一种能够促进慢性伤口愈合的敷料的制作方法

1.本发明属于生物材料领域，具体涉及一种载药的复合温敏水凝胶敷料及其促进慢性伤口愈合的应用。


背景技术：

2.糖尿病足是糖尿病最常见、最严重、治疗成本最高的慢性并发症之一，据相关研究统计，在所有糖尿病患者一生之中，高达15％-20％的机率患有糖尿病足。随着病变进展，肢端出现坏疽，足部受压部位出现溃疡，接近30％的患者出现肢体感染，需要截肢治疗。这些慢性创口不仅给患者带来很大伤害，给社会也带来很多负面影响，消耗掉了大量人力、物力和财力。因此，迫切需要研究人员开发安全有效的治疗手段。
3.生物敷料治疗是创口愈合的关键局部治疗手段，普通的敷料在糖尿病足溃疡的治疗中只能作为辅助，因为它一般只能起到清创，保湿和抗菌的作用。随着敷料不断被开发，使得局部治疗逐渐被大众认可。其中，水凝胶因其良好的亲水性、生物相容性和细胞外基质(ecm)等三维(3d)多孔结构，已成为伤口敷料最具竞争力的候选者，关于水凝胶作为伤口敷料的研究也显示了一种增长趋势，特别是在过去十年中。许多亲水性聚合物，包括壳聚糖等天然聚合物，明胶、透明质酸、海藻酸盐和右旋糖以及合成亲水聚合物，如聚(乙二醇)(peg)和poloxamer、聚(乙烯醇)、含烯烃聚合单体，如聚丙烯酰胺(pam)、聚(丙烯酸)和多肽，这些材料可以通过各种化学或物理交联构建水凝胶。然而，这些材料结构简单、功能单一、强度不够、响应性较差不能显著促进慢性伤口愈合。
4.因此，本领域需要提供能够促进糖尿病足等慢性难愈性伤口愈合的敷料。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种能够促进糖尿病足等慢性难愈性伤口愈合的敷料及其应用。
6.本发明第一方面，提供了一种温敏水凝胶敷料，包括:
7.活性成分：β-烟酰胺单核苷酸(nmn)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)，或其组合；和
8.温敏水凝胶基质，
9.其中，所述活性成分分散在所述水凝胶基质中。
10.在另一优选例中，用于形成水凝胶的凝胶剂选自下组：pluronic f127、pluronic f68、壳聚糖(cs)、明胶、透明质酸、海藻酸钠、聚乙二醇，或其组合。
11.在另一优选例中，用于形成水凝胶的凝胶剂包括pluronic f127和pluronic f68。
12.在另一优选例中，用于形成水凝胶的凝胶剂为pluronic f127、pluronic f68和壳聚糖(cs)的组合。
13.在另一优选例中，用于形成水凝胶的凝胶剂中，pluronic f127和pluronic f68的质量之和占凝胶剂总重的90w/w％以上，较佳地，95w/w％以上，如96w/w％以上、97w/w％以上、98w/w％以上、或99w/w％以上。
14.在另一优选例中，在所述敷料中，pluronic f127的含量16-24wt/vol％(wt/vol为g/ml)，较佳地18-22wt/vol％，更佳地19-21wt/vol％。
15.在另一优选例中，在所述敷料中，pluronic f68的含量4-8wt/vol％，较佳地5-7wt/vol％，更佳地4-6wt/vol％。
16.在另一优选例中，在所述敷料中，壳聚糖(cs)的含量为0.05-1wt/vol％，较佳地0.1-0.5wt/vol％，更佳地0.2-0.3wt/vol％。
17.在另一优选例中，在所述敷料中，f127、f68和cs的含量分别20wt/vol％、6wt/vol％和0.2wt/vol％。
18.在另一优选例中，用于形成水凝胶的凝胶剂中，pluronic f127和pluronic f68的质量之和占凝胶剂总重的90w/w％以上，较佳地，95w/w％以上，如96w/w％以上、97w/w％以上、98w/w％以上、99w/w％以上甚至100w/w％。
19.在另一优选例中，在所述敷料中，明胶、透明质酸和海藻酸钠的含量分别为15％wt/vol、0.5wt/vol％和1wt/vol％。
20.在另一优选例中，在所述敷料中，所述活性成分的含量为0.01μg/ml～20mg/ml，较佳地为0.1μg/ml～1mg/ml，较佳地为0.5μg/ml～200μg/ml，如1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、或180μg/ml、300μg/ml、500μg/ml、800μg/ml、2mg/ml或5mg/ml。
21.在另一优选例中，在所述敷料还可以包括一种或多种选自下组的物质：氯化钠、缓冲盐、ph调节剂，色素，保湿剂、防腐剂、或其组合。
22.在另一优选例中，所述水凝胶基质还包括水或水性溶液，较佳地，所述水性溶液为生理盐水、生理缓冲液(如ph为7.35-7.4的pbs溶液、tris-盐酸溶液或磷酸盐缓冲溶液)。
23.在另一优选例中，在所述敷料还可以包括另外的治疗剂，如抗菌剂、消炎剂。
24.在另一优选例中，所述敷料在≤25℃的温度下为液态，较佳地，4-25℃，如5℃、10℃、15℃、或20℃。
25.在另一优选例中，所述敷料在≥30℃为凝胶固态，较佳地，32-38℃，如33℃、34℃、35℃、36℃、37℃或37.5℃。
26.本发明第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的敷料的制备方法，其特征在于，步骤如下：
27.1)提供水或水性溶液；和
28.2)在液态温度下，将凝胶剂和活性成分溶解在所述水或水性溶液中，从而形成液态的敷料。
