CTAB在提高YedE1E2蛋白表达菌株对外源大分子药物底物摄取中的应用

ctab在提高yede1e2蛋白表达菌株对外源大分子药物底物摄取中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及ctab在提高yede1e2蛋白表达菌株对外源大分子药物底物摄取中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.鬼臼毒素(ptox)是鬼臼属植物中某些种产生的一种抗肿瘤成分。其部分衍生物为抗癌药，主要采用化学半合成法生产。细胞工厂生物合成在大规模生产ptox衍生物方面具有巨大潜力。除了酶的发现外，ptox向细胞内的运输也是限制生物合成过程的重要因素。
4.ptox是一种具有复杂化学结构的芳基四氢萘木酚素，这限制了其被宿主细胞的摄取。微生物的有机溶剂或表面活性剂处理可以增加膜渗透性并刺激底物向细胞内的运输。十六烷基三甲基溴化铵(ctab)是一种阳离子表面活性剂，对膜的通透性和底物转运有一定的影响，研究发现适当浓度的ctab对生物膜的细胞活力影响较小，但较高的浓度可能会对生物膜的细胞活力产生较大影响，从而影响细胞的生长和凋亡。ctab可以穿透膜的疏水屏障，并在线粒体中积累，导致线粒体毒性。此外，先前的研究发现，ctab对骨肉瘤显示出巨大的抑制作用，其作为潜在治疗药物的使用正在探索中。因此，利用ctab提高细菌膜通透性可能是提高细菌细胞对底物摄取的可行方法，目前存在的主要问题是如何在保持细胞活力的同时刺激底物转运。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的问题，本发明提供ctab在提高yede1e2蛋白表达菌株对外源大分子药物底物摄取中的应用。具体的，本发明在ctab的存在下借助转运蛋白yede1e2极大的改善了大肠杆菌对底物ptox的细胞摄取。yede1e2通过调节硫烷硫的转运，降低了胞内ctab引起的活性氧(ros)地增高，增加了细菌的抗逆性和生存能力。基于上述研究成果，从而完成本发明。
6.具体的，本发明涉及以下技术方案：
7.本发明的第一个方面，提供ctab在提高yede1e2蛋白表达菌株对外源大分子药物底物摄取中的应用。
8.其中，所述外源大分子药物底物可以是抗癌药物，所述抗癌药物可以是(植物)天然产物或者其衍生物，在本发明的一个具体实施方式中，所述外源大分子药物底物为鬼臼毒素。
9.其中，所述yede1e2蛋白表达菌株可以为天然yede1e2蛋白表达菌株或者通过基因工程技术手段实现yede1e2蛋白表达的菌株。
10.具体的，所述菌株为表达外源yede1e2蛋白的大肠杆菌。
11.所述表达外源yede1e2蛋白的大肠杆菌，其构建方法包括：将所述外源yede1e2蛋白编码基因与表达载体连接并导入大肠杆菌中。
12.其中，所述表达载体为质粒，具体为pbbr1mcs2质粒。
13.本发明的第二个方面，提供一种提高yede1e2蛋白表达菌株对外源大分子药物底物摄取的方法，所述方法包括：向含有外源大分子药物底物以及yede1e2蛋白表达菌株的培养环境中添加ctab。
14.其中，所述ctab的浓度为10～100μm，进一步为200～600μm。
15.所述外源大分子药物底物可以是抗癌药物，所述抗癌药物可以是(植物)天然产物或者其衍生物，在本发明的一个具体实施方式中，所述外源大分子药物底物为鬼臼毒素。所述鬼臼毒素的含量为100～1000μm，进一步的，所述鬼臼毒素的含量为500μm。
16.所述yede1e2蛋白表达菌株可以为天然yede1e2蛋白表达菌株或者通过基因工程技术手段实现yede1e2蛋白表达的菌株。
17.具体的，所述菌株为表达外源yede1e2蛋白的大肠杆菌。
18.本发明的第三个方面，提供上述方法在生物合成药物衍生物中的应用。
19.具体的，所述药物衍生物可以为抗癌药物衍生物，具体可以为植物天然产物的衍生物，在本发明的一个具体实施方式中，所述衍生物为鬼臼毒素衍生物。
20.本发明的第四个方面，提供一种鬼臼毒素衍生物的生物合成方法，所述生物合成方法：向含有鬼臼毒素以及yede1e2蛋白表达菌株的培养环境中添加ctab，对所述yede1e2蛋白表达菌株进行培养发酵，并分离获取鬼臼毒素衍生物。
21.以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
22.上述技术方案报道了在ctab的存在下借助转运蛋白yede1e2极大的改善了大肠杆菌对底物ptox的细胞摄取。yede1e2可调控细胞对外源零价硫的吸收，从而降低ctab引起的胞内ros升高，提高细胞的存活率，在此基础上改善细胞对外源大分子底物的吸收能力，对利用大分子底物酶促合成药物衍生物具有重要意义，因此具有可观的应用价值和前景。
