水溶性共轭高分子造影剂、其制备方法及应用

1.本发明涉及纳米生物医学材料领域，特别涉及一种具有近红外第二窗口吸收荧光的水溶性共轭高分子造影剂、其制备方法及应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤亦称癌症，是人类目前所面临的最大威胁之一，与心脏病、脑血管疾病成为目前导致人类因病死亡前三种疾病。恶性肿瘤由于其种类繁多、复杂性高、早期症状隐蔽等特点导致较高的死亡率。因此，癌症的早期诊断成为了热门研究方向。
3.近年来，各种成像技术，包括计算机断层扫描(ct)、磁共振成像(mri)以及正电子发射断层扫描(pet)和单光子发射计算机断层扫描(spect)已被用于活体成像。然而，由于空间分辨率和时间分辨率的不足以及安全隐患，很难实现对活体中的多个事件同时进行原位、实时成像。第二近红外窗口(nir-ii，1000-1700nm)的荧光成像是一项新兴的技术，与传统的荧光成像(400-900nm)相比，它具有更深的组织穿透力、更高的空间分辨率和更高的时间分辨率，这是因为它减少了光子的吸收和散射，并且可以忽略组织的自发荧光。
4.目前临床批准的有机近红外染料只有亚甲基蓝(mb)和吲哚菁绿(icg)两种，这两种染料都是小分子，可以快速从体内排出。然而，它们的荧光发射位于nir-i区域，对体内成像的穿透深度有限。到目前为止，只有少数有机分子在nir二区区有荧光发射，这些有机分子都是高度疏水、不溶于水的染料，它们必须被包裹在聚合物基质中进行生物成像，其颗粒大小增加到超过肾脏滤过阈值(ca.40kd)。小分子ch1055(8.9kda)nir二区有机染料在808nm激发下在约1055nm处发射，具有高水溶性。虽然这种小分子染料在临床前已显示出前景，但制备工艺简单、量子产率高、高分辨率成像质量的近红外二区有机染料的研究仍处于起步阶段，需要提供更多的可靠方案。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种具有近红外第二窗口吸收荧光的水溶性共轭高分子造影剂、其制备方法及应用。
6.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种具有近红外第二窗口吸收荧光的水溶性共轭高分子造影剂，该水溶性共轭高分子造影剂具有如下式iii所示的化学结构：
[0007][0008]
式iii
[0009]
其中，x＝y＝4～8，m＝30～50。
[0010]
本发明的水溶性共轭高分子造影剂具有双亲型的分子结构，含有聚合物主链以及侧链，其中聚合物主链具有供体和受体结构，能够延长共轭骨架中共轭键长度，使吸收红移，提高聚合物的荧光强度，提升活体造影分辨率和对比度；侧链选择带有氨基的peg分子，通过共价键连接，使近红外二区共轭聚合物具有良好的水溶性，通过增强渗透性和滞留(epr)效应实现肿瘤富集，进而实现荧光成像的效果。该水溶性共轭高分子造影剂的上述特性，使得其用于荧光成像时具有提高信噪比和和成像清晰度的优点。
[0011]
本发明还提供一种如上所述的具有近红外第二窗口吸收荧光的水溶性共轭高分子造影剂的制备方法，包括以下步骤：
[0012]
s1、制备化学结构如下式i所示的聚合物i：
[0013][0014]
其中，x＝y＝4～8。
[0015]
s2、通过聚合物1与丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯进行原子转移自由基聚合反应，制备化学结构如下式ii所示的聚合物2：
[0016][0017]
其中，m＝30～50；
[0018]
s3、然后将聚合物2脱去琥珀酰亚胺酯，并与甲氧基聚乙二醇氨基进行酰胺化反应，制备得到聚合物3，即所述水溶性共轭高分子造影剂，其结构式如式iii所示。
[0019]
本发明的水溶性共轭高分子造影剂的制备方法，以具有供体-受体结构的具有式i所示结构的聚合物1作为主链，通过原子转移自由基聚合的方式活化，实现氨基的酰胺化反应，合成出侧链末端含有大量peg的自组装的纳米粒子。通过调整具有式i所示结构的共轭聚合物1的聚合度以及调整端氨基保护的甲氧基聚乙二醇氨基用量控制接枝的聚合度，实现对分子结构和纳米尺寸等性质的调控，实现对靶向性的调节。
