苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌及其构建方法与应用与流程

1.本发明涉及一种微生物工程菌技术领域，特别涉及一种苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌、上述工程菌的构建方法、以及上述工程菌的应用。


背景技术：

2.苏云金杆菌（bacillus thuringiensis, bt）是一类广泛存在于土壤中的革兰氏阳性菌，在芽胞形成的同时能够合成具有特异杀虫活性的杀虫晶体蛋白，在农、林及卫生害虫的防治中得到了广泛的应用。bt以色列亚种（b. thuringiensissubsp.israelensis, bti）是第一个被证明对双翅目幼虫具有毒性的bt亚种，可以产生cry4aa、cry4ba、cry11aa和cyt1aa等多种杀虫晶体蛋白，对500多种蚊、蜹和蝇具有毒力活性。晶体蛋白在芽胞形成ii期产生，有三种不同类型晶体组成，位于芽胞外膜外，在生长过程中随着芽胞的释放而脱落。晶体蛋白被幼虫取食后在昆虫中肠碱性蛋白酶作用下解离出毒性肽，破坏肠道正常功能，造成昆虫幼虫死亡。得益于其广谱、高效的杀蚊活性，对环境及非靶标生物安全，以及其显著的经济效益、社会效益和生态效益，bti被成功并广泛地应用于病媒蚊虫的生物防治。
3.晶体蛋白在芽胞形成后期通过母细胞裂解释放出来，由于没有细胞壁包埋，裸露在环境中的晶体蛋白易受到太阳辐射、温度等自然界因素的影响而失活，从而使bti的杀虫持效性显著下降，其中紫外线（uv）辐射被认为是最关键的影响因素。为了克服环境不利因素对晶体蛋白的影响，传统的途径主要是通过添加uv保护剂或者采用物理材料包埋晶体蛋白以提高bt蛋白对uv的耐受性，增强毒素蛋白的持效稳定性。在母细胞不裂解菌株bt 407-中表达cry1c/ab嵌合晶体蛋白，利用不裂解的细胞壁保护晶体蛋白免受uv破坏而失活，增加了菌株杀虫活性的持效期。在bt库斯塔克亚种（b. thuringiensissubsp.kurstaki, btk）hd73菌株中，通过敲除关键肽聚糖水解酶基因cwlc构建了母细胞不裂解菌株，并保持了菌株原始毒力。因此，通过敲除关键肽聚糖水解酶基因，阻断母细胞裂解，利用细胞壁包埋杀虫晶体蛋白，不仅保持了菌株的杀虫活性，而且显著增强了蛋白的持效稳定性。
4.bti菌株bt59参与母细胞裂解的的肽聚糖水解酶有cwlb、cwlc。和hd73中功能不同，敲除cwlc只能延迟而不能完全阻断bt59母细胞裂解。在bti芽胞生长后期，cwlc和cwlb均受转录调控因子sigk调控，敲除sigk后可以完全抑制cwlb和cwlc的表达，但仍然不能完全阻断bti母细胞裂解。
5.申请人对于上述技术问题进行了深入研究，敲除sigk后可以完全抑制cwlb和cwlc的表达，但仍然不能完全阻断bti母细胞裂解的原因：bti菌株bt59参与母细胞裂解的的肽聚糖水解酶，除了cwlb、cwlc外，还有hydrolase1 (hyd1)，而且 hyd1是在bti中特异性表达的。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明的第一个目的是提供一种苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌，用以解决苏云金杆菌以色列亚种工程菌持效期短的技术问题。
7.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案，苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌，其特征是，所述工程菌为菌株bt59肽聚糖水解酶基因hyd1和转录调控因子基因sigk双突变工程菌bt59(δhyd1-sigk)，保藏编号：cgmcc no.27191，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2023年4月23日；分类命名：bacillus thuringiensis var. israelesis。
8.本发明通过生物信息学和体外活性分析，鉴定了一个在苏云金杆菌以色列亚种中特异性表达的水解酶基因hyd1，重组水解酶hyd1具有水解bti细胞壁的活性，并在bti母细胞裂解中起着关键作用。bti的杀虫晶体蛋白受环境中的紫外线等因素的影响易失活，严重影响bti的实际使用效果，而细胞壁可以保护晶体蛋白免受外界环境的影响，增强其持效性。
