人PC4蛋白Ser17位点的磷酸化在肿瘤细胞增殖调控中的应用

人pc4蛋白ser17位点的磷酸化在肿瘤细胞增殖调控中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及人pc4蛋白ser17位点的磷酸化在肿瘤细胞增殖调控中的应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤是威胁人类生命和健康的重大疾病之一，近年来肿瘤发病率逐渐上升，死亡率也居高不下，并且发病年龄呈年轻化趋势。尽管近年来肿瘤的基础研究和临床治疗取得了较大进展，但仍然缺乏高效特异的早期诊断指标和治疗方法，再加上肿瘤容易复发和转移的特性，所以大部分肿瘤患者的预后都比较差。因此，深入研究恶性肿瘤发生发展机制，鉴定一些辅助肿瘤早期诊断的生物标志物，以及发现肿瘤治疗的新靶点对于肿瘤的预防和治疗都具有十分重要的意义。
3.辅助转录因子4(positive cofactor 4，pc4)是一种功能强大且结构高度保守的核蛋白，广泛存在于酵母、哺乳动物和人类等组织细胞中。除了参与rna聚合酶ⅱ介导的基础转录，pc4还可以调控dna复制、染色质重塑、dna修复以及rna代谢等分子生物学过程。近年来关于pc4的生物学功能研究逐渐增多，本课题组最早报道了pc4在正常细胞恶性转化后的模型以及肺癌、骨肉瘤等多种肿瘤临床标本中异常高表达，并且调控肿瘤的恶性进展(shi cm，2007，in vitro cell dev biol；peng y，2012，cancer gene ther；luo p，2019，cell commun signal)。
4.鉴于pc4在肿瘤发生和发展过程中发挥的重要作用，而磷酸化、泛素化等翻译后修饰往往在细胞信号通路介导的生理和病理过程中发挥着关键作用，但具有不同修饰如何发挥作用是未知的，因而进一步研究pc4蛋白的翻译后修饰及其对肿瘤的影响，具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是克服现有pc4蛋白与肿瘤之间研究的不足，提供一种能够用于诊断与靶向治疗肿瘤的pc4蛋白磷酸化位点，并给予此开发肿瘤诊断产品与靶向治疗药物，并进一步开发能够特异识别人pc4蛋白的ser17磷酸化位点的抗体。
6.本发明第一目的是提供pc4蛋白ser17位点在作为肿瘤诊断靶点，pc4蛋白ser17位点磷酸化水平在作为肿瘤诊断指标，以及检测pc4蛋白ser17位点磷酸化水平的试剂在制备肿瘤诊断产品中的应用。
7.本发明第二目的是提供pc4蛋白ser17位点在作为肿瘤治疗靶点或肿瘤细胞增殖调控靶点中的应用，或作为靶点在筛选、开发和/或设计预防和/或治疗肿瘤产品中的应用，以及能够激活/促进pc4蛋白ser17位点磷酸化的试剂在制备肿瘤治疗产品中的应用。
8.本发明第三目的是提供ck2磷酸激酶在作为或制备能够激活/促进pc4蛋白ser17位点磷酸化的产品中的应用，或在制备肿瘤治疗产品中的应用。
9.本发明第四目的是提供一种磷酸化修饰ppc4
s17
抗原肽。
10.本发明第五目的是提供一种特异性识别pc4蛋白ser17磷酸化位点的抗体。
11.本发明第六目的是提供所述抗原肽或所述抗体在作为或制备肿瘤检测/诊断/筛查、治疗或预后判定产品中的应用。
12.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
13.我们研究发现，pc4氨基酸序列中的ser17位点是其蛋白磷酸化修饰的位点，然而该修饰是否能通过影响pc4蛋白功能来影响肿瘤细胞生长还不清楚。我们进一步研究显示：pc4蛋白的ser17位点磷酸化在肿瘤细胞或组织的表达水平比正常细胞或组织的表达水平低；激活pc4蛋白的ser17位点磷酸化能够明显减弱pc4蛋白与rna结合的能力，导致细胞周期阻滞和肿瘤细胞生长抑制，抑制肿瘤细胞生长、增殖和恶性表型转化。表明pc4的ser17可作为关键的靶点应用于肿瘤诊断产品或肿瘤靶向药物的开发。因此可以针对该位点开发肿瘤筛查、诊断与治疗疗效的监测产品，以及靶向治疗肿瘤的药物。进一步地，本发明还开发了针对人pc4蛋白ser17位点的磷酸化抗体，可应用于肿瘤等疾病的诊断、治疗及预后判定等。
14.基于本发明的研究成果，本发明要求保护如下方案：
15.pc4蛋白ser17位点在作为肿瘤诊断靶点中的应用。
16.pc4蛋白ser17位点磷酸化水平在作为肿瘤诊断指标中的应用。
17.检测pc4蛋白ser17位点磷酸化水平的试剂在制备肿瘤诊断产品中的应用。
18.pc4蛋白ser17位点在作为肿瘤治疗靶点或肿瘤细胞增殖调控靶点中的应用。所述调控是抑制肿瘤细胞增殖、生长和恶性进展。调控手段是通过激活pc4蛋白ser17位点磷酸化，进而可明显减弱pc4蛋白与rna结合的能力，导致细胞周期阻滞，抑制肿瘤细胞生长和恶性进展。
