一种外泌体分离制备方法与流程

1.本发明涉及外泌体分离技术领域，具体是一种外泌体分离制备方法。


背景技术：

2.外泌体是由不同细胞类型在体内分泌的直径40～120nm的质膜囊泡。各种体液中鉴于他们的来源和他们的生物发生，外泌体反映了他们所来源的细胞的内含物和正常状态或病理生理状态。几乎所有类型的细胞都能分泌，如血清、血浆等，现有技术中的外泌体分离方法有超高速离心法、试剂盒沉淀法、免疫共沉淀法等。
3.现有专利如中国专利公开号为：cn105934670b，该专利的名称为“用于分离外泌体的方法”，该专利包括至少下述两个连续的亲和纯化步骤：第一步骤使用外泌体通用配体的至少一种特异性抗配体，以便获得外泌体群体p，将外泌体与抗配体分离，第二步骤，其应用于外泌体群体p，使用外泌体亚群体sp特有配体的至少一种特异性抗配体，以便获得外泌体亚群体sp，将外泌体与抗配体分离或者不分离。用于实现外泌体的分离。
4.现有技术的不足之处在于：现有技术中的外泌体分离制备方法耗时较长，操作繁琐，成本较高，且分离后外泌体纯度较低，无法在保证高纯度的同时，实现外泌体的高收率。因此，本领域技术人员提供了一种外泌体分离制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种外泌体分离制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种外泌体分离制备方法，所述外泌体分离制备方法具体包括以下步骤：
7.s01：初次分离：对待分离的生物样品进行离心处理，去除提取液中的细胞杂质，得到初提液；
8.s02：再次分离：对初次分离后的生物样品进行再次分离，去除细胞碎片和蛋白杂质，得到上清液；
9.s03：复合层析：将上述上清液进行复合层析处理，得到穿流液；
10.s04：浓缩：将上述穿流液通过超滤膜进行超滤浓缩，得到浓缩液；
11.s05：纯化：将羟基磷灰石加入纯化柱中，再将上述浓缩液加入纯化柱中，使用磁粒搅拌器混合均匀，摇动孵育，后使用磷酸二氢钠溶液洗涤，得到纯化后的外泌体溶液。
12.作为本发明进一步的方案：所述s01中初次分离采用高速分离，转速为12000～13000r/mi n，离心时间为15～30mi n。
13.作为本发明再进一步的方案：所述s02中的再次分离采用低速分离，转速为3000～5000r/mi n，离心时间为10～15mi n。
14.作为本发明再进一步的方案：所述s03中复合层析为将上清液进行阳离子交换层
析和分子筛层析结合方式进行复合层析。
15.作为本发明再进一步的方案：所述阳离子交换层析填料的配基为强阳离子交换配基或弱阳离子交换配基，阳离子交换层析过程中平衡缓冲液ph为7.5～7.8，缓冲液电导率为8ms/cm。
16.作为本发明再进一步的方案：阳离子交换配基为羧甲基，填料粒径为80～100μm，孔径围为30～50nm。
17.作为本发明再进一步的方案：所述s04中超滤膜的分子截流量为200～300kd。
18.作为本发明再进一步的方案：所述所述s05中磁粒搅拌器搅拌时间为5～8mi n，后静置10mi n。
19.作为本发明再进一步的方案：所述s05中孵育时间为20～30mi n，摇动的转速为100～120rpm。
20.作为本发明再进一步的方案：所述s05中磷酸二氢钠溶液的洗涤次数为3次。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明公开了一种外泌体分离制备方法，本发明外泌体分离方法生产周期较短，操作工序简单，成本较低，采用本发明方法分离出的外泌体样品其纯度高度100％，收率高达56％，本发明能够在保证外泌体高纯度的同时，实现外泌体的高收率。
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.本发明实施例中，
24.实施例1
25.一种外泌体分离制备方法，外泌体分离制备方法具体包括以下步骤：
26.s01：初次分离：对待分离的生物样品进行离心处理，去除提取液中的细胞杂质，得到初提液；
27.s02：再次分离：对初次分离后的生物样品进行再次分离，去除细胞碎片和蛋白杂质，得到上清液；
28.s03：复合层析：将上述上清液进行复合层析处理，得到穿流液；
29.s04：浓缩：将上述穿流液通过超滤膜进行超滤浓缩，得到浓缩液；