9.申请人发现，bti菌株bt59参与母细胞裂解的的肽聚糖水解酶除了有cwlb、cwlc外，还有hydrolase1 (hyd1)，且 hyd1是在bti中特异性表达的。和hd73中功能不同，敲除cwlc只能延迟而不能完全阻断bt59母细胞裂解。在bti芽胞生长后期，cwlc和cwlb均受转录调控因子sigk调控，敲除sigk后可以完全抑制cwlb和cwlc的表达，但不能完全阻断bti母细胞裂解。hyd1受转录调控因子sige调控，sigk的缺失并不影响hyd1的表达。因此，同时敲除肽聚糖水解酶基因hyd1和转录调控因子sigk可以构建母细胞不裂解bti菌株，延长其持效期。
10.本发明的第二个目的是提供苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌的构建方法，用以解决现有苏云金杆菌以色列亚种生产菌株持效期短的技术问题。
11.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌的构建方法，以bt59基因组为模板，利用重叠pcr技术，分别获得细胞壁水解酶基因hyd1缺失的基因片段和转录调控因子基因sigk缺失的基因片段，然后利用同源重组技术，将获得的细胞壁水解酶基因hyd1缺失的基因片段和转录调控因子基因sigk缺失的基因片段，构建到基因操作载体pmad中，经电击转化至bti感受态细胞中，高温筛选后，即可获得双突变工程菌bt59(δhyd1-sigk)。
12.本发明利用基因敲除技术，可以快速对bti进行基因改造，以获得优良性状的工程菌，同时高温可以使外源质粒丢失，工程菌不含外源基因、无标记抗性，可直接用于工业化生产发酵。
13.本发明利用同源重组技术，成功构建了肽聚糖水解酶基因hyd1缺失突变体、转录调控因子基因sigk缺失突变体、hyd1和sigk双缺失突变体。hyd1和sigk双突变可以完全阻断bti母细胞裂解，可以利用细胞壁包埋晶体蛋白，以增强其环境稳定性。本发明构建的双突变工程菌，不产芽胞，具有较高的杀虫活性以及较强的紫外线抗逆性。
14.为解决转录调控因子基因sigk缺失的基因片段如何获得的技术问题，所述利用重叠pcr技术，获得转录调控因子基因sigk缺失的基因片段，包括：以bt59基因组为模板，利用重叠引物一seq id no.9-10经重叠pcr，获得转录调控因子基因sigk缺失的基因片段，将转录调控因子基因sigk缺失的基因片段连接到线性化的pmad质粒上，得到重组质粒；重组质粒去甲基化后，经电击转化至bt59细胞中，获取sigk缺失突变株bt59(δsigk)；
所述重叠pcr引物一seq id no.9为：上游引物atcgatgcatgccatggtacccgggattgtacagagtcatcggtaatttc；下游引物gcgtctgcagaagcttctagaattccagaaccagaaagcggactatg。
15.为解决细胞壁水解酶基因hyd1缺失的基因片段的技术问题，所述利用重叠pcr技术，细胞壁水解酶基因hyd1缺失的基因片段，包括：以bt59基因组为模板，利用重叠引物二seq id no.11-12经重叠pcr，获得细胞壁水解酶基因hyd1缺失的基因片段，将细胞壁水解酶基因hyd1缺失的基因片段连接到线性化的pmad质粒上，得到重组质粒；重组质粒去甲基化后，经电击分别转化至bt59和bt59 (δsigk)细胞中，获取hyd1缺失突变株bt59(δhyd1)、以及hyd1和sigk双突变菌株bt59(δhyd1-sigk)；所述重叠pcr引物二seq id no.10-11为：上游引物cagatctatcgatgcatgccatggtacccgaatccatctgtcccgcttaaactg；下游引物：catgggaatattcggtgtgggaaattacatatccatcgctcctcttctcttag。
16.本发明的第二个目的是提供上述任一项的苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌在病媒蚊虫生物防治中的应用。本发明采用的苏云金杆菌以色列亚种作为微生物杀虫剂，长期用于病媒蚊虫生物防治，其毒素主要作用于蚊虫，对脊椎动物相对安全。
17.发明技术方案作进一步改进，所述苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌在病媒蚊虫淡色库蚊和白纹伊蚊生物防治中的应用，所述病媒蚊虫包括淡色库蚊和白纹伊蚊。本发明通过基因编辑技术，对肽聚糖水解酶基因hyd1和转录调控因子基因sigk双突变，阻断母细胞裂解，利用细胞壁包埋晶体蛋白，提高bti对蚊幼虫的杀虫持效期。
18.苏云金杆菌以色列亚种肽聚糖水解酶基因hyd1，所述肽聚糖水解酶基因的核苷酸序列如seq id no .1所示。
19.苏云金杆菌以色列亚种转录调控因子基因sigk上游序列，所述转录调控因子基因上游的核苷酸序列如seq id no .2所示。