19.pc4蛋白ser17位点在作为靶点在筛选、开发和/或设计预防和/或治疗肿瘤产品中的应用。
20.能够激活/促进pc4蛋白ser17位点磷酸化的试剂在制备肿瘤靶向治疗产品中的应用。
21.本发明还研究了ck2磷酸激酶直接催化pc4的ser17位点磷酸化，抑制pc4与rna结合，进而阻碍pc4对rna的稳定性调控，最终导致肿瘤细胞生长受限，因此要求保护：ck2磷酸激酶在作为或制备能够激活/促进pc4蛋白ser17位点磷酸化的产品中的应用，以及ck2磷酸激酶在制备肿瘤治疗产品中的应用。
22.另外，本发明还进一步开发了一种磷酸化修饰ppc4
s17
抗原肽，序列为：cssgsd-psdsev。其中的ser氨基酸被磷酸化修饰。该抗原肽既能解决pc4蛋白磷酸化修饰有效研究的问题，又能用于肿瘤等疾病的诊断、治疗及预后判定。
23.更进一步地，利用所述抗原肽作为免疫原免疫动物，制备了一种特异性识别pc4蛋白ser17磷酸化位点(ppc4
s17
)的多克隆抗体(命名为p-pc4-s17抗体)。该抗体既能解决pc4蛋白磷酸化修饰有效研究的问题，又能用于肿瘤等疾病的诊断、治疗及预后判定。
24.因此，所述抗原肽在制备特异性识别pc4蛋白ser17磷酸化位点(ppc4
s17
)的多克隆抗体中的应用，也应在本发明保护范围之内。
25.所述抗原肽或所述抗体在作为或制备肿瘤检测/诊断/筛查、靶向治疗或预后判定产品中的应用，也应在本发明保护范围之内。
26.其中抗体用于诊断或靶向治疗药物开发，包括将抗体与药物链接开展肿瘤靶向治疗、将抗体与放射性标记物链接进行放射性免疫显像来协助肿瘤的诊断。
27.本发明方案中所述肿瘤包括肝癌、宫颈癌、结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌。
28.本发明方案中所述包括药物等。
29.pc4蛋白作为一种rna结合蛋白，通过调控肝癌细胞周期相关基因的mrna稳定性和蛋白表达水平，加快细胞周期g1/s期的转化同时确保细胞有丝分裂有序进行，进而促进肝癌细胞的增殖、迁移和转移。本发明的方案针对pc4蛋白的ser17位点磷酸化，通过质谱分析和western blot明确了ser17位点磷酸化是ck2磷酸激酶与pc4蛋白互作后的产物，而pp2a磷酸水解酶能去除pc4的ser17位点的磷酸修饰，从而促进肿瘤细胞的发生、发展和转移。这对于肿瘤的发生发展研究、治疗方案研究均有非常高的价值。
30.本发明制备得到的高特异性的针对人pc蛋白ser17位点磷酸化抗体可用western blot实验可检测正常细胞、肿瘤细胞的表达差异，有助于研究pc4蛋白的磷酸化修饰在肿瘤疾病发生发展过程中的作用，为临床肿瘤疾病的诊断或治疗提供潜在的作用靶点，还可以用ihc、elisa等免疫学相关实验以检测人pc4蛋白的磷酸化水平，探讨其与肿瘤等系统疾病的关系，在疾病诊断、治疗及预后判定等方面具有广泛的临床应用前景。
31.本发明具有以下有益效果：
32.(a)本发明研究得到一种rna结合蛋白pc4的ser17位点磷酸化，通过减弱pc4蛋白与rna结合，使得肿瘤细胞发生细胞周期阻滞和生长抑制。因此可针对该位点开发治疗靶向抗肿瘤药物。
33.(b)本发明提供的人pc4蛋白的ser17位点磷酸化，可作为肿瘤生物标志物，用于临床肿瘤疾病的筛查、诊断与治疗疗效的监测。
34.(c)本发明还提供了对应的磷酸化抗原肽和抗体，能够作为或用于开发制备肿瘤检测/诊断/筛查产品，以及作为或用于开发制备肿瘤靶向治疗或预后判定药物，对于肿瘤的防治具有重要应用价值。
35.(d)本发明提供的抗原肽和抗体，在实际应用中能够检测人pc4蛋白的翻译后磷酸化修饰情况，便于研究人pc4蛋白特定位点磷酸化修饰在特定生物学事件如肿瘤细胞周期等的相关性；有助于探讨人pc4蛋白的特定位点磷酸化修饰在肿瘤疾病发生发展过程中的作用机制，以及在特定生物学事件或疾病发生发展过程中的作用机制，亦可用于研究介导其发生磷酸化作用的激酶和水解酶在肿瘤疾病发生过程中的生物学功能，有助于研究pc4蛋白的多种生物学功能，还具有很好的科研价值。
附图说明
36.图1显示人pc4蛋白ser17位点在phosohositeplus数据库查询结果。
37.图2显示人pc4蛋白ser17磷酸化修饰位点的质谱图。
38.图3显示ser17在人、鼠、猩猩、猕猴、牛、鸡和非洲爪蟾都是高度保守。
39.图4显示pc4
wt
，pc4
s17a
或pc4
s17e
中磷酸化表达水平差异，敲低ck2后，pc4蛋白ser17位点的磷酸化水平显著降低。
40.图5体外磷酸激酶实验显示pc4是ck2和pp2a的真实底物。
41.图6体外磷酸激酶实验显示ck2磷酸化pc4 ser17位点。
42.图7显示在不同的细胞周期中，pc4 ser17磷酸化修饰水平发生变化，原因是在细胞间期pc4蛋白与ck2结合，pc4磷酸化水平升高；而在细胞分裂时期pc4蛋白与pp2a结合，pc4蛋白的磷酸修饰消失。
