止水部17可以通过涂布止水用聚合物等止水剂并使其干燥而形成。由此，通过使与止水部17接触的待测体凝胶化，能够阻止进一步向流路的下游移动。
[0134]
接着，如图1的c所示，在载置有试剂层15的基材10上配置间隔物18。间隔物18也可以隔着绝缘层配置。在一个或多个实施方式中，间隔物18可以使用树脂制膜和带(tape)等来形成。间隔物18以形成于形成有止水部17的一侧的一端上的电极露出的方式配置。
[0135]
接着，如图1的d所示，在间隔物18之上配置盖19。由基材10和盖19包围的、间隔物18的开口部的空间成为流路。盖19具备成为待测体供给部的贯通孔20和成为通气口的贯通孔21，成为待测体供给部的贯通孔20和成为通气口的贯通孔21分别形成为位于试剂层15和止水部17的上部。作为盖19的材质，在一个或多个实施方式中，可举出pet(聚对苯二甲酸乙二醇酯，polyethylene terephthalate)等各种塑料等。如图2所示，形成有由基材10和盖19包围的空间(流路)23，该空间(流路)23中，供给到成为待测体供给部的贯通孔20的待测体经由试剂层15能够移动到成为通气口的贯通孔21。
[0136]
最后，如图1的e所示，配置o环型防水带22，以覆盖盖19的成为待测体供给部的贯通孔20的周围。由此，能够防止待测体流出到贯通孔20和流路23等之外。
[0137]
图3的a～e和图4示出本公开的生物传感器的制作方法的其他示例。图4是图3e的ii-ii线剖视图。
[0138]
在一个或多个实施方式中，如图3的a～e和图4所示，本公开的生物传感器也可以具备第一试剂层15和第二试剂层16作为试剂层。第一试剂层15至少包含氧化还原酶的底物和2种以上的介体，第二试剂层16包含用氧化还原酶修饰的分子识别元件。如本方式的生物传感器那样，通过具有第一试剂层15和第二试剂层16，在一个或多个实施方式中，能够根据第二试剂层的材质来调整待测体通过第二试剂层的时间，能够适当变更待测体与分子识别元件的反应时间。
[0139]
另外，能够用检测极(1)13和对电极11检测到待测体到达了检测极(1)13。进而，能够用检测极(2)14和工作电极12检测到待测体到达了检测极(2)14。也可以根据用检测极(1)13检测到待测体的时间和用检测极(2)14检测到待测体的时间来计算进行了孵育(存储)的时间。
[0140]
如图3的b所示，第二试剂层16以与检测极(1)13和对电极11接触的方式配置，第一
试剂层15以与对电极11和工作电极12的一部分接触的方式配置。第二试剂层16可以通过将浸渍有由氧化还原酶修饰的分子识别元件的基材配置在检测极(1)13和对电极11上而形成。作为基材，在一个或多个实施方式中，可举出玻璃过滤器和珠分离膜等。第一试剂层15至少包含氧化还原酶的底物和2种以上的介体，可根据需要制备分散有缓冲剂和粘合剂的试剂液(分散液)，将其配置(分注)于对电极11和工作电极12之上，并进行干燥而形成。
[0141]
本方式的生物传感器除了形成第一试剂层15和第二试剂层16这2个试剂层以外，可以与图1的a～e所示的生物传感器同样方式制作。
[0142]
本公开可以涉及以下的不受限的一个或多个实施方式。
[0143]
[a1]一种使用生物传感器对氧化还原酶的量进行电化学测定的方法，其中，
[0144]
所述生物传感器包括：
[0145]
导电部，包含2个以上的电极；以及
[0146]
试剂层，与所述导电部接触配置，并包含所述氧化还原酶的底物和2种以上的介体，
[0147]
所述介体包括第一介体和第二介体，所述第一介体是用于将由所述底物与所述氧化还原酶之间的反应生成的电子传递到第二介体的介体，所述第二介体是用于将从所述第一介体传递的电子传递到所述电极的介体，
[0148]
所述方法包括：
[0149]
使含有氧化还原酶的试样与所述试剂层接触；
[0150]
接触后，通过进行规定时间的孵育，使所述电子蓄积于所述第二介体；
[0151]
孵育后，在所述电极之间施加电压；
[0152]
测定通过所述电压的施加而产生的电信号；以及
[0153]
基于所述电信号，计算所述氧化还原酶的量。
[0154]
[a2]根据[a1]所述的方法，其中，将所述孵育的时间设定为所述试剂层中含有的底物不会因与所述氧化还原酶之间的反应而枯竭的范围的时间。
[0155]
