一种从低值海洋生物下脚料中提取活性肽的方法与流程

1.本发明涉及低值海洋生物下脚料回收利用提取活性肽技术领域，具体涉及一种从低值海洋生物下脚料中提取活性肽的方法。


背景技术：

2.黑虎虾(penaeus monodon)是一种大型虾类，通常身体呈黑色或深灰色，在海洋中生活，主要分布于热带和亚热带地区，如东南亚、印度洋和太平洋的沿岸水域。黑虎虾是一种重要的经济虾类，具有可食用的鲜美虾肉，其肉质鲜嫩、味道浓郁，因此在世界各地的烹饪中广受欢迎。它们适合用于多种烹饪方式，如煮、炒、蒸、烧烤等。在中国，黑虎虾主要产自南部和东南沿海的地区，这些地区的气候条件和水质都比较适合黑虎虾的生长和养殖。
3.海洋水产品的下脚料主要是通过酶解下脚料用来获取活性物质，人们可以通过调节酶解条件，进而获得对人类最具有利用价值的营养物质。在众多科研工作者的的研究中表明：在从海洋水产品下脚料被制备成生物活性肽的过程中，会使许多具有特异性基团展现出来，这是多肽液具备各种各样的生物学活性。在东南沿海地区的人民已经从海洋水产品的下脚料中获取了鱼类的蛋白水解物，并且广泛用于人们的饮食中。
4.在海洋生物加工过程中，等海洋生物黑虎虾虾头的下脚料一般不容易被利用，直接被废弃掉，一方面造成资源的浪费，另一方面造成环境污染，由于目前海洋生物下脚料的加工方式主要是采用高温蒸煮、机械压榨等方法，使得废弃物中的蛋白质变性，特别是与脂肪等交合在一起，就更加增加了分离的难度，导致海洋生物下脚料利用效果差。
5.因此，本领域的技术人员致力于开发一种利用酶解方法从低值海洋生物下脚料中提取活性肽的方法，避免环境污染，同时增加低值海洋生物下脚料的附加值。