43.图8显示肿瘤组织中的pc4蛋白与pp2a结合，pc4蛋白的磷酸化水平降低。
44.图9显示rip-qpcr实验表明flag-pc4
s17a
突变与rna结合能力显著提高。
45.图10显示体外emsa实验表明在ck2的磷酸化修饰下，pc4
wt
野生型与rna结合能力减弱，而pc4
s17a
突变体与rna结合能力增强。
46.图11显示rna稳定性实验表明pc4
s17a
突变对下游mrna稳定性的影响。
47.图12显示敲低pc4(shpc4)后，ccnd1 mrna水平显著下降，在这个情况下，外源转入野生型pc4
wt
能挽救ccnd1 mrna下降的趋势，而转入突变型pc4
s17a
使ccnd1 mrna水平升高，但转入突变型pc4
s17e
不能恢复ccnd1mrna下降水平。
48.图13显示敲低pc4(shpc4)后，ccnd1蛋白水平显著下降，在这个情况下，外源转入野生型pc4
wt
能挽救ccnd1蛋白下降的趋势，而转入突变型pc4
s17a
使ccnd1蛋白表达水平升高，但转入突变型pc4
s17e
不能恢复ccnd1蛋白表达水平下降。
49.图14cck8实验显示pc4
s17a
突变促进，而pc4
s17e
突变抑制肿瘤细胞增殖。
50.图15edu实验显示pc4
s17a
突变促进，而pc4
s17e
突变抑制肿瘤细胞dna复制。
51.图16显示pc4
s17a
突变促进肿瘤细胞侵袭和迁移能力，而pc4
s17e
突变抑制肿瘤细胞侵袭和迁移能力。
52.图17小鼠皮下荷瘤生长曲线表明，对比野生型pc4
wt
，pc4
s17e
突变抑制肿瘤形成。
53.图18显示h2b-gfp系统追踪细胞周期后，对比野生型pc4
wt
，pc4
s17e
突变体使细胞显著抑制细胞周期进程。
54.图19显示elisa检测纯化后的ppc4
s17
抗体对ser17位点磷酸化合成肽的特异性情况。
55.图20蛋白点杂交(dot blot)检测显示纯化后的ppc4
s17
抗体对ser17位点磷酸化合成肽的特异性情况。
56.图21wb显示ppc4
s17
抗体能特异性识别pc4 ser17位点的磷酸化修饰。
57.图22wb显示与配对的正常组织相比，肿瘤组织中的ppc4
s17
表达水平显著降低。
58.图23显示pc4蛋白ser17磷酸化抑制肿瘤细胞生长示意图。
具体实施方式
59.以下结合说明书附图和具体实施例，对本发明提供的针对人pc4蛋白ser17位点磷酸化在肿瘤细胞调控作用及其特异性抗体制备的技术路线，进一步进行阐述和说明。但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
60.除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
61.部分展示，如下实施例中用到的实验材料和实验方法包括(未尽之处为本领域常规材料、方法)：
62.1实验细胞：
63.人肝癌细胞huh7和hepg2，宫颈癌细胞hela，正常肝脏细胞lo2和lx2。
64.2实验药品及抗体：
65.荧光标记的抗体溶液、4％多聚甲醛、pbs缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、苏木素染色液、伊红染色液、封闭用山羊血清、免疫组化二抗、dab显色液、中性树胶、rpmi-1640培养基、dmem高糖培养基、胎牛血清、胰酶、异丙醇、三氯甲烷、trizol、qpcr试剂盒、逆转录试剂盒、sybr、actinomycin d、基质胶matrigel matrix、western及ip细胞裂解液、bca蛋白浓度检测试剂盒、蛋白marker、5
×
蛋白上样缓冲液、sds-page凝胶配制试剂盒、tris、甘氨酸、sds、pvdf膜、hrp标记二抗、tween 20、western封闭液、一抗稀释液、beyo ecl发光液、cck-8试剂盒、结晶紫染色液、pc4抗体(abcam,ab72132)、ck2α抗体(cst,2656s)、pp2a抗体(bd,610555)、flag抗体(sigma,f1804)、cyclin d1抗体(cst,2978)、cenpf抗体(abcam,ab5)、gapdh抗体(bioss,bs-2188r)、β-actin抗体(cst,3700)等。
66.3实验仪器及耗材：
67.切片机、电子天平、切片机、倒置相差显微镜、免疫组化湿盒、普通pcr仪、qpcr仪、细胞培养箱、漩涡振荡器、恒温摇床、超净工作台、离心机、制冰机、凝胶成像仪、垂直蛋白电泳槽、酶标仪、移液枪、pvdf膜、防脱载玻片、盖玻片、培养瓶、离心管、枪头、6孔板、96孔板、transwell小室等。
68.4实验方法
