一种检测ZNF9致病基因突变的方法与流程

一种检测znf9致病基因突变的方法
技术领域
1.本发明涉及遗传病致病基因检测技术领域，具体涉及一种检测znf9致病基因突变的方法。


背景技术：

2.znf9编码蛋白在微管介导的转运和囊泡功能中发挥作用，正常znf9基因序列中cctg核苷酸序列有12-44次拷贝，而当这种不稳定的序列拷贝数达到52-86次，会导致肌强直性营养不良。肌强直性营养不良是一种常染色体隐性遗传病，属于多系统疾病。主要表现为近端肌无力、肌强直、心脏病和白内障，还伴有多汗、睾丸萎缩、胰岛素抵抗和糖尿病、中枢神经系统异常。携带该致病基因的青少年，成人，老年人均可发病，具体的严重程度在发病人群中差异很大。治疗方法也针对不同个体特征和症状而不同。
3.目前，现有技术中检测znf9基因的技术主要是基于某个突变位点的扩增和测序方法，但是，现有技术中的检测方法存在的显著缺点是步骤繁琐，费用昂贵。
4.为此，本发明旨在提供一种检测znf9致病基因突变的方法，以解决上述问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种检测znf9致病基因突变的方法。
6.为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
7.本发明提供了一种检测znf9致病基因突变的方法，包括以下步骤：
8.s1、对被检测者的静脉采血进行基因组dna提取；
9.s2、提取靶向目标区域前后1kb的序列，并使用工具primer3进行引物序列的设计(用于扩增znf9基因内含子1到外显子2序列中包含cctg拷贝的引物znf9 forward和znf9 reward)，挑选出横跨靶向目标区域znf9基因中包含cctg拷贝区域的引物序列对，得到扩增引物(通过聚合酶链式反应，将肌强直性营养不良的致病基因znf9的片段扩增出来)；
10.s3、正常znf9的扩增片段在1198bp-1314bp之间，属阴性；而异常基因的扩增片段在1494bp-15274bp，属阳性。通过琼脂糖凝胶电泳，对扩增片段的大小进行比对，区分znf9基因是否发生突变；
11.s4、使用labchip gx touch生物分析仪验证扩增片段的大小，实现znf9致病基因突变的检测。
12.进一步地，步骤s2中pcr反应扩增znf9片段中，使用的引物序列为：
13.znf9 forward：aatatctcagtcaccaggcaa，
14.znf9 reward：gccagatcgtccacacttgaa。
15.进一步地，设计上述引物，将znf9基因中包含cctg重复序列的片段扩增出来，扩增片段序列如seq id no.1所示。
16.seq id no.1：
17.aatatctcagtcaccaggcaagtgctgcagtataactaggtactacgt
18.caggtgctaaggttaagagagtattttcttcactgactcctcactccg
19.agaatccattttacagcttcattggtttgggttattccaattttttgat
20.gtgagtaaataaatgacttctatttgcccaaaataaagcttatataggc
21.cttataaccatgcaaatgtgtccattaagttggacttggaatgagtga
22.atgagtattactgccagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgt
23.gtgtgtctgtctgtctgtctgtctgtctgtctgtctgtctgtctgcctg
24.cctgcctgcctgcctgcctgcctgcctggctgcctgtctgcctgtctg
25.cctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgtctgtctcactttgtcccct
26.aggctggagtgcagtggtatgatctcggctcactgcaacctccaccc
27.cccgggttcaagcgattcttctgcctcagcctcctgagtagctgggat
28.tacaggcgcatgccgccatgcccggctgttttttgtatttttagtagag
29.acggggtttcgccatgttggccagactggtctcaaactcctgacctc
30.agatggtccacccgcttcagcctcccaaagtgctaggattacaggcat
31.gagccaccgtgcccagccactaccaattatttctcttaatggattttca
32.ttgaccctaaccctgtaaattccatcacttttatcaaggtgtatattata
33.ataagtctataatacccaatcatgtagttgtgtgattattttattttttt
34.gagacagagtctcaatgttgcccaggctggagtacagtggcaccatc
35.tcagctcactgtaagctccgcctcctgggttcacaccattctcctgcc
36.tcagcctcccaagtagctgggattacaggcgcctgccacttcaccgg
37.gctaattttttgtatttttcgtagagacggggtttcaccatgttagcca
38.agatggtctcgatctcatgatccacccacctcggcctcccaaagtgat
39.gggattactggcgtgagccaccatgcccagctatttttttaaccaatat
40.attagctagcttttttccccagaataattttccaaaaatacatttaata
41.gagaataaaagttaaaagaactttcagtggtttaatgctgttactttt
42.aatatttcaaagatctgactgcagccatgagcagcaatgagtgcttcaagtgtggacgatctggc。
43.进一步地，步骤s2扩增znf9片段中，扩增条件为：预变性95℃，5min；变性95℃，1min；退火56℃，1min；延伸72℃，1min；充分延伸72℃，10min；循环数30。
44.进一步地，在步骤s1中采取外周静脉血于edta抗凝试管中，立即混匀，使用tiangen试剂盒relaxgene blood dna system提取基因组dna；4℃保存的血液不得超过一周。
45.进一步地，所述外周静脉血采集的量为1.5ml，所述试剂盒relaxgene blood dna system试剂盒，每次血液用量为300μl。
46.与现有技术相比，本方案的有益效果：
47.本发明的方法利用znf9基因序列中不稳定的cctg拷贝，在适当的位置设计扩增引物，将包含cctg重复序列的片段扩增出来，直接通过扩增产物的大小区分znf9基因是否发生突变。操作简单方便，能高效的区分znf9基因是否异常。
附图说明
48.图1是本发明实施例的方法流程图；
49.图2是本发明实施例中24个样本的检测结果图；
50.图3是本发明实施例中labch ip gx touch生物分析仪分析第26号样本的znf9基因扩增大小。
具体实施方式
51.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
52.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
53.实施例：
54.以下为本发明实施例提供的方案：一种检测znf9致病基因的方法，如图1所示，包括以下步骤：
55.s1、被检测者静脉采血，提取基因组dna。每个样本血液用量为300μl，用relaxgene blood dna system试剂盒提取基因组dna；
56.s2、利用设计好序列的引物znf9 forward和znf9 reward，通过聚合酶链式反应，对znf9基因的片段进行扩增，扩增程序为：预变性95℃，5min；变性95℃，1min；退火56℃，1min；延伸72℃，1min；充分延伸72℃，10min；循环数30。
57.s3、正常znf9的扩增片段在1198bp-1314bp之间，而异常基因的扩增片段1494bp-15274bp。通过琼脂糖凝胶电泳，对扩增片段的大小进行比对，可以区分znf9基因是否发生突变。如图2所示，其是24个样本的检测结果图，图2中24个样本均符合znf9基因正常的扩增大小。
58.s4、使用labchip gx touch生物分析仪验证扩增片段的大小，确认致病基因。如图3所示，其为labchip gx touch生物分析仪分析第26号样本的znf9基因扩增大小，图3中26号样本在1697bp处存在有效峰值，范围在异常基因的扩增片段1494bp-15274bp之间，为异常样本。即znf9基因扩增片段中有cctg异常拷贝，考虑含有znf9致病基因。
59.综上所述，通过本发明的上述实施例，本发明的上述方法利用znf9基因序列中不稳定的cctg拷贝，在适当的位置设计扩增引物，并将包含cctg重复序列的片段扩增出来，能够直接通过扩增产物的大小区分znf9基因是否发生突变。本发明的上述方法操作简单方便，且能高效的区分znf9基因是否异常。
60.以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