29.在另一优选例中，所述方法还包括步骤：3)在固态温度下形成固态凝胶敷料。
30.在另一优选例中，所述液态温度和所述固态温度为不同温度。
31.在另一优选例中，所述液态温度≤25℃，较佳地，4-25℃，如5℃、10℃、15℃、或20℃。
32.在另一优选例中，所述固态温度≥30℃，较佳地，32-38℃，如33℃、34℃、35℃、36℃、37℃或37.5℃。
33.在另一优选例中，所述水性溶液选自下组：生理盐水或生理缓冲溶液(如ph为7.35-7.4的pbs溶液、tris-盐酸溶液或磷酸盐缓冲溶液)。
34.本发明第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述的敷料在制备促进伤口愈合的药物或医疗器械中的用途。
35.在另一优选例中，所述药物或医疗器械具有一种或多种选自下组的用途：
36.促进细胞增殖和/或迁移；
37.促进血管生成；
38.抗氧化作用；
39.抗炎；
40.和/或
41.修复皮肤和/或粘膜损伤。较佳地，通过上述功能，从而促进伤口愈合。
42.在另一优选例中，所述伤口为慢性(难愈性)伤口，如糖尿病足溃疡、静脉性溃疡、压疮、瘘及窦道等皮肤损伤或者粘膜损伤。
43.在另一优选例中，所述医疗器械还包括负载或固定所述水凝胶的固相载体，如医用纱布、棉签、棉球、棉垫、胶布、塑料贴纸等。
44.本发明第四方面，提供了一种促进伤口愈合的方法，所述方法包括步骤：将本发明第一方面所述的温敏水凝胶敷料，在液态下注射或敷凃在伤口上，从而促进所述伤口愈合。
45.在另一优选例中，所述伤口为慢性(难愈性)伤口，如糖尿病足溃疡、静脉性溃疡、压疮、瘘及窦道等皮肤损伤或者粘膜损伤。
46.在另一优选例中，所述伤口为人或其他哺乳动物(如大鼠、小鼠)的伤口。
47.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
48.为了更清楚地说明本技术的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的每一幅附图针对本技术的部分实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
49.图1：复合水凝胶各成分的优化配比
50.图2：复合水凝胶在扫描电镜下的微观形貌(从左到右依次放大150倍，250倍，2500倍)
51.图3：复合水凝胶的温敏性
52.图4：温敏水凝胶对nmn的缓释趋势图
53.图5：菌落数反映f127/f68/cs温敏水凝胶在不同浓度cs下的抑菌效果
54.图6：复合水凝胶对细胞存活率的影响(左为hacat细胞，右为ea.hy 926细胞)
55.图7：温敏水凝胶的溶血情况
56.图8：载nmn温敏水凝胶在大鼠皮下的刺激反应
57.图9：载不同浓度的nmn复合水凝胶对细胞活性的影响
58.图10：载不同浓度的nmn复合水凝胶对hacat细胞迁移能力的影响
59.图11：载不同浓度的nmn水凝胶对血管生成的影响
60.图12:载不同浓度的nmn水凝胶对细胞氧化的影响
61.图13:各组糖尿病小鼠皮肤全层打孔敷药后1d,4d,7d,10d,14d,18d和21d的愈合情况
62.图14:各组糖尿病小鼠打孔敷药后第10天的伤口组织he染色分析
63.图15:各组糖尿病小鼠打孔敷药后第10天的伤口组织vegf/tgf-β1的表达情况。
具体实施方式
64.本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了一种负载有nmn或nad+的温敏水凝胶敷料及其应用。本发明人意外的发现，所述敷料具有从多方面性能都非常适合用于促进糖尿病足等慢性伤口愈合的优异技术效果。在此基础上完成了本发明。
65.术语
66.除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
67.如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
68.如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由
…
构成”、或“由
…
构成”。
69.如本文所用，术语“室温”或“常温”是指温度为10-30℃，较佳地，25
±
5℃。
70.活性成分
71.所述的β-烟酰胺单核苷酸(beta-nicotinamide mononucleotide，nmn)，化学式:c
11h15
n2o8p；nmn是辅酶i的合成底物，同时nmn也被用于抗衰老研究。
72.所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(beta-nicotinamide adenine dinucleotide trihydrate，nad+)，别名辅酶ⅰ，化学式c
21h27
n7o
14
p2；nad+参与细胞物质代谢、能量合成、细胞dna修复等多种生理活动，对机体免疫能力有重要作用。
73.本发明首次将上述活性成分负载在水凝胶中形成医用敷料，意外地，所述敷料能够促进慢性伤口的愈合。
74.温敏水凝胶
75.本发明中应用的水凝胶是温度敏感型凝胶(简称温敏水凝胶或温敏凝胶)，是一种温度响应型的原位凝胶,其状态与温度密切相关,在室温使用时为可流动的溶胶状态，方便医务人员给药操作，可注射或涂布至创面后，在体温作用下通过物理交联，可实现凝胶-溶胶的原位转变，以不可流动的凝胶状态覆盖创面，并具有较好的黏附性，给药后可缓慢释放包载的药物，维持药效。其原位温敏成胶方式可更加充分填充不规则的创面，实现凝胶与伤口缺损形状的完美匹配。