69.4.1cck-8
70.4.1.1细胞铺板：将各组(nc，shpc4，shpc4+pc4
wt
，shpc4+pc4
s17a
和shpc4+pc4
s17e
)的huh7细胞消化、计数并制成2
×
104/ml密度的细胞悬液，于96孔板每孔加入100μl，每组设置6个复孔。然后置于37℃，5％ co2的细胞培养箱中培养。
71.4.1.2od值检测和生长曲线绘制：每间隔24h取出96孔板，根据每次需要检测的培养孔数目，按照10μl cck-8试剂和90μl pbs的比例配置工作液。吸出旧培养基，加入新配置的cck-8工作液100μl，放回37℃细胞培养箱中孵育2h，再用酶标仪检测450nm波长下的吸光度值，最后绘制生长曲线。
72.4.2集落形成
73.4.2.1细胞铺板：将各组(nc，shpc4，shpc4+pc4
wt
，shpc4+pc4
s17a
和shpc4+pc4
s17e
)的huh7细胞消化、计数并制成2
×
104/ml密度的细胞悬液，于6孔板每孔加入100μl，再用加入2ml培养基，每组设置3个复孔。然后置于37℃，5％co2的细胞培养箱中培养。
74.4.2.2集落染色和计数：每隔2-3天更换培养基，显微镜下观察集落大小。待2-3周后，集落出现肉眼可见的大小时，即可终止实验。吸出培养基，pbs清洗2遍，再用4％多聚甲醛固定15分钟。最后用结晶紫染色15分钟，干燥后拍照并统计集落数目。
75.4.3transwell实验检测各组乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力
76.4.3.1基质胶铺板：用基质胶包被transwell小室(8μl孔径)底部膜的上室面，并于37℃放置半小时使基质胶凝聚(迁移实验则不需要基质胶铺板)。
77.4.3.2接种细胞：将各组(nc，shpc4，shpc4+pc4wt，shpc4+pc4s17a和shpc4+pc4s17e)的huh7细胞消化，制成密度5
×
105/ml无血清细胞悬液(可预先将细胞无血清培养饥饿12h)，向transwell小室中加入100μl细胞悬液。下室为含20％fbs的培养基，上层小室为无血清培养，注意下室培养液和小室之间不能有气泡。
78.4.3.3染色和统计：培养24h后，发生侵袭迁移的细胞会穿过膜，贴于膜的下室侧而
不掉到下室中。pbs清洗2遍，再用4％多聚甲醛固定15分钟。最后用结晶紫染色15分钟，用棉签擦除上层未迁移细胞，清洗干燥后取多个视野观察、拍照并统计细胞数目。
79.4.4裸鼠荷瘤
80.4.4.1以生长良好的各组(nc，shpc4，shpc4+pc4wt，shpc4+pc4s17a和shpc4+pc4s17e)的huh7细胞为研究模型，将各组细胞消化、计数并制备成密度2.5
×
107/ml的细胞悬液，放在冰盒中备用。
81.4.4.2于第三军医大学动物中心购买5-6周龄的雄性balb/c裸鼠，分为4组，每组5只。于裸鼠背部注射接种200μl细胞悬液，即每只裸鼠接种5
×
106个细胞。
82.4.4.3将裸鼠饲养于spf动物房，每隔3天观察荷瘤生长状况并测量肿瘤大小(荷瘤体积＝(长度
×
宽度2)/2，于实验终点处死裸鼠并取出瘤体拍照和称重。将瘤体一部分冷冻于-80℃，另一部分瘤体放入4％多聚甲醛中固定。
83.4.5qpcr检测各组细胞周期基因的mrna稳定性
84.4.5.1将各组(nc，shpc4，shpc4+pc4
wt
，shpc4+pc4
s17a
和shpc4+pc4
s17e
)的huh7细胞中加入5ug/ml的actinomycin d后，分别于0h、2h、4h、6h收集样本，即倒掉培养瓶中的培养基，pbs洗1-2次，再加入1ml trizol，用细胞刮将各组细胞刮下，收集并转移至1.5ml ep管中；
85.4.5.2提取rna：每管加入0.2ml三氯甲烷，剧烈震荡15s，室温静置15分钟；4℃离心，12000rpm，15分钟，可见液体分为3层；小心地取450μl上清液至另一1.5ml ep管；加入0.5ml异丙醇，轻轻颠倒混匀30s，4℃放置约10min；4℃离心，12000rpm，10min，弃上清，管底可见白色针尖大小的沉淀；按1ml 75％乙醇(depc水配制)/ml trizol的量加入至各ep管，洗涤沉淀；4℃离心，12000rpm，5min后，弃上清；重复清洗rna一遍；超净台内晾干(防止乙醇抑制逆转录酶)；用适量去rna酶depc水溶解管底的rna，测量浓度并配平；
86.4.5.3去除基因组dna并逆转录rna为cdna；
87.4.5.4real-time pcr：体系20ul(sybr 10ul、引物(上)0.5ul、引物(下)0.5ul、cdna 1ul、dh2o 8ul)，程序退火温度59℃，循环数40。具体引物序列如表2所示。