[a3]根据[a1]或[a2]所述的方法，其中，所述试剂层中所述底物的配合量(试剂层的每1cm3)为4.4nmol以上。
[0156]
[a4]根据[a1]至[a3]中任一项所述的方法，其中，所述孵育的时间为1分钟以上。
[0157]
[a5]根据[a1]至[a4]中任一项所述的方法，其中，所述氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶，所述底物为葡萄糖。
[0158]
[a6]根据[a1]至[a5]中任一项所述的方法，其中，所述第一介体与所述第二介体的组合是1-甲氧基-5-乙基酚嗪硫酸乙酯盐(1-mpes)与钌化合物的组合、或1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐(1-mpms)与钌化合物的组合。
[0159]
[a7]根据[a1]至[a6]中任一项所述的方法，其中，用于计算所述氧化还原酶的量的电信号是在施加后10秒以内测定的电信号。
[0160]
[a8]根据[a1]至[a7]中任一项所述的方法，其中，所述生物传感器包含基材，所述导电部和试剂层形成于所述基材的表面。
[0161]
[b1]一种使用生物传感器对氧化还原酶的量进行电化学测定的方法，其中，
[0162]
所述生物传感器包括：
[0163]
导电部，包含2个以上的电极；以及
[0164]
试剂层，包含所述氧化还原酶的底物和2种以上的介体，并与所述导电部接触配置，
[0165]
所述介体包括第一介体和第二介体，所述第一介体是用于将所述底物与所述氧化还原酶之间的反应生成的电子传递到第二介体的介体，所述第二介体是用于将从所述第一介体传递的电子传递到所述电极的介体，
[0166]
所述方法包括：
[0167]
使含有所述氧化还原酶的试样与所述生物传感器的所述试剂层接触；
[0168]
接触后，在所述电极之间施加电压(第一施加)；
[0169]
测定通过所述第一施加而产生的电信号(第一测定)；
[0170]
基于通过所述第一测定获得的电信号，计算孵育时间；
[0171]
以计算获得的时间进行孵育；
[0172]
孵育后，在所述电极之间施加电压(第二施加)；
[0173]
测定通过所述第二施加而产生的电信号(第二测定)；以及
[0174]
基于通过第二测定获得的电信号，计算所述氧化还原酶的量。
[0175]
[b2]根据[b1]所述的方法，其中，所述试剂层中所述底物的配合量(试剂层的每1cm3)为4.4nmol以上。
[0176]
[b3]根据[b1]或[b2]所述的方法，其中，所述氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶，所述底物为葡萄糖。
[0177]
[b4]根据[b1]至[b3]中任一项所述的方法，其中，所述第一介体与所述第二介体的组合是1-甲氧基-5-乙基酚嗪硫酸乙酯盐(1-mpes)与钌化合物的组合、或1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐(1-mpms)与钌化合物的组合。
[0178]
[b5]根据[b1]至[b4]中任一项所述的方法，其中，通过所述第二测定而获得的电信号是在施加后10秒以内测定出的电信号。
[0179]
[b6]根据[b1]至[b5]中任一项所述的方法，其中，所述生物传感器包含基材，所述导电部和试剂层形成于所述基材的表面。
[0180]
[c1]一种用于对氧化还原酶进行电化学测定的生物传感器，包括：
[0181]
导电部，包含2个以上的电极；以及
[0182]
试剂层，包含所述氧化还原酶的底物和2种以上的介体，并与所述导电部接触配置，
[0183]
所述介体包括第一介体和第二介体，所述第一介体是用于将由所述底物和所述氧化还原酶之间的反应生成的电子传递到第二介体的介体，所述第二介体是用于将从所述第一介体传递的电子传递到所述电极的介体，
[0184]
所述生物传感器是[a1]至[a6]以及[b1]中任一项所述的测定方法中使用的生物传感器。
[0185]
[c2]一种用于对氧化还原酶进行电化学测定的的生物传感器，包括：
[0186]
基材；
[0187]
导电部，包含形成于所述基材的表面上的2个以上的电极；以及
[0188]
试剂层，包含所述氧化还原酶的底物和2种以上的介体，并与所述导电部接触配置，
[0189]
