一株耐受多种重金属的植物促生细菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一株耐受多种重金属的植物促生细菌及其应用。


背景技术：

4.植物根际促生细菌(pgpr)指的是能够在植物根系定殖并促进种子萌发、植株生长发育、提高植株抗性和非生物胁迫能力的一类有益根系细菌。pgpr促进植物的生长和发育主要作用机制包括：合成铁载体、植物激素吲哚乙酸(iaa)的分泌、乙酰辅酶a羧化酶的合成、固氮作用和溶解无机磷等。目前，已发现多个属种的根际微生物具有植物促生特性：如土壤杆菌(agrobacterium)、节杆菌(arthrobacter)、固氮菌(azotobacter)、固氮螺旋菌(azospirillum)、芽孢杆菌(bacillus)、假单胞菌(pseudomonas)和沙雷菌(serratia)等。截至目前，耐受单一重金属的pgpr已有大量的报道，然而在多种重金属污染下能够促进植物生长发育的pgpr报道相对较少。针对粤西地区红壤多种重金属污染的问题，如何缓解重金属对植物的胁迫，促进植物生长发育已成为人们关注的焦点。
5.因此，发掘能够耐受多种重金属的pgpr，并将其应用于粤西地区单种或多种重金属污染土壤中，将有效缓解重金属对植物的胁迫，丰富本土pgpr的微生物资源，为利用pgpr修复治理并恢复重金属污染土壤的生态生产功能，促进重金属污染土壤植物生长发育提供科学支撑，对于改善重金属污染土壤的生态环境健康和安全具有重要的经济价值和现实意义。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种耐受多种重金属的植物根际促生细菌，便于规模化应用和扩大生产，为利用植物根际促生细菌修复治理并恢复重金属污染土壤的生态生产功能，促进重金属污染土壤植物生长发育提供科学支撑，对于改善重金属污染土壤的生态环境健康和安全具有重要的经济价值和现实意义。
7.本发明的目的是提供一株耐受多种重金属且促进植物生长的氧化假节杆菌(pseudarthrobacter oxydans)s4453-8。
8.本发明另一目的是提供氧化假节杆菌(pseudarthrobacter oxydans)s4453-8菌株的应用。
9.本发明再一目的是提供一种植物促生剂或耐重金属促生剂。
10.本发明又一目的是提供一种促进植物生长或在重金属环境下促进植物生长的方法。
11.本发明再一目的是提供一种促进水稻发芽的方法。
12.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
13.本发明分离得到一株耐受多种重金属且促进植物生长的氧化假节杆菌(pseudarthrobacter oxydans)s4453-8，菌株s4453-8为革兰氏阴菌，其菌落形态呈圆形，
乳白色，表面光滑，边缘整齐，不透明；菌株能够利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和果糖，与明胶酶、水解酶和过氧化氢酶反应均呈阳性；但与精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶反应呈阴性。菌株s4453-8的适宜生长条件为：温度范围为20-40℃，ph范围为5-8，盐浓度范围为0-2％，接种量范围为1-9％。菌株株s4453-8已于2023年05月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no.63497。
14.本发明研究显示，菌株s4453-8耐受多种重金属，在重金属cd
2+
、cu
2+
、pb
2+
、cr
6+
和as
3+
浓度分别为200、300、400、700、200mg/l的条件下能够正常生长；菌株s4453-8具有分泌iaa的能力，可在高cd
2+
浓度下分泌iaa，当cd
2+
浓度为50-200mg/l时，菌株s4453-8生长情况良好，iaa产量为62.32-75.70mg/l，能用于制备重金属耐受制剂或制备植物生长素。同时，菌株s4453-8能促进植物生长，在重金属环境下能促进水稻发芽，其中，在高浓度cd
2+
、cr
6+
和as
3+
