一种瓜蒌SSR分子标记及其应用

一种瓜蒌ssr分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种瓜蒌ssr分子标记及其应用。


背景技术：

2.瓜蒌作为重要的药用植物和休闲食品，在中国，长期历史进化过程中形成了适应各地生态环境的品种资源，具有广泛的遗传多样性和广泛的遗传基础。加强瓜蒌遗传资源研究和利用，发掘优异相关基因为育种服务，是培养高产、优质和抗逆瓜蒌新品种的有效途径，是促进育种其进程的重要推动力。为了科学、公正、合理地开展相关测定，保护品种合法权益，促进种质资源评价，提高种质资源鉴定水平，急需制定适合瓜蒌品种鉴定技术规程。
3.ssr标记具有
①
数量丰富，广泛分布于整个基因组，
②
具有较多的等位性变异，
③
共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子，
④
实验重复性好，结果可靠等优点。已经被广泛使用于大田作物的品种鉴定和分子标记辅助育种。但当前瓜蒌上的研究还未见报道，开发瓜蒌ssr分子标记，为瓜蒌的品种鉴定，基因分型、乃至遗传定位和分子标记辅助选择奠定基础。能够提高瓜蒌品种鉴定的科学性、实用性和适用性。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的上述不足，本发明提供一种瓜蒌ssr分子标记及其应用。
5.本发明采用以下技术方案实现：一种瓜蒌ssr分子标记，所述瓜蒌ssr分子标记如gl001-gl064所示的其中任意一种或至少任意两种组成的混合物。
6.所述瓜蒌ssr分子标记用于瓜蒌性质的检测。
7.所述瓜蒌性质包括瓜蒌品种、瓜蒌基因分型、瓜蒌亲缘关系、瓜蒌遗传多样性及瓜蒌基因定位。
8.一种瓜蒌ssr分子标记在制备用于检测瓜蒌性质的生物制品中应用，所述生物制品包含权利要求1所述的瓜蒌ssr分子标记。
9.所述生物制品包括试剂、试剂盒、芯片。
10.一种瓜蒌ssr分子标记在检测瓜蒌性质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
11.s1瓜蒌基因组dna提取：
12.提取待检样品的dna，其中待检样品为已鉴定为瓜蒌或者瓜蒌属的植物；
13.s2ssr扩增反应：
14.提取后的待检样品的dna加入上下游引物进行扩增反应；
15.s3电泳监测：
16.ssr扩增反应后的产物进行非变性丙烯酰胺凝胶电泳检测；
17.s4结果统计分析：
18.依据电泳检测后的条带的位置，判断分子量大小，确定引物的多态性和鉴定相关等位基因。
19.相比现有技术，本发明的有益效果在于：
20.本发明提出一种高效、便捷、快速鉴定不同基因型瓜蒌的ssr的标记和相关方法，仅仅需要基本的分子生物学仪器设备，灵敏度高，ssr具有共显性，能够鉴别瓜蒌的纯合型和杂合型，具有很高的特异性。本发明对于瓜蒌的品种鉴定、基因分型、亲缘关系分析、遗传多样性分析和基因定位等都有重要意义。
附图说明
21.图1为本发明提供的rna测序分析图，其中：
22.图1a为mapped_reads在mrna上的位置分布图；
23.图1b为插入片段大小分布图；
24.图1c为转录组测序数据饱和度模拟图；
25.图2为本发明提供的瓜蒌的不同重复基元的重复数目分布及部分引物筛选电泳图，其中：
26.图2a为瓜蒌的不同重复基元的重复数目分布图；
27.图1b为在皖篓9号和17号上的引物筛选电泳图
28.图3为本发明提供的gl001、gl002、gl003和gl004分子标记的电泳检测图；
29.图4为本发明提供的gl005、gl006和gl007分子标记的电泳检测图；
30.图5为本发明提供的gl008、gl009和gl010分子标记的电泳检测图；
31.图6为本发明提供的gl011、gl012和gl013分子标记的电泳检测图；
32.图7为本发明提供的gl014、gl015和gl016分子标记的电泳检测图；
33.图8为本发明提供的gl017、gl018和gl019分子标记的电泳检测图；
34.图9为本发明提供的gl020、gl021和gl022分子标记的电泳检测图；
35.图10为本发明提供的gl023、gl024和gl025分子标记的电泳检测图；
36.图11为本发明提供的gl026、gl027和gl028分子标记的电泳检测图；