20.苏云金杆菌以色列亚种转录调控因子基因sigk，所述转录调控因子基因的核苷酸序列如seq id no .3所示。
21.苏云金杆菌以色列亚种转录调控因子基因sigk下游序列，所述转录调控因子基因下游的核苷酸序列如seq id no .4所示。
22.苏云金杆菌以色列亚种肽聚糖水解酶基因hyd1上游序列，所述肽聚糖水解酶基因上游的核苷酸序列如seq id no .5所示。
23.苏云金杆菌以色列亚种肽聚糖水解酶基因hyd1下游序列，所述肽聚糖水解酶基因下游的核苷酸序列如seq id no .6所示。
附图说明
24.图1为本发明重组hyd1对bti细胞壁的水解活性图；图1中，bsa为牛血清白蛋白；图2a为本发明hyd1和sigk双突变后，苏云金杆菌以色列亚种在ssm培养基中培养5d的细胞形态图；图2b为hyd1和sigk双突变后，苏云金杆菌以色列亚种在ssm培养基中培养6d的细
胞形态图；图2c为hyd1和sigk双突变后，苏云金杆菌以色列亚种在ssm培养基中培养7d的细胞形态图。
具体实施方式
25.以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
26.实施例中所设计的试剂和培养基配方：(1)lb液体培养基：在900ml双蒸水中加入10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物和5g nacl，搅拌混匀，用双蒸水定容至1l，置于高压灭菌锅中，121℃，灭菌20min，冷却后置于4℃保存。
27.(2)lb固体培养基：在900ml双蒸水中加入10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，5g nacl和15g琼脂，搅拌混匀，用双蒸水定容至1l，置于高压灭菌锅中，121℃，灭菌20min，冷却后至50℃加入抗生素，倒板，冷却后置于4℃保存。
28.(3)tk buffer：0.05 m tris-hcl，0.05m kcl，ph=7。
29.(4)ssm培养基：营养肉汤8 g、10% kcl 1 ml、12% mgso4 1 ml、1 mol/l naoh 1 ml，用双蒸水定容至1l，置于高压灭菌锅中，121℃，灭菌20min。
30.(5)发酵培养基：2%淀粉，4.5%豆饼粉，2.0%玉米浆，0.1% mgso4，0.1% caco3，0.1% kh2po4，置于高压灭菌锅中，121℃，灭菌20min。
31.（6）bt59采用现有菌种，参见公开号cn 109628362 a、公开日2019年4月16日的中国专利说明书第0020-0022段。
32.实施例1以bt59基因组为模板，利用上游引物cagcaaatgggtcgcggatccgaattcatggatatggttaaagtttgg和下游引物ggtgctcgagtgcggccgcaagcttttaatttaatctttttttccaag克隆肽聚糖水解酶hyd1基因片段seq id no .1，并在c端引入6
×
his标签（catcatcatcatcatcac），用于重组蛋白纯化。按照vazyme公司的clonexpressii one step cloning kit试剂盒说明书，将目的片段与线性化的pet21b质粒（novagen）连接，重组质粒经测序后，转化至vazyme公司的escherichia colibl21（de3）菌株。利用终浓度为0.5 mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷iptg，在150 rpm，18℃的条件下，培养12 h，诱导目的蛋白的表达。诱导结束后，收集菌体，采用赛飞公司的超声波破碎仪biosafer 900破碎菌体，重组蛋白通过sds-page进行检测后，经ge公司的akta pure快速蛋白纯化系统进行纯化。
33.bt59细胞于lb培养中培养至对数生长期，离心收集菌体，并用tk buffer重悬菌体，采用赛飞公司的超声波破碎仪biosafer 900破碎菌体。破碎的细胞液经高速离心后，收集沉淀，用4%（w/v）的十二烷基硫酸钠sds溶液重悬沉淀，并煮沸5-10 min，用1 m nacl洗涤两次，去离子水洗涤三次，去除残留的sds，制备好的细胞壁保存在-80℃中备用。用tk buffer将制备的bt59细胞壁悬起，使悬浊液吸光度od
540
为0.3左右，将纯化后的hyd1加入悬
浊液中，于37℃温育，取不同时间的混合液进行吸光度测定，用于分析重组细胞壁水解酶活性，结果见图1，结果表明明，重组水解酶hyd1具有水解bt59细胞壁的活性。