30.s05：纯化：将羟基磷灰石加入纯化柱中，再将上述浓缩液加入纯化柱中，使用磁粒搅拌器混合均匀，摇动孵育，后使用磷酸二氢钠溶液洗涤，得到纯化后的外泌体溶液。
31.进一步的，s01中初次分离采用高速分离，转速为12000r/mi n，离心时间为15mi n。
32.再进一步的，s02中的再次分离采用低速分离，转速为3000r/mi n，离心时间为10mi n。
33.再进一步的，s03中复合层析为将上清液进行阳离子交换层析和分子筛层析结合方式进行复合层析。
34.再进一步的，阳离子交换层析填料的配基为强阳离子交换配基或弱阳离子交换配基，阳离子交换层析过程中平衡缓冲液ph为7.5，缓冲液电导率为8ms/cm。
35.再进一步的，阳离子交换配基为羧甲基，填料粒径为80μm，孔径围为30nm。
36.再进一步的，s04中超滤膜的分子截流量为200kd。
37.再进一步的，s05中磁粒搅拌器搅拌时间为5mi n，后静置10mi n。
38.再进一步的，s05中孵育时间为20mi n，摇动的转速为100rpm。
39.再进一步的，s05中磷酸二氢钠溶液的洗涤次数为3次。
40.实施例2
41.一种外泌体分离制备方法，外泌体分离制备方法具体包括以下步骤：
42.s01：初次分离：对待分离的生物样品进行离心处理，去除提取液中的细胞杂质，得到初提液；
43.s02：再次分离：对初次分离后的生物样品进行再次分离，去除细胞碎片和蛋白杂质，得到上清液；
44.s03：复合层析：将上述上清液进行复合层析处理，得到穿流液；
45.s04：浓缩：将上述穿流液通过超滤膜进行超滤浓缩，得到浓缩液；
46.s05：纯化：将羟基磷灰石加入纯化柱中，再将上述浓缩液加入纯化柱中，使用磁粒搅拌器混合均匀，摇动孵育，后使用磷酸二氢钠溶液洗涤，得到纯化后的外泌体溶液。
47.进一步的，s01中初次分离采用高速分离，转速为13000r/mi n，离心时间为30mi n。
48.再进一步的，s02中的再次分离采用低速分离，转速为5000r/mi n，离心时间为15mi n。
49.再进一步的，s03中复合层析为将上清液进行阳离子交换层析和分子筛层析结合方式进行复合层析。
50.再进一步的，阳离子交换层析填料的配基为强阳离子交换配基或弱阳离子交换配基，阳离子交换层析过程中平衡缓冲液ph为7.8，缓冲液电导率为8ms/cm。
51.再进一步的，阳离子交换配基为羧甲基，填料粒径为100μm，孔径围为50nm。
52.再进一步的，s04中超滤膜的分子截流量为300kd。
53.再进一步的，s05中磁粒搅拌器搅拌时间为8mi n，后静置10mi n。
54.再进一步的，s05中孵育时间为30mi n，摇动的转速为120rpm。
55.再进一步的，s05中磷酸二氢钠溶液的洗涤次数为3次。
56.实施例3
57.一种外泌体分离制备方法，外泌体分离制备方法具体包括以下步骤：
58.s01：初次分离：对待分离的生物样品进行离心处理，去除提取液中的细胞杂质，得到初提液；
59.s02：再次分离：对初次分离后的生物样品进行再次分离，去除细胞碎片和蛋白杂质，得到上清液；
60.s03：复合层析：将上述上清液进行复合层析处理，得到穿流液；
61.s04：浓缩：将上述穿流液通过超滤膜进行超滤浓缩，得到浓缩液；
62.s05：纯化：将羟基磷灰石加入纯化柱中，再将上述浓缩液加入纯化柱中，使用磁粒
搅拌器混合均匀，摇动孵育，后使用磷酸二氢钠溶液洗涤，得到纯化后的外泌体溶液。
63.进一步的，s01中初次分离采用高速分离，转速为12000r/mi n，离心时间为20mi n。
64.再进一步的，s02中的再次分离采用低速分离，转速为4000r/mi n，离心时间为12mi n。
65.再进一步的，s03中复合层析为将上清液进行阳离子交换层析和分子筛层析结合方式进行复合层析。
66.再进一步的，阳离子交换层析填料的配基为强阳离子交换配基或弱阳离子交换配基，阳离子交换层析过程中平衡缓冲液ph为7.6，缓冲液电导率为8ms/cm。
67.再进一步的，阳离子交换配基为羧甲基，填料粒径为90μm，孔径围为40nm。
68.再进一步的，s04中超滤膜的分子截流量为250kd。
69.再进一步的，s05中磁粒搅拌器搅拌时间为6mi n，后静置10mi n。