下对水稻种子催芽能力最强。此外，在重金属污染区域(cd、cr和as)上的土壤添加s4453-8菌剂，能够明显促进水稻的生长及地上和地下部生物量的积累，能有效缓解重金属对植物的胁迫，对于改善重金属污染土壤的生态环境健康和安全具有重要的经济价值和现实意义。
15.因此，本发明提供氧化假节杆菌(pseudarthrobacter oxydans)s4453-8或其菌液的以下应用：
16.在促进水稻发芽或在制备促进水稻发芽制剂中的应用。
17.在促进植物生长或在制备植物促生剂中的应用。
18.在缓解重金属对植物的胁迫中的应用。
19.在制备重金属耐受制剂或在制备植物生长素中的应用。
20.在重金属环境下促进植物生长或在制备耐重金属促生剂中的应用。
21.进一步地，所述重金属为cd
2+
、cu
2+
、pb
2+
、cr
6+
、as
3+
中的一种或多种。
22.本发明提供一种植物促生剂或耐重金属促生剂，含上述氧化假节杆菌s4453-8或其菌液。
23.优选地，所述菌液浓度不低于1
×
108cfu/ml。
24.本发明还提供一种促进植物生长或在重金属环境下促进植物生长的方法，采用氧化假节杆菌(pseudarthrobacter oxydans)s4453-8菌株或其菌液对植物进行处理，或采用上述促生剂进行处理。
25.本发明还提供一种促进水稻发芽的方法，采用上述促生剂进行处理。
26.本发明具有以下有益效果：
27.(1)本发明提供的氧化假节杆菌(pseudarthrobacter oxydans)s4453-8在200mg/l的cd
2+
和其他重金属污染条件下，能够正常生长，并具有良好的iaa分泌能力，能够有效的促进植物种子发芽，有效缓解重金属对植物的胁迫，为促进重金属污染土壤植物生长发育提供科学支撑。
28.(2)本发明提供的氧化假节杆菌(pseudarthrobacter oxydans)s4453-8在使用过程中无污染，无公害，能够分泌大量的iaa和促进作物生长，并对多种重金属污染土壤具有较强的耐受能力，可广泛用于重金属污染修复治理中，对于改善重金属污染土壤的生态环境健康和安全具有重要的经济价值和现实意义。
附图说明
29.图1为s4453-8菌株的形态特征；
30.图2为s4453-8菌株的系统发育树；
31.图3为s4453-8菌株的最佳生长条件；
32.图4为s4453-8菌株的在不同重金属浓度下的生长及iaa产量。
具体实施方式
33.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
34.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
35.下述实施例中使用的培养基组成如下：
36.lb培养基：10.0g/l蛋白胨，5.0g/l nacl，10.0g/l酵母提取物，ph＝7.0
±
0.2。
37.平板固体培养基为相应的培养基中加入20g的琼脂。
38.实施例1耐重金属细菌富集、筛选和特性鉴定
39.1、耐重金属细菌筛选
40.从广东省湛江市徐闻县龙塘镇牛郎农场矿区附近稻田收集土壤样品。在无菌操作下，准确称取10g沉积物样品放入装有90ml无菌水的250ml三角瓶中(加玻璃珠)，摇床振荡30min，使样品与水充分混合，将细胞分散，形成均匀的菌悬液。静置20-30s，再吸取2ml上清液到含有10mg/l cd
2+
的lb培养基中，在30℃，180rpm条件下震荡培养。培养5d后，再次以2％接种量接种于含有20mg/l cd
2+
的lb培养基中，在相同条件下培养，依次类推，直至lb培养基中cd
2+
浓度为50mg/l。每次富集培养都有不加菌液的空白对照。
41.2、耐重金属细菌的分离和纯化
42.将cd驯化浓度为50mg/l时的富集培养物分别稀释为10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
，各处理分别取10-4
、10-5
、10-6
稀释液100μl涂布于添加相应cd
2+
浓度的固体培养基平板上(50mg/l)，置于30℃恒温培养箱中避光培养。重复3次，直至分离获得纯化的初筛耐cd细菌。
43.3、耐多种重金属细菌筛选
44.将已纯化的单一初筛耐cd细菌分别接种于含有cu
2+
、pb
2+
、cr
6+
和as
3+
的lb培养基中。根据菌落的形态及显微镜检查，挑选可以生长的单菌落在逐步提高重金属浓度的培养基上进行划线分离，剔除不可生长的细菌，最终筛选出可以耐受多种重金属的菌株，并命名为s4453-8。将纯培养后的菌株保存在含有30％甘油的液体培养基中，并置于-80℃冰箱中保存。