所述介体包括第一介体和第二介体，所述第一介体用于将由所述底物与所述氧化还原酶之间的反应生成的电子传递到第二介体，所述第二介体用于将从所述第一介体传递的电子传递到所述电极。
[0190]
[c3]根据[c1]或[c2]所述的传感器，其中，所述氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶，所述底物为葡萄糖。
[0191]
[c4]根据[c1]至[c3]中任一项所述的传感器，其中，所述第一介体与所述第二介体的组合是1-甲氧基-5-乙基酚嗪硫酸乙酯盐(1-mpes)与钌化合物的组合、或1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐(1-mpms)与钌化合物的组合。
[0192]
[c5]根据[c1]至[c4]中任一项所述的传感器，其中，所述试剂层中所述底物的配合量(试剂层的每1cm3)为4.4nmol以上。
[0193]
[c6]根据[c1]至[c5]中任一项所述的传感器，其中，所述第一介体为1-甲氧基-5-乙基酚嗪硫酸乙酯盐(1-mpes)和1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐(1-mpms)中的至少一个，所述第二介体为钌化合物。
[0194]
[d1]一种使用生物传感器对待测体中的分析对象物进行电化学测定的方法，其中，
[0195]
所述生物传感器包括：
[0196]
导电部，包含包含2个以上的电极；
[0197]
第二试剂层，包含用氧化还原酶修饰的分子识别元件；以及
[0198]
第一试剂层，包含所述氧化还原酶的底物和2种以上的介体，并与所述导电部接触配置，
[0199]
所述介体包括第一介体和第二介体，所述第一介体用于将由所述底物与所述氧化还原酶之间的反应生成的电子传递到第二介体的，所述第二介体用于将从所述第一介体传递的电子传递到所述电极，
[0200]
所述方法包括：
[0201]
将所述待测体导入到所述生物传感器；
[0202]
通过进行规定时间的孵育，使电子蓄积于所述第二介体；
[0203]
孵育后，在所述电极之间施加电压；
[0204]
测定通过所述施加而产生的电信号；以及
[0205]
基于所述测定值，计算所述氧化还原酶的量。
[0206]
[d2]根据[d1]所述的方法，其中，将所述孵育的时间设定为所述第一试剂层中含有的底物不会因与所述氧化还原酶之间的反应而枯竭的范围的时间。
[0207]
[d3]根据[d1]或[d2]所述的方法，其中，所述第一试剂层中所述底物的配合量(试剂层的每1cm3)为4.4nmol。
[0208]
[d4]根据[d1]至[d3]中任一项所述的方法，其中，所述孵育的时间为1分钟以上。
[0209]
[d5]根据[d1]至[d4]中任一项所述的方法，其中，所述氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶，所述底物为葡萄糖。
[0210]
[d6]根据[d1]至[d5]中任一项所述的方法，其中，所述第一介体与所述第二介体的组合是1-甲氧基-5-乙基酚嗪硫酸乙酯盐(1-mpes)与钌化合物的组合、或1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐(1-mpms)与钌化合物的组合。
[0211]
以下，通过实施例，更详细地说明本公开，但这些是例示性的，本公开并不局限于这些实施例。
[0212]
实施例
[0213]
在实验例中，使用下述试剂和电极。
[0214]
[缓冲液]
[0215]
0.5m磷酸缓冲液(ph7.3～7.4，0.5m nacl，0.25％吐温20)
[0216]
[介体]
[0217]
钌化合物(ru(nh3)6cl3，lt金属株式会社制造)
[0218]
1-mpes(1-甲氧基-5-乙基酚嗪硫酸乙酯盐，株式会社同仁化学研究所制造)
[0219]
[gdh]
[0220]
fad依赖的葡萄糖脱氢酶(fad-dependent glucose dehydrogenase；商品名：葡萄糖脱氢酶“amano 8”，mw：18万，天野酶制品株式会社制造)
[0221]
[底物]
[0222]
葡萄糖
[0223]
[电极]
[0224]
dep-chip(型号名：dep-er-n，圆型金电极，固定化用印刷电极(3电极系统)，外尺寸：12.5mm