88.4.5.5统计分析各组的mrna表达水平，并制成各基因的mrna稳定性图表。
89.表2.细胞周期基因的qpcr引物序列
[0090][0091]
4.6western blotting
[0092]
4.6.1细胞蛋白的提取：直接用细胞挂在培养瓶中刮取各组细胞(nc，shpc4，shpc4+pc4wt，shpc4+pc4s17a和shpc4+pc4s17e)，全部收集转移至各离心管中；室温1500rpm，离心5min；倒掉上清，pbs重悬底部细胞，转移至1.5ml ep管；室温1500rpm，离心5min；倒掉pbs，加入约细胞体积3倍的含10％cocktail蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，用手指轻弹以充分裂解细胞，置于冰浴30min；12000rpm离心10min，取上清转移至1.5ml ep管。
[0093]
4.6.2bca法测定蛋白浓度：取0.8ml蛋白标准配置剂加入一管标准蛋白(20mg bsa)中，溶解完全后即配制成25mg/ml的标准蛋白溶液。取20ul25mg/ml标准蛋白，加入980μl pbs，稀释50倍，浓度即为0.5mg/ml。配制成bca工作液(a液和b液的比例为50:1)，现用现配。将0.5mg/ml的标准蛋白按照0,1,2,4,8,12,16,20μl加入96孔板中，然后每孔加入0.9％生理盐水或者纯净水补足至20μl。加2μl样品和18μl pbs到96孔板中，总体积为20μl。每孔加入200μl bca工作液，37℃静置30min。酶标仪测定蛋白od562。绘制标准曲线，计算蛋白浓度，并且以最低浓度为准，配平各组。取一定体积蛋白，加入1/5体积的6
×
loading buffer，100℃5min使蛋白变性。
[0094]
4.6.3sds-page电泳：配制12％下层分离胶和5％上层浓缩胶。取bio-rad公司产电泳装置，将大小两块干净的bio-rad玻璃板(8cm
×
8cm，1.5mm)对齐固定于架子上。均匀灌注下层分离胶至玻璃板高度约2/3处，左右移动缓慢地加入异丙醇封胶，静置约30min。当上层异丙醇与下层分离胶之间界限明显时，用蒸馏水清洗、弃净异丙醇。灌注浓缩胶，水平缓慢插入梳子以防气泡生成。室温静置约30min。将配好胶的玻璃板放入电泳槽，倒入500ml蛋白电泳缓冲液，注意内槽用新配置电泳液，外槽可以用回收电泳液。取出蛋白，短暂离心以收集管壁的液体，用微量进样器或者移液器上样品蛋白，在两边或其他合适位置加入约5μl marker。电泳80v约40min，当溴酚兰跑过浓缩胶后，将电压调至120v，电泳约1.5h，待溴酚兰将要跑至分离胶下缘时(胶底部约1cm处)停止电泳。
[0095]
4.6.4转膜(湿转法)：配制转膜缓冲液，甲醇于准备转膜时加入。将夹子和滤纸浸泡于缓冲液中，4℃预冷。根据上样孔数，用梳子做对照，剪取大概相同大小的pvdf膜，浸泡在甲醇中约10min。从电泳槽中取出玻璃板，轻柔地将凝胶转移到缓冲液中。根据marker示意的抗体所在位置用切胶板切胶，按照“黑胶白膜”的原则将物品放在转膜夹子中，自下而上：黑色夹子、滤纸、凝胶、pvdf膜、滤纸、白色夹子。用玻璃棒仔细地轻轻赶走气泡。夹紧夹子，置于电转装置中。内置白色盒子放满冰块。并将电转装置置于冰浴中转膜。电流250ma，电转约60min-120min，根据蛋白分子量大小调整时间。
[0096]
4.6.5封闭：电转完毕后取pvdf膜在tbst溶液中漂洗一次，置于干净的孵育盒或者塑料袋中，加入western封闭液进行封闭，置于摇床上，37℃封闭2h。
[0097]
4.6.6孵育一抗、二抗
[0098]
4.6.7封闭完毕的pvdf膜在tbst中漂洗一下，放于另一干净的孵育盒中。用一抗稀释液稀释抗体至浓度为1:1000(p-pc4-s17)或1:2000(β-actin)，稀释后的抗体加入孵育盒中，置于摇床上，4℃孵育过夜。次日取出该pvdf膜，置于洗膜的透明塑料盒中，倒入约20ml tbst使之能浸没pvdf膜，置于摇床上室温洗涤3次，每次约10min。用western二抗稀释液(或者tbst)稀释二抗，浓度分别为羊抗鼠(1:1000，抗β-actin)、羊抗兔(1:2000，抗pc4)，加入含有pvdf膜的孵育盒中。置于摇床上，37℃孵育二抗约2h。洗涤二抗，置于摇床上室温洗涤3次，每次约10min。
[0099]
4.6.8化学发光显影：取ecl化学发光试剂a液和b液各100μl混合均匀，避光放置。pvdf膜平铺在剪开的塑料袋上，将ecl化学发光液均匀地滴在pvdf膜上，用bio-rad的凝胶成像仪器进行曝光成像。
[0100]
4.7免疫组织
[0101]
4.7.1取材固定：标记各取样瓶，并加入适量4％多聚甲醛固定液(2/3左右)，将各