45.4、耐重金属细菌产iaa能力测定
46.将分离得到的菌株s4453-8按1％接种量接入到含+有l-色氨酸(100mg/l)的lb培养基中，在30℃，180rpm条件下震荡培养24h，以不加色氨酸的培养基为阴性对照。
47.培养完成后，以8000g的转速离心10min。取1ml上清液于试管中，加入2ml salkowski’s试剂(1ml 0.5m fecl3和50ml 35％ hclo4)，黑暗反应20min，与对照相比，如果试管中有粉红颜色出现，则认定有iaa的产生。如若显色，测定od
530
的吸光度值，通过iaa标
准曲线计算菌株产生iaa的浓度。
48.结果表明菌株s4453-8具有分泌iaa的能力。在培养24h后，菌株s4453-8分泌的iaa为78.24mg/l。
49.5、菌株特性鉴定
50.(1)菌株形态特性
51.菌株s4453-8为革兰氏阴性菌，在lb培养基上培养24h后形成的菌落呈圆形，如图1所示，乳白色，表面光滑，边缘整齐，不透明。
52.(2)菌株生理生化特性
53.菌株s4453-8能够利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和果糖，与明胶酶、水解酶和过氧化氢酶反应均呈阳性；但与精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶反应呈阴性。
54.(3)分子生物学特性
55.采用试剂盒法提取细菌总dna，并用细菌16s rdna通用引物27f和1492r，进行pcr检测，扩增细菌的16s rdna，在1400bp附近出现明显的条带；随后将pcr扩增产物回收后进行序列测定，将获得的dna序列在ncbi网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行blast比对分析，并利用mega软件(版本：7.0)构建系统发育树。
56.系统发育树如图2所示，菌株s4453-8的序列如seq id no:1所示，显示菌株s4453-8的16s rdna序列和与genbank中氧化假节杆菌(pseudarthrobacter oxydans)具有较高的同源性。结合上述的形态特性、16s rdna序列的结果，将该菌株应归属于氧化假节杆菌(pseudarthrobacter oxydans)，命名为s4453-8，并于2023年05月24日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmcc no：63497，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
57.实施例2氧化假节杆菌s4453-8的最佳生长条件
58.(1)温度对菌株生长的影响
59.将菌株s4453-8的种子液(od
600
＝0.8)按1％接种量接种到含50mg/l cd
2+
的lb培养基中，共设3个重复，分别在10、20、30、40、50℃，180rpm/min条件下在恒温震荡培养，培养3d后取样测定菌株生长情况(od
600
)。
60.(2)ph对菌株生长的影响
61.将菌株s4453-8的种子液(od
600
＝0.8)按1％接种量接种到含50mg/l cd
2+
的lb培养基中，ph分别设置为4、5、6、7、8、9、10，共设3个重复，分别在30℃，180rpm/min条件下在恒温震荡培养，培养3d后取样测定菌株生长情况(od
600
)。
62.(3)盐浓度对菌株生长的影响
63.将菌株s4453-8的种子液(od
600
＝0.8)按1％接种量接种到含50mg/l cd
2+
的lb培养基中，盐浓度分别设置为0、2、4、6、8、10％，共设3个重复，分别在30℃，180rpm/min条件下在恒温震荡培养，培养3d后取样测定菌株生长情况(od
600
)。
64.(4)接种量对菌株生长的影响
65.将菌株s4453-8的种子液(od
600
＝0.8)按1％接种量接种到含50mg/l cd
2+
的lb培养基中，共设3个重复，分别在30℃，180rpm/min条件下在恒温震荡培养，培养3d后取样测定菌株生长情况(od
600
