基于明胶分子修饰的可逆回收固定纤维素酶的制备方法

1.本发明属于固定化酶材料制备技术领域，具体涉及基于明胶分子修饰的可逆回收固定纤维素酶的制备方法。


背景技术：

2.纤维素是由葡萄糖重复单元构成的一类最为丰富的生物质资源，能够转化为醇、芳烃、糖类等小分子，对这些小分子进行加工后能转化为各种高附加值化学品和液体燃料，因此合理化、高值化利用生物质资源对提高能源安全，降低化石资源依赖性以及建立多元化能源结构具有重要意义。在纤维素生物质资源高值化利用的过程中，将纤维素水解成葡萄糖，则是纤维素生物质资源化利用最为关键的一步。酶法水解能够绿色高效地实现这一目的，但是纤维素酶的可回收性差，纤维素酶一次性使用的成本依然限制着酶法水解纤维素的应用。将酶固定到固体基质上能够实现纤维素酶的回收，但固体基质束缚了酶的活性位点，易造成严重的传质障碍，因此在增加纤维素酶可重复性，降低酶法成本的同时，保证纤维素酶的催化效率仍然颇具挑战。
3.多孔材料具有较高的比表面积，将其用于纤维素酶的负载，能够增加纤维素酶与不溶性底物之间的接触，增加催化过程的传质效率。纳米技术的发展也为纤维素酶的固定化提供了新思路，纳米粒子尺寸小，在液体介质中分散性优良。用纳米粒子对纤维素酶修饰后，能大大增加酶与底物之间接触的机会，从而降低固定化纤维素酶在催化不溶性底物时的传质阻力。此外，膜或织物等聚合物材料能从反应体系中直接分离出来，很大程度上降低了纤维素酶分离回收的操作难度，更适合大规模连续生产操作。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供基于明胶分子修饰的可逆回收固定纤维素酶的制备方法，实现了纤维素酶、底物与产物三者之间的有效分离。
5.本发明所采用的技术方案是，基于明胶分子修饰的可逆回收固定纤维素酶的制备方法，具体按照以下步骤实施：
6.步骤1，制备明胶水凝胶基体；
7.步骤2，采用戊二醛溶液对明胶进行活化，得到活化后的明胶分子溶液；
8.步骤3，向活化后的明胶分子溶液中加入纤维素酶溶液，恒温振荡反应，之后加入过量的甘氨酸，以封闭未反应的醛基，离心，所得溶液即为明胶分子修饰的纤维素酶溶液；
9.步骤4，将明胶水凝胶基体置于明胶分子修饰的纤维素酶溶液中，使修饰的纤维素酶分子充分吸附到明胶水凝胶基体上，即可。
10.本发明的特点还在于，
11.步骤1中，具体为：
12.将明胶溶于去离子水中，加入谷氨酰胺转氨酶，恒温反应，之后升高体系温度至谷氨酰胺转氨酶失活，以终止其交联作用，冷却至室温，得到明胶水凝胶基体。
13.明胶、谷氨酰胺转氨酶、去离子水的质量比为26-100：1-1.5：666-1000；反应温度为40-45℃；反应时间为4-6h。
14.步骤2中，具体为：
15.用缓冲液将明胶分子充分溶解后，加入戊二醛溶液反应，反应温度为40-45℃，反应时间为4-6h，反应转速为500-1500rpm；待反应结束后，采用超滤离心管进行离心，得到活化后的明胶分子溶液。
16.明胶分子、戊二醛溶液和缓冲液的质量比为0.8-1.5：0.00016-0.0003：50-60；超滤离心管的截留分子量为30kda-50 kda；离心转速为6000-8000rpm；离心时间为5-10min。
17.缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠、乙酸缓冲液或者pbs缓冲液。
18.步骤3中，活化后的明胶分子溶液、纤维素酶溶液的质量比为0.8-1.5：0.04-0.06；反应温度为40-45℃，反应时间为4-8h；离心转速为6000-8000rpm，离心时间为5-10min。
19.本发明的有益效果是：以易降解的天然明胶分子为原料，用明胶分子共价修饰纤维素酶，制备明胶基体材料作为回收基材。在高温下破坏修饰纤维素酶与基体之间的氢键作用，将修饰纤维素酶从基体水凝胶表面释放，在液态下进行不溶性纤维素的水解，保证了水解过程的传质效率；低温下修饰纤维素酶与水凝胶基体之间的多重氢键作用再次形成，重新将修饰纤维素酶吸附到水凝胶基体表面，以实现纤维素酶的分离回收。这种以明胶水凝胶作为纤维素酶可逆回收的材料，其生物降解性优良，安全环保；此外在实际工业生产中，无需对载体材料进行后处理，进一步降低了纤维素酶的应用成本。