76.在另一优选例中，用于形成水凝胶的凝胶剂选自下组：pluronic f127、pluronic f68、壳聚糖(cs)、明胶、透明质酸、海藻酸钠、聚乙二醇，或者组合。
77.特别地，本发明水凝胶是基于pluronic f127、pluronic f68和壳聚糖(cs)的组合所形成的温敏水凝胶。
78.如本文所用，pluronic f127或f127为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，化学式：ho(c2h4o)m·
(c3h6o)n·
h(average mn:12600)，主要作增稠剂和胶体成形剂，缓释材料，用
作粘合剂、包衣材料等以制备片剂、胶囊剂、凝胶剂等，所述pluronic f127可通过商业购得。
79.如本文所用，pluronic f68或f68为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，化学式：ho(c2h4o)m·
(c3h6o)n·
h(average mn:8400)，是水包油合成乳化剂之一，物理性质稳定，能够耐受热压和低温冰冻，所述pluronic f68可通过商业购得。
80.如本文所用，壳聚糖(cs)为甲壳素n-脱乙酰基的产物，化学式：(c6h
11
no4)
·
n，具有广谱抗菌、生物降解性、生物相容性、无毒性、抗癌、降脂、增强免疫等多种生理功能。壳聚糖可以作为凝胶剂形成凝胶，但本发明中主要利用其抗菌性能，基本不影响水凝胶的温敏等性质。
81.如本文所用，明胶为一种由动物的结缔组织提取的蛋白质，主要成分是胶原蛋白，化学式：c6h9o4(x)n，可以用于制作食品、药品、化妆品、胶原蛋白贴片等。
82.如本文所用，透明质酸为天然存在于人体中的多糖类物质，也被称为玻璃质酸，化学式：(c
14h21
no
11
)n，广泛用于医疗美容领域，作为填充剂来填充面部皮肤的皱纹和凹陷部位，具有很好的保湿和润滑作用。
83.如本文所用，海藻酸钠是从褐藻等海藻的细胞壁中提取的一种多糖类物质，化学式：nac6h7o6，常用作增稠、乳化、稳定等功能性添加剂，生产医用敷料、人工血管。
84.特别地，本发明提供的，基于f127、f68和cs的混合水凝胶具有温敏性和缓释作用，在低温条件下为液态，在体温条件下为凝胶固态，使用方便，在接触伤口后迅速成为凝胶固态，并在伤口环境中可以缓慢释放所载的药物。而且f127、f68和cs所组成的混合水凝胶具有生物相容性，对细胞活性没有不利影响，对皮肤无刺激性，不会出现溶血现象，非常适合作为医用敷料。
85.敷料
86.提供了一种温敏水凝胶敷料，其特征在于，包括:
87.活性成分：β-烟酰胺单核苷酸(nmn)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)，或其组合；和水凝胶基质，其中，所述活性成分分散在所述水凝胶基质中。
88.优选地，所述水凝胶基质为上述的温敏水凝胶。
89.优选地，本发明的敷料在接触伤口前优选是液态(在液态温度(如4-25℃)下保存或操作)。接触伤口后，在室温或体温(如34-40℃)下，转变为凝胶固态，并缓慢释放活性成分。
90.制备方法
91.本发明提供了一种所述温敏水凝胶的制备方法，步骤如下：
92.1)提供水或水性溶液；和
93.2)在液态温度下，将凝胶剂和活性成分溶解在所述水或水性溶液中，从而形成液态的敷料。
94.在另一优选例中，所述方法还包括步骤：3)在固态温度下形成固态凝胶敷料。
95.在另一优选例中，所述液态温度和所述固态温度为不同温度。
96.在另一优选例中，所述液态温度≤25℃，较佳地，4-25℃，如5℃、10℃、15℃、或20℃。
97.在另一优选例中，所述固态温度≥30℃，较佳地，32-38℃，如33℃、34℃、35℃、36
℃、37℃或37.5℃。
98.在另一优选例中，所述水性溶液选自下组：生理盐水或生理缓冲溶液(如ph为7.35-7.4的pbs溶液、tris-盐酸溶液或磷酸盐缓冲溶液)。
99.用途
100.本发明提供了所述的敷料在制备促进伤口愈合的药物或医疗器械中的用途。
101.本发明中，伤口是指受伤破裂的地方，多指人或其他动物的皮肤、肌肉、黏膜等而言。伤口根据愈合时间通常可以分为急性伤口以及慢性伤口。急性伤口主要是指突然性的损伤(如损伤后7天之内的伤口)，例如擦伤、磨伤、划伤、刺伤等；慢性伤口(即难愈性伤口)指各种原因导致急性创面不能按机体正常生理机制愈合，导致伤口迁延不愈，一般从医学角度认为超过一个月无法愈合的伤口，称为慢性伤口或难愈性伤口。导致慢性伤口的原因包括(但并不限于)：由压力原因引起的损伤(如褥疮)、静脉曲张或动脉供血不足引起的溃疡、糖尿病溃疡等；或由皮肤软组织感染、血管性炎症、结缔组织病、肿瘤等各种疾病引起的非典型伤口；经长期射线照射导致创口组织坏死感染，预后较差的伤口等。
102.优选地，所述的伤口可以是(但并不限于)：由创伤性溃疡引起的慢性难愈性伤口、压力性溃疡(如压疮)引起的慢性难愈性伤口，和动脉性溃疡(如糖尿病溃疡)引起的慢性难愈性伤口、静脉性溃疡、压疮、瘘及窦道等皮肤损伤或者粘膜损伤。
