一类水溶性方酸菁染料及其合成方法和应用

1.本发明涉及有机染料技术领域，尤其涉及一类水溶性方酸菁染料及其合成方法和应用。


背景技术：

2.细胞膜是位于细胞外围，由磷脂双层组成的弹性半透膜，由于其具有选择性和渗透性，在调节物质交换和维持细胞内环境的稳定性方面尤为重要，细胞膜的异常也通常被用作一些相关疾病的参考指标。而荧光成像作为一种高灵敏度和高分辨率的技术，目前已被广泛应用于细胞膜成像方面，在细胞膜实时成像和检测方面具有重要作用。
3.光热疗法是利用光热材料将外部光源转化为局部热能，使蛋白质、核酸或其他细胞内生物大分子变性，影响细胞膜通透性，最终造成不可逆的损伤，可应用于消融微生物或癌症。作为一种微创的局部癌症治疗方法，具有非侵入性和远程可控性等优点，近些年来受到研究者们的广泛关注。
4.然而，目前研究的细胞膜荧光染料仍存在一些缺点，例如，低信噪比，较高的细胞毒性，容易发生光漂白等，阻碍了它们的应用。并且，能够靶向细胞膜进行光热治疗的染料，目前的报道还比较少。因此，合成一例具有高信噪比，良好生物相容性的细胞膜靶向光热剂，对于癌症的实时成像与治疗，是十分必要的。


技术实现要素：

5.针对现有细胞膜荧光染料存在低信噪比，较高的细胞毒性，容易发生光漂白等问题，本发明的目的在于提供一类水溶性方酸菁染料及其合成方法和应用，通过设计合成一种两亲型的方酸染料，在刚性的氮杂吲哚方酸菁染料中引入亲水的二甘醇胺，调节亲疏水性质，使其可以精准的定位于细胞膜上。同时，其聚集形态的改变也进一步改善了在生物体内的光热性能，实现实时的生物成像与治疗。
6.为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一类水溶性方酸菁染料，具有通式i的结构：
[0007][0008]
通式i中，
[0009]
r1和r4各自独立的选自具有1-18个碳的羧烷基、羟基、烷基磺酸盐中的至少一种；
[0010]
r2和r3各自独立的选自氢、芳基、具有1-4个碳的烷基中的至少一种。
[0011]
进一步地，所述r1和r4各自独立的选自具有如下结构基团中的任意一种：
[0012][0013]
进一步地，
[0014]
所述r2和r3各自独立的选自具有如下结构基团中的任意一种：
[0015][0016]
一类水溶性方酸菁染料的合成方法，包括如下步骤：
[0017]
(1)将羧基取代的7-氮杂吲哚j-1加入甲醇溶液中，在0℃下，缓慢滴加socl2，反应3-5h后，在60-80℃回流3-6h，随后加入带有r1取代的胺，在40-70℃下反应3-5h，得到中间体j-2；
[0018]
(2)在50-120℃下，将步骤(1)制得的中间体j-2溶解在第一有机溶剂中，加入带有r2取代的卤代烷烃进行反应，得到中间体j-3；
[0019][0020]
(3)在70-120℃下，将步骤(2)制得的中间体j-3溶解在第二有机溶剂中，加入方酸，在第一有机碱的催化下发生缩合，经纯化后得到中间体j-4；
[0021][0022]
(4)在100-120℃下，将步骤(3)制得的中间体j-4溶解在第三有机溶剂中，加入带有r3、r4取代的5-酰胺-2,3,3-三甲基-3h-吡咯并[2,3-b]吡啶季铵盐s-1，在第二有机碱的催化下发生缩合反应，得荧光染料。
[0023][0024]
进一步地，在步骤(2)中，所述第一有机溶剂选自苯、甲苯、邻二氯苯、乙腈、丙酮中的至少一种。
[0025]
进一步地，在步骤(3)中，所述第二有机溶剂选自乙醇、乙酸、乙酸酐、dmf、正丁醇、原甲酸三甲酯、原甲酸三乙酯中的至少一种；
[0026]
所述第一有机碱选自三乙胺、吡啶和dipea中的至少一种。
[0027]
进一步地，在步骤(4)中，所述第三有机溶剂选自乙醇、乙酸、乙酸酐、dmf、原甲酸三甲酯、原甲酸三乙酯中的至少一种；
[0028]
所述第二有机碱选自三乙胺、吡啶和dipea中的至少一种。
[0029]
进一步地，在步骤(2)中，加入带有r1取代的胺，在40-70℃下反应3-5h后，经过重
结晶纯化，得到中间体j-3，其中重结晶所用溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚中的至少一种。
[0030]
一类水溶性方酸菁染料在生物和医药领域中的应用。
[0031]
更进一步地，用于细胞成像以及肿瘤光热治疗方面的应用。
