一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法与流程

1.本发明涉及环境工程与微生物工程领域，具体涉及一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法。


背景技术：

2.现有一种利用微生物降解环境中化学农药污染的方法，主要是利用有机农药成为碳源，接种能够分解此种农药的菌株，并通过分离与鉴定来筛选出接种能够分解此种农药的菌株，是一种非常经济且有效的方法。
3.而如何分离能够降解此种农药的菌株以及鉴定菌株的降解能力、生长环境等成为热门课题。
4.为了分离出降解菌株并鉴定菌株的降解因素与所需环境，常用的方法为在msm平板中添加农药溶液，在lb平板中添加农药溶液，以及在lb平板中不添加农药溶液来稀释涂布筛选农药的降解菌株，但在实际培养分离的过程中，由于需要lb扩大培养去验证降解功能，导致验证的时间长，工作量大，筛选的成功率低。
5.其次，由于需要进行扩大培养，在分离与鉴定时，其培养体系过大，导致每次挑单菌验证的工作量增加，包括试剂和耗材的准备，在培养设备中占用的空间大，单次筛选出的样本少，而影响菌株的生长因素多，导致其鉴定效率低。
6.现需要一种能够快速大量分离与鉴定菌株的方法，从而进一步提高对有机农药降解单菌筛选的成功率。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，以解决现有技术中降解菌株的分离与鉴定效率低下的技术问题。
8.为解决上述技术问题，本发明具体提供下述技术方案：
9.本发明提供了一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，包括如下步骤：
10.取富集液用无菌水梯度稀释，然后分别取各梯度的所述富集液涂布于lb固体培养基上，对固体培养基进行培养，以获得多种菌落；
11.向96孔无菌pcr板中的孔中，依次加入a份无菌msm、单个所述菌落，混合均匀，再依次加入b份无菌msm、有机农药的水溶液，以制得混合液；
12.其中，不同浓度梯度所述富集液制得的所述菌落放置在所述pcr板不同的孔中，得到不同的所述混合液；
13.对所述混合液进行震荡培养，以制得反应液；
14.取所述反应液，加入c份无菌msm稀释，离心处理，取上清液，以得到样品；
15.对上所述样品依次进行紫外分光光度计扫描，吸收峰形状发生变化的所述样品内含有降解菌株。
16.作为本发明的一种优选方案，所述a份无菌msm为10μl，所述b份无菌msm为185μl。
17.作为本发明的一种优选方案，在所述混合液中，所述有机农药的浓度为250mg/l；
18.其中，所述有机农药的水溶液的体积为5μl，浓度为10g/l。
19.作为本发明的一种优选方案，所述有机农药为对氯苯氧乙酸钠。
20.作为本发明的一种优选方案，所述震荡培养包括如下步骤：
21.所述pcr板封膜处理，放置在150rpm的旋转震荡培养箱中培养5天；
22.其中，所述混合液的ph为7.0，所处的环境温度为30℃。
23.作为本发明的一种优选方案，所述反应液的体积与所述c份无菌msm的体积比为15：85。
24.作为本发明的一种优选方案，所述离心处理满足以下条件：转速为12000rpm，时间为1min；
25.所述扫描的波长范围为200-350nm。
26.作为本发明的一种优选方案，所述富集液的稀释梯度为10 ‑4，10 ‑5，10-6
，10 ‑7。
27.作为本发明的一种优选方案，所述固体培养基的培养包括如下步骤：
28.分别取10 ‑4，10 ‑5，10 ‑6，10 ‑7各浓度梯度的所述富集液100μl，涂布于lb固体培养基上；
29.将所述lb固体培养基置于35℃下恒温培养1-2天，以获得多种所述菌落。
30.本发明与现有技术相比较具有如下有益效果：
31.本发明不用lb扩大培养去验证降解功能，直接从平板中挑取单菌至含有msm中培养验证，节省了中间lb培养再收菌体的操作，可以缩短验证的时间，同时也大大减少了工作量。
32.本发明使用的体系减少，试剂和耗材的使用量大大减少，在培养设备中占用的空间也很少，成本降低；本发明在不增加操作步骤的基础上，单次可以得到大量样本，通量增加；发明一次筛选的单菌数量多，成功筛选有效降解菌的效率大大提升。
33.本发明在此分离方法与鉴定方法能够用于多种农药降解菌株的分离与鉴定，在实际操作上为有机农药的生物分解领域提供了一种新的且高效的分离以及鉴定方法，提高了生物分解领域在分解有机农药中的应用范围。
附图说明
34.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