103.在另一优选例中，所述的难愈性伤口修复/愈合包括提高伤口愈合率和/或缩短伤口愈合时间已达到解剖和功能上完整状态，例如，与不使用本发明的敷料或不含本发明的活性成分的敷料相比，使用本发明的敷料的伤口的愈合率提高了和/或愈合时间缩短了10％、20％、50％甚至100％；或者本发明的敷料修复了其他常规修复创伤的药物无法修复的伤口。
104.实验证明，本发明的敷料或其所制备的药物或医疗器械具有下述用途：促进细胞增殖和/或迁移；促进血管生成；抗氧化作用；抗炎；和/或修复皮肤和/或粘膜损伤。通过上述多方面的活性和功能，可以非常有利的促进伤口愈合。
105.在另一优选例中，所述医疗器械还包括负载或固定所述水凝胶的固相载体，如医用纱布、棉签、棉球、棉垫、胶布、塑料贴纸等。
106.本发明还提供了一种促进伤口愈合的方法，所述方法包括步骤：将本发明第一方面所述的温敏水凝胶敷料，在液态下注射或敷凃在伤口上，从而促进所述伤口愈合。
107.本发明的有益效果
108.温敏水凝胶体系缓释效果：温敏水凝胶体系(f127/f68/cs)对nmn具有缓释效果，可作为负载该药物的敷料，将其缓慢释放作用于伤口，实现nmn的控制释放。在24h前，释放速度较快，累积释放量可到73.1％，在24h后，释放速度放缓，在48h时，累积释放量可达96.9％。
109.温敏水凝胶体系抗菌作用：金黄色葡萄球菌(s.aureus)和大肠杆菌(e.coli)是伤口感染的两种典型病原菌。随着水凝胶中壳聚糖分子质量的增大，平板上的菌落数越少，表现出明显的抑制作用，温敏水凝胶体系抗菌作用：对金黄色葡萄球菌的抑制率是30％～82％，对大肠杆菌的抑制率是19％～70％。
110.温敏水凝胶体系生物相容性：这种水凝胶被用作糖尿病足溃疡的敷料，敷料是要被敷在创口处，会直接接触损伤的血管，裸露的皮肤组织和再增殖的细胞等。溶血实验可以
证明该敷料不会影响创口处的血管恢复。细胞毒性实验可以证明该敷料不会对伤口愈合相关的细胞有毒副作用，不会影响细胞的增殖，创口的修复。体内皮内刺激实验可以证明该敷料不是生物体过敏源，不会使机体发生过敏反应。这些实验均可证明该温敏水凝胶具有良好的生物相容性，符合临床材料的生物安全性要求。
111.负载nmn温敏水凝胶体具有促进细胞增殖、迁移、血管生成、抗氧化和抗炎作用：负载nmn温敏水凝胶体不但没有影响角质形成细胞、静脉内皮细胞的细胞活力，并且可以显著提高细胞活力，与24h所测得的细胞活力相比，48h的细胞活力提高的更为显著，这在一定程度上表明一定浓度的nmn在一定条件下可以提高细胞活力，促进细胞增殖；nmn还可以显著增强细胞的迁移能力，最高浓度nmn组的细胞迁移速度接近对照组的两倍；nmn还可以有效地促进血管生成，实验组中镜下可以观察到较多的管状结构，生成较多血管，其新生血管数量可达对照组中的3.5倍。h2o2存在的情况下，细胞产生大量的ros，细胞损伤凋亡，活力下降，加入nmn后，ros水平降低，细胞活力提高，所得结果与典型的抗氧化剂vc相近，可以说明载nmn温敏水凝胶具有一定的抗氧化性能。nmn还具有抗炎作用，结果显示，nmn可显著抑制脂多糖(lps)诱导的单核巨噬细胞(thp-1)炎症模型中tnf-α、il-6和il-1β等炎性因子的过度分泌，发挥抗炎作用。
112.负载nmn温敏水凝胶体在糖尿病小鼠皮肤伤口有明显的促进伤口愈合的作用：一次在糖尿病小鼠模型皮肤全层打孔敷药后，实验组的相对伤口面积明显小于阴性对照组的，高剂量实验组的相对伤口面积明显小于上市药物阳性对照组，且差异有统计学意义，证明了载nmn温敏水凝胶敷料有明显的促进伤口愈合的作用，从伤口面积和愈合时间的比较都可以直观地说明其药效，在组织学分析中，又进一步从微观的角度说明该敷料对伤口愈合的促进作用。
113.下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按质量/体积百分比计算。
114.实施例1
115.敷料的制备筛选方法，包括如下步骤：
116.1.生理盐水的制备：称取0.45g的氯化钠粉末，用50ml的蒸馏水溶解，得到0.9％的氯化钠溶液。
117.2.温敏水凝胶的溶解：采用低温溶解法制备温敏水凝胶，在精密的电子天平上称取f127、f68和cs，分别置于三个50ml离心管中，加入适量生理盐水，使固液充分接触，之后放于4℃静置，3～5天后完全溶解，得到澄清的凝胶溶液，再用生理盐水定容到指定体积，较高浓度的f127、f68和cs放于4℃冰箱备用。
118.3.以胶凝温度(tm)为指标(纵坐标)，以f127和f68的质量分数为可变影响因素(横坐标)，将不同质量分数的f127和f68混合在1.5ml离心管中，再将离心管放到37℃恒温水浴锅，观察记录成胶温度和时间，以离心管倒置时液体在1min内不再流动为成胶。根据前期单因素实验结果，f127的取值为16％、18％、20％、22％和24％，f68的取值为2％、4％、6％和8％，两组取值两两搭配，分别测定并记录成胶温度和时间。每份样品重复测3次，结果取平均值。
119.4.成胶温度的测定：成胶温度是指温敏水凝胶由液态转变为半固态时的相转变温度。采用离心管倒置法测定成胶温度，从4℃冰箱中取出已配置好的质量分数梯度的温敏水凝胶溶液，每个梯度1ml于1.5ml离心管中，将离心管完全置于恒温水浴锅中，保证水凝胶液面低于水浴锅液面3cm。水浴锅的初始温度为20℃，设置温度为60℃，温度持续升高。即时温度计插入水浴锅液面下，实时检测温度，同时观察离心管内水凝胶的流动情况。当离心管内的水凝胶不再流动并能保持1min，记录此刻对应的温度计上的温度，记为成胶温度。每份样品重复测3次，结果取平均值。