附图说明
20.图1是明胶水凝胶基体可逆吸附修饰纤维素酶操作循环示意图；
21.图2是明胶水凝胶基体可逆吸附修饰纤维素酶的操作稳定性和酶回收率图；
22.图3是明胶水凝胶基体吸附修饰纤维素酶土壤降解随时间质量变化图。
具体实施方式
23.下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
24.本发明基于明胶分子修饰的可逆回收固定纤维素酶的制备方法，具体按照以下步骤实施：
25.步骤1，将明胶充分溶于去离子水中，加入谷氨酰胺转氨酶，恒温反应，之后升高体系温度至谷氨酰胺转氨酶失活，以终止其交联作用，冷却至室温，得到明胶水凝胶基体；
26.明胶、谷氨酰胺转氨酶、去离子水的质量比为26-100：1-1.5：666-1000。
27.反应温度为40-45℃；反应时间为4-6h。
28.步骤2，用缓冲液将明胶分子充分溶解后，加入戊二醛溶液反应，即采用戊二醛溶液对明胶进行充分活化，随即采用超滤离心管进行离心，得到活化后的明胶分子溶液；
29.明胶分子、戊二醛溶液和缓冲液的质量比为0.8-1.5：0.00016-0.0003：50-60。
30.反应温度为40-45℃，反应时间为4-6h，反应转速为500-1500rpm；
31.超滤离心管的截留分子量为30kda-50 kda；
32.离心转速为6000-8000rpm；离心时间为5-10min。
33.缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠、乙酸缓冲液或者pbs缓冲液。
34.步骤3，向活化后的明胶分子溶液中加入纤维素酶溶液，恒温振荡反应，之后向反应体系中加入过量的甘氨酸，以封闭未反应的醛基，最后用超滤离心管进行离心分离，所得溶液即为明胶分子修饰的纤维素酶溶液；
35.活化后的明胶分子溶液、纤维素酶溶液的质量比为0.8-1.5：0.04-0.06。
36.反应温度为40-45℃，反应时间为4-8h；
37.超滤离心管的截留分子量为30kda-50 kda；
38.离心转速为6000-8000rpm，离心时间为5-10min；
39.步骤4，将步骤1中所得明胶水凝胶基体置于步骤3所得的明胶分子修饰的纤维素酶溶液中，在4℃条件下，过夜，使修饰纤维素酶分子充分吸附到明胶水凝胶基体上，即可。
40.该体系能在48℃释放修饰纤维素酶分子，以进行纤维素的水解，待水解反应完成后，在4℃下把整个体系重新放置在明胶分子修饰的纤维素酶溶液中，明胶水凝胶基体即可重新吸附修饰纤维素酶分子，从而实现纤维素酶分子的回收。
41.在本发明方法中，采用降解性优异的生物质材料—明胶作为纤维素酶回收的基体，在高温下破坏修饰纤维素酶与基体之间的氢键作用，将修饰纤维素酶从基体水凝胶表面释放，在液态下进行不溶性纤维素的水解，保证了水解过程的传质效率；低温下修饰纤维素酶与水凝胶基体之间的多重氢键作用再次形成，重新将修饰纤维素酶吸附到水凝胶基体表面，以实现纤维素酶的分离回收。另外，明胶作为蛋白质的水解产物，其生物相容性、生物降解性优良，将其用做纤维素酶催化回收的基材，水解产物安全无毒，生产过程绿色、环保，不会造成环境负担，具有良好的工业应用前景。
42.实施例1
43.本发明基于明胶分子修饰的可逆回收固定纤维素酶的制备方法，具体为：
44.称取0.5g明胶于20ml去离子水中，在40℃下将其充分溶解后，向其中加入20mg tg酶，搅拌均匀后将其置于45℃恒温箱中，反应5h后，升高温度到60℃并保持30min，使tg酶失活终止交联反应，得到明胶水凝胶基体；