[0032]
进一步地，应用时激发波长为600-950nm，荧光检测波长为650-1000nm。
[0033]
综上所述，本发明具有以下有益效果：
[0034]
1、本发明所述染料，由于亲水性的基团的引入，改变分子的亲疏水性质，染料母体中的亲脂性结构使其可以进入细胞，而两端连接的亲水性的柔性链与脂质层排斥，使染料精准的定位于细胞膜上，从而使其实现实时的细胞成像。
[0035]
2、本发明通过对氮杂吲哚类方酸菁染料的改性，使得所述染料的水溶性明显增强，解决了氮杂吲哚类方酸菁染料在水溶液中易于聚集问题的同时使染料分子更容易产生分子振动，改善了在生物体内的光热性能，体外及细胞实验均显示出良好的光热效果，并且染料具有良好的生物相容性，可以应用于肿瘤光热治疗等方面。
附图说明
[0036]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0037]
图1是本发明实施例1制得的化合物1的高分辨质谱图；
[0038]
图2是本发明实施例1制得的化合物1、化合物2、化合物3在二氯甲烷中的归一化发射光谱图；
[0039]
图3是本发明实施例1制得的化合物1的mtt实验图；
[0040]
图4是本发明实施例2制得的化合物2的mtt实验图；
[0041]
图5是本发明实施例3制得的化合物3的mtt实验图；
[0042]
图6是本发明实施例制得的化合物1、化合物2、化合物3与对比例在细胞中的共聚焦成像图。
具体实施方式
[0043]
以下，进一步对本发明进行详细说明。
[0044]
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
[0045]
本发明中使用的术语“mtt”指的是一种检测细胞存活和生长的方法。
[0046]
实施例中所采用的仪器和设备：
[0047]
本发明柱层析过程中，采用购于青岛美高集团有限公司的200-300目、100-200目柱色谱硅胶和购于天大化学试剂厂的20-40目分析纯石英砂。
[0048]
在检测化合物过程中，质谱仪器用美国waters公司的synapt g2-si hdms高分辨质谱仪，采用双喷针电喷雾离子源，对化合物进行正负模式检测。
[0049]
染料吸收和发射光谱用agilent公司的cary 60紫外可见分光光度计和cary eclipse荧光分光光度计测得。
[0050]
细胞毒性试验用美国thermofisher公司的varioskan lux multimode microplate reader仪器测得。
[0051]
细胞摄取实验用日本的olympus公司的单光子共聚焦显微镜仪器测得。
[0052]
以下结合实施例对通式i所示的细胞膜靶向的方酸菁染料进行详细说明。
[0053][0054]
通式i中，
[0055]
r1和r4各自独立的选自具有如下结构基团中的任意一种：
[0056][0057][0058][0059]
r2和r3各自独立的选自具有如下结构基团中的任意一种：
[0060][0061]
以下，举出由通式i所标示的化合物的具体例，但本发明并不限于这些具体例。
[0062][0063]
本发明通式i所示的化合物的合成机理为：
[0064]
[0065][0066]
本发明由通式i所示的化合物可通过下述记载的方法合成。
[0067]
实施例
[0068]
实施例1
[0069]
制造r1和r4相同均为羟基、r2和r3相同为甲基的化合物1
[0070]
(1)制造中间体1.1
[0071][0072]
将羧基取代的7-氮杂吲哚(1g,4.90mmol)加入20ml甲醇溶液中，在0℃下，缓慢滴加4mlsocl2，反应3h后转入油浴中，升高温度至60℃，回流6h，随后加入2.6ml二甘醇胺，在50℃下反应3-5h，经过浓缩，得到中间体1.1(0.42g,1.44mmol,产率为29％)。
[0073]
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+
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15h22
n3o
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,292.1661；found,292.1658.