[0020]
例如，式ii所示的结构中，与噻吩环连接的封端基为与苯环连接的封端基团为卤代基，例如为溴基。
[0021]
优选的是，所述步骤s1中，所述聚合物i通过将结构式如式ⅳ所示的单体1、结构式如式v所示的单体2以及结构式如式ⅵ所示的单体3进行施蒂勒偶联反应制备得到，合成路线如下所示：
[0022]
[0023]
具体的，单体1为：4，7-二溴苯并[1，2-c:4，5-c']双([1，2，5]噻二唑，结构式为式ⅳ；
[0024]
单体2为：2，6-二(三甲基锡)-4，8-二(5-(2-乙基己基)噻吩-2-基)-苯并二噻吩，结构式为式v；
[0025]
单体3为：(2，7-二溴-9h-芴-9，9-二基)双(丙-3，1-二基)双(2-溴-2-甲基丙酸酯)，结构式为式ⅵ。
[0026]
优选的是，所述步骤s1具体为：在避光环境下，将单体1、单体2、单体3加入溶剂中完全溶解，然后向所得溶液中通入氮气鼓泡20分钟以上进行除氧处理，向溶液中加入钯催化剂，在氮气保护、80-90℃下反应2-4小时，反应结束后将产物过滤，然后在甲醇中沉降，得到所述聚合物1。其中，钯催化剂优选为双(三苯基膦)二氯化钯(ii)，溶剂优选为甲苯。
[0027]
优选的是，所述步骤s1中，单体1：单体2：单体3的投料的摩尔比为1：2：1。
[0028]
优选的是，所述步骤s1具体为：在避光环境下，将0.2mm单体1、0.2mm单体2、0.1mm单体3加入1ml甲苯中完全溶解，然后向所得溶液中通入氮气鼓泡20分钟以上，向溶液中加入50mg双(三苯基膦)二氯化钯(ii)，在氮气保护、80℃下反应3小时，反应结束后将产物过滤，然后在甲醇中反复沉降，得到所述聚合物1。
[0029]
优选的是，所述步骤s2具体为：
[0030]
在避光条件下，将聚合物1、丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯加入有机溶剂中，然后加入催化剂，在氮气保护下加入配体五甲基二乙烯三胺，所得混合溶液在80-100℃下反应9-12h，反应结束后将产物过滤，然后在乙醚中反复沉降，得到所述聚合物2；合成路线如下所示：
[0031][0032]
优选的是，其中，聚合物i和丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:50～200，例如为1:100。
[0033]
优选的是，催化剂为溴化亚铜，有机溶剂为苯甲醚。
[0034]
优选的是，所述步骤s2具体为：
[0035]
在避光条件下，将100mg聚合物1、887mg丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯加入1ml苯甲醚中，然后加入催化剂cubr，在氮气保护下加入50μl五甲基二乙烯三胺，所得混合溶液在90℃下反应12h，反应结束后将产物过滤，然后在乙醚中反复沉降，得到所述聚合物2。
[0036]
优选的是，所述步骤s3具体为：
[0037]
在避光条件下，将聚合物2、甲氧基聚乙二醇氨基加入dmf(n，n-二甲基甲酰胺)中溶解，在氮气保护下，加入三乙胺(相转移催化剂)，35-45℃下搅拌反应24-60h；反应结束后将产物体系中的溶液加到去离子水中，所得混合水溶液置于透析袋中，用去离子水透析，透析结束后将透析袋内的溶液干燥，得到聚合物3；合成路线如下所示：
[0038][0039]
优选的是，所述步骤s3具体为：
[0040]
在避光条件下，将300mg聚合物2、630mg甲氧基聚乙二醇氨基加入5ml dmf中溶解，在氮气保护下，加入177mg三乙胺，40℃下搅拌反应48h；反应结束后将产物体系中的溶液加到20ml去离子水中，所得混合水溶液置于截留分子量为3500的透析袋中，用去离子水透析48h，每6h换1次透析液，透析结束后将透析袋内的溶液冷冻干燥，得到聚合物3。
[0041]
本发明还提供一种如上所述的水溶性共轭高分子造影剂在近红外第二窗口荧光成像中的应用。
[0042]
本发明的有益效果是：
[0043]