37.图12为本发明提供的gl029、gl030和gl031分子标记的电泳检测图；
38.图13为本发明提供的gl032、gl033和gl034分子标记的电泳检测图；
39.图14为本发明提供的gl035、gl036和gl037分子标记的电泳检测图；
40.图15为本发明提供的gl038、gl039和gl040分子标记的电泳检测图；
41.图16为本发明提供的gl041、gl042和gl043分子标记的电泳检测图；
42.图17为本发明提供的gl044、gl045和gl046分子标记的电泳检测图；
43.图18为本发明提供的gl047、gl048和gl049分子标记的电泳检测图；
44.图19为本发明提供的gl050、gl051和gl052分子标记的电泳检测图；
45.图20为本发明提供的gl053、gl054和gl055分子标记的电泳检测图；
46.图21为本发明提供的gl056、gl057和gl058分子标记的电泳检测图；
47.图22为本发明提供的gl059、gl060和gl061分子标记的电泳检测图；
48.图23为本发明提供的gl062、gl063和gl064分子标记的电泳检测图。
具体实施方式
49.下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施
例。
50.实施例1：
51.一种瓜蒌ssr分子标记，所述瓜蒌ssr分子标记如gl001-gl064所示的其中任意一种或至少任意两种组成的混合物。
52.所述瓜蒌ssr分子标记用于瓜蒌性质的检测。
53.所述瓜蒌性质包括瓜蒌品种、瓜蒌基因分型、瓜蒌亲缘关系、瓜蒌遗传多样性及瓜蒌基因定位。
54.一种瓜蒌ssr分子标记在制备用于检测瓜蒌性质的生物制品中应用，其特征在于，所述生物制品包含权利要求1所述的瓜蒌ssr分子标记。
55.所述生物制品包括试剂、试剂盒、芯片。
56.一种瓜蒌ssr分子标记在检测瓜蒌性质的方法，包括以下步骤：
57.s1瓜蒌基因组dna提取：
58.提取待检样品的dna，其中待检样品为已鉴定为瓜蒌或者瓜蒌属的植物；
59.s2ssr扩增反应：
60.提取后的待检样品的dna加入上下游引物进行扩增反应；
61.s3电泳监测：
62.ssr扩增反应后的产物进行非变性丙烯酰胺凝胶电泳检测；
63.s4结果统计分析：
64.依据电泳检测后的条带的位置，判断分子量大小，确定引物的多态性和鉴定相关等位基因。
65.实施例2：
66.一、瓜蒌转录组测序
67.1.1rna的提取、检测和mrna富集
68.总rna用天根生化科技有限公司rnapreppurerna试剂盒(北京)提取，用nanophotometer@的试剂盒(implenca，usa)纯化rna，用agilent2100检测rna的完整性，用oligo(dt)磁珠富集mrna。
69.1.2mrna片段化、cdna合成、纯化与文库构建
70.mrna用fragmentationbuffer随机打断，用六碱基随机引物合成第一条cdna链，然后加入缓冲液、dntps、rnaseh和dnapolymerasei合成第二条cdna链，利用ampurexpbeads纯化cdna；纯化的双链cdna再进行末端修复、加a尾并连接测序接头，然后用ampurexpbeads进行片段大小选择；最后通过pcr富集得到cdna文库。
71.1.3cdna测序与ssr开发
72.使用qubit2.0进行初步定量，使用agilent2100对文库的插入大小进行检测，符合预期大小的片段，进行qpcr定量文库的有效浓度(文库有效浓度＞2nm)。用novaseq6000平台进行测序，测序读长为pe150。
73.测序结果组装后，用misa(microsatelliteidentificationtool)通过对unigene序列的分析，筛选得到1kb以上的unigene做ssr分析，鉴定出6种类型的ssr，并利用上下游序列设计ssr标记引物。
74.二、瓜蒌ssr分析
75.2.1rna测序分析
76.测序后，过滤掉低质量数据，共获得24.48百万个有效reads，平均长度300bp，共7.34gb的转录组净数据，错误概率小于1％占96.92％，错误概率小于0.1％的数据占91.91％，说明测序所获得的数据质量高，gc含量为43.90％，如表1所示；
77.表1为测序数据统计表：