[0074]1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ8.79(d,j＝1.6hz,1h),8.53(t,j＝6.8hz,1h),8.30(d,j＝1.6hz,1h),4.24(t,j＝7.4hz,1h),3.70
–
3.51(m,8h),2.66(s,3h),1.36(s,6h).
[0075]
(2)制造中间体1.2
[0076][0077]
在65℃下，将步骤(1)制得的中间体1.1溶解在20ml乙腈中，加入碘甲烷(0.82g,5.77mmol)进行反应，经过重结晶纯化，得到中间体1.2(0.34g,1.11mmol,产率为77％)。
[0078]
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16h24
n3o
3+
,306.1812；found,306.1813.
[0079]
(3)制造化合物1
[0080][0081]
在115℃下，将步骤(2)制得的中间体1.2溶解在10ml正丁醇中，加入方酸(0.07g,0.57mmol)进行缩合反应，经柱层析纯化后得到化合物1(0.025g,0.04mmol,产率为6％)。
[0082]
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+
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36h45
n6o
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,689.3283；found,689.3299.
[0083]1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ8.86(d,j＝1.4hz,1h),8.74(d,j＝1.4hz,1h),8.37
–
8.26(m,2h),8.12
–
8.02(m,2h),7.98(d,j＝1.4hz,1h),7.24(s,1h),4.08
–
3.98(m,5h),3.68
–
3.50(m,16h),3.39(s,3h),1.52(s,6h),1.41(s,6h)(参照图1).
[0084]
实施例2
[0085]
制造r1和r4相同均为羧基、r2和r3相同为甲基的化合物2
[0086]
(1)制造中间体2.1
[0087][0088]
将羧基取代的7-氮杂吲哚(1g,4.90mmol)加入20ml甲醇溶液中，在0℃下，缓慢滴加4ml socl2，反应5h后转入油浴中，升高温度至60℃，回流6h，随后加入2.8ml氨基-单乙二醇-羧酸，在40℃下反应5h，经过浓缩，得到中间体2.1(0.51g,1.60mmol,产率为33％)。
[0089]
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+
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16h22
n3o
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,320.1610；found,320.1601.
[0090]1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ8.79(d,j＝1.6hz,1h),8.64(td,j＝6.6,0.9hz,1h),8.30(d,j＝1.4hz,1h),3.76(t,j＝7.1hz,2h),3.66
–
3.50(m,4h),2.63(s,3h),2.49(t,j＝7.0hz,2h),1.36(s,6h).
[0091]
(2)制造中间体2.2
[0092][0093]
在65℃下，将中间体2.1溶解在20ml乙腈中，加入碘甲烷(0.85g,6.00mmol)进行反应，经过重结晶纯化，得到中间体2.2(0.36g,1.08mmol,产率为67％)。
[0094]
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+
for c
17h24
n3o
4+
,334.1761；found,334.1750.