附图说明
23.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
24.图1为本发明实施例中ctab刺激细胞对ptox的摄取。
25.图2为本发明实施例中yede1e2降低了ctab对细菌生长的抑制作用。
26.图3为本发明实施例中yede1e2表达的细胞通过调节细胞中的零价硫含量来消除细胞ros。a，yede1e2的存在可降低胞内ros生成；b，yede1e2可通过调节胞内硫烷硫(sulfane sulfur)浓度降低细胞ros积累。
27.图4为本发明实施例yede1e2促进胞内过硫化物双加氧酶pdo2对外源添加多硫化物(硫烷硫)的降解。诱导表达的大肠杆菌细胞重悬在50mm，ph7.4的kpi中作为静息细胞(od＝3)，分别添加1mm的多硫化物(csp)，检测不同细胞对多硫化物吸收利用后的剩余硫烷浓度。
●
,e.coli(pdo2/yede1e2)；
■
,e.coli(pdo2)；
▲
,e.coli(yede1e2)；
▼
,e.coli bl21。
28.图5为本发明实施例中pdo2存在可刺激yede1e2摄取外源硫烷硫，降低胞内ctab引
起的ros增高。
具体实施方式
29.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
30.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
31.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
32.实施例
33.表达菌株的构建。采用低拷贝质粒pbbr1mcs2在lac启动子下表达yede1e2。yede1e2为yeee/yede家族的蛋白质，本实验所用蛋白来源于cupriavidus pinatubonensis jmp134的yede1(蛋白id：wp_011296422.1)及yede2(蛋白id：wp_011296423.1)。采用低拷贝质粒ptrc99a在trc启动子下表达过硫化物双加氧酶pdo2(蛋白id：wp_011299714.1)。具体构建方法可参见文献(如：葛福林.cupriavidus pinatubonensis jmp134中潜在的多硫化物转运蛋白yede1e2及其转录调控研究.山东大学,2020.)等，在此不再赘述。
34.添加ctab改善yede1e2表达细胞中的ptox摄取。由于细菌宿主细胞对ptox的摄取限制了其细胞内衍生化的酶促反应，因此我们试图提高ptox对大肠杆菌细胞的渗透性来提高其进入细胞的能力。分别用500μm ptox和200、300、400以及600μm的ctab在lb培养基中对具有yede1e2的大肠杆菌(yede1e2)和大肠杆菌bl21进行培养并诱导表达。检测各菌株摄取ptox的能力及其对生长的影响。
35.将200μm ctab加入到含500μm ptox的两株静态细胞(od600＝20)中6h后，如图1所示，大肠杆菌中没有加入ctab的细胞显示胞内吸收的ptox只有几十μm，而添加ctab后在野生型和yede1e2表达菌株中ptox含量分别达到627
±
258μm和938
±
248μm。这些结果表明，ctab可以刺激ptox转运到细胞中。
36.添加不同浓度的ctab到lb培养基中，大肠杆菌bl21和大肠杆菌(yede1e2)菌株均表现出ctab对其生长的抑制作用：培养20h后，600μm的ctab完全抑制了bl21菌株的生长，即使200μm的ctab在前10小时内亦表现出抑制作用。然而，在较低浓度的ctab下，大肠杆菌(yede1e2)细胞在抑制5h后开始生长并逐渐达到较高的生物量。不同浓度ctab的琼脂平板亦表现出相似的趋势，yede1e2的表达增加了细菌细胞对ctab的耐受性。
37.虽然两个菌株添加ctab后都对鬼臼毒素具有很好的吸收作用，但是bl21菌株生长受到极大抑制，因此大肠杆菌(yede1e2)作为表达宿主的潜力很大。
38.yede1e2表达的细胞通过调节细胞中的零价硫来消除细胞ros，提高细胞耐受性及
存活率。ctab具有细胞毒性，可能导致细胞中的ros升高。在细菌培养过程中，加入200μm ctab 10小时后，共取1od细胞进行ros分析。结果表明，ctab可增加两个细胞的胞内ros(图3a)，而yede1e2表达细胞中的ros明显降低。过氧化氢可增加细胞ros，并作为细菌内ros增高的阳性对照，在yede1e2存在时，细胞内ros水平较野生型也有降低。对零价硫烷硫的检测发现，当有ctab胁迫导致ros升高时，yede1e2表达细胞中的硫烷硫含量发生了改变(图3b)，而大量研究表明适量零价硫可降低胞内ros，而ros是细胞凋亡的重要原因之一。