)。
66.上述各条件测定结果如图3所示，显示菌株s4453-8的适宜培养条件为：温度范围
为20-40℃，ph范围为5-8，盐浓度范围为0-2％，接种量范围为1-9％。实施例3氧化假节杆菌s4453-8在不同重金属浓度条件下生长及产iaa特性试验
67.将菌株s4453-8的种子液(od
600
＝0.8)按1％接种量分别接种于含cd
2+
(50、100、150、200、250mg/l)；cu
2+
(100、200、300、400、500mg/l)；pb
2+
(300、400、500、600、700mg/l)；cr
6+
(400、500、600、700、800mg/l)；as
3+
(50、100、150、200、250mg/l)的lb培养基中，共设3个重复，在30℃，180rpm/min条件下在恒温震荡培养，培养3d后取样测定菌株生长情况(od
600
)和iaa产量，以未接种菌株培养液为空白对照。
68.结果如图4所示，菌株s4453-8对重金属cd
2+
、cu
2+
、pb
2+
、cr
6+
和as
3+
的最大耐受浓度分别为200、300、400、700和200mg/l，对应的iaa产量分别是66.27、45.23、53.04、68.91和61.58mg/l。可见，菌株s4453-8在高浓度cd
2+
、cr
6+
和as
3+
存在的条件下具有较好的iaa分泌能力。
69.实施例4氧化假节杆菌s4453-8在不同重金属条件下对水稻发芽的促进效应
70.为观察氧化假节杆菌s4453-8在不同重金属条件下促进水稻种子发芽的效果，每培养皿加入不同浓度重金属溶液20ml，一部分培养皿加入5ml蒸馏水，另一部分培养皿加入5ml菌液。使cd
2+
、cu
2+
、pb
2+
、cr
6+
和as
3+
终浓度分别为200mg/l，300mg/l，400mg/l，700mg/l和200mg/l。同时设置培养皿中仅加入25ml蒸馏水的空白对照(不加菌液)和加入25ml蒸馏水+5ml的s4453-8菌液的空白对照(加菌液)，共设置12个处理，每个处理重复3次。
71.挑选颗粒饱满且大小匀称的水稻种子，用75％乙醇浸泡1min，用无菌水冲洗3次后，再用5％的次氯酸钠浸泡5min，随后用无菌水清洗多次。将表面消毒的水稻种子置于培养皿内，每培养皿放置100颗水稻种子，置于25℃培养箱内培养48h催芽。
72.结果如表1所示，在不加菌的所有处理中，对照处理水稻发芽率最高，添加重金属后水稻发芽率均有不同程度降低。经过s4453-8菌液浸种后，水稻种子的发芽率显著地提高。添加s4453-8菌液的处理中，在存在cd
2+
、cr
6+
和as
3+
的条件下，水稻发芽率均达到70％以上；而在存在cu
2+
和pb
2+
的条件下，水稻发芽率略低，但仍然高于未加菌处理，水稻发芽率分别为55.67％和50.67％。因此，菌株s4453-8能在高浓度cd
2+
、cu
2+
和cr
6+
存在的条件下有效促进水稻种子发芽。
73.表1菌株s4453-8在不同重金属条件下对水稻发芽的促进效应
[0074][0075]
实施例5氧化假节杆菌s4453-8在重金属污染区域的田间效果试验
[0076]
(1)s4453-8菌剂的制备
[0077]
将菌株s4453-8的种子液(od
600
＝0.8)按1％接种量接入lb培养基中，在30℃，180rpm/min条件下在恒温震荡培养培养1d，随后取培养液8000r/min离心10min，用无菌水悬浮菌体，离心2次洗去培养基，再次用无菌水配制浓度为1
×
108cfu/ml的菌剂。
[0078]
(2)菌株对重金属污染区域水稻生长的促进效果
[0079]
为观察氧化假节杆菌s4453-8在重金属污染区域促进作物生长的效果，本实施例使用的土壤分别于从广东省湛江市徐闻县龙塘镇牛郎农场矿区附近稻田(xw)及廉江市和寮镇废弃重金属冶炼厂附近稻田(lj)采集，其两种土壤均含有多种不同程度的重金属污染，其土壤理化性质如表2所示。
[0080]
表2重金属污染土壤基本理化性质
[0081][0082]
本试验共设置4个处理：xw(不接菌+xw稻田土壤)；xw+s4453-8(s4453-8菌剂+xw稻田土壤)；lj(不接菌+lj稻田土壤)；lj+lhl01(s4453-8菌剂+lj稻田土壤)每个处理共设置3个重复。
[0083]