本发明提供的水溶性共轭高分子造影剂具有双亲型的分子结构，含有聚合物主链以及侧链，其中聚合物主链具有供体和受体结构，能够延长共轭骨架中共轭键长度，使吸收红移，提高聚合物的荧光强度，提升活体造影分辨率和对比度；侧链选择带有氨基的peg分子，通过共价键连接，使近红外二区共轭聚合物具有良好的水溶性，通过增强渗透性和滞留(epr)效应实现肿瘤富集，进而实现荧光成像的效果。该聚合物的上述特性，使得其用于荧光成像时具有提高信噪比和成像清晰度的优点；
[0044]
本发明提供的水溶性共轭高分子造影剂具有良好的水溶性和较高的近红外二区荧光成像强度，能够显著提高近红外二区荧光成像效果。
附图说明
[0045]
图1为实施例1中所采用的聚合物1的吸收光谱图；
[0046]
图2为实施例1中所采用的聚合物2的吸收光谱图；
[0047]
图3为实施例1中制得的水溶性共轭高分子造影剂(聚合物3)的核磁共振氢谱图；
[0048]
图4为实施例1中制得的水溶性共轭高分子造影剂的透射电镜照片；
[0049]
图5为实施例1中制得的水溶性共轭高分子造影剂的动态光散射测得的纳米直径示意图；
[0050]
图6为实施例1中制得的水溶性共轭高分子造影剂(2mg/ml)的吸收与发射光谱图；
[0051]
图7为实施例1中制得的水溶性共轭高分子造影剂水溶液的第二窗口近红外而且荧光成像图；
[0052]
图8为实施例1中制得的水溶性共轭高分子的生物毒性测试结果。
具体实施方式
[0053]
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0054]
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0055]
下列实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下列实施例中所用的材料试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下列实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0056]
实施例1
[0057]
一种具有近红外第二窗口吸收荧光的水溶性共轭高分子造影剂，其制备方法包括以下步骤：
[0058]
s1、制备化学结构如下式i所示的聚合物i：
[0059][0060]
其中，x＝y＝4～8。
[0061]
具体步骤为：
[0062]
在避光环境下，在反应管中加入受体分子(单体1)4，7-二溴苯并[1，2-c:4，5-c']双([1，2，5]噻二唑(35.2mg，0.2mm)、供体分子(单体2)2，6-二(三甲基锡)-4，8-二(5-(2-乙基己基)噻吩-2-基)-苯并二噻吩(180.9mg，0.2mm)、供体分子(单体3)(2，7-二溴-9h-芴-9，9-二基)双(丙-3，1-二基)双(2-溴-2-甲基丙酸酯)(73.8mg，0.1mm)，用甲苯(1ml)溶解上述固体后，通入氮气鼓泡20分钟以上；快速向烧瓶中加入双(三苯基膦)二氯化钯(ii)(50mg)，在氮气保护下将烧瓶置于80℃的条件中反应3小时；粗品用有机滤膜过滤，除去固体催化剂，之后再甲醇中反复沉降得到红棕色的聚合物1(100mg)。
[0063]
s2、通过聚合物1与丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯进行原子转移自由基聚合反应，制备化学结构如下式ii所示的聚合物2：
[0064][0065]
其中，m＝30～50。
[0066]
具体步骤为：
[0067]
在避光条件下，在反应管中加入聚合物1(100mg)，丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯(887mg，5.24mm)，用苯甲醚(1ml)溶解上述固体，加入cubr作为催化剂，在氮气保护下，加入50μl五甲基二乙烯三胺作为配体，所得混合溶液在90℃下反应12h，反应结束后用有机滤膜过滤以除去固体催化剂，之后再乙醚中反复沉降得到红棕色的丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯侧链取代的共轭主链聚合物，聚合物2(900mg)。
[0068]