35.图1为本发明提供一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法的流程示意图；
36.图2为本发明提供实施例中对氯苯氧乙酸钠降解富集液的紫外扫描图谱；
37.图3为本发明提供图2所示实施例中的96孔pcr板筛选对氯苯氧乙酸钠降解菌株的紫外扫描图谱；
38.图4为本发明提供图2所示实施例中的纯化菌株降解对氯苯氧乙酸钠的紫外扫描图谱；
39.图5为本发明提供图2所示实施例中的纯化后的降解菌株单菌形态图；
40.图6为本发明提供对氯苯氧乙酸钠标准曲线；
41.图7为本发明提供降解过程的紫外扫描图谱和hplc图谱；
42.图8为本发明提供对氯苯氧乙酸钠的降解曲线；
具体实施方式
43.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
44.在筛选降解对氯苯氧乙酸钠的单菌时，运用现有的方法，比如在msm平板中添加50mg/l的对氯苯氧乙酸钠，在lb平板中添加50mg/l的对氯苯氧乙酸钠，以及在lb平板中不添加50mg/l的对氯苯氧乙酸钠来稀释涂布筛选对氯苯氧乙酸钠降解菌株，均未能筛选出稳定降解对氯苯氧乙酸钠的单菌。推测有可能是培养基缺少某些物质，比如微量元素，在msm中添加微量元素进行培养后紫外扫描发现仍然没有降解的功能。同时也推测是有可能由2种甚至多种微生物同时起作用，因此测试不同的单菌混合验证，仍然没有发现降解的功能。
45.产生上述问题的主要原因为菌株在培养制备过程中的影响因素过多，均可能对筛选造成影响，为了能够快速的筛选出能够降解对氯苯氧乙酸钠的单菌，本发明提供了以对氯苯氧乙酸钠为具体实施例，提供了一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，具体如下。
46.试验例1：
47.1、富集：从长期生产对氯苯氧乙酸钠的四川国光农化股份有限公司生产基地的排污口采集污水，并对其进行驯化和富集培养。
48.具体方法如下：量取1ml污水接种至含有50mg/l对氯苯氧乙酸钠的灭菌msm培养基中；在30℃、150rpm的旋转震荡培养箱中培养5天，然后取5ml该培养液转接到相同的新鲜msm中继续培养，经过3次转接后，得到目的富集液。
49.2、筛选：取富集液用无菌水梯度稀释至10 ‑7，然后分别取10 ‑4，10 ‑5，10 ‑6，10 ‑7各100μl涂布于lb固体培养基上，使菌落均匀地分布于培养基表面，最后将培养皿置于35℃恒温培养箱中培养1-2天；
50.待培养基表面长出菌落，用枪头随机挑取48个单菌落至96孔无菌pcr板中，48个孔提前先加入10μl无菌msm，之后用枪头吹打混匀，再补充185μl无菌msm；
51.最后再加入5μl对氯苯氧乙酸钠(10g/l)，使其终浓度为250mg/l；
52.将96孔板封膜后放置在30℃、150rpm的旋转震荡培养箱中培养5天，之后取150μl反应液，再加入850μl无菌msm稀释，12000rpm离心1min后取上清，由紫外分光光度计对200-350nm波长范围进行扫描，对比标准品对照组与处理组吸收峰的形状初步确定对氯苯氧乙酸钠是否降解，吸收峰形状发生变化的样品为初筛得到的降解菌株。
53.3、纯化：将降解菌株剩余50μl反应接种至3mllb中培养过夜，用无菌枪头挑菌在固体lb培养基中划线培养，直至分离出降解对氯苯氧乙酸钠性状稳定的单菌落。
54.4、保存：配制80％的甘油，准备1.5ml的离心管，在121℃高温高压20min，灭菌结束后80％甘油放置于超净工作台中冷却至室温，1.5ml离心管于50℃烘箱中干燥，在离心管中加入800μl菌悬液和200μl的80％甘油充分混匀，放置于-80℃的冰箱中冷冻保藏。
55.以下通过试验例2，验证实施例是否成功实现了对对氯苯氧乙酸钠的降解菌株的快速分离。
56.试验例2：
57.通过紫外-可见分光光度扫描检测到经3次传代培养的富集液，发现对氯苯氧乙酸钠已经降解，该富集液在5天内能够降解5mg的对氯苯氧乙酸钠(图2)。通过200-350nm波长范围的扫描结果表明，与标准品对照组相比，处理组(富集液中)的对氯苯氧乙酸钠吸收峰强度明显降低，并且峰型发生变化，推测对氯苯氧乙酸钠完全降解。
58.将具有降解对氯苯氧乙酸钠效果的富集液进行梯度稀释，取10 ‑4、10 ‑5、10 ‑6梯度的稀释液涂布在lb固体培养基上，35℃培养1至2天，待菌体长大后，随机挑取48个单菌至96孔pcr板中。48个孔提前先加入10μl无菌msm，之后用枪头吹打混匀，再补充185μl无菌msm。最后再加入5μl对氯苯氧乙酸钠(10g/l)，使其终浓度为250mg/l，将96孔板封膜后放置在30℃、150rpm的旋转震荡培养箱中培养5天。