34.实施例2以bt59基因组为模板，根据转录调控因子基因sigk序列seq id no.2-4，设计重叠pcr引物（atcgatgcatgccatggtacccgggattgtacagagtcatcggtaatttc/gcgtctgcagaagcttctagaattccagaaccagaaagcggactatg），经重叠pcr获得目的基因sigk缺失的基因片段，按照vazyme公司的clonexpress ii one step cloning kit试剂盒说明书，将基因片段连接到线性化的pmad质粒上。重组质粒去甲基化后，利用bio-rad公司的genepulser xcell电穿孔仪，电压为2.4 kv，电阻为1000 ω，将重组质粒转化至bt59细胞中。经鉴定，挑选转化成功的单菌落，分别经30℃和39℃摇瓶培养后，稀释一定倍数涂布于lb平板上，挑选单菌落分别在lb平板含红霉素的平板上对应扎斑，筛选在lb上生长而不能在含红霉素的平板上生长的单克隆进行pcr鉴定，获取sigk缺失突变株bt59(δsigk)。
35.实施例3以bt59基因组为模板，根据水解酶基因hyd1序列seq id no.1, 5-6，设计重叠pcr引物（cagatctatcgatgcatgccatggtacccgaatccatctgtcccgcttaaactg/catgggaatattcggtgtgggaaattacatatccatcgctcctcttctcttag），经重叠pcr获得目的基因hyd1缺失的基因片段，按照vazyme公司的clonexpress ii one step cloning kit试剂盒说明书，将基因片段连接到线性化的pmad质粒上。重组质粒去甲基化后，利用bio-rad公司的genepulser xcell电穿孔仪，电压为2.4 kv，电阻为1000 ω，将重组质粒分别转化至bt59和bt59 (δsigk)细胞中。经鉴定，挑选转化成功的单菌落，分别经30℃和39℃摇瓶培养后，稀释一定倍数涂布于lb平板上，挑选单菌落分别在lb平板含红霉素的平板上对应扎斑，筛选在lb上生长而不能在含红霉素的平板上生长的单克隆进行pcr鉴定，获取hyd1缺失突变株bt59(δhyd1)以及hyd1和sigk双突变菌株bt59(δhyd1-sigk)。将bt59(δhyd1-sigk)菌种在ssm培养基中培养5d、6d、7d，在光学显微镜中观察其细胞形态，结果见图2a、图2b、图2c。图2可知，突变株bt59(δhyd1-sigk)在ssm培养基中培养7d，母细胞仍不发生裂解。
36.实施例4bt59和bt59(δhyd1-sigk)在发酵培养基中培养43 h，此时bt59母细胞已完全裂解，bt59(δhyd1-sigk)母细胞不发生裂解。取上述菌株发酵液梯度稀释至0.0781，0.156，0.313，0.625，1.250，2.500，5.000 μl/l，分别用于测定bt59和bt59(δhyd1-sigk)对白纹伊蚊和淡色库蚊的杀虫活性并利用poloplus软件计算lc
50
值。
37.实施例5bt59和bt59(δhyd1-sigk)在发酵培养基中培养43 h，取bt59和bt59(δhyd1-sigk)发酵液置于365 nm紫外光下照射30 min后，分别梯度稀释至0.156，0.313，0.625，1.250，2.500，5.000，10.000 μl/l，用于测定经紫外线照射后bt59和bt59(δhyd1-sigk)对白纹伊蚊和淡色库蚊的杀虫活性并利用poloplus软件计算lc
50
值。
38.表1为苏云金杆菌以色列亚种对白纹伊蚊的毒力测定结果
.2，如下attgtacagagtcatcggtaatttcattctcgttagtttgaagttcaactaagaaagatgtactacgggaagaatctgttttgcttgtaatatgtaattcagtaggaatcatgggtatttcataaaactcattttttattatagtattgtagtcttctgaaaatttacgaacttcttttggaaaagagtcttcttcttgtgtatttaaaaaggttttatgttgctttggaaatttttattaaactttaatgtttctttaaagtaataattggatccagtcaaaaataaacaactacaaattaataaaaaattcgatacggattttgaaagtgaaagaaaaatagtatacatgtaataattccaattacatagagaataaagataagtagttctagttttgagtgaaaggaaaaaccatagttatgaaaaaatttcattccagttataatttgagctccaaaaaataaagaaattccaaattgaaaaaataataaatcaggccctcttttaataacaaaagtaatgaacgaaatgaaaagtaaaaatcccctaaataaattgttacatttaataatcgatctaatgtaatcatgaatagtgtcccctttaatagcatattcatatataaataacaatttcttttaattataatataacaataaaatattttaaatgttagaagtgttgagttttataaataaactgtacagacacaaacaacctcacgcctacatacacataataaagaccactattttggcggaggtgaaaggt苏云金杆菌以色列亚种转录调控因子基因sigk的核苷酸序列为seq id no .3，如下：ttgagtctattcgccgcaattggatatatggttcgagaagtgtttgtctttgtttcttatgtaaagaataatgcgttcccgcagccgttatcatcagatgatgagagaaagtacttagagttaatggagcaaggtgatgctcaagcgagaaatcttttgattgaacataatttacggcttgtagctcatatcgttaaaaaatttgagaacacaggagaagatgcagaagatttaatttcaattggtacgatcgggctcattaaagcgatcgagagctattctgcaggaaagggaacaaagcttgcgacgtatgcagcacgctgtattgaaaatgaaattttgatgcatttacgtgtactaaagaaaacgaaaaaagatgtttcacttcatgatccgattgggcaagataaagagggcaatgaaatatcgcttattgatatattaaaatcagagtctgaagatgtaattgatatgattcagcttagtatggagttagaaaaaattaaagagtatatcgatattttagacgaaagagaaaaagaagtgattgtgaaacgttttggacttgggctagataaggagaaaacacagcgggaaatcgctaaggcgcttggtatttctagaagctacgtatcaaggattgaaaagcgtgctttaatgaagatgttccacgagtttgtaagggcagagaaagagaaaaaagcgaaagagtaa苏云金杆菌以色列亚种转录调控因子基因sigk下游的核苷酸序列为seq id no .4，如下：agtgtattagaagcagccatattttaaaaggggctgcttttcttattgtaaataagaaaagaaaacgcgttatgctaagaagaaatacatgttcactgttgaaaatgacggattctatctgtaatattagaaggtgctaaataatttaagaataataccatacttagttttctgtatgtataataaggctgctttatatgatatgtgggaataagaaccaattttacatatgatatagaaagaaaagaagggaaaactaaagttatagactgattagggggtttcgcaatttgcgacgtacattatatcgacttatgatagaacttacaaatggtcgctttacttcttatatattacgtaaatttgcacaatctcgtttgagctctatcattattccatcgtatgcgaaagtttttcaaattaatcaagatgagatggaaaagggcttgaaggaatatagaacattgcatgaattatttacgcgtaagctaaaagaaggaaagcgtagtattgatacagatgcatcgagtatcgttagtcctgttgatggtgtttttgcagatcatggtcctattgaggatacaaaaacatttgatattaaaggaaagcgctattcaattgtggatatgctaggtaatgaagaacgtgcaacgcgatatgcaggcggtacatatatggtaatttatttgagtccaagtcactatcatcgcattcatagtccgctttctggttctg苏云金杆菌以色列亚种肽肽聚糖水解酶基因hyd1上游的核苷酸序列为seq id no .5，如下：gaatccatctgtcccgcttaaactgaattacagaatttattaacaattaaatgacaaggatttcgcat