组织(肝癌和对照正常肝组织)依次放入取样瓶中，固定24—72h。
[0102]
4.7.2组织的修剪、脱水：将脱水篮用煮沸的水冲洗，除去其表面附着的蜡。将每个取样瓶中的组织全部取出，逐个修剪，尽量使各组织平整，放入脱水篮，注意做好标记。放入脱水机中，常温脱水16h。
[0103]
4.7.3组织包埋：将待包埋组织放于液态石蜡中，并紧贴底面摆放整齐，注意做好标记。置于常温使蜡块凝固(0.5h以上，冷冻容易使蜡块开裂)。
[0104]
4.7.4修块：将凝固的蜡块取出，尽量修成规则的长方体(切面不用修剪，切面的上下面即机器固定面也尽量少修剪，切面的左右面和对面可以多修剪点)。修剪结束后重新烫上标签。
[0105]
4.7.5切片：切片前半小时将蜡块放入-20℃，切片的厚度一般为5mm。未用完的蜡块可以密封好常温长时间保存(防止老鼠啃食)。
[0106]
4.7.6捞片：提前用铅笔(防止酒精脱色)标记好空白载玻片，一般每种组织捞5-6张，每张载玻片上通常捞2-3份组织，做对照使用。烘干结束后如果不马上脱蜡染色，可以放入玻片盒里面(尽量在1个月内染色)，脱蜡染色前再烘干0.5h。
[0107]
4.7.7脱蜡：放入二甲苯ⅱ—二甲苯ⅰ—100％乙醇—95％乙醇—80％乙醇中依次10min—10min—5min—5min—5min。脱蜡结束后，将支架放入烧杯中，用清水冲洗3min。
[0108]
4.7.8枸橼酸钠修复：往烧杯中加入300ml 0.01mol枸橼酸钠溶液，然后将支架放入烧杯中，再将烧杯放入提前煮沸的水锅中(蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来)，待烧杯中温度升至93℃以上计时修复20min后，将烧杯取出，室温冷却至37℃左右(枸橼酸钠可回收)。
[0109]
4.7.9过氧化氢修复：往烧杯中加入300ml pbs溶液(或双蒸水)，将支架放入烧杯中浸泡10min(注意中间换1次pbs)或者5min x 3次，若玻片数量较少，可以直接往玻片上滴加pbs溶液(或双蒸水)，5min x 3次。然后将玻片轻轻甩干(可用纸擦干)，注意不要擦得很干，使玻片保持湿润。将3％h2o2直接滴加在各玻片组织面上，注意不要触碰到组织，室内放置15min(或放入湿盒内)。然后将玻片上的试剂甩掉，再放入支架上。
[0110]
4.7.10血清封闭：往烧杯中加入300ml pbs溶液(或双蒸水)，将支架放入烧杯中浸泡10min(注意中间换1次pbs)或者5min x 3次，若玻片数量较少，可以直接往玻片上滴加pbs溶液(或双蒸水)，5min x 3次。然后将玻片轻轻甩干(可用纸擦干)，注意不要擦得很干，使玻片保持湿润。将血清用移液器滴加在各玻片组织面上，使一些非特异性的位点封闭起来，再将玻片放入湿盒中(若数量不多，可直接放入加水的枪头盒中)，再将湿盒放入37℃温箱30min(如果后面的一抗是用血清稀释配置，则37℃放置时间可缩短至15min)。
[0111]
4.7.11加一抗：将提前配置的一抗(p-pc4-s17抗体1:100稀释)用移液器滴加在各玻片组织面上(如果做对照实验，就在对照组织上滴加pbs，同1类或同1张片子留一份组织做对照)，再将玻片放入湿盒中，然后再将湿盒放入4℃冰箱中保存过夜(12h以上)。一抗的配置：用pbs(或血清)稀释，一般1个样本大约需要100ul抗体稀释液，比例根据说明书可以是1:50、1:100、1:200。
[0112]
4.7.12加二抗：往烧杯中加入300ml pbs溶液(或双蒸水)，将支架放入烧杯中浸泡10min(注意中间换1次pbs)或者5min x 3次，若玻片数量较少，可以直接往玻片上滴加pbs溶液(或双蒸水)，5min x 3次。然后将玻片轻轻甩干(可用纸擦干)，注意不要擦得很干，使
玻片保持湿润。将二抗直接滴加在各玻片组织面上，再将玻片放入湿盒中，再将湿盒放入37℃温箱40min。
[0113]
4.7.13加显色剂：往烧杯中加入300ml pbs溶液(或双蒸水)，将支架放入烧杯中浸泡10min(注意中间换1次pbs)或者5min x 3次，若玻片数量较少，可以直接往玻片上滴加pbs溶液(或双蒸水)，5min x 3次。将支架放入装有pbs或双蒸水的烧杯中，拿去显微镜前显色。将玻片轻轻甩干(可用纸擦干)，将配置好的dab显色液用移液器直接滴加在各玻片组织面上，显色10s左右(具体时间根据实际情况而定)，迅速放入水中洗去，镜下观察，如显色不够则继续重复前面步骤。dab显色液的配置：一般1个样本大约需要100uldab显色液，比例根据说明书是1ml试剂a+1滴试剂b。
[0114]
4.7.14复染：将显色后的载玻片重新放入支架(烧杯)，用清水冲洗3min。浸泡于苏木精中染色3min(过染)，用清水冲洗3min。放入盐酸中6s(恢复)，用清水冲洗3min。镜下观察，是否复染上(若没有，则需要重复此步骤；若复染比较重，则放入盐酸中6s，用清水冲洗3min)。