[0095]
(3)制造化合物2
[0096][0097]
在115℃下，将步骤(2)制得中间体2溶解在10ml正丁醇中，加入方酸(0.07g,0.57mmol)进行缩合反应，经柱层析纯化后得到化合物2(0.028g,0.04mmol,产率为7％)。
[0098]1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ8.86(d,j＝1.4hz,1h),8.40(d,j＝1.6hz,1h),8.37
–
8.30(m,1h),8.27(s,1h),8.10
–
8.02(m,2h),7.98(d,j＝1.4hz,1h),7.24(s,1h),4.06(s,3h),3.76(t,j＝7.1hz,4h),3.66
–
3.51(m,8h),3.39(s,3h),2.50(t,j＝7.1hz,4h),1.60(s,6h),1.42(s,6h).
[0099]
实施例3
[0100]
制造r1和r4相同均为烷基磺酸盐、r2和r3相同为甲基的化合物1
[0101]
(1)制造中间体3.1
[0102][0103]
将羧基取代的7-氮杂吲哚(1g,4.90mmol)加入20ml甲醇溶液中，在0℃下，缓慢滴加4ml socl2，反应5h后转入油浴中，升高温度至60℃，回流6h，随后加入2.4ml 3-氨基丙烷
磺酸，在40℃下反应3-5h，经过浓缩，得到中间体3.1(0.58g,1.64mmol,产率为33％)。
[0104]
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15h20
n3o5s-,354.1129；found,354.1140.
[0105]1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ8.79(d,j＝1.4hz,1h),8.62(t,j＝6.8hz,1h),8.30(d,j＝1.4hz,1h),3.69(t,j＝7.1hz,2h),3.65
–
3.59(m,2h),3.59
–
3.50(m,2h),3.35(t,j＝7.1hz,2h),2.52(s,3h),1.37(s,6h)
.
[0106]
(2)制造中间体3.2
[0107][0108]
在65℃下，将步骤(1)制得的中间体3.1溶解在20ml乙腈中，加入碘甲烷(0.92g,6.56mmol)进行反应，经过重结晶纯化，得到中间体3.2(0.43g,1.16mmol,产率为71％)。
[0109]
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+
for c
16h24
n3o5s
+
,370.1437；found,370.1402.
[0110]
(3)制造化合物3
[0111][0112]
在115℃下，将将步骤(2)制得的中间体3.2溶解在10ml正丁醇中，加入方酸(0.07g,0.57mmol)进行缩合反应，经柱层析纯化后得到化合物3(0.027g,0.03mmol,产率为6％)。
[0113]1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ8.86(d,j＝1.4hz,1h),8.73(d,j＝1.6hz,1h),8.34
–
8.26(m,1h),8.23(s,1h),8.10
–
8.02(m,2h),7.98(d,j＝1.4hz,1h),7.24(s,1h),4.06(s,3h),3.70(t,j＝7.1hz,4h),3.65
–
3.51(m,8h),3.41
–
3.31(m,7h),1.60(s,6h),1.42(s,6h).
[0114]
对比例1
[0115]
制造化合物4
[0116]
(1)制造中间体4.1
[0117][0118]
将7-氮杂吲哚(1.00g,4mmol)和碘甲烷(1.77g,8mmol)加入含20ml丙酮的100ml双颈圆底烧瓶中，置于氮气中。然后加热混合物使反应回流一夜，反应终止，冷却至室温后，加入50ml乙醚沉淀，得到的固体沉淀经过过滤，用乙醚洗涤，干燥，得到棕色固体中间体4.1(1.64g,5.4mmol,产率为87％)。
[0119]
(2)制造化合物4
[0120][0121]
在氮气保护下，将方酸(300mg,2.6mmol)与化合物1.2(1.59g,5.3mmol)在原甲酸三乙酯和正丁醇的混合溶剂中于120℃下加热反应，搅拌2h后停止反应，待反应液降至室温后将其逐滴滴加到150ml乙醚中重结晶，得到的粗产品经硅胶柱纯化，然后以80:1二氯甲烷/甲醇(v/v)为洗脱溶剂，用硅胶层析对粗产品进行纯化，得到蓝色固体化合物4(0.067g,0.16mmol,产率为6％)
[0122]
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+
for c
26h26
n4o
2+
,427.2129；found,427.2130.