39.降解代谢存在时，yede1e2加速细胞对外源小分子零价硫的吸收利用。由于外源零价硫存在时胞内硫烷硫浓度难以检测，因此我们构建了e.coli(pdo2)以及e.coli(yede1e2-pdo2)用来检测细胞对外源零价硫的摄取。当外源添加多硫化物之后，只有含有pdo2的细胞可以降解硫烷硫，其中含有yede1e2的细胞氧化硫烷硫的速度明显快于没有yede1e2的细胞，证明当胞内有降解作用存在时，yede1e2可以促进细胞对外界硫烷硫的吸收，从而迅速降低零价硫对细胞造成的毒害作用。
40.硫烷硫和ctab共同影响胞内ros的生成。胞内硫烷硫在适当的浓度下会降低胞内ros，但是过量硫烷硫则会升高胞内ros。进一步对反应过程中胞内ros的分析表明，外源添加100um的硫烷硫(s0)时，e.coli(pdo2)和e.coli(pdo2/yede1e2)中ros均有升高，表明过量的硫烷硫或其代谢产物so
32-及s2o
32-可导致ros有所上升。由于e.coli(pdo2/yede1e2)胞内积累s0，so
32-及s2o
32-速度更快，导致细胞ros略高于e.coli(pdo2)。但是，同时添加ctab和s0时，由于ctab及硫氧化产物存在而导致的ros增高效应则会因为s0的快速摄取而降低。如果如图5所示。
41.综上所述，yede1e2可调控细胞对外源零价硫的吸收，从而降低ctab引起的胞内ros升高，提高细胞的存活率，在此基础上改善细胞对外源大分子底物的吸收能力，对利用大分子底物酶促合成药物衍生物具有重要意义。
42.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.ctab在提高yede1e2蛋白表达菌株对外源大分子药物底物摄取中的应用。2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述外源大分子药物底物为抗癌药物，所述抗癌药物包括植物天然产物或者其衍生物。3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述外源大分子药物底物为鬼臼毒素。4.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述yede1e2蛋白表达菌株为天然yede1e2蛋白表达菌株或者通过基因工程技术手段实现yede1e2蛋白表达的菌株。5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述菌株为表达外源yede1e2蛋白的大肠杆菌。6.一种提高yede1e2蛋白表达菌株对外源大分子药物底物摄取的方法，其特征在于，所述方法包括：向含有外源大分子药物底物以及yede1e2蛋白表达菌株的培养环境中添加ctab。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述ctab的浓度为10～100μm，进一步为200～600μm；所述外源大分子药物底物为鬼臼毒素；所述鬼臼毒素的含量为100～1000μm，进一步的，所述鬼臼毒素的含量为500μm；所述yede1e2蛋白表达菌株可以为天然yede1e2蛋白表达菌株或者通过基因工程技术手段实现yede1e2蛋白表达的菌株；具体的，所述菌株为表达外源yede1e2蛋白的大肠杆菌。8.权利要求6或7所述方法在生物合成药物衍生物中的应用。9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述药物衍生物为鬼臼毒素衍生物。10.一种鬼臼毒素衍生物的生物合成方法，其特征在于，所述生物合成方法：向含有鬼臼毒素以及yede1e2蛋白表达菌株的培养环境中添加ctab，对所述yede1e2蛋白表达菌株进行培养发酵，并分离获取鬼臼毒素衍生物。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及CTAB在提高YedE1E2蛋白表达菌株对外源大分子药物底物摄取中的应用。具体的，本发明在CTAB的存在下借助转运蛋白YedE1E2极大的改善了大肠杆菌对底物PTOX的细胞摄取。YedE1E2通过调节硫烷硫的转运，降低了胞内CTAB引起的活性氧(ROS)地增高，增加了细菌的抗逆性和生存能力，从而对利用大分子底物酶促合成药物衍生物具有重要意义，因此具有可观的应用价值和前景。因此具有可观的应用价值和前景。因此具有可观的应用价值和前景。


技术研发人员：刘红蕾 于蕙源 荀鲁盈 汤亚杰
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：2023.06.16
技术公布日：2023/10/8