120.5.成胶时间的测定：成胶时间是指温敏水凝胶由液态转变为半固态所需要的时间。采用离心管倒置法测定成胶时间，从4℃冰箱中取出已配置好的质量分数梯度的温敏水凝胶溶液，每个梯度1ml于1.5ml离心管中，将离心管完全置于恒温水浴锅中，保证水凝胶液面低于水浴锅液面3cm。水浴锅的温度为34℃，含水凝胶的离心管进入水浴锅时开始计时，根据情况每隔若干秒将离心管倒置，观察离心管中水凝胶的流动情况。当离心管内的水凝胶不再流动并能保持1min，记录此刻对应的计时器上的时间，记为成胶时间。每份样品重复测3次，结果取平均值。
121.6.在f127/f68/cs的混合水凝胶中加入nmn。
122.实施例2.复合水凝胶各成分的优化配比
123.采用低温溶解法制备复合水凝胶，分别溶解f127、f68和cs，各自溶解完全后按照比例混合。如表1和表2所示，随着f127浓度的增加，凝胶的初始凝胶化温度降低。f68和f127的浓度越大，成胶时间越短。由于皮肤给药温度在34℃左右，因此，f127的浓度为20％，f68的浓度为4％-6％，为了成胶时间较短，使用方便，f68的浓度为6％，且该复合水凝胶在温度为32℃～37℃范围内为凝胶态，物理状态稳定不变。在f127/f68浓度一定，加入不同量壳聚糖(0.2，0.4，0.8％)后，随着壳聚糖浓度的增加，成凝胶时间也逐渐减小，但在壳聚糖低浓度(0.2％)时对温敏性未见明显影响，再结合壳聚糖的抑菌性以及对细胞毒性的影响，确定了壳聚糖浓度，即0.2％。综上，f127/f68/cs三者所优化配比为(20/6/0.2wt/vol％)，制备的复合水凝胶符合皮肤给药温度，且成胶时间较短，使用方便(结果见图1)。
124.表1不同浓度配比的f127/f68的成胶温度
[0125][0126]
表2不同浓度配比的f127/f68在34℃条件下的成胶时间
[0127][0128]
实施例3.复合水凝胶在扫描电镜下的微观形貌
[0129]
取10ml已配置好的复合水凝胶放置-80℃预冷2h，冷冻干燥，喷金，扫描电镜拍照。结果显示，在扫描电子显微镜下观察到复合水凝胶敷料是三维网状结构，呈多孔，具有良好的孔隙性，孔径大约为20μm，可负载和控释药物(结果见图2，从左到右依次放大150倍，250倍，2500倍)。
[0130]
实施例4.复合水凝胶f127/f68/cs(20/6/0.2wt/vol％)的温敏性
[0131]
复合水凝胶在特定的温度会发生相变，在较低温度下的液态转变为较高温度下的固态，也可以由固态转变为液态，随着温度可逆的相变。在25℃下呈液态，倾斜离心管，拍照。在37℃呈固态，倒置离心管，拍照。结果显示，在25℃下呈液态，倾斜离心管，流动性较好，液面发生变化，呈水平，质地均匀，无色透明。在37℃呈固态，倒置离心管，液面不发生变化，没有流动性，且维持1分钟以上(结果见图3)。而且本发明的水凝胶体系形成凝胶之前是黏性溶液，形成固态水凝胶之后具有良好的黏弹性，敷料可以更好的附着于伤口，减轻外力对伤口的影响。
[0132]
实施例5.复合温敏水凝胶f127/f68/cs(20/6/0.2wt/vol％)载nmn的缓释实验
[0133]
在紫外分光光度计的235nm的检测波长下，检测不同绝对浓度的nmn所测得的相对浓度值，确定绝对浓度和相对浓度的关系。将nmn(1mg/ml)放入载体温敏水凝胶(f127/f68/cs)中，4℃混匀后形成载nmn复合水凝胶体系，放置34℃恒温箱中，24h后载nmn温敏水凝胶呈固体状，加入1ml生理盐水，将载bsa的温敏水凝胶浸泡在生理盐水中，一起放置34℃，100rpm的摇床上。在预定的时间点(0h,4h,8h,12h,24h,36h,48h)收集上清液，并用新鲜的生理盐水替换，使该系统保持一个恒定的体积。实验重复进行三次，按时间点收集到的上清液在紫外分光光度仪上，235nm的检测波长，测其中nmn的浓度，并用公式计算累积释放量：释放量＝(释放nmn的质量/投放nmn的质量)
×
100％。结果显示：在24h前，释放速度较快，累积释放量可到73.1％，在24h后，释放速度放缓，在48h时，累积释放量可达96.9％，说明该温敏水凝胶体系(f127/f68/cs)对nmn具有缓释效果，可作为负载该药物的敷料，将其缓慢释放作用于伤口，实现nmn的控制释放(结果见图4)。
[0134]
实施例6.复合温敏水凝胶的抗菌性能测试
[0135]
细菌培养：从-80℃冰箱中取出冻存的金黄色葡萄球菌(s.aureus)和大肠杆菌(e.coli),快速放进37℃水浴锅中晃动解冻，待菌液融化后，在两种菌液中各取100μl转移至装有5ml液体培养基的摇菌管中，吹打均匀，放置恒温振荡器中，37℃，220r/min，振荡培养18h，细菌扩大培养进入对数生长期。抗菌率的测定：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌经过扩大培养，从两种菌液中各吸取80μl,再各加入20μl温敏水凝胶f127/f68/cs(20/6/0.1-1wt/
vol％)，100μl体系的菌液水凝胶混合物充分混匀，金黄色葡萄球菌水凝胶混合液滴加到bhis培养基平板上，大肠杆菌水凝胶混合液滴加到lb培养基平板上，放置37℃恒温培养箱，12h后，观察平板并记录菌落数。抑菌率＝1-(加水凝胶平板菌落数/不加水凝胶平板菌落数)
×
100％。结果显示，随着水凝胶中壳聚糖分子质量的增大，平板上的菌落数越少，表现出明显的抑制作用。对金黄色葡萄球菌的抑制率是30％～82％，对大肠杆菌的抑制率是19％～70％(结果见图5)。
[0136]