78.样品reads数目平均读长q20(％)q30(％)gc(％)n(％)净数据2448116130096.9291.9143.900.00
79.其中：q20(％)：错误概率小于1％的数据百分比；q30(％)：错误概率小于0.1％的数据百分比，n(％)：数据中未知碱基含量。
80.从mrna降解情况，插入片段的离散程度和测序饱和度来看，mrna片段化的随机程度中间的斜率很小，如图1a所示；说明mrna降解程度很低。插入片段主峰落在280-400bp附近，没有偏离目标区域，且峰型较窄，说明插入片段长度离散程度较小，插入片段大小选择正常，如图1b所示；测序数据量与基因数目之间的关系分析表明，当数据量增加到全部数据时，各类表达的基因都达到饱和程度，如图1c所。全部数据进行分析表达时，各类表达的基因数据达到饱和程度，如图1c所。说明rna测序的数据降解少，分布是随机的，并且测序数据表达的基因接近饱和，说明测序的数据质量高。组装共得到91424条转录本和31861条unigene，转录本和unigene的n50分别为2133和2005，组装完整性较高。unigene总长度32.17mb。
81.2.2ssr标记的开发、分布及重复类型和频率特征
82.经misa(microsatelliteidentificationtool)鉴定简单重复序列(ssr)，分为8种类型：串联不嵌入复杂重复、串联嵌入复杂重复、单碱基、双碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基重复ssr。筛选出1kb以上的unigene上的ssr标记，共筛选得到8887个ssr位点，最多的是单碱基重复ssr有4705个，最少的是六碱基重复，仅有15个；
83.在unigene上平均每mb有276.25个ssr标记，如表2和图2a所示。
84.表2为瓜蒌ssr的类型、数量及分布特征：
[0085][0086]
根据ssr标记的上下游序列，用primer3设计相关motifs的ssr标记的引物。
[0087]
2.3扩增结果分析
[0088]
从设计的引物序列中，挑选出64对不同重复数目的ssr标记进行引物设计验证，如表3和4所示。
[0089]
表3为64对ssr标记序列内容：
[0090]
[0091]
[0092]
[0093]
[0094]
[0095][0096]
表4为64对ssr标记及其引物对应内容：
[0097]
[0098][0099]
其分别在皖篓9号和17号上进行扩增筛选，结果表明扩增效果良好，都有条带，如图2b所示，可以用于遗传多样性分析。64对引物在13份瓜蒌dna样品中共扩增出了213个带型，每对引物平均扩增出了3.35个带型。其中gl018、gl040、gl049、gl053、gl059只能扩增出1个带型，引物在13个样品上没有多态性，多态性引物占比92.19％。
[0100]
表5为13个样品信息内容：
[0101][0102][0103]
实施例3：
[0104]
瓜蒌基因组dna提取
[0105]
在瓜蒌苗期，以单株取样，用改良ctab法提取单株dna，具体步骤如下：
[0106]
1.称取1g瓜蒌幼嫩的叶片，置研钵中，经液氮冷冻后研磨成粉末；
[0107]
2.将叶片粉末转移到1.5ml离心管中，加入600μl65℃预热的2
×
ctab提取缓冲液和20μlβ巯基乙醇，轻轻摇匀，使粉末充分散开；
[0108]
其中，ctab提取缓冲液按照每100ml如下比例进行配制：ctab2.0g、tris-hcl(1mph8.0)10ml、edta(0.5mph8.0)10ml、nacl 8.2g、pvp(聚乙烯吡咯烷酮)0.5g、ddh2o 74.4ml；
[0109]
3.置65℃水浴锅中水浴40～60min，间隔晃动数次；
[0110]
4.加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，温和摇匀3min，静置10min；
[0111]
5.室温下10000rpm离心10min；
[0112]
6.取400μl上清至一新离心管中，加入240μl异丙醇，摇匀后放-20℃中静置3h；
[0113]
7.在4℃下，10000rpm离心10min；
[0114]
8.去上清，加入500μlte的te缓冲液溶解30min，加入500μl氯仿/异戊醇(24:1)，温和摇动10min；