s3、然后将聚合物2脱去琥珀酰亚胺酯，并与甲氧基聚乙二醇氨基进行酰胺化反应，制备得到聚合物3，即所述水溶性共轭高分子造影剂，其结构式如式iii所示。
[0069][0070]
具体步骤为：
[0071]
在避光条件下，在烧瓶中加入聚合物2(300mg)，甲氧基聚乙二醇氨基(630mg，0.63mmol)，混合溶解在5ml dmf中。在氮气保护下，加入三乙胺(177mg，1.75mmol)，40℃下搅拌反应48h；反应结束后将产物体系中的溶液滴加到20ml去离子水中，所得混合水溶液置于透析袋中(截留分子量为3500)，用去离子水透析48h，每6h换1次透析液，彻底除去dmf后得聚合物3的水溶液，透析结束后将透析袋内物水溶液进行冻干去除水分，冷冻干燥得到聚合物3。
[0072]
对实施例1制备的中间产品、最终产品进行以下性能检测与表征：
[0073]
1、以二氯甲烷作为有机溶剂，配置聚合物1的有机溶液，测试其吸收光谱图，如图1所示，可以看出其吸收峰位于734纳米波段。
[0074]
2、以二氯甲烷作为有机溶剂，配置聚合物2的有机溶液，测试其吸收光谱图，如图2所示，可以看出其吸收峰位于727纳米波段。
[0075]
3、对实施例1中制备的聚合物3进行核磁共振波谱检测，得到聚合物3核磁共振氢谱图，如图3所示，可看到peg侧链的特征质子信号。
[0076]
4、将实施例1中制得的聚合物3配制成浓度为2mg/ml的水溶液：
[0077]
i)采用透射电镜对各水溶液进行分析，所得的透射电镜图如图4所示，由图4可知，聚合物iii的粒径大小约为100纳米。
[0078]
ii)基于配制的聚合物3水溶液，根据动态光散射测得：水溶性近红外二区荧光成像在水中的平均流体力学直径约为90纳米，所得的流体力学图如图5所示。
[0079]
iii)基于配制的聚合物3的水溶液，分别测试聚合物iii的吸收与发射光谱图，结果如图6所示，可以看出：聚合物iii的吸收峰位于980纳米波段，在808纳米激光激发下其发射峰位于在1050纳米波段。
[0080]
5、分别将实施例1中制得的聚合物3配制成浓度梯度为5mg/ml、3mg/ml、2mg/ml、1mg/ml的聚合物3的水溶液。
[0081]
基于配制的不同浓度的聚合物3的水溶液，用1064nm的激光激发，在第二近红外窗口荧光成像仪中拍摄溶液的荧光成像图，结果如图7所示，聚合物iii具有明显的荧光信号，说明其具有近红外二区荧光成像的性能。
[0082]
6、分别将实施例1中制得的聚合物3配制成具有一定浓度梯度的一系列细胞培养液，细胞培养液中聚合物3的最高浓度为3mg/ml，用这些培养液与小鼠乳腺癌细胞培养4小时，加入cck-8试剂，测试450纳米处的吸光度，得到的吸光度换算成细胞存活率，如图8所示，可以看出：聚合物iii的细胞毒性很低，说明本发明制备的水溶性共轭高分子造影剂具有良好的生物相容性。
[0083]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

技术特征：
1.一种水溶性共轭高分子造影剂，其特征在于，该水溶性共轭高分子造影剂具有如下式iii所示的化学结构：其中，x＝y＝4～8，m＝30～50。2.一种如权利要求1所述的水溶性共轭高分子造影剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、制备化学结构如下式i所示的聚合物1：其中，x＝y＝4～8。s2、通过聚合物1与丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯进行原子转移自由基聚合反应，制备化学结构如下式ii所示的聚合物2：