[0123]1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ8.25(d,j＝4.7hz,2h),7.60(d,j＝7.2hz,2h),7.05(dd,j＝7.3,5.1hz,2h),6.07(s,2h),3.68(s,6h),1.80(d,j＝6.1hz,12h).
[0124]
性能检测
[0125]
对上述实施例1-3及对比例1制备的化合物进行如下性能测试，测试方法如下：
[0126]
测试例1
[0127]
对上述实施例制得的化合物1、化合物2、化合物3的荧光光谱测定
[0128]
用万分之一天平精确称量经过真空干燥后的染料，配制2mmol/l的dmso染料母液于棕色样品瓶中，在4℃冰箱中保存备用。
[0129]
测试紫外可见吸收光谱和荧光光谱时，用微量移液枪量取3μl的染料母液，并将其溶于含有3ml待测溶剂的石英比色皿中，混合均匀，得到染料的浓度为2.0μmol/l，用于吸收光谱和荧光发射光谱的测试。所有测试均在25℃下完成。
[0130]
图2为化合物1、化合物2、化合物3在二氯甲烷中的归一化发射光谱图；
[0131]
如图2所示，在二氯甲烷溶液中，化合物1、化合物2、化合物3发射在640-750nm之间，处于近红外区域，近红外区域的发射有利于避免生物自发荧光的影响，可以具有更好的分辨率和呈现效果，因此这更加利于染料在生物成像及治疗方面的应用。
[0132]
测试例2
[0133]
对实施例制备的化合物1、化合物2、化合物3的细胞毒性实验
[0134]
染料分子对细胞的毒性通过mtt测定评估。其原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在490nm和570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
[0135]
将mcf-7细胞接种于96孔板中，孵育24h(每孔细胞数目为1
×
104个)。将含有不同浓度化合物1、化合物2、化合物3的dmem培养基分别加入孔中，给予光照/黑暗处理，孵育24h后通过mtt实验检测细胞活性。实验数据如图3、图4、图5所示。
[0136]
从图3、4、5可以看出，化合物1、化合物2、化合物3在mcf-7细胞中表现出了良好的生物相容性，这有利于染料在细胞中的特异性成像。同时，选取了不同浓度化合物1、化合物2、化合物3进行光毒性实验，结果表明，染料具有良好的光毒性效果，可以在300mw有效的杀死细胞，证实了染料在光照下能够高效的产生热量，从而具有优异的光热治疗效果，因此可以应用于生物成像与领域中。
[0137]
测试例3
[0138]
对实施例制得的化合物1、化合物2、化合物3及对比例1制得的化合物4进行细胞摄取实验
[0139]
将mcf-7细胞提前一天接种到共聚焦培养皿中，待细胞贴壁后，用pbs溶液清洗三次，随后加入2ml的培养基以及1μm的化合物1、化合物2、化合物3、对比例，用共聚焦激光扫描显微镜(clsm)拍摄细胞荧光图像，观察染料与细胞的摄取情况。激发波长为640nm，发射接收波段为650-700nm，实验数据如图6所示。
[0140]
从图6中可以看出，化合物1、化合物2、化合物3可以在2h内特异性的定位于细胞膜，而对比例化合物4进入了细胞，且在细胞中有强烈荧光，而未定位于细胞膜上。因此，可以发现引入水溶性的基团后，化合物1、化合物2、化合物3的水溶性增强，使其具有两亲性结构，更容易定位于细胞膜。染料母体中的亲脂性结构使其可以进入细胞，而两端连接的亲水性的柔性链与脂质层排斥，因而化合物1、化合物2、化合物3可以特异性的定位于细胞膜上，具有理想的荧光生物探针的潜力。