45.称取1.0g明胶于60ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.05m、ph 4.8)，升高温度至45℃后，不断搅拌至其完全溶解后，向其内加入200μl戊二醛，反应5h后；用截留分子量50kda的超滤离心管于6000rpm/min离心5min，将游离戊二醛和小分子明胶进行分离。随后用20ml柠檬酸-柠檬酸钠溶解分离后的明胶分子，向其中加入50mg纤维素酶在45℃、300rpm/min下反应4h，随后向体系内加入1.0g甘氨酸反应4h，将剩余的戊二醛消耗掉。随后用截留分子量50kda的超滤离心管在6000rpm/min下离心10min，完全除去游离纤维素酶分子，完成纤维素酶修饰，得到明胶分子修饰的纤维素酶溶液；将明胶水凝胶基体置于所得的明胶分子修饰的纤维素酶溶液中，在4℃条件下，过夜，使修饰纤维素酶分子充分吸附到明胶水凝胶基体上，在48℃释放修饰纤维素酶分子，以进行纤维素的水解，待水解反应完成后，在4℃下把整个体系重新放置在明胶分子修饰的纤维素酶溶液中，明胶水凝胶基体即可重新吸附修饰纤维素酶分子，从而实现纤维素酶分子的回收。该体系循环5次后仍能保留其最高活性的约50％，纤维素酶的回收量能够达到初始酶量的60％；且该体系无毒无害，在经过90天的自然降解能降解95％。
46.实施例2
47.本发明基于明胶分子修饰的可逆回收固定纤维素酶的制备方法，具体为：
48.称取0.4g明胶于20ml去离子水中，在40℃下将其充分溶解后，向其中加入15mg tg酶，搅拌均匀后将其置于40℃恒温箱中，反应4h后，升高温度到60℃并保持30min，使tg酶失活终止交联反应，即完成明胶水凝胶基体的制备。
49.称取0.8g明胶于60ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.05m、ph 4.8)，升高温度至45℃后，不断搅拌至其完全溶解后，向其内加入160μl戊二醛，反应4h后；用截留分子量50kda的超滤离心管于6000rpm/min离心5min，将游离戊二醛和小分子明胶进行分离。随后用20ml柠檬酸-柠檬酸钠溶解分离后的明胶分子，向其中加入40mg纤维素酶在45℃、300rpm/min下反应4h，随后向体系内加入1.0g甘氨酸反应4h，将剩余的戊二醛消耗掉。随后用截留分子量50kda的超滤离心管在6000rpm/min下离心10min，完全除去游离纤维素酶分子，完成纤维素酶修饰，得到明胶分子修饰的纤维素酶溶液；将明胶水凝胶基体置于所得的明胶分子修饰的纤维素酶溶液中，在4℃条件下，过夜，使修饰纤维素酶分子充分吸附到明胶水凝胶基体上，在48℃释放修饰纤维素酶分子，以进行纤维素的水解，待水解反应完成后，在4℃下把整个体系重新放置在明胶分子修饰的纤维素酶溶液中，明胶水凝胶基体即可重新吸附修饰纤维素酶分子，从而实现纤维素酶分子的回收。该体系循环5次后仍能保留其最高活性的约52％，纤维素酶的回收量能够达到初始酶量的63％；且该体系无毒无害，在经过90天的自然降解能降解94％。
50.实施例3
51.本发明基于明胶分子修饰的可逆回收固定纤维素酶的制备方法，具体为：
52.称取0.45g明胶于20ml去离子水中，在40℃下将其充分溶解后，向其中加入13mg tg酶，搅拌均匀后将其置于40℃恒温箱中，反应4h后，升高温度到60℃并保持30min，使tg酶失活终止交联反应，即完成明胶水凝胶基体的制备。
53.称取0.9g明胶于60ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.05m、ph 4.8)，升高温度至45℃后，不断搅拌至其完全溶解后，向其内加入180μl戊二醛，反应4h后；用截留分子量50kda的超滤离心管于6000rpm/min离心5min，将游离戊二醛和小分子明胶进行分离。随后用20ml柠檬酸-柠檬酸钠溶解分离后的明胶分子，向其中加入45mg纤维素酶在45℃、300rpm/min下反应4h，随后向体系内加入1.0g甘氨酸反应4h，将剩余的戊二醛消耗掉。随后用截留分子量50kda的超滤离心管在6000rpm/min下离心10min，完全除去游离纤维素酶分子，完成纤维素酶修饰，得到明胶分子修饰的纤维素酶溶液；将明胶水凝胶基体置于所得的明胶分子修饰的纤维素酶溶液中，在4℃条件下，过夜，使修饰纤维素酶分子充分吸附到明胶水凝胶基体上，在48℃释放修饰纤维素酶分子，以进行纤维素的水解，待水解反应完成后，在4℃下把整个体系重新放置在明胶分子修饰的纤维素酶溶液中，明胶水凝胶基体即可重新吸附修饰纤维素酶分子，从而实现纤维素酶分子的回收。该体系循环5次后仍能保留其最高活性的约54％，纤维素酶的回收量能够达到初始酶量的61％；且该体系无毒无害，在经过90天的自然降解能降解95.3％。