[0115]
4.7.15烤干、脱水：将支架放入烤箱中烤干(几分钟即可，不能太干)，再将支架放入二甲苯ⅱ中20min后晾干。
[0116]
4.7.16封片：中性树胶滴封片、晾干，镜下观察并拍照。
[0117]
4.8mrna稳定性测定
[0118]
4.8.1将各组(nc，shpc4，shpc4+pc4
wt
，shpc4+pc4
s17a
和shpc4+pc4
s17e
)的huh7细胞中加入5ug/ml的actinomycin d后，分别于0h、2h、4h、6h收集样本，即倒掉培养瓶中的培养基，pbs洗1—2次，再加入1ml trizol，用细胞刮将各组细胞刮下，收集并转移至1.5ml ep管中；
[0119]
4.8.2用trizol法提取rna
[0120]
4.8.3去除基因组dna；
[0121]
4.8.4逆转录cdna；
[0122]
4.8.5real-time pcr
[0123]
4.9免疫共沉淀
[0124]
4.9.1提取蛋白：用预冷的pbs洗涤细胞两次，最后一次吸干pbs；加入预冷的lysis buffer；用移液枪吹散细胞，将悬液转移到1.5ml ep试管中，4℃缓慢晃动15min；4℃，14000rpm离心15min,立即将上清液转移到一个新的离心管中。
[0125]
4.9.2去除大分子蛋白：准备琼脂糖珠，用lysis buffer洗两遍珠子，然后用lysis buffer配制成50％浓度；每1ml总蛋白中加入100μl琼脂糖珠，4℃摇晃10min。4℃，14000rpm离心15min，将上清转移到一个新离心管中，去除琼脂糖珠子。制作蛋白曲线，测定蛋白浓度。用lysis buffer将总蛋白稀释到约1ug/μl。
[0126]
4.9.3ip：加入5μg特定的一抗到600μl总蛋白中，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜。
[0127]
4.9.4磁珠捕捉：取出30μl proteina/g磁珠，用pbs洗两遍珠子，用100μllysis buffer回溶珠子并加入抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物4h。
[0128]
4.9.5清洗磁珠复合物：将含有磁珠抗原抗体复合物的ep管放入磁力架，去除清液，用预冷的ip buffer反复清洗6遍；
[0129]
4.9.6用50μl ip buffer将磁珠抗原抗体复合物悬起，加入10μl的6
×
loading buffer，100℃5min使蛋白变性。
[0130]
4.10体外磷酸激酶反应
[0131]
4.10.1配置激酶反应液：25mm tris(ph 7.5),2mm dtt,10mm mgcl2
[0132]
4.10.2使用前向激酶反应液中加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和atp，atp终浓度为200μm。
[0133]
4.10.3用50μl激酶反应液溶解10μg底物蛋白(pc4纯化蛋白)和0.5μg激酶(ck2纯化蛋白或pp2a纯化蛋白)，30℃反应45min。
[0134]
4.10.4 100℃5min使蛋白变性后进行sds-page胶电泳和考马斯亮蓝染色。
[0135]
4.11磷酸化修饰组学(质谱分析)
[0136]
4.11.1蛋白提取：样品从-80℃取出，各组样品分别加入4倍体积裂解缓冲液(8m尿素，1％蛋白酶抑制剂，1％磷酸酶抑制剂)，超声裂解。4℃，12000g离心10min，去除细胞碎片，上清液转移至新的离心管，利用bca试剂盒进行蛋白浓度测定。
[0137]
4.11.2胰酶酶解：各样品蛋白取等量进行酶解，用裂解液将体积调整至一致。缓慢加入终浓度20％ tca，涡旋混匀，4℃沉淀2h。4500g，离心5min，弃上清，用预冷的丙酮洗涤沉淀2-3次。晾干沉淀后加入终浓度200mm的teab，超声打散沉淀，以1:50的比例(蛋白酶：蛋白，m/m)加入胰蛋白酶，酶解过夜。加入二硫苏糖醇(dtt)使其终浓度为5mm，56℃还原30min。之后加入碘乙酰胺(iaa)使其终浓度为11mm，室温避光孵育15min。
[0138]
4.11.3修饰富集：将肽段溶解在富集缓冲溶液中(50％乙腈/6％三氟乙酸)，转移上清液至提前洗涤好的imac材料中，放置于旋转摇床上温和摇晃孵育。孵育结束后依次使用缓冲溶液50％乙腈/6％三氟乙酸和30％乙腈/0.1％三氟乙酸洗涤树脂3次。最后使用10％氨水洗脱修饰肽段，收集洗脱液并真空冷冻抽干。抽干后按照c18 ziptips说明书除盐，真空冷冻抽干后供液质联用分析。
[0139]