×
4mm
×
0.3mm，工作电极面积：3.67mm2，株式会社biodevicetech制造)
[0225]
[实验例1]
[0226]
按照以下步骤，对gdh进行电化学测定。
[0227]
＜步骤＞
[0228]
1.在pcr管中分注50μl的缓冲液
[0229]
2.在1的管中分注50μl的1m葡萄糖
[0230]
3.在2的管中分注50μl的5mm 1-mpes
[0231]
4.在3的管中分注50μl的500mm ru化合物
[0232]
5.在4的管中分注50μl的gdh溶液，以使终浓度为0～12.5nm，并且将与测定器连接的电极浸渍于反应液中
[0233]
6.在分注了最后gdh溶液的时刻开始测量孵育时间
[0234]
7.从测量开始经过5分钟后，向电极施加电压并进行电化学测定
[0235]
施加电压：200mv
[0236]
测量时间：15秒
[0237]
采样间隔：0.1秒
[0238]
8.测定结束
[0239]
反应液(6的管)的组成如下。
[0240]
＜反应液的组成＞
[0241]
0.1m磷酸缓冲液(ph7.3～7.4)
[0242]
0.1m nacl
[0243]
0.05％吐温20
[0244]
200mm葡萄糖
[0245]
1mm 1-mpes
[0246]
100mm ru(nh3)6cl3[0247]
0～12.5nm gdh
[0248]
将获得的结果示于图5的a和b。图5的a和b是施加开始后2秒的响应值的图表，图5的b扩大了低浓度(0～0.8nm)的范围。
[0249]
如图5的a和b所示，可以通过将0.024nm(24pm)～12.5nm范围的gdh浓度孵育5分钟并进行存储来进行检测。即，通过5分钟的孵育(存储)，能够测定pm级的gdh。
[0250]
根据在施加后较早的时间(例如，从施加起2秒后)获得的响应值，能够进行直线性高的gdh的定量。
[0251]
[实验例2]
[0252]
按照以下步骤，对gdh进行电化学测定。
[0253]
＜步骤＞
[0254]
1.在pcr管中分注50μl的缓冲液
[0255]
2.在1的管中分注50μl的1m葡萄糖
[0256]
3.在2的管中分注50μl的5mm 1-mpes
[0257]
4.在3的管中分注50μl的500mm ru化合物
[0258]
5.在4的管中分注50μl的gdh溶液，以使终浓度为0.56、5.56和55.56nm，并且将与测定器连接的电极浸渍于反应液中
[0259]
6.在分注了最后gdh溶液的时刻开始测量孵育时间
[0260]
7.经过规定时间(5分钟、10分钟、15分钟的任意时间)后，向电极施加电压并进行电化学测定
[0261]
施加电压：200mv
[0262]
测量时间：30秒
[0263]
采样间隔：0.1秒
[0264]
8.测定结束
[0265]
反应液(6的管)的组成如下。
[0266]
＜反应液的组成＞
[0267]
0.1m磷酸缓冲液(ph7.3～7.4)
[0268]
0.1m nacl
[0269]
0.05％吐温20
[0270]
200mm葡萄糖
[0271]
1mm 1-mpes
[0272]
100mm ru(nh3)6cl3[0273]
0.56nm、5.56nm、55.56nm gdh
[0274]
将获得的结果示于图6的a～c。图6的a～c示出将孵育时间为5分钟的响应值设为100时的相对值(灵敏度比)。响应值使用开始施加后2秒的响应值。
[0275]
如图6的a～c所示，在任意gdh浓度下，观察到依赖于孵育时间的响应值的增大。
[0276]
[实验例3]
[0277]
按照以下步骤，对gdh进行电化学测定。
[0278]
＜步骤＞
[0279]
1.在pcr管中分注50μl的缓冲液
[0280]
2.在1的管中分注50μl的葡萄糖，以使终浓度为2～200mm
[0281]
3.在2的管中分注50μl的5mm 1-mpes
[0282]
4.在3的管中分注50μl的500mm ru化合物
[0283]
5.在4的管中分注50μl的5nm gdh溶液，并且将与测定器连接的电极浸渍于反应液中
[0284]
6.在分注了最后gdh溶液的时刻开始测量孵育时间
[0285]
7.经过规定时间(5分钟)后，向电极施加电压并进行电化学测定
[0286]