实施例7.温敏水凝胶f127/f68/cs(20/6/0.2wt/vol％)对细胞存活率的影响
[0137]
采用cck-8法同时在ea.hy.926和hacat两株细胞上验证，首先配制含水凝胶20％，1％和0.5％的细胞培养基，ea.hy926细胞使用dmem培养基培养，hacat细胞使用mem培养基培养，分别配制。两株细胞分别胰酶消化，离心收集对数生长期中的细胞，调整细胞浓度为105个细胞/ml,在96孔板中每孔铺100μl的细胞液，即每孔104个细胞，置于co2浓度为5％，37℃培养箱中，12h后细胞贴壁，将每孔里的旧培养基丢弃，加入100μl提前配制好的含有水凝胶的培养基，与细胞一起孵育24h、48h和72h三个时间点后，吸掉培养基，向每孔中加入含有10％cc-k8的完全培养基，放置37℃，孵育2h，在酶标仪上波长450nm条件下测定细胞的吸光度值，计算细胞相对增殖率(rgr)，每组分别有3个复孔。细胞相对增殖率＝(实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)
×
100％。结果显示，对于hacat细胞或对于ea.hy926细胞，不同时间下不同浓度的水凝胶组与非凝胶组细胞吸收光度值无显著差异。两种不同细胞同时证明该温敏水凝胶对细胞没有毒性，具有良好的生物相容性(结果见图6)。
[0138]
实施例8.温敏水凝胶f127/f68/cs(20/6/0.2wt/vol％)溶血相容性实验
[0139]
在大鼠身上通过眼眶取血，用edta抗凝管接取新鲜血液，放置离心机中，2000rpm，5min，离心后血液分层，弃去中上层的白细胞和血浆，再加入生理盐水清洗3次，每次离心弃去上清溶液，直至上清液不是红色为止，得到沉淀就是红细胞，取2ml的所得红细胞，加入98ml的生理盐水，配制成2％的红细胞悬液。取三支1.5ml ep离心管，一支离心管中加入0.5ml 2％红细胞悬液，0.5ml生理盐水，作为阴性对照组；一支离心管中加入0.5ml 2％红细胞悬液，0.5ml温敏水凝胶，作为实验组；一支离心管中加入0.5ml 2％红细胞悬液，0.5ml蒸馏水，作为阳性对照组。混匀后，置于37℃的恒温水浴锅中进行温浴，在1h，24h后观察记录各管的溶血情况，拍照后，置于离心机中，在常温下2000rpm离心5min，取上清液，使用分光光度计在545nm波长条件下检测吸光度值，求溶血率，本实验重复做三次，取平均值。溶血率＝(实验组的吸光度值/阳性对照组的吸光度值)
×
100％。结果显示，复合温敏水凝胶实验组和其阴性对照组(生理盐水)，阳性对照组(牛血清蛋白)在1h和24h时呈现的状态，阴性对照组上清清澈透明，没有变红变浑浊，而阳性对照组的溶液已发生溶血现象，整体均匀变红变浑浊。此外复合水凝胶实验组和阴性对照组的溶血率均不到2％，没有导致溶血现象，具有良好的血液相容性(结果见图7)。
[0140]
实施例9.载nmn温敏水凝胶f127/f68/cs(20/6/0.2wt/vol％)皮内刺激实验
[0141]
选取sd大鼠作为实验对象，将背部脊柱两侧作为注射位点，首先将注射区域剃毛，再用脱毛膏脱毛，暴露背部皮肤，保证皮肤无水肿，红斑等情况。实验组注射0.2ml载nmn温敏水凝胶(0.04mg/只、0.4mg/只、2mg/只)，有三组，阴性对照组注射0.2ml无菌生理盐水，分别于注射后0h，24h，48h观察背部注射位点的状态，准确记录水肿和红斑情况，并拍照。结果显示，大鼠背部没有出现明显的红斑水肿或其他状况(结果见图8)，显示出载nmn温敏水凝
胶安全性。
[0142]
实施例10.载nmn温敏水凝胶f127/f68/cs(20/6/0.2wt/vol％)对ea.hy926/hacat的细胞增殖试验
[0143]
从培养箱中取出ea.hy926或hacat细胞，清洗消化，计数，将细胞定量转移到96孔板中，每个孔加104个细胞，每组有3个平行孔。铺板24h后，细胞都贴到孔底，去掉上清液，换成含有不同浓度nmn(0、500ng/ml、10μg/ml、200μg/ml)和1μg/ml pdgf的完全培养基，放置37℃、5％ co2的培养箱中进行培养。培养24h和48h两个时间点后，吸掉培养基，向每孔中加入含有10％ cc-k8的完全培养基，放置37℃，孵育2h，在酶标仪上波长450nm条件下测定细胞的吸光度值，计算细胞相对增殖率(rgr)。细胞相对增殖率(rgr)＝(实验组的吸光度值/对照组的吸光度值)
×
100％。结果显示，与对照组相比，nmn不但没有影响两种细胞的细胞活力，并且可以显著提高细胞活力，与24h所测得的细胞活力相比，48h的细胞活力提高的更为显著，这在一定程度上表明一定浓度的nmn在一定条件下可以提高细胞活力，促进细胞增殖(结果见图9)。
[0144]
实施例11.载nmn温敏水凝胶f127/f68/cs(20/6/0.2wt/vol％)对hacat的细胞迁移试验
[0145]
取一个新的六孔板，在其外底部用直尺比着，用签字笔画线，使每个孔底部可以看到两条平行的直线，然后在这个六孔板中每孔接种106个hacat细胞，放置37℃、5％ co2的培养箱中进行培养24h，直至细胞全部贴至板底且长到了适宜的密度，使用200μl移液枪的枪头对hacat细胞进行划痕，这个划痕与外底部的画线垂直，使用pbs溶液清洗细胞两次，直至划痕脱离掉的细胞被清洗干净，之后分别加入含有500ng/ml、10μg/ml和200μg/ml nmn的mem完全培养基(含2％fbs)以及不加nmn的mem完全培养基(含2％fbs)，放置37℃、5％co2的培养箱中进行培养，分别在0h,12h,24h和48h的时间点在显微镜下观察划痕处细胞的迁移情况，并拍照，计算划痕孔隙处的面积，用image j进行数据分析。结果显示，相同时间内随着nmn浓度的增加，孔隙面积越小，细胞的迁移能力越强，与对照组相比，最高浓度的nmn组表现出最佳的细胞迁移性能，nmn可以显著增强细胞的迁移能力，最高浓度nmn组的细胞迁移速度接近对照组的两倍(结果见图10)。