54.实施例4
55.本发明基于明胶分子修饰的可逆回收固定纤维素酶的制备方法，具体为：
56.称取0.55g明胶于20ml去离子水中，在45℃下将其充分溶解后，向其中加入16.5mg tg酶，搅拌均匀后将其置于45℃恒温箱中，反应4h后，升高温度到60℃并保持30min，使tg酶失活终止交联反应，即完成明胶水凝胶基体的制备。
57.称取1.1g明胶于60ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.05m、ph 4.8)，升高温度至45℃后，不断搅拌至其完全溶解后，向其内加入220μl戊二醛，反应5h后；用截留分子量50kda的超滤离心管于6000rpm/min离心5min，将游离戊二醛和小分子明胶进行分离。随后用20ml柠檬酸-柠檬酸钠溶解分离后的明胶分子，向其中加入55mg纤维素酶在45℃、300rpm/min下反应4h，随后向体系内加入1.0g甘氨酸反应4h，将剩余的戊二醛消耗掉。随后用截留分子量50kda的超滤离心管在6000rpm/min下离心10min，完全除去游离纤维素酶分子，完成纤维素酶修饰，得到明胶分子修饰的纤维素酶溶液；将明胶水凝胶基体置于所得的明胶分子修饰的纤维素酶溶液中，在4℃条件下，过夜，使修饰纤维素酶分子充分吸附到明胶水凝胶基体上，在48℃释放修饰纤维素酶分子，以进行纤维素的水解，待水解反应完成后，在4℃下把整个体系重新放置在明胶分子修饰的纤维素酶溶液中，明胶水凝胶基体即可重新吸附修饰纤维素酶分子，从而实现纤维素酶分子的回收。该体系循环5次后仍能保留其最高活性的约51％，纤维素酶的回收量能够达到初始酶量的62％；且该体系无毒无害，在经过90天的自然降解能降解95.5％。
58.实施例5
59.本发明基于明胶分子修饰的可逆回收固定纤维素酶的制备方法，具体为：
60.称取0.6g明胶于20ml去离子水中，在40℃下将其充分溶解后，向其中加入18mg tg酶，搅拌均匀后将其置于43℃恒温箱中，反应5h后，升高温度到60℃并保持30min，使tg酶失活终止交联反应，即完成明胶水凝胶基体的制备。
61.称取1.2g明胶于60ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.05m、ph 4.8)，升高温度至45℃后，不断搅拌至其完全溶解后，向其内加入240μl戊二醛，反应4h后；用截留分子量50kda的超滤离心管于6000rpm/min离心5min，将游离戊二醛和小分子明胶进行分离。随后用20ml柠檬酸-柠檬酸钠溶解分离后的明胶分子，向其中加入60mg纤维素酶在45℃、300rpm/min下反应4h，随后向体系内加入1.0g甘氨酸反应4h，将剩余的戊二醛消耗掉。随后用截留分子量50kda的超滤离心管在6000rpm/min下离心10min，完全除去游离纤维素酶分子，完成纤维素酶修饰，得到明胶分子修饰的纤维素酶溶液；将明胶水凝胶基体置于所得的明胶分子修饰的纤维素酶溶液中，在4℃条件下，过夜，使修饰纤维素酶分子充分吸附到明胶水凝胶基体上，在48℃释放修饰纤维素酶分子，以进行纤维素的水解，待水解反应完成后，在4℃下把整个体系重新放置在明胶分子修饰的纤维素酶溶液中，明胶水凝胶基体即可重新吸附修饰纤维素酶分子，从而实现纤维素酶分子的回收。该体系循环5次后仍能保留其最高活性的约56％，纤维素酶的回收量能够达到初始酶量的66％；且该体系无毒无害，在经过90天的自然降解能降解96％。
62.图1是明胶水凝胶基体可逆吸附修饰纤维素酶操作循环示意图，48℃修饰纤维素酶从基体表面释放，在液态下进行不溶性纤维素的水解，以确保水解过程的传质效率；而4℃下将修饰纤维素酶吸附到基体，以实现纤维素酶的分离回收。该生物明胶材料完成纤维素酶循环的体系能够增加纤维素酶的利用率，这对降低纤维素酶工业生产成本有着重要意义。