施加电压：200mv
[0287]
测量时间：10秒
[0288]
采样间隔：0.1秒
[0289]
8.测定结束
[0290]
反应液(6的管)的组成如下。
[0291]
＜反应液的组成＞
[0292]
0.1m磷酸缓冲液(ph7.3～7.4)
[0293]
0.1m nacl
[0294]
0.05％吐温20
[0295]
2～200mm葡萄糖
[0296]
1mm 1-mpes
[0297]
100mm ru(nh3)6cl3[0298]
1nm gdh
[0299]
将获得的结果示于图7。响应值使用开始施加后2秒的响应值。如图7所示，在本实验例的条件下，葡萄糖浓度(底物浓度)为10mm以上，得到了超过200na的高响应电流。在葡萄糖浓度(底物浓度)为60mm以上(60～200mm)的情况下，响应值未变化(未观察到响应值的减少)。即，确认到：即使在反应液中底物(葡萄糖)浓度为高浓度的情况下(例如，在作为待测体的生物体试样中以高浓度含有成为氧化还原酶反应的底物的物质的情况下)，酶(gdh)也不会受到葡萄糖的底物阻碍，能够测定酶的浓度。
[0300]
[实验例4]
[0301]
按照以下步骤，对gdh进行电化学测定。分注以反应液中介体的浓度成为下述表所示的浓度的方式进行。
[0302]
＜步骤＞
[0303]
1.在pcr管中分注50μl的缓冲液
[0304]
2.在1的管中分注50μl的1m葡萄糖
[0305]
3.在2的管中分注50μl的5mm 1-mpes(不含1-mpes的情况下分注缓冲液)
[0306]
4.在3的管中分注50μl的500mm ru化合物(不含ru化合物的情况下分注缓冲液)
[0307]
5.在4的管中分注50μl的gdh溶液，以使终浓度为0～10nm，并且将与测定器连接的电极浸渍于反应液中
[0308]
6.在分注了最后gdh溶液的时刻开始测量孵育时间
[0309]
7.经过规定时间(5分钟)后，向电极施加电压并进行电化学测定
[0310]
施加电压：200mv
[0311]
测量时间：10秒
[0312]
采样间隔：0.01秒
[0313]
8.测定结束
[0314]
反应液(6的管)的组成如下。
[0315]
＜反应液的组成＞
[0316]
0.1m磷酸缓冲液(ph7.3～7.4)
[0317]
0.1m nacl
[0318]
0.05％吐温20
[0319]
200mm葡萄糖
[0320]
1-mpes和ru(nh3)6cl3如下表
[0321]
0～10nm gdh
[0322]
[表1]
[0323][0324][0325]
将其结果示于图8。响应值使用了在施加开始后2.0～2.1秒的响应值的平均值。如图8所示，仅通过1种介体无法得到充分的响应值。特别是在仅使用钌化合物的情况下，无论哪种gdh浓度都无法得到响应值。认为这是因为钌化合物几乎无法从gdh接受电子，或者无法对接受到的电子进行存储。
[0326]
与此相对，通过使用2种介体(钌化合物和1-mpes)，在任意gdh浓度下都能够得到高的响应值。
[0327]
[实验例5]
[0328]
按照以下步骤，对gdh进行电化学测定。
[0329]
＜步骤＞
[0330]
1.在pcr管中分注50μl的缓冲液
[0331]
2.在1的管中分注50μl的1m葡萄糖
[0332]
3.在2的管中分注50μl的5mm或500mm 1-mpes
[0333]
4.在3的管中分注50μl的500mm ru化合物
[0334]
5.在4的管中分注50μl的5nm gdh溶液，并且将与测定器连接的电极浸渍于反应液中
[0335]
6.在分注了最后gdh溶液的时刻开始测量孵育时间
[0336]
7.经过规定时间(5分钟)后，向电极施加电压并进行电化学测定
[0337]
施加电压：200mv
[0338]
测量时间：10秒
[0339]
采样间隔：0.01秒
[0340]
8.测定结束
[0341]
反应液(6的管)的组成如下。
[0342]
＜反应液的组成＞
[0343]
0.1m磷酸缓冲液(ph7.3～7.4)
[0344]
0.1m nacl
[0345]
0.05％吐温20
[0346]
200mm葡萄糖
[0347]
1mm或100mm 1-mpes
[0348]
100mm ru(nh3)6cl3[0349]
1nm gdh
[0350]