[0146]
实施例12.载nmn温敏水凝胶f127/f68/cs(20/6/0.2wt/vol％)成血管性能评估
[0147]
血管生成实验使用matrigengel基底膜基质完成。实验前一天将matrigengel基质胶放入冰盒中，放入4℃冰箱，使胶过夜缓慢融化，提前将96孔板和枪头预冷，准备两个预冷1.5ml离心管用于稀释matrigengel，按照2:1的比例用mem培养基稀释matrigengel，在每孔中垂直于内孔正上方加入50μl稀释好的matrigengel，轻轻晃动96孔板，使底部铺胶均匀，避免产生气泡，放置37℃培养箱中45min-1h。当ea.hy.926细胞长满80％左右时，消化，用不含和含500ng/ml、10μg/ml和200μg/mlnmn的无血清dmem培养基，重悬，计数，每孔加入50μl重悬的细胞液，且浓度为30000个细胞/孔，每组重复三孔。放置37℃、5％ co2的培养箱中进行培养孵育，分别在12h和24h的时间点在显微镜下观察形成的血管条数，拍照，用image j软件对形成的血管条数进行计数统计和数据分析。结果显示，不加nmn的对照组中，新生血管数量较少，12h时几乎观察不到明显的新生血管，而在含nmn的实验组中，可以观察到有较多的新生血管，尤其在200μg/mlnmn高剂量组中，镜下可以观察到较多的管状结构，生成较多血管，其新生血管数量可达对照组中的3.5倍(结果见图11)。
[0148]
实施例13.载nmn温敏水凝胶f127/f68/cs(20/6/0.2wt/vol％)的抗氧化性能检测
[0149]
根据绘制出的hacat细胞存活率随过氧化氢浓度变化的趋势图(图12a)，得到过氧化氢对hacat细胞的半数致死量。取hacat细胞，以每孔104个细胞铺到96孔板中，放置37℃、5％ co2的培养箱中进行培养24h，直至细胞贴到板底，弃掉孔中的旧mem完全培养基，加入含半数致死量相同浓度过氧化氢的mem培养基，分别再加入0，0.5μg/ml，10μg/ml和200μg/mlnmn，10μg/ml维生素c，每个孔里的体系为100μl。不加过氧化氢和nmn的细胞组为空白对照组，加过氧化氢不加nmn的细胞组为阴性对照组，加过氧化氢和维生素c的细胞组为阳性对照组，其余为不同浓度的实验组，各组设置3个平行孔。放置37℃、5％ co2的培养箱中进行培养12h后，通过cck-8实验，在酶标仪450nm条件下检测吸光度值。以阴性对照组为100％，实验组和阳性对照组各组分别与阴性对照组比较，得出细胞相对存活率。结果显示，不含nmn对照组中的平均细胞活力是47.16％，在含nmn的实验组中，nmn的浓度越高，其细胞活力越高，200μg/ml nmn的高剂量组的平均细胞活力可达77.71％(结果见图12b)。
[0150]
实施例14.载nmn温敏水凝胶f127/f68/cs(20/6/0.2wt/vol％)3处理糖尿病小鼠皮肤伤口
[0151]
糖尿病小鼠模型的血糖稳定保持两周后，对小鼠进行麻醉，将麻醉后的小鼠背部朝上放置，用电动剃毛器将背部区域的毛发剔除，然后再在该区域用脱毛膏进一步脱毛，消毒。先用打孔器在小鼠背部按压打孔，再用无菌手术剪沿着小鼠背部打孔打出的圆形痕迹剪出直径为1.0cm的圆形创口，将此区域的全层皮肤组织切除。之后，每组小鼠的创口处添加不同的敷料，加生理盐水为空白阴性对照组，加不含nmn的温敏水凝胶为水凝胶对照组，加含nmn的温敏水凝胶(3个浓度：0.5μg/ml,10μg/ml和200μg/ml)为实验组，单独nmn(10μg/ml)的不含温敏水凝胶组，加扶济复(国药准字s20020023，北京双鹭药业)为阳性对照组，加入敷料后使用3m创伤贴包裹创面，每组6只，分笼饲养，按照规定时间观察，拍照，测量，记录，并计算创口面积，在第10天时，每组随机取1只小鼠，取其创口处及其周围组织，一分为二，一份用于做组织学分析，另一份用于做qpcr检测。表3结果显示，在第4天时，空白阴性对照组的伤势几乎没有变化，伤口仍保持原有形状，而高中剂量实验组的伤口面积已经有缩小趋势，伤口形状已经发生变化；在第7天时实验组的平均相对伤口面积是初始值的59.74％，而空白阴性对照组为85.04％。在第14天时，高剂量实验组的创面已全部愈合，而阳性对照组在第14天时基本愈合，空白阴性对照组的伤口在第21天时基本愈合(结果见图13)。显示出载nmn温敏水凝胶加速促进慢性伤口愈合作用。
[0152]
表3各组糖尿病小鼠打孔敷药后在1d，4d，7d，10d，14d，18d和21d的伤口相对面积
[0153][0154]
所有实验结果都是6只糖尿病小鼠结果得到的平均值，误差线代表标准偏差，通过t检验检测统计学差异性，空白阴性对照组与其他各组比较，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001；上市药阳性对照组与高剂量实验组，中剂量实验组比较，#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001；(n＝6)。