ttttgaatttgtttaatgtaaaaaattttacaacagaactatttatcttaataatcggatgactttctacaactacataactttaatattgatttagtttcttctagtttgagctgtaacagcatttctttttttattactgttttgagagtatctaccgtgctctcgttagttgccaacaattgatcaagcgatacttttccctttttaaattcagtcacaactgcttgaaccttttcaccttctgcattaattacgtgggctagtcctaattcttctaatccaattgatgctaagataatattaattgcctgctcacgagttatatccaatccttctggaatatttggaattcccatttatttcacccctcatttatattttgggaccatttaaatttgacaagtagtaaacattatattcactactatgcccatatatgcaaaaatagttctttcagaagatacataagggacaaaagagctttagaacatattgatttctttgatcgtatgtgaaatataacgaatagcttaacatcctaaaaatttaagacaatatcgcttaatgcgtgaataactctaataattcaagattgactttaacatcctatccacttaaattactcctatatttttctattactttaacaaagcctttatggccaaccgctaccaatttaatatctatttttgaattattatcttataaaactctctatacatgattctcttcattaaactcttttacatgttagctaaatttcaagtactttattatatgttactacatataataaagtactaagagaagaggagcg苏云金杆菌以色列亚种肽聚糖水解酶基因hyd1下游的核苷酸序列为seq id no .6，如下：tttcccacaccgaatattcccatgaaattaagaattaaaatttaaaaattctccttttactttaaaatttatattatagaacttttaaaaagatataaggtctggctacaggcagctagattatattcagctcttaataaattgccgtaatttgttatgtgcaaaaaacaggagttttaaatagcaaactcctgtttttttacatgcaataaattaaacttattttttatactaagaaatagaaggtggcgaagatgattgtattagcgatttagcttcttctaacttaaattgtaataacatttccttttttattaccgttttaagagtttgggttacactttcatttgtagctaataattggtcaaaggtaactgtttctttttcaaatccagccacaactgcttgcaccttttcgccctctgcattaattacgtgagctagccctaattcttctaatccaatagaagctaaaataatattaattgcttggtctctagtaatatctaaaccttctggaattgttggcatccccattaatatcattccttttcactttatttataatcattgtatcttgaaatattatatgtaacagctattccaaaggtgcagggggaataaatttaatccaaaatatttttatgaaaattcaattcagtacatgaaattacaagactaccagatcgtatattttaaaggcaaacatatccaacaagttattaacgttatatcatctggataatattgttattttattttttaattactttgatgtatcacaactgaaacaaactagttgttccatttcacaaaaattaatattatcggaatttataaacttttctgaaaaatagtatggaaaatacacgattctgataaaaaaacagtctcactattactatcttttctaaatagttaaaagagaatatactttatgcccatataacttattgtacagttcattatgtaaatgttccctgcgtatgtg克隆hyd1基因引物seq id no.7-8上游引物cagcaaatgggtcgcggatccgaattcatggatatggttaaagtttgg下游引物ggtgctcgagtgcggccgcaagcttttaatttaatctttttttccaag。
41.重叠pcr引物一seq id no.9-10为：上游引物atcgatgcatgccatggtacccgggattgtacagagtcatcggtaatttc；下游引物gcgtctgcagaagcttctagaattccagaaccagaaagcggactatg。