将其结果示于图9。响应值使用了在施加开始后2.0～2.1秒的响应值的平均值。如图9所示，通过使1-mpes(第一介体)的量向100mm增加，能够使灵敏度(响应值)为2倍以上。
[0351]
[实验例6]
[0352]
使用由gdh修饰(标记)的腺苷dna适配体作为分子识别元件，按照下述步骤，对反应液中的gdh进行电化学测定。
[0353]
腺苷dna适配体是作为目标分子识别部能够识别并结合腺苷的适配体，用gdh标记，并且固定于磁珠。腺苷dna适配体固定化珠在腺苷与适配体结合时，gdh标记适配体相较于珠而游离。
[0354]
＜步骤＞
[0355]
1.在pcr管中分注100μl的腺苷dna适配体固定化珠(终浓度：6pmol/100μl)
[0356]
2.集磁，废弃液体
[0357]
3.在2的管中分注120μl的将腺苷溶解于缓冲液而得到的腺苷溶液(腺苷终浓度：0、7.5、12.5、37.5、75、125、375或750μm)
[0358]
4.反应5分钟后，集磁(2分钟)，回收上清液
[0359]
5.在pcr管中分注50μl的缓冲液
[0360]
6.在5的管中分注50μl的1m葡萄糖
[0361]
7.在6的管中分注50μl的5mm 1-mpes
[0362]
8.在7的管中分注50μl的500mm ru化合物
[0363]
9.在8的管中分注50μl的4个样品(包含gdh标记适配体)，并且与测定器连接
[0364]
10.在分住了最后的4的样品的时刻开始测量孵育时间
[0365]
11.经过规定时间(5分钟)后，向电极施加电压并进行电化学测定
[0366]
施加电压：200mv
[0367]
测量时间：10秒
[0368]
采样间隔：0.01秒
[0369]
12.测定结束
[0370]
反应液(10的管)的组成如下。
[0371]
＜反应液的组成＞
[0372]
0.1m磷酸缓冲液(ph7.3～7.4)
[0373]
0.1m nacl
[0374]
0.05％吐温20
[0375]
200mm葡萄糖
[0376]
1mm 1-mpes
[0377]
100mm ru(nh3)6cl3[0378]
根据腺苷浓度从磁珠游离的gdh标记适配体
[0379]
除了使用溶解于血浆中的腺苷溶液代替缓冲液以外，按照上述步骤同样地进行测定。
[0380]
将其结果示于图10。响应值使用了在施加开始后2.0～2.1秒的响应值的平均值。如图10所示，虽然在血浆和缓冲液中观察到灵敏度的差异，但确认到依赖于测定对象物(腺苷)浓度的响应电流的增大。
[0381]
即，使用由适配体与分析对象物(腺苷)之间的反应游离的gdh修饰适配体来进行了对象物浓度的检测。
[0382]
[实验例7]
[0383]
按照以下步骤，对gdh进行电化学测定。
[0384]
[器件的制作]
[0385]
在pet基板上溅射金属并进行修整，由此制作具有对电极、工作电极和参比电极的电极。使用所获得的电极，制作具有毛细管构造的器件。
[0386]
＜步骤＞
[0387]
1.在pcr管中分注50μl的缓冲液
[0388]
2.在1的管中分注50μl的1m葡萄糖
[0389]
3.在2的管中分注50μl的5mm 1-mpes
[0390]
4.在3的管中分注50μl的500mm ru化合物
[0391]
5.在4的管中分注50μl的gdh，以使终浓度为0.56nm、5.56nm和55.56nm
[0392]
6.分注后迅速(从分注10秒后左右)，将样品的一部分从5的管吸引到一个上述器件
[0393]
7.吸引后迅速向电极施加电压并进行电化学测定(第一施加和第一测定)
[0394]
施加电压：200mv
[0395]
测量时间：5秒
[0396]
采样间隔：0.1秒
[0397]
8.从5的分注经过规定的孵育时间(1、3或5分钟)后，向电极施加电压并进行电化学测定(第二施加和第二测定)
[0398]
施加电压：200mv
[0399]
测量时间：15秒
[0400]
采样间隔：0.1秒
[0401]
9.测定结束
[0402]
反应液(7和8的管)的组成如下。
[0403]
＜反应液的组成＞
[0404]
0.1m磷酸缓冲液(ph7.3～7.4)
[0405]
0.1m nacl
[0406]
0.05％吐温20
[0407]
200mm葡萄糖
[0408]
1mm 1-mpes
[0409]