技术实现要素：

6.有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是黑虎虾虾头随意丢弃，污染环境的问题
7.为实现上述目的，本发明提供了一种从低值海洋生物下脚料中提取活性肽的方法，其包括以下步骤：
8.1)将黑虎虾虾头脱脂，清洗，粉碎均质成糜；
9.2)在上述糜中加入超纯水制成溶液，料液比为1:8-15w/v，调节ph为中性，加入中性蛋白酶，45-65℃下超声波辅助酶解20-60min；
10.3)调节中性蛋白酶酶解液的ph为碱性，加入碱性蛋白酶，35-55℃超声波辅助酶解35-55min；沸水灭酶，离心取上清液得酶解溶液；
11.4)将上述酶解液采用膜分子截流量为3kda的biomax改良的聚醚砜复合膜包进行超滤处理，分离纯化出a1(》3kda)、a2(《3kda)2种分子量的多肽溶液；
12.5)将a2多肽溶液脱盐，经sephadex g-15凝胶柱分离纯化，收集各峰，冻干后测定各组的dpph清除率；
35min，在酶解过程中利用超声波辅助酶解，所述超声频率为15khz；
35.调节中性蛋白酶酶解液的ph为8.5，加入碱性蛋白酶，所述碱性蛋白酶的添加量为3000u/g虾头，所述酶解温度为40-46℃，酶解时间为30-35min，在酶解过程中利用超声波辅助酶解，所述超声频率为15khz，酶解结束后，沸水浴10min灭活，离心(4000r/min，10min)取上清液得酶解溶液；
36.将上述酶解液采用膜分子截流量为3kda的biomax改良的聚醚砜复合膜包进行超滤处理，分离纯化出a1(》3kda)、a2(《3kda)2种分子量的多肽溶液，收集a2组分并用透析袋(100da)进行除盐，经旋转蒸发浓缩后进行冷冻干燥，收集dpph清除活性较好的组分，储存在-20℃冰箱中备用。
37.实施例2
38.将a2多肽溶液脱盐，经hitrap
tm desalting预装柱脱盐后，经sephadex g-15凝胶柱分离纯化，收集各峰，冻干后测定各组的dpph清除率，其中凝胶柱分离纯化中洗脱液为超纯水，流速为10ml
·
min-1
，检测波长280nm。其中dpph清除率的测定方法如下：取1ml水解液，加入1ml新配制浓度为0.1mmol/l的dpph乙醇溶液，混匀后在室温避光条件下反应20min，在517nm处测定吸光值为as；空白组为1ml无水乙醇代替dpph溶液，测吸光值为ax；对照组为1ml蒸馏水代替样品，测定吸光值为ao；以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液进行空白调零。所有测定值均为三次平均值，dpph自由基的清除率(dsa)计算公式为：
39.dsa＝[1-(as-ax)/ao]
×
100％。
[0040]
对a2组分进行sephadex g-15分离得到b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7七个组分，具体如下表：
[0041]
时间(min)组分12.3-20.7b120.7-31.2b231.2-38.4b338.4-43.1b443.1-51.8b551.8-69.3b669.3-84b7
[0042]
如图1所示，b5组分的dpph清除率最高，为74％。
[0043]
将上述dpph清除率最高的组分离心，取上清液，冷冻干燥，得到黑虎虾虾头活性肽。
[0044]
实施例3
[0045]
培养hepg2细胞，将处于对数生长期的hepg2细胞以1
×
105个/ml接种于96孔板中，加入dmem完全培养基，放入培养箱(37℃，5％co2)培养24h待细胞融合度达到70-80％后准备开始试验。
[0046]
对照组：仅加入dmem完全培养基培养；
[0047]
模型组：加入dmem完全培养基培养24h后，加入含h2o2的培养基刺激6h；
[0048]
样品组：加入含b5的培养基干预24h后，再加入含h2o2的培养基刺激6h。
[0049]
以1
×
105个/ml的浓度将hepg2细胞接种于96孔板中，pbs清洗干净后，对照组和模
型组仅加入dmem完全培养基，样品组分别加入b5终浓度为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/ml的培养液，处理24h；再次用pbs清洗干净，采用浓度为0.8mm的h2o2对模型组和样品组刺激6h；将各实验组用pbs清洗干净后，更换新鲜培养基，使用cck-8试剂盒对细胞存活率进行测定。
[0050]
同时，对上述对照组、模型组和样品组检测ros含量，按照ros试剂盒使用方法，向各实验组中加入10μm dcfh-da荧光探针，在培养箱中孵育20min后用pbs清洗干净未装载的荧光探针，收集细胞并用流式细胞仪检测荧光强度。
[0051]
如图2所示，随着b5浓度的升高，对h2o2诱导损伤的hepg2细胞的保护作用明显增加，说明b5能够有效地预防氧化损伤对细胞活力造成的不良影响。
[0052]
如图3所示，随着b5浓度的升高，细胞内ros水平相比模型组显著下降，说明本技术制备的活性肽能够对hepg2细胞内ros产生抑制作用，可以减少过氧化氢介导的氧化应激。
[0053]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种从低值海洋生物下脚料中提取活性肽的方法，其包括以下步骤：1)将黑虎虾虾头脱脂，清洗，粉碎均质成糜；2)在上述糜中加入超纯水制成溶液，料液比为1:8-15w/v，调节ph为中性，加入中性蛋白酶，45-65℃下超声波辅助酶解20-60min；3)调节中性蛋白酶酶解液的ph为碱性，加入碱性蛋白酶，35-55℃超声波辅助酶解35-55min；沸水灭酶，离心取上清液得酶解溶液；4)将上述酶解液采用膜分子截流量为3kda的biomax改良的聚醚砜复合膜包进行超滤处理，分离纯化出a1(>3kda)、a2(<3kda)2种分子量的多肽溶液；5)将a2多肽溶液脱盐，经sephadexg-15凝胶柱分离纯化，收集各峰，冻干后测定各组的dpph清除率；6)将上述dpph清除率最高的组分离心，取上清液，冷冻干燥，得到黑虎虾虾头活性肽。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱除油脂的试剂包括正丁醇。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述料液比为1:12w/v。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声频率为10～30khz。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中性蛋白酶的添加量为2000u/g虾头-4000u/g虾头，所述酶解温度为40-46℃，酶解时间为30-35min。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶的添加量为2500u/g虾头-3000u/g虾头，所述酶解温度为40-46℃，酶解时间为30-35min。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝胶柱的流动相为蒸馏水，流速为10ml/min。8.权利要求1-7所述从低值海洋生物下脚料中提取活性肽的方法制备得到的活性肽。9.权利要求8所述的活性肽制备抗氧化损伤药物中的应用。10.一种化妆品，其包含权利要求8所述的活性肽。

技术总结
本发明涉及低值海洋生物下脚料回收利用提取活性肽技术领域，具体涉及一种从低值海洋生物下脚料中提取活性肽的方法。所述方法包括以下步骤：将黑虎虾虾头脱脂，清洗，粉碎均质成糜；先后使用中性蛋白酶和碱性蛋白酶酶解；采用膜分子截流量为3kDa的膜截留小于3kDa的组分；经SephadexG-15凝胶柱分离纯化，得到DPPH清除率最高的组分。本发明制备得到的黑虎虾虾头活性肽1)对具有较强的抗氧化活性且DPPH清除率可达74％以上；2)对H2O2诱导损伤的HepG2细胞都具有显著的保护作用，对HepG2细胞内ROS产生抑制作用，并且可以减少过氧化氢介导的氧化应激。化应激。化应激。


技术研发人员：王凡
受保护的技术使用者：王凡
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/10/6