一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法

1.本发明涉及精子冷冻保存技术领域，尤其涉及一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法。


背景技术：

2.翘嘴鲌的收集时间主要集中在每年的11月中旬至12月底，这段时间是大湖开湖季节，亲本量大，易收集，加之气温、水温偏低，鱼类活动量小，耗氧量低，鳞片紧凑，很利于亲本的收集运输，成活率也将大大提高，供实验需求的精液基本也是在这段时间内获取，如果不能够对翘嘴鲌鱼精液进行冷冻保存，将会使得翘嘴鲌种质资源的研究进度慢，整体开发利用比例相对偏低。
3.不同种类淡水鱼的种质资源特征迥异，生存环境千差万别，导致目前我国淡水鱼种质资源高通量表型性状测定技术缺乏，性状精准鉴定与评估难度大，为此本发明提供一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，为淡水鱼的种质资源研究提供可靠的支撑条件。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法。
5.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
6.一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，包括：以下步骤：
7.s1、精液获取
8.采集野生成熟期的翘嘴鲌鱼提取活性比较高的精液，在1-4℃的温度环境下临时保存；
9.s2、制备保存体
10.将缓释液均匀涂抹在片状薄膜的表面，涂抹厚度为1-2.5mm,并在-15℃温度环境下进行真空干冷冻，缓释液形成稳定的片状结构后将片状薄膜去除，然后在片状固态缓释液的两面均涂抹精液，精液的厚度0.25-0.5mm，形成片状保存体；
11.s3、冷冻保存
12.在2.5cm*2.5cm*2.5cm的方形保存容器中滴入1-2滴10％的乙二醇冷冻液，并将片状保存体分切成2cm*2cm的片状后投入保存容器中，在4℃温度环境下平衡20-25min后送入液氮中冷冻保存；
13.s4、解冻
14.将方形保存容器和精液从液氮中取出，置于4℃温度环境下平衡5min，增加体积比为5％复活液，然后置于20℃恒温水浴15min。
15.进一步：
16.所述制备保存体的全过程均在4℃温度环境下完成。
17.进一步：
18.所述缓释液为：含有nacl0.4％、kcl0.2％、葡萄糖1.5％质量比的溶液，且ph值为
5.8。
19.进一步：
20.还包括：对获得精液进行活性检测，对成活率大于75％的精液进行冷冻保存。
21.进一步：
22.还包括：对涂抹精液的片状固态缓释液表面进行覆膜，且所使用的膜为多孔膜。
23.进一步：
24.s4中将保存容器送入液氮中冷冻保存采用两步降温保存；其中，第一步，将保存容器置于距离液氮表面5cm处平衡10分钟；第二步，将保存容器置于液氮中进行保存。
25.进一步：
26.所述复活液为：含有西洋参总皂苷2％、淫羊藿1.5％、黄芪提取物0.05％、精氨酸0.1％质量比的溶液。
27.本发明具有如下有益效果：
28.1、与现有技术相比，该一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，将缓释液冷冻形成片状固态，然后将精液均匀的涂抹在片状固态缓释液的两面，然后进行分切保存，相比较将精液与液态的缓释液搅拌均匀后分装保存，本方法能够获得较多样本，以便于实验室单独进行取出保存容器，而且本方法操作简单，使用到的设备仪器较少，便于全面的推广应用。
29.2、与现有技术相比，该一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，将精液涂抹在片状固态的缓释液中，分切之后进行在4℃温度环境下平衡20-25min，配合10％的乙二醇冷冻液，片状固态的缓释液融化，此过程不断的向精液中流入缓冲液，相对传统的混合搅拌，配比更加的均匀、可控。
附图说明
30.图1为本发明的保存方法流程图；
31.图2为本发明的分切保存体的示意图。
具体实施方式
32.实施例一
33.下面以捕获的两条成熟期3年左右的翘嘴鲌进行精液提取、保存为例。
34.精液获取：将翘嘴鲌的腹部用清水冲洗干净，然后挤压腹部，分多次轻轻的挤压，从其生殖孔挤出精液，当精液中基本无杂质的时候，开始用负压吸管收集，收集到的精液在1-4℃的温度环境下临时保存，两只翘嘴鲌共收集精液14ml精液。
35.在实验室，先用牙签挑取少许浸入事先准备好的清水中激活，立即盖片后用显微镜观察，成活率约为84％。
36.配置含有nacl0.4％、kcl0.2％、葡萄糖1.5％质量比的溶液，且ph值为5.8。
37.将缓释液均匀涂抹在事先准备好的15*11cm片状薄膜的表面，涂抹厚度为2mm,并在-15℃温度环境下进行真空干冷冻，缓释液形成稳定的片状结构后将片状薄膜去除，然后在片状固态缓释液的两面均涂抹精液，精液的厚度约为0.5mm，形成片状保存体。
38.在涂抹精液的过程中，需要对涂抹精液的片状固态缓释液表面进行覆膜，且所使用的膜为多孔膜，用于保证冷冻液进入该膜内，一面涂满精液之后，在该面上贴敷一层多孔
膜，将其反面之后，涂抹另一面。
39.在2.5cm*2.5cm*2.5cm的方形保存容器中滴入1-2滴10％的乙二醇冷冻液，并将片状保存体分切成2cm*2cm的片状后投入保存容器中，其中制备保存体的全过程均在4℃温度环境下完成，在4℃温度环境下平衡20-25min后送入液氮中冷冻保存。
40.将保存容器送入液氮中冷冻保存采用两步降温保存；其中，第一步，将保存容器置于距离液氮表面5cm处平衡10分钟；第二步，将保存容器置于液氮中进行保存。
41.上述过程共得到32个完整的保存样本(装有精液的方形保存容器)。
42.实施例二
43.将其中一个方形保存容器和精液从液氮中取出，置于4℃温度环境下平衡5min，增加体积比为5％复活液，然后置于20℃恒温水浴15min。得到的精液需要进一步采用清水稀释，然后投入实验使用。
44.复活液为：含有西洋参总皂苷2％、淫羊藿1.5％、黄芪提取物0.05％、精氨酸0.1％质量比的溶液。
45.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。