挑选颗粒饱满且大小匀称的水稻种子，用75％乙醇浸泡1min，用无菌水冲洗3次后，再用5％的次氯酸钠浸泡5min，随后用无菌水清洗多次，将表面消毒的水稻种子置于放有湿润无菌滤纸的培养皿内，置于25℃培养箱内培养24h催芽。2d后露出芽播种到苗床中。当苗约为10cm高时，称取5kg重金属污染土壤置于花盆，将10株幼苗移栽在花盆中。种植20d后，观察水稻生长情况，测定水稻的株高、地上部鲜重、干重和地下部干重。
[0084]
结果如表3所示，xw和lj处理的植株矮小，根系发育受到抑制，地上部和地下部生物量较低。相反地，添加s4453-8菌剂对水稻生长发育的促进作用较佳。xw+s4453-8和lj+s4453-8处理的株高分别为66.85和52.14cm，根长分别为28.25和22.57cm地上部鲜重和干重分别为16.85和1.42g；13.42和1.24g，地下部干重分别为0.15和0.13g。可见，s4453-8菌剂能够明显促进水稻的生长及地上和地下部生物量的积累，为促进重金属污染土壤植物生长发育提供科学支撑，对于改善重金属污染土壤的生态环境健康和安全具有重要的经济价值和现实意义。
[0085]
表3菌剂s4453-8对重金属污染土壤水稻生长的促进效果
[0086][0087]
综上，本发明提供一株耐受多种重金属并具有植物促生特性的氧化假节杆菌(pseudarthrobacter oxydans)s4453-8，研究显示菌株s4453-8能够耐受不同高浓度的重金属，并具有分泌iaa和促进植物生长的特性。其中，在高浓度cd
2+
、cr
6+
和as
3+
下对水稻种子催芽能力最强。此外，在重金属污染区域(cd、cr和as)上的土壤添加s4453-8菌剂，能够明显促进水稻的生长及地上和地下部生物量的积累，将有效缓解重金属对植物的胁迫，为利用植物促生菌修复治理并恢复重金属污染土壤的生态生产功能，促进重金属污染土壤植物生长发育提供科学支撑，对于改善重金属污染土壤的生态环境健康和安全具有重要的经济价值和现实意义。
[0088]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一株耐受多种重金属且促进植物生长的氧化假节杆菌(pseudarthrobacter oxydans)s4453-8，其特征在于，该菌株已于2023年05月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no.63497。2.权利要求1所述氧化假节杆菌s4453-8或其菌液在促进水稻发芽或在制备促进水稻发芽制剂中的应用。3.权利要求1所述氧化假节杆菌s4453-8或其菌液在促进植物生长和/或在重金属环境下促进植物生长中的应用。4.权利要求1所述氧化假节杆菌s4453-8或其菌液在缓解重金属对植物的胁迫中的应用。5.权利要求1所述氧化假节杆菌s4453-8或其菌液在制备重金属耐受制剂或在制备植物生长素中的应用。6.权利要求1所述氧化假节杆菌s4453-8或其菌液在制备促生剂和/或耐重金属促生剂中的应用。7.根据权利要求3～6任一所述应用，其特征在于，所述重金属为cd
2+
、cu
2+
、pb
2+
、cr
6+
、as
3+
中的一种或多种。8.一种植物促生剂或耐重金属促生剂，其特征在于，含权利要求1所述氧化假节杆菌s4453-8或其菌液。9.根据权利要求8所述促生剂，其特征在于，所述菌液浓度不低于1
×
108cfu/ml。10.一种促进植物生长或在重金属环境下促进植物生长的方法，其特征在于，采用氧化假节杆菌(pseudarthrobacter oxydans)s4453-8菌株或其菌液对植物进行处理，或采用权利要求8或9所述促生剂进行处理。

技术总结
本发明公开了一株耐受多种重金属的植物促生细菌及其应用。本发明分离得到一株氧化假节杆菌(Pseudarthrobacter oxydans)s4453-8，该菌株已于2023年05月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.63497。菌株s4453-8能够耐受不同高浓度的重金属，并具有分泌IAA和促进植物生长的特性，在高浓度Cd


技术研发人员：蔺中 吴伟健 甄珍 阳长洪 杨贵琼
受保护的技术使用者：广东海洋大学
技术研发日：2023.07.21
技术公布日：2023/10/6