[0155]
实施例15.皮肤创伤组织切片he染色
[0156]
为了进一步评估糖尿病小鼠的伤口愈合，对其进行了组织学分析。从图中可以看出与上市药物阳性对照组相比，高剂量组实验组和中剂量实验组的愈合程度更为明显，其新生肉芽组织的表皮结构完整连续，高剂量实验组的表皮层厚度约为68.13μm空白阴性对照未形成汇合的表皮层(结果见图14)。
[0157]
实施例16.皮肤创伤组织的vegf、tgf-β1的表达
[0158]
tgf-β1和vegf是伤口愈合过程中的两种重要生长因子。为了进一步探究载nmn温敏水凝胶促进伤口愈合的机制，我们检测了各组伤口部位皮肤组织中tgf-β1和vegf的相对表达情况。造模敷药后的第10天，对各组小鼠伤口部位的皮肤组织结构进行qpcr检测。结果显示，实验组的vegf和tgf-β1mrna表达量均有上调，有统计学差异(结果见图15)。
[0159]
讨论
[0160]
烟酰胺单核苷酸(nmn)是一种生物活性核苷酸，是nad+生物合成的中间产物，来源广泛，储量丰富，nmn在现代疗法中打开一个新的视野，在几种临床前疾病模型中表现出许多有效的药理活性，包括心肌、脑缺血、阿尔茨海默氏病等神经退行性疾病。β-nmn是生成nad+的关键前体物质，其功能通过nad+体现，具有抗氧化、减少氧化应激的作用，特别是在抗衰老方面作用明显。
[0161]
本技术制备了一种载nmn的复合温敏水凝胶敷料，意外地发现其可以促进糖尿病足溃疡等慢性伤口的愈合。
[0162]
特别的本发明提供了以泊洛沙姆pluronic f127和pluronic f68为基体，添加壳聚糖(cs)作为抑菌材料，制备出一种温敏复合水凝胶(f127/f68/cs)，该温敏复合水凝胶具有结构稳定、固液相变适宜、疏松多孔和缓释性能，以及具有粘附性、良好的抗菌性和生物相容性等特点；进一步制备负载nmn的温敏复合水凝胶，具有促进细胞增殖和迁移、血管生成、抗氧化及抗炎性能，并在体内外验证了其具有良好的生物相容性和加速促进糖尿病小鼠模型伤口愈合的作用。
[0163]
以上所述的实施例仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本技术公开的技术范围内，可以不通过创造性劳动即能够联想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应以本技术中权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.一种温敏水凝胶敷料，其特征在于，包括:活性成分：β-烟酰胺单核苷酸(nmn)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)，或其组合；和温敏水凝胶基质，其中，所述活性成分分散在所述水凝胶基质中。2.如权利要求1所述的敷料，其特征在于，用于形成水凝胶的凝胶剂选自下组：pluronic f127、pluronic f68、壳聚糖(cs)、明胶、透明质酸、海藻酸钠、聚乙二醇，或其组合。3.如权利要求1所述的敷料，其特征在于，用于形成水凝胶的凝胶剂包括pluronic f127和pluronic f68。4.如权利要求1所述的敷料，其特征在于，用于形成水凝胶的凝胶剂为pluronic f127、pluronic f68和壳聚糖(cs)的组合。5.如权利要求1所述的敷料，其特征在于，在所述敷料中，所述pluronic f127的含量16-24wt/vol％，较佳地18-22wt/vol％，更佳地19-21wt/vol％。6.如权利要求1所述的敷料，其特征在于，在所述敷料中，所述pluronic f68的含量4-8wt/vol％，较佳地5-7wt/vol％，更佳地4-6wt/vol％。7.如权利要求1所述的敷料，其特征在于，在所述敷料中，f127、f68和cs的含量分别20wt/vol％、6wt/vol％和0.2wt/vol％。8.如权利要求1所述的敷料，其特征在于，在所述敷料中，所述活性成分的含量为0.01μg/ml～20mg/ml，较佳地为0.1μg/ml～1mg/ml，较佳地为0.5μg/ml～200μg/ml，如1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、或180μg/ml、300μg/ml、500μg/ml、800μg/ml、2mg/ml或5mg/ml。9.一种如权利要求1所述的敷料的制备方法，其特征在于，步骤如下：1)提供水或水性溶液；和2)在液态温度下，将凝胶剂和活性成分溶解在所述水或水性溶液中，从而形成液态的敷料。10.如权利要求1所述的敷料在制备促进伤口愈合的药物或医疗器械中的用途。

技术总结
本发明提供了一种能够促进慢性伤口愈合的敷料。具体地，提供了一种温敏水凝胶敷料，包括：活性成分：β-烟酰胺单核苷酸(NMN)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，或其组合；和温敏水凝胶基质，其中，所述活性成分分散在所述水凝胶基质中。实验证明本发明的敷料具有优异的促进糖尿病足等慢性难愈性伤口愈合的效果。糖尿病足等慢性难愈性伤口愈合的效果。


技术研发人员：朱焕章 梁玥 李敏 杨金龙 朱豫琪
受保护的技术使用者：上海鑫昊生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.13
技术公布日：2023/9/20