[0115]
其中，te缓冲液采用如下比例配制：tris-hcl(1m ph 8.0)10ml、edta(0.5mph8.0)2ml、并用ddh2o定容至1l；
[0116]
9. 4℃，10000rpm离心10min；
[0117]
10.取400μl上清至一新离心管中，加入40μl3mol/lnaac(ph6.8)和2倍体积的无水乙醇，沉淀dna，摇匀后，放-20℃中静置过夜；
[0118]
11. 4℃，10000rpm离心10min，弃上清；
[0119]
12.加入70％的乙醇洗涤1-2次，4℃，10000rpm离心5min，弃上清，超净工作台中吹干；
[0120]
13.加入100μlte，4℃溶解1天，转入-20℃保存备用。
[0121]
实施例3：
[0122]
ssr扩增反应
[0123]
将提取的瓜蒌基因组dna样品进行扩增反应，
[0124]
其中扩增反应配制表如表6所示；
[0125]
表6为扩增反应配制表：
[0126]
模板基因组dna3.0μl上下游引物(2μmol/l)各1.5μl10
×
buffer(100mmol/ltris-hcl,ph8.0，500mmol/lkcl,0.1％gelatin)1.5μlmg
2+
(25mmol/l)0.8μldntp(2.5mmol/l)0.24μltaq酶(5u/μl)0.12μlddh2o补足至10μl
[0127]
其中扩增反应程序为：
[0128]
94℃预变性5min
[0129][0130]
72℃保温10min
[0131]
12℃保存。
[0132]
该发明提出一种高效、便捷、快速鉴定不同基因型瓜蒌的ssr的标记和相关方法，仅仅需要基本的分子生物学仪器设备，灵敏度高，ssr具有共显性，能够鉴别瓜蒌的纯合型和杂合型，具有很高的特异性。本发明对于瓜蒌的品种鉴定、基因分型、亲缘关系分析、遗传多样性分析和基因定位等都有重要意义。
[0133]
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

技术特征：
1.一种瓜蒌ssr分子标记，其特征在于，所述瓜蒌ssr分子标记如gl001-gl064所示的其中任意一种或至少任意两种组成的混合物。2.如权利要求1所述的一种瓜蒌ssr分子标记，其特征在于，所述瓜蒌ssr分子标记用于瓜蒌性质的检测。3.如权利要求1所述的一种瓜蒌ssr分子标记，其特征在于，所述瓜蒌性质包括瓜蒌品种、瓜蒌基因分型、瓜蒌亲缘关系、瓜蒌遗传多样性及瓜蒌基因定位。4.一种瓜蒌ssr分子标记在制备用于检测瓜蒌性质的生物制品中应用，其特征在于，所述生物制品包含权利要求1所述的瓜蒌ssr分子标记。5.如权利要求4所述的一种瓜蒌ssr分子标记在制备用于检测瓜蒌性质的生物制品中应用，其特征在于，所述生物制品包括试剂、试剂盒、芯片。6.一种瓜蒌ssr分子标记在检测瓜蒌性质的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1瓜蒌基因组dna提取：提取待检样品的dna，其中待检样品为已鉴定为瓜蒌或者瓜蒌属的植物；s2ssr扩增反应：提取后的待检样品的dna加入上下游引物进行扩增反应；s3电泳监测：ssr扩增反应后的产物进行非变性丙烯酰胺凝胶电泳检测；s4结果统计分析：依据电泳检测后的条带的位置，判断分子量大小，确定引物的多态性和鉴定相关等位基因。

技术总结
本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种瓜蒌SSR分子标记及其应用，包括一种瓜蒌SSR分子标记，所述瓜蒌SSR分子标记如GL001-GL064所示的其中任意一种或至少任意两种组成的混合物，所述瓜蒌性质包括瓜蒌品种、瓜蒌基因分型、瓜蒌亲缘关系、瓜蒌遗传多样性及瓜蒌基因定位。本发明提出一种高效、便捷、快速鉴定不同基因型瓜蒌的SSR的标记和相关方法，仅仅需要基本的分子生物学仪器设备，灵敏度高，SSR具有共显性，能够鉴别瓜蒌的纯合型和杂合型，具有很高的特异性；对于瓜蒌的品种鉴定、基因分型、亲缘关系分析、遗传多样性分析和基因定位等都有重要意义。有重要意义。有重要意义。


技术研发人员：何庆元 刘丽 徐荣华 李正鹏 朱军军 孙武
受保护的技术使用者：安徽科技学院
技术研发日：2023.07.14
技术公布日：2023/9/20