技术特征：
1.一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，其特征在于，包括：以下步骤：s1、精液获取采集野生成熟期的翘嘴鲌鱼提取活性比较高的精液，在1-4℃的温度环境下临时保存；s2、制备保存体将缓释液均匀涂抹在片状薄膜的表面，涂抹厚度为1-2.5mm,并在-15℃温度环境下进行真空干冷冻，缓释液形成稳定的片状结构后将片状薄膜去除，然后在片状固态缓释液的两面均涂抹精液，精液的厚度0.25-0.5mm，形成片状保存体；s3、冷冻保存在2.5cm*2.5cm*2.5cm的方形保存容器中滴入1-2滴10％的乙二醇冷冻液，并将片状保存体分切成2cm*2cm的片状后投入保存容器中，在4℃温度环境下平衡20-25min后送入液氮中冷冻保存；s4、解冻将方形保存容器和精液从液氮中取出，置于4℃温度环境下平衡5min，增加体积比为5％复活液，然后置于20℃恒温水浴15min。2.根据权利要求1所述的一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：所述制备保存体的全过程均在4℃温度环境下完成。3.根据权利要求1所述的一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，其特征在于，所述缓释液为：含有nacl0.4％、kcl0.2％、葡萄糖1.5％、精氨酸0.1％质量比的溶液，且ph值为5.8。4.根据权利要求1所述的一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，其特征在于，还包括：对获得精液进行活性检测，对成活率大于75％的精液进行冷冻保存。5.根据权利要求1所述的一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，其特征在于，还包括：对涂抹精液的片状固态缓释液表面进行覆膜，且所使用的膜为多孔膜。6.根据权利要求1所述的一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：s4中将保存容器送入液氮中冷冻保存采用两步降温保存；其中，第一步，将保存容器置于距离液氮表面5cm处平衡10分钟；第二步，将保存容器置于液氮中进行保存。7.根据权利要求1所述的一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，其特征在于，所述复活液为：含有西洋参总皂苷2％、淫羊藿1.5％、黄芪提取物0.05％、精氨酸0.1％质量比的溶液。

技术总结
本发明涉及精子冷冻保存技术领域，尤其是指一种翘嘴鲌鱼精子冷冻保存方法，包括以下步骤：S1、精液获取；S2、制备保存体、将缓释液均匀涂抹在片状薄膜的表面，涂抹厚度为1-2.5mm,并在-15℃温度环境下进行真空干冷冻，缓释液形成稳定的片状结构后将片状薄膜去除，然后在片状固态缓释液的两面均匀涂抹精液，精液的厚度0.25-0.5mm，形成片状保存体；S3、冷冻保存；S4、解冻。本发明，将缓释液冷冻形成片状固态，然后将精液均匀的涂抹在片状固态缓释液的两面，然后进行分切保存，能够获得较多样本，以便于实验室单独进行取出保存容器，将精液投入实验使用。用。用。


技术研发人员：杨品红 刘良国 张运生 夏虎
受保护的技术使用者：湖南文理学院
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/9/20