59.取150μl反应液，再加入850μl无菌msm稀释，12000rpm离心1min后取上清，经紫外分光光度计扫描，和对照组相比，发现d2孔的上清紫外吸收峰形状发生变化(图3)，将d2孔剩余50μl反应液接种至3mllb中培养过夜。将过夜培养的菌继续在固体lb培养基中划线培养，至长出单菌落后，再接种至3mllb液体培养基中过夜培养，取1ml菌液，5000rpm离心3min后用无菌msm洗涤2次，再用无菌msm重悬，接种至10ml含有50mg/l对氯苯氧乙酸钠的msm中培养5天，紫外扫描与富集液峰型一致，已降解(图4)，纯化后的降解菌株单菌形态见图5。
60.试验例3：
61.1、对氯苯氧乙酸钠浓度的测定
62.高效液相色谱(hplc)法：取500μl经过msm培养后的对氯苯氧乙酸钠降解液，加入500μl甲醇混匀后，12000rpm离心后取上清，样品经过0.22μm的有机相滤头过滤后，用于hplc检测。
63.色谱条件：色谱柱：c-18反相色谱柱(250mm
×
4.6mm
×
5um)；柱温：40℃；a、b流动相比例为甲醇：0.25％醋酸溶液(60：40)；检测波长280nm；流速：0.8ml/min；进样量：20μl。
64.对氯苯氧乙酸钠标准曲线的制作：通过梯度稀释法将对氯苯氧乙酸钠稀释至浓度为25mg/l，50mg/l，100mg/l，200mg/l，400mg/l，然后通过hplc检测对氯苯氧乙酸钠的280nm处的峰面积，通过对对氯苯氧乙酸钠的浓度和hplc检测得到的对应峰面积，建立对氯苯氧乙酸钠的浓度标准曲线(图6)，拟合后得到一次方程：y＝0.0001x+0.1974，r2＝0.9999。
65.2、降解菌株菌悬液的制备
66.挑取试验例1中过夜培养的降解菌株单菌落，接种至100ml lb液体培养中，30℃，150rpm培养16h后，5000rpm离心5min收集菌体，用灭菌的msm洗涤三次，然后用灭菌的msm重悬，调至所需浓度备用，即为降解菌株种子液。
67.3、降解菌株降解对氯苯氧乙酸钠的降解曲线
68.将降解菌株种子液接种到msm中，调节菌体初始浓度od600至0.1，添加终浓度为50mg/l的对氯苯氧乙酸钠作为培养基中的唯一碳源于30℃，150rpm恒温摇床培养，每6h取样，监测对氯苯氧乙酸钠的残余浓度和中间产物生成情况。通过hplc检测对对氯苯氧乙酸钠浓度进行定量。对氯苯氧乙酸钠降解过程中，通过用紫外分光光度计扫描以及hplc同步检测可以看到，在第6h能检测到中间产物，在第18-24小时之间达到峰值，随后浓度降低(图
7)。将测得的样品峰面积代入到标准曲线公式中计算出待测样品中对氯苯氧乙酸钠浓度，制作降解曲线(图8)，在24h内50mg/l的对氯苯氧乙酸钠已完全降解。
69.通过本试验，进一步说明试验1中的方法筛选得到的降解菌株，能够高效降解对氯苯氧乙酸钠。
70.根据试验例2与试验例3可知，通过在lb平板稀释涂布，然后挑单菌至96孔pcr板大规模微量(体系200μl)培养筛选的方法，能够在短时间内成功筛选出一株能够降解对氯苯氧乙酸钠的菌株，并且能够以对氯苯氧乙酸钠为唯一碳源生长，筛选效率高。
71.此分离方法与鉴定方法可以用于多种农药降解菌株的分离与鉴定，为农药的生物分解领域提供了一种新的且高效的分离鉴定方式。
72.该方法与现有方法的不同之处在于：
73.1：不用lb扩大培养去验证降解功能。为了提高菌落数量，提高筛选的效率，现有的方式是先从平板中挑取单菌至lb中过夜培养，然后再收集菌体转移至含有50mg/l的msm中培养5天验证。而本方法直接从平板中挑取单菌至含有50mg/l的msm中培养5天验证，节省了中间lb培养再收菌体的操作，可以缩短验证的时间，同时也大大减少了工作量。
74.2：体系减少。现有的方法需要用20ml的msm培养验证，每次挑单菌验证的工作量较大，试剂和耗材的准备多，在培养设备中占用的空间大，成本高。而本次方法只需要用200μl的msm培养验证，通过与96孔板进行结合，同时得到多个样品，试剂和耗材的使用量大大减少，在培养设备中占用的空间减少，成本与相比之前大大降低。
75.3：通量大大增加，现有的方法单次样品少，工作量大，本方法由于体量降低，在与多孔孔板配合后，在不增加操作步骤的基础上，单次可以得到大量样本。
76.4：单菌筛选效率提升：现有的方法一次筛选单菌有可能找不到需要的降解菌，因此要重复挑单菌培养再继续筛选，成功率低。本次方法一次筛选的单菌数量多，成功筛选有效降解菌的效率大大提升。