42.重叠pcr引物二seq id no.11-12为：上游引物cagatctatcgatgcatgccatggtacccgaatccatctgtcccgcttaaactg；下游引物：catgggaatattcggtgtgggaaattacatatccatcgctcctcttctcttag。

技术特征：
1. 苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌，其特征是，所述工程菌为菌株bt59肽聚糖水解酶基因hyd1和转录调控因子基因sigk双突变工程菌bt59(δhyd1-sigk)，保藏编号：cgmcc no.27191。2.权利要求1所述的苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌的构建方法，其特征是，以bt59基因组为模板，利用重叠pcr技术，分别获得细胞壁水解酶基因hyd1缺失的基因片段和转录调控因子基因sigk缺失的基因片段，然后利用同源重组技术，将获得的细胞壁水解酶基因hyd1缺失的基因片段和转录调控因子基因sigk缺失的基因片段，构建到基因操作载体pmad中，经电击转化至bti感受态细胞中，高温筛选后，即可获得双突变工程菌bt59(δhyd1-sigk)。3.根据权利要求2所述构建方法，其特征是，所述利用重叠pcr技术，获得转录调控因子基因sigk缺失的基因片段，包括：以bt59基因组为模板，利用重叠引物一seq id no.9-10经重叠pcr，获得转录调控因子基因sigk缺失的基因片段，将转录调控因子基因sigk缺失的基因片段连接到线性化的pmad质粒上，得到重组质粒；重组质粒去甲基化后，经电击转化至bt59细胞中，获取sigk缺失突变株bt59(δsigk)；所述重叠pcr引物一seq id no.9-10为：上游引物atcgatgcatgccatggtacccgggattgtacagagtcatcggtaatttc；下游引物gcgtctgcagaagcttctagaattccagaaccagaaagcggactatg。4.根据权利要求3所述构建方法，其特征是，所述利用重叠pcr技术，细胞壁水解酶基因hyd1缺失的基因片段，包括：以bt59基因组为模板，利用重叠引物二seq id no.11-12经重叠pcr，获得细胞壁水解酶基因hyd1缺失的基因片段，将细胞壁水解酶基因hyd1缺失的基因片段连接到线性化的pmad质粒上，得到重组质粒；重组质粒去甲基化后，经电击分别转化至bt59和bt59 (δsigk)细胞中，获取hyd1缺失突变株bt59(δhyd1)、以及hyd1和sigk双突变菌株bt59(δhyd1-sigk)；所述重叠pcr引物二seq id no.10-11为：上游引物cagatctatcgatgcatgccatggtacccgaatccatctgtcccgcttaaactg；下游引物：catgggaatattcggtgtgggaaattacatatccatcgctcctcttctcttag。5.根据权利要求1-4任一项的苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌在病媒蚊虫生物防治中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征是，所述病媒蚊虫包括淡色库蚊和白纹伊蚊。

技术总结
本发明涉及一种微生物工程菌技术领域。苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌，为菌株Bt59肽聚糖水解酶基因hyd1和转录调控因子基因sigK双突变工程菌Bt59(Δhyd1-sigK)，保藏编号：CGMCC No.27191。上述工程菌的构建方法，以Bt59基因组为模板，利用重叠PCR技术，分别获得细胞壁水解酶基因hyd1缺失的基因片段和转录调控因子基因sigK缺失的基因片段，然后利用同源重组技术，将获得的细胞壁水解酶基因hyd1缺失的基因片段和转录调控因子基因sigK缺失的基因片段，构建到基因操作载体pMAD中，经电击转化至Bti感受态细胞中，高温筛选后，即可获得双突变工程菌Bt59(Δhyd1-sigK)。上述工程菌的应用。本发明用以解决苏云金杆菌以色列亚种工程菌持效期短的技术问题。工程菌持效期短的技术问题。工程菌持效期短的技术问题。


技术研发人员：黄立鑫 徐健 韩光杰 李传明 刘琴 陆玉荣 夏杨 张楠
受保护的技术使用者：江苏里下河地区农业科学研究所
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/10/8