70.再进一步的，s05中孵育时间为25mi n，摇动的转速为110rpm。
71.再进一步的，s05中磷酸二氢钠溶液的洗涤次数为3次。
72.对比例1
73.采用现有技术中的外泌体分离分离出的外泌体。
74.实验例
75.将采用上述实施例1-3分离方法分离出的外泌体和对比例1中分离出的外泌体样品进行检测，检测结果详见下表1。
76.表1外泌体样品检测结果
[0077][0078][0079]
由此可知，实施例1-3中的分离方法分离出的外泌体样品较对比例1中分离出的外泌体样品其纯度、收率得到明显提升。
[0080]
综上，本发明外泌体分离方法生产周期较短，操作工序简单，成本较低，采用本发明方法分离出的外泌体样品其纯度高度100％，收率高达56％，本发明能够在保证外泌体高纯度的同时，实现外泌体的高收率。
[0081]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权
利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0082]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：
1.一种外泌体分离制备方法，其特征在于：所述外泌体分离制备方法具体包括以下步骤：s01：初次分离：对待分离的生物样品进行离心处理，去除提取液中的细胞杂质，得到初提液；s02：再次分离：对初次分离后的生物样品进行再次分离，去除细胞碎片和蛋白杂质，得到上清液；s03：复合层析：将上述上清液进行复合层析处理，得到穿流液；s04：浓缩：将上述穿流液通过超滤膜进行超滤浓缩，得到浓缩液；s05：纯化：将羟基磷灰石加入纯化柱中，再将上述浓缩液加入纯化柱中，使用磁粒搅拌器混合均匀，摇动孵育，后使用磷酸二氢钠溶液洗涤，得到纯化后的外泌体溶液。2.根据权利要求1所述的一种外泌体分离制备方法，其特征在于：所述s01中初次分离采用高速分离，转速为12000～13000r/min，离心时间为15～30min。3.根据权利要求1所述的一种外泌体分离制备方法，其特征在于：所述s02中的再次分离采用低速分离，转速为3000～5000r/min，离心时间为10～15min。4.根据权利要求1所述的一种外泌体分离制备方法，其特征在于：所述s03中复合层析为将上清液进行阳离子交换层析和分子筛层析结合方式进行复合层析。5.根据权利要求4所述的一种外泌体分离制备方法，其特征在于：所述阳离子交换层析填料的配基为强阳离子交换配基或弱阳离子交换配基，阳离子交换层析过程中平衡缓冲液ph为7.5～7.8，缓冲液电导率为8ms/cm。6.根据权利要求5所述的一种外泌体分离制备方法，其特征在于：阳离子交换配基为羧甲基，填料粒径为80～100μm，孔径围为30～50nm。7.根据权利要求1所述的一种外泌体分离制备方法，其特征在于：所述s04中超滤膜的分子截流量为200～300kd。8.根据权利要求1所述的一种外泌体分离制备方法，其特征在于：所述所述s05中磁粒搅拌器搅拌时间为5～8min，后静置10min。9.根据权利要求1所述的一种外泌体分离制备方法，其特征在于：所述s05中孵育时间为20～30min，摇动的转速为100～120rpm。10.根据权利要求1所述的一种外泌体分离制备方法，其特征在于：所述s05中磷酸二氢钠溶液的洗涤次数为3次。

技术总结
本发明公开了一种外泌体分离制备方法，涉及外泌体分离技术领域，具体包括以下步骤：S01：初次分离：对待分离的生物样品进行离心处理，去除提取液中的细胞杂质，得到初提液；S02：再次分离：对初次分离后的生物样品进行再次分离，去除细胞碎片和蛋白杂质，得到上清液；S03：复合层析：将上述上清液进行复合层析处理，得到穿流液；S04：浓缩：将上述穿流液通过超滤膜进行超滤浓缩，得到浓缩液；S05：纯化。本发明外泌体分离方法生产周期较短，操作工序简单，成本较低，采用本发明方法分离出的外泌体样品其纯度高度100％，收率高达56％，本发明能够在保证外泌体高纯度的同时，实现外泌体的高收率。实现外泌体的高收率。


技术研发人员：李秀梅 张雍承 李静韬
受保护的技术使用者：隆泰银信生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.13
技术公布日：2023/9/20