77.通过本实施例的菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，可以缩短验证的时间，同时也大大减少了工作量，试剂和耗材的使用量大大减少，在培养设备中占用的空间也很少，成本与相比之前下降，通量增加，单菌筛选效率提升。
78.以上实施例仅为本技术的示例性实施例，不用于限制本技术，本技术的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本技术的实质和保护范围内，对本技术做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本技术的保护范围内。

技术特征：
1.一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：取富集液用无菌水梯度稀释，然后分别取各梯度的所述富集液涂布于lb固体培养基上，对固体培养基进行培养，以获得多种菌落；向96孔无菌pcr板中的孔中，依次加入a份无菌msm、单个所述菌落，混合均匀，再依次加入b份无菌msm、有机农药的水溶液，以制得混合液；其中，不同浓度梯度所述富集液制得的所述菌落放置在所述pcr板不同的孔中，得到不同的所述混合液；对所述混合液进行震荡培养，以制得反应液；取所述反应液，加入c份无菌msm稀释，离心处理，取上清液，以得到样品；对上所述样品依次进行紫外分光光度计扫描，吸收峰形状发生变化的所述样品内含有降解菌株。2.根据权利要求1所述的一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，其特征在于，所述a份无菌msm为10μl，所述b份无菌msm为185μl。3.根据权利要求1所述的一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，其特征在于，在所述混合液中，所述有机农药的浓度为250mg/l；其中，所述有机农药的水溶液的体积为5μl，浓度为10g/l。4.根据权利要求3所述的一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，其特征在于，所述有机农药为对氯苯氧乙酸钠。5.根据权利要求1所述的一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，其特征在于，所述震荡培养包括如下步骤：所述pcr板封膜处理，放置在150rpm的旋转震荡培养箱中培养5天；其中，所述混合液的ph为7.0，所处的环境温度为30℃。6.根据权利要求1所述的一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，其特征在于，所述反应液的体积与所述c份无菌msm的体积比为15：85。7.根据权利要求1所述的一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，其特征在于，所述离心处理满足以下条件：转速为12000rpm，时间为1min；所述扫描的波长范围为200-350nm。8.根据权利要求1所述的一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，其特征在于，。所述富集液的稀释梯度为10-4
，10-5
，10-6
，10-7
。9.根据权利要求8所述的一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，其特征在于，所述固体培养基的培养包括如下步骤：分别取10-4
，10-5
，10-6
，10-7
各浓度梯度的所述富集液100μl，涂布于lb固体培养基上；将所述lb固体培养基置于35℃下恒温培养1-2天，以获得多种所述菌落。

技术总结
本发明公开了一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，包括如下步骤：取生产有机农药后的排放污水进行驯化和富集培养，得到富集液；取所述富集液涂布于LB固体培养基上，以获得多种菌落；向96孔无菌PCR板的孔中，依次加入A份无菌MSM、单个所述菌落，混合均匀，再依次加入B份无菌MSM、有机农药的水溶液，以制得混合液；对所述混合液进行震荡培养，以制得反应液；取所述反应液，加入C份无菌MSM稀释，离心处理，取上清液，以得到样品；对上所述样品依次进行紫外分光光度计扫描，吸收峰形状发生变化的所述样品内含有降解菌株。发明提高了有效菌株的筛选效率，通过减少反应体系、提高单次实验通量，缩短降解菌株验证的时间，成本降低。成本降低。成本降低。


技术研发人员：刘诗燕 刘辉超 刘洪明
受保护的技术使用者：上海信诺佰世医学检验有限公司
技术研发日：2023.07.12
技术公布日：2023/10/6