63.图2是明胶水凝胶基体可逆吸附修饰纤维素酶的操作稳定性和酶回收率图；由图可以看到修饰纤维素酶在经过5个批次循环之后能够保持50％的活性；能够保持60％的纤维素酶回收率。
64.图3是明胶水凝胶基体吸附修饰纤维素酶土壤降解随时间质量变化图；由图可以看到基材在经过46天的土壤自然降解后的质量降低为2.9315g，降解率为47.89％；在经过91天土壤自然降解之后基材的质量为0.2529g，降解率可达95.55％。

技术特征：
1.基于明胶分子修饰的可逆回收固定纤维素酶的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：步骤1，制备明胶水凝胶基体；步骤2，采用戊二醛溶液对明胶进行活化，得到活化后的明胶分子溶液；步骤3，向活化后的明胶分子溶液中加入纤维素酶溶液，恒温振荡反应，之后加入过量的甘氨酸，以封闭未反应的醛基，离心，所得溶液即为明胶分子修饰的纤维素酶溶液；步骤4，将明胶水凝胶基体置于明胶分子修饰的纤维素酶溶液中，使修饰的纤维素酶分子充分吸附到明胶水凝胶基体上，即可。2.根据权利要求1所述的基于明胶分子修饰的可逆回收固定纤维素酶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，具体为：将明胶溶于去离子水中，加入谷氨酰胺转氨酶，恒温反应，之后升高体系温度至谷氨酰胺转氨酶失活，以终止其交联作用，冷却至室温，得到明胶水凝胶基体。3.根据权利要求2所述的基于明胶分子修饰的可逆回收固定纤维素酶的制备方法，其特征在于，明胶、谷氨酰胺转氨酶、去离子水的质量比为26-100：1-1.5：666-1000；反应温度为40-45℃；反应时间为4-6h。4.根据权利要求1所述的基于明胶分子修饰的可逆回收固定纤维素酶的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，具体为：用缓冲液将明胶分子充分溶解后，加入戊二醛溶液反应，反应温度为40-45℃，反应时间为4-6h，反应转速为500-1500rpm；待反应结束后，采用超滤离心管进行离心，得到活化后的明胶分子溶液。5.根据权利要求4所述的基于明胶分子修饰的可逆回收固定纤维素酶的制备方法，其特征在于，明胶分子、戊二醛溶液和缓冲液的质量比为0.8-1.5：0.00016-0.0003：50-60；超滤离心管的截留分子量为30kda-50 kda；离心转速为6000-8000rpm；离心时间为5-10min；缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠、乙酸缓冲液或者pbs缓冲液。6.根据权利要求1所述的基于明胶分子修饰的可逆回收固定纤维素酶的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，活化后的明胶分子溶液、纤维素酶溶液的质量比为0.8-1.5：0.04-0.06；反应温度为40-45℃，反应时间为4-8h；离心转速为6000-8000rpm，离心时间为5-10min。

技术总结
本发明公开了基于明胶分子修饰的可逆回收固定纤维素酶的制备方法，具体为：制备明胶水凝胶基体；采用戊二醛溶液对明胶进行活化，向活化后的明胶分子溶液中加入纤维素酶溶液，恒温振荡反应，加入过量的甘氨酸，以封闭未反应的醛基，离心，得到明胶修饰的纤维素酶溶液；将明胶水凝胶基体置于明胶修饰的纤维素酶溶液中，使修饰的纤维素酶分子充分吸附到明胶水凝胶基体上。采用降解性优异的生物质材料—明胶作为纤维素酶回收的基体，在高温下破坏修饰纤维素酶与基体之间的氢键作用，将纤维素酶从基体表面释放；在低温下纤维素酶与基体之间的多重氢键作用再次形成，重新将纤维素酶吸附到基体表面，实现纤维素酶的分离回收。实现纤维素酶的分离回收。实现纤维素酶的分离回收。


技术研发人员：朱兴 强元园 贺斌 王学川 范明亮
受保护的技术使用者：陕西科技大学
技术研发日：2023.07.10
技术公布日：2023/10/6