[0141]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一类水溶性方酸菁染料，其特征在于，具有通式i的结构：通式i中，r1和r4可以相同也可以不同，r1和r4各自独立的选自具有1-18个碳的羧烷基、羟基、烷基磺酸盐中的至少一种；r2和r3可以相同也可以不同，r2和r3各自独立的选自氢、芳基、具有1-4个碳的烷基中的至少一种。2.根据权利要求1所述的一类水溶性方酸菁染料，其特征在于，所述r1和r4相同，r1和r4各自独立的选自具有如下结构基团中的任意一种：-cooh-ohoh3.根据权利要求1所述的一类水溶性方酸菁染料，其特征在于，所述r2和r3相同，r2和r3各自独立的选自具有如下结构基团中的任意一种：4.权利要求1-3任意一项所述的一类水溶性方酸菁染料的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：如下步骤：(1)将羧基取代的7-氮杂吲哚j-1加入甲醇溶液中，在0℃下，缓慢滴加socl2，反应3-5h后，在60-80℃回流3-6h，随后加入带有r1取代的胺，在40-70℃下反应3-5h，得到中间体j-2；(2)在50-120℃下，将步骤(1)制得的中间体j-2溶解在第一有机溶剂中，加入带有r2取代的卤代烷烃进行反应，得到中间体j-3；
(3)在70-120℃下，将步骤(2)制得的中间体j-3溶解在第二有机溶剂中，加入方酸，在第一有机碱的催化下发生缩合，经纯化后得到中间体j-4；在100-120℃下，将制得的中间体j-4溶解在第三有机溶剂中，加入带有r3、r4取代的5-酰胺-2,3,3-三甲基-3h-吡咯并[2,3-b]吡啶季铵盐s-1，在第二有机碱的催化下发生缩合反应，得荧光染料。5.根据权利要求4所述的一类水溶性方酸菁染料的合成方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述第一有机溶剂选自苯、甲苯、邻二氯苯、乙腈、丙酮中的至少一种。6.根据权利要求4所述的一类水溶性方酸菁染料的合成方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述第二有机溶剂选自乙醇、乙酸、乙酸酐、dmf、正丁醇、原甲酸三甲酯、原甲酸三乙酯中的至少一种；所述第一有机碱选自三乙胺、吡啶和dipea中的至少一种。7.根据权利要求4所述的一类水溶性方酸菁染料的合成方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述第三有机溶剂选自乙醇、乙酸、乙酸酐、dmf、原甲酸三甲酯、原甲酸三乙酯中的至少一种；所述第二有机碱选自三乙胺、吡啶和dipea中的至少一种。8.根据权利要求4所述的一类水溶性方酸菁染料的合成方法，其特征在于，在步骤(2)中，加入带有r1取代的胺，在40-70℃下反应3-5h后，经过重结晶纯化，得到中间体j-3，其中重结晶所用溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚中的至少一种。9.权利要求1-3任意一项所述的一类水溶性方酸菁染料在生物和医药领域中的应用。10.根据权利要求9所述的一类水溶性方酸菁染料的应用，其特征在于，应用时激发波长为600-950nm，荧光检测波长为650-1000nm。

技术总结
本发明公开了一类水溶性方酸菁染料及其合成方法和应用。其中一类水溶性方酸菁染料，具有如下结构通式：本发明提供一类水溶性方酸菁染料及其合成方法和应用，通过设计合成一种两亲型的方酸染料，在刚性的氮杂吲哚方酸菁染料中引入亲水的二甘醇胺，调节亲疏水性质，使其可以精准的定位于细胞膜上。同时，其聚集形态的改变也进一步改善了在生物体内的光热性能，实现实时的生物成像与治疗。实现实时的生物成像与治疗。实现实时的生物成像与治疗。


技术研发人员：杜健军 刘圆 李鑫 潘静巍 樊江莉 彭孝军
受保护的技术使用者：大连理工大学宁波研究院
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/10/6