其中，m＝30～50；s3、然后将聚合物2脱去琥珀酰亚胺酯，并与甲氧基聚乙二醇氨基进行酰胺化反应，制备得到聚合物3，即所述水溶性共轭高分子造影剂，其结构式如式iii所示。3.根据权利要求2所述的水溶性共轭高分子造影剂的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，所述聚合物i通过将结构式如式ⅳ所示的单体1、结构式如式v所示的单体2以及结构式如式ⅵ所示的单体3进行施蒂勒偶联反应制备得到，合成路线如下所示：4.根据权利要求3所述的水溶性共轭高分子造影剂的制备方法，其特征在于，所述步骤s1具体为：在避光环境下，将单体1、单体2、单体3加入溶剂中完全溶解，然后向所得溶液中通入氮气鼓泡20分钟以上，向溶液中加入钯催化剂，在氮气保护、80-90℃下反应2-4小时，反应结束后将产物过滤，然后在甲醇中沉降，得到所述聚合物1。5.根据权利要求4所述的水溶性共轭高分子造影剂的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，单体1：单体2：单体3的投料的摩尔比为1：2：1。6.根据权利要求5所述的水溶性共轭高分子造影剂的制备方法，其特征在于，所述步骤s1具体为：在避光环境下，将0.2mm单体1、0.2mm单体2、0.1mm单体3加入1ml甲苯中完全溶解，然后向所得溶液中通入氮气鼓泡20分钟以上，向溶液中加入50mg双(三苯基膦)二氯化钯(ii)，在氮气保护、80℃下反应3小时，反应结束后将产物过滤，然后在甲醇中反复沉降，得到所述聚合物1。
7.根据权利要求3所述的水溶性共轭高分子造影剂的制备方法，其特征在于，所述步骤s2具体为：在避光条件下，将聚合物1、丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯加入有机溶剂中，然后加入催化剂，在氮气保护下加入五甲基二乙烯三胺，所得混合溶液在80-100℃下反应9-12h，反应结束后将产物过滤，然后在乙醚中反复沉降，得到所述聚合物2；合成路线如下所示：8.根据权利要求7所述的水溶性共轭高分子造影剂的制备方法，其特征在于，其中，聚合物i和丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:50～200。9.根据权利要求8所述的水溶性共轭高分子造影剂的制备方法，其特征在于，所述步骤s2具体为：在避光条件下，将100mg聚合物1、887mg丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯加入1ml苯甲醚中，然后加入催化剂cubr，在氮气保护下加入50μl五甲基二乙烯三胺，所得混合溶液在90℃下反应12h，反应结束后将产物过滤，然后在乙醚中反复沉降，得到所述聚合物2。10.根据权利要求2所述的水溶性共轭高分子造影剂的制备方法，其特征在于，所述步骤s3具体为：在避光条件下，将聚合物2、甲氧基聚乙二醇氨基加入dmf中溶解，在氮气保护下，加入三乙胺，35-45℃下搅拌反应24-60h；反应结束后将产物体系中的溶液加到去离子水中，所得混合水溶液置于透析袋中，用去离子水透析，透析结束后将透析袋内的溶液干燥，得到聚合物3；合成路线如下所示：11.根据权利要求10所述的水溶性共轭高分子造影剂的制备方法，其特征在于，所述步骤s3具体为：在避光条件下，将300mg聚合物2、630mg甲氧基聚乙二醇氨基加入5ml dmf中溶解，在氮
气保护下，加入177mg三乙胺，40℃下搅拌反应48h；反应结束后将产物体系中的溶液加到20ml去离子水中，所得混合水溶液置于截留分子量为3500的透析袋中，用去离子水透析48h，每6h换1次透析液，透析结束后将透析袋内的溶液冷冻干燥，得到聚合物3。12.一种如权利要求所述的水溶性共轭高分子造影剂或权利要求2-11中任意一项所述的方法制备的水溶性共轭高分子造影剂在近红外第二窗口荧光成像中的应用。

技术总结
本发明公开了一种具有近红外第二窗口吸收荧光的水溶性共轭高分子造影剂、其制备方法及应用，该水溶性共轭高分子造影剂具有如下式III所示的化学结构：本发明提供的水溶性共轭高分子造影剂具有双亲型的分子结构，含有聚合物主链以及侧链，其中聚合物主链具有供体和受体结构，能够延长共轭骨架中共轭键长度，使吸收红移，提高聚合物的荧光强度，提升活体造影分辨率和对比度；侧链选择带有氨基的PEG分子，通过共价键连接，使近红外二区共轭聚合物具有良好的水溶性，通过增强渗透性和滞留效应实现肿瘤富集，进而实现荧光成像的效果。进而实现荧光成像的效果。进而实现荧光成像的效果。


技术研发人员：卢晓梅 李力
受保护的技术使用者：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/9/20