100mm ru(nh3)6cl3[0410]
0.56、5.56和55.56nm gdh
[0411]
将其结果的一部分示于图11的a和b。图11的a是第一测定(预施加时)的响应电流值的测定结果，图11的b是第二测定时的响应电流值的测定结果。图11的a的响应值使用在施加开始后0.5秒的响应值，图11的b的响应值使用在施加开始后2.0秒的响应值。
[0412]
如图11的a所示，在第一测定(预施加)中，在gdh浓度高的样品中电流值高，在gdh浓度低的样品中电流值低。根据第一测定的电流值，改变第二测定中的孵育(存储)时间。将其结果示于图11的b。第一测定中的电流值高的样品(测量开始后0.5秒的电流值为2000na以上)可以用1分钟的孵育(存储)充分地测定。在预施加的电流值为1000na以上且小于2000na的情况下，能够用3分钟的孵育(存储)进行测定。在第一测定的电流值小于1000na的情况下，通过进行5分钟的孵育(存储)能够检测响应值。
[0413]
即，教导了如下内容：通过对第一测定的电流值预先设定阈值和针对各阈值的孵育(存储)时间，将第一测定的测定值与阈值进行比较来使孵育(存储)时间变化，从而能够进行更迅速的测定，并且能够将对器件的负载降低、电极结构中的对电极面积设定得更小。
[0414]
[生物传感器的制作]
[0415]
如图3的a～e所示，生物传感器按如下步骤制作。
[0416]
如图3的a所示，准备pet制基材10(长度：50mm，宽度：6mm，厚度：250μm)，在其一个表面上溅射金属，对其进行修整，由此形成检测极(1)13、对电极11、工作电极12以及参比电极和检测极(2)14。
[0417]
接着，如图3的b所示，在形成有电极的基材10上设置第一试剂层15、第二试剂层16和止水部17。第二试剂层16以与检测极(1)13和对电极11接触的方式设置在它们之上。第一试剂层15以与对电极11和工作电极12的一部分接触的方式设置在它们之上。止水部17设置在参比电极和检测极(2)14上。第二试剂层16通过配置包含由用氧化还原酶修饰的分子识别元件的玻璃过滤器来形成。第二试剂层16的过滤器的直径为3mm。第一试剂层15通过配置含有氧化还原酶的底物、第一介体和第二介体以及缓冲剂的试剂液并使其干燥而形成。止水部17通过配置止水用聚合物来形成。
[0418]
接着，如图3的c所示，将具有开口部的间隔物18配置在形成有第二试剂层16、第一试剂层15和止水部17的基材10上，该开口部露出第二试剂层16、第一试剂层15和止水部17。此外，间隔物18以一侧端部(该图的右手侧)的电极露出的方式配置。间隔物18的厚度为100μm左右。
[0419]
接着，如图3的d所示，在间隔物18上配置有具备成为待测体供给部的贯通孔20和成为通气口的贯通孔21的盖19。由基材10和盖19包围的、间隔物18的开口部的空间成为流路。流路的高度为100μm左右。成为待测体供给部的贯通孔20和成为通气口的贯通孔21分别形成为位于第二试剂层16和止水部17的上部。成为待测体供给部的贯通孔20的直径为4mm，
成为通气口的贯通孔21的直径为0.5mm。
[0420]
最后，如图3的e所示，在盖19上配置o环型防水带22(内径：2mm且外径：6mm)。防水带22以覆盖成为待测体供给部的贯通孔20的周围的方式配置，由此，能够防止待测体流出到第二试剂层16(过滤器)之外。
[0421]
图4是图3的e中的ii-ii线剖视图。如图4所示，形成有由基材10和盖19包围的空间(流路)23，该空间(流路)23中，供给到成为待测体供给部的贯通孔20的待测体经由第二试剂层16和第一试剂层15能够移动到成为通气口的贯通孔21。

技术特征：
1.一种使用生物传感器对氧化还原酶的量进行电化学测定的方法，其中，所述生物传感器包括：导电部，包含2个以上的电极；以及试剂层，与所述导电部接触配置，并包含所述氧化还原酶的底物和2种以上的介体，所述介体包括第一介体和第二介体，所述第一介体是用于将由所述底物与所述氧化还原酶之间的反应生成的电子传递到第二介体的介体，所述第二介体是用于将从所述第一介体传递的电子传递到所述电极的介体，所述方法包括：使含有氧化还原酶的试样与所述试剂层接触；接触后，通过进行规定时间的孵育，使所述电子蓄积于所述第二介体；孵育后，在所述电极之间施加电压；测定通过所述电压的施加而产生的电信号；以及基于所述电信号，计算所述氧化还原酶的量。