技术特征：
1.一种检测znf9致病基因突变的方法，其特征是：包括以下步骤：s1、对被检测者的静脉采血进行基因组dna提取；s2、提取靶向目标区域前后1kb的序列，并使用工具primer3进行引物序列的设计，挑选出横跨靶向目标区域znf9基因中包含cctg拷贝区域的引物序列对，得到扩增引物；s3、通过琼脂糖凝胶电泳，对扩增片段的大小进行比对，区分znf9基因是否发生突变；s4、使用labchip gx touch生物分析仪验证扩增片段的大小，实现znf9致病基因突变的检测。2.如权利要求1所述的一种检测znf9致病基因突变的方法，其特征是：步骤s2中pcr反应扩增znf9片段中，使用的引物序列为：znf9 forward：aatatctcagtcaccaggcaa，znf9 reward：gccagatcgtccacacttgaa。3.如权利要求2所述的一种检测znf9致病基因突变的方法，其特征是：设计上述引物，将znf9基因中包含cctg重复序列的片段扩增出来，扩增片段序列如seq id no.1所示。4.如权利要求3所述的一种检测znf9致病基因突变的方法，其特征是：步骤s2扩增znf9片段中，扩增条件为：预变性95℃，5min；变性95℃，1min；退火56℃，1min；延伸72℃，1min；充分延伸72℃，10min；循环数30。

技术总结
本发明公开了一种检测ZNF9致病基因突变的方法，涉及遗传病致病基因检测技术领域，包括以下步骤：S1、对被检测者的静脉采血进行基因组DNA提取；S2、提取靶向目标区域前后1kb的序列，使用工具Primer3进行引物序列设计，挑选出横跨靶向目标区域ZNF9基因中包含CCTG拷贝区域的引物序列对，得到扩增引物；S3、通过琼脂糖凝胶电泳，对扩增片段的大小进行比对，区分ZNF9基因是否发生突变；S4、使用LabChip GXTouch生物分析仪验证扩增片段大小。本发明利用ZNF9基因序列中不稳定的CCTG拷贝，在适当位置设计扩增引物，将包含CCTG重复序列的片段扩增出来，直接通过扩增产物的大小区分ZNF9基因是否发生突变；本发明操作简单方便，能高效区分ZNF9基因是否异常。区分ZNF9基因是否异常。区分ZNF9基因是否异常。


技术研发人员：李生斌 李小明
受保护的技术使用者：西安华壹健康医学检验实验室有限公司
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/9/20