2.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述孵育的时间设定为所述试剂层中含有的底物不会因与所述氧化还原酶之间的反应而枯竭的范围的时间。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，以试剂层的每1cm3计，所述试剂层中所述底物的配合量为4.4nmol以上。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述孵育的时间为1分钟以上。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶，所述底物为葡萄糖。6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第一介体与所述第二介体的组合是1-甲氧基-5-乙基酚嗪硫酸乙酯盐与钌化合物的组合、或1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐与钌化合物的组合。7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，用于计算所述氧化还原酶的量的电信号是在施加后10秒以内测定的电信号。8.一种用于对氧化还原酶进行电化学测定的的生物传感器，包括：基材；导电部，包含形成于所述基材的表面上的2个以上的电极；以及试剂层，包含所述氧化还原酶的底物和2种以上的介体，并与所述导电部接触配置，所述介体包括第一介体和第二介体，所述第一介体是用于将由所述底物与所述氧化还原酶之间的反应生成的电子传递到第二介体的介体，所述第二介体是用于将从所述第一介体传递的电子传递到所述电极的介体，所述生物传感器是权利要求1至7中任一项所述的方法中使用的生物传感器。9.根据权利要求8所述的生物传感器，其中，以试剂层的每1cm3计，所述试剂层中所述底物的配合量为4.4nmol以上。10.根据权利要求8或9所述的生物传感器，其中，所述氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶，所述底物为葡萄糖。11.根据权利要求8或9所述的生物传感器，其中，
所述第一介体为1-甲氧基-5-乙基酚嗪硫酸乙酯盐和1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐中的至少一个，所述第二介体为钌化合物。12.一种使用生物传感器对氧化还原酶的量进行电化学测定的方法，其中，所述生物传感器包括：导电部，包含2个以上的电极；以及试剂层，包含所述氧化还原酶的底物和2种以上的介体，并与所述导电部接触配置，所述介体包括第一介体和第二介体，所述第一介体是用于将由所述底物与所述氧化还原酶之间的反应生成的电子传递到第二介体的介体，所述第二介体是用于将从所述第一介体传递的电子传递到所述电极的介体，所述方法包括：使含有所述氧化还原酶的试样与所述生物传感器的所述试剂层接触；接触后在所述电极之间施加电压，作为第一施加；测定通过所述第一施加而产生的电信号，作为第一测定；基于通过所述第一测定获得的电信号，计算孵育时间；以计算获得的时间进行孵育；孵育后在所述电极之间施加电压，作为第二施加；测定通过所述第二施加而产生的电信号，作为第二测定；以及基于通过第二测定获得的电信号，计算所述氧化还原酶的量。

技术总结
本发明涉及使用生物传感器的氧化还原酶的电化学测定方法以及其中使用的生物传感器。本公开的方法中使用的生物传感器包括包含2个以上的电极的导电部、以及与导电部接触地配置且包含氧化还原酶的底物和2种以上的介体的试剂层，介体包括第一介体和第二介体，第一介体是用于将由底物与氧化还原酶之间的反应生成的电子传递到第二介体的介体，第二介体是用于将从第一介体传递的电子传递到电极的介体。本公开的方法包括：使含有氧化还原酶的试样与试剂层接触；接触后，通过进行规定时间的孵育，使电子蓄积于第二介体；孵育后，在电极之间施加电压；测定通过电压的施加而产生的电信号；以及基于电信号，计算氧化还原酶的量。计算氧化还原酶的量。计算氧化还原酶的量。


技术研发人员：筱嵜耕太郎 大贺美咲 三上寿幸
受保护的技术使用者：爱科来株式会社
技术研发日：2023.03.16
技术公布日：2023/9/20