4.11.4液相色谱-质谱联用分析：肽段用液相色谱流动相a相溶解后使用easy-nlc 1000超高效液相系统进行分离。流动相a为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相b为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液。液相梯度设置：0-86min，3％～17％b；86-110min，17％～28％b；110-115min，28％～80％b；115-120min，80％b，流速维持在500nl/min。肽段经由超高效液相系统分离后被注入nsi离子源中进行电离然后进q exactive
tm
plus质谱进行分析。离子源电压设置为2.2kv，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350-1800m/z，扫描分辨率设置为70000；二级质谱扫描范围则固定起点为100m/z，二级扫描分辨率设置为35000。数据采集模式使用数据依赖型扫描(dda)程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20肽段母离子依次进入hcd碰撞池使用28％的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制(agc)设置为1e5，信号阈值设置为2e4 ions/s，最大注入时间设置为100ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为15s秒避免母离子的重复扫描。
[0140]
4.12制备特异性的pc4蛋白ser17磷酸化位点的抗原肽
[0141]
4.12.1设计人pc4蛋白ser17位点磷酸化抗原肽：以人pc4蛋白ser17位点为中心，n端ssgsd，c端dsev，设计的合成肽(抗原肽)序列cssgsdsdsev，在氨基酸ser17上添加磷酸化基团，肽段序列为：cssgsd-psdsev。
[0142]
4.12.2合成抗原肽：根据半抗原合成肽的设计，分别在ser17位点上添加一个磷酸化基团得到磷酸化抗原肽，并与血蓝蛋白(klh)偶联得到全抗原用于鸡免疫(pser17-klh)。此外将磷酸化合成肽(抗原肽)通过马来酰亚胺法与牛血清白蛋白(bsa)偶联用作亲和纯化层析柱的填料(pser17-bsa)。与之相对应，合成一段ser17对应的非磷酸化合成肽与牛血清白蛋白(bsa)偶联用作亲和分离层析柱的填料(ser17-bsa)。
[0143]
4.13制备特异性的pc4蛋白ser17磷酸化多克隆抗体
[0144]
4.13.1制备阴性血清：从用于注射的鸡(2～3kg，雌性，健壮，购于中科院斯莱克实验动物中心)的翅下静脉采取3ml血液于采血管中，用棉球压迫止血。将血液置室温1h左右，待血液凝固形成血块，4℃下放置2h使血清析出，2500g离心10min，吸取上清，标记为阴性对照血清，分装并贮存于-20℃待测。
[0145]
4.13.2免疫前筛选-western blot：分别取bsa标准品、ser17-bsa、pser17-bsa各5μg，加入适当的5
×
sds上样缓冲液，沸水浴煮沸10min使蛋白质变性，10000
×
g离心1min；sds-page电泳分离胶为8％，浓缩胶为5％；按预定顺序使用加样枪上样，在不用的样品孔中加等体积的1
×
sds凝胶上样缓冲液；80v 20min电泳后改为120v约50min，直至溴酚蓝到达分离胶的底部，关闭电源。转膜条件：恒流300ma，时间为120min。5％脱脂奶粉封闭，摇床37℃1h。将转印膜放入用一抗稀释缓冲液按1:5000配制免疫前抗血清稀释液，水平缓慢摇匀，4℃过夜。次日使用1
×
pbst洗膜10min，重复4次。将膜置于用1
×
pbst按1:5000稀释的hrp标记的羊抗鸡igy的二抗稀释液中，摇床37℃，60min。弃二抗溶液，1
×
pbst洗膜10min，重复3次。按照厂家说明使用ecl试剂盒显影，拍照记录。
[0146]
4.13.3动物免疫：约73天，用无菌的1
×
pbs溶解pser17-klh完全抗原，用一个无菌注射器吸取抗原溶液，另一个注射器吸取等量弗氏完全佐剂(cfa)，二者之间以塑料管连接，来回反复抽吸，将pser17-klh完全抗原与cfa混匀，直至形成完全乳化的乳状液，滴于水中不扩散。首次免疫在胸大肌多点肌肉(i.m)注射，腰部两侧进行皮内(i.d)注射，多部位多点注射抗原乳状液。抗原首次免疫总量为0.2mg。首次免疫21天后进行第一次加强免疫，用弗氏不完全佐剂(ifa)代替cfa作为免疫佐剂制备抗原乳状液并按首次免疫方式进行注射，此次加强免疫的抗原总量均约为0.1mg。免疫14天后进行加第二次强免疫，用弗氏不完全佐剂(ifa)代替cfa作为免疫佐剂制备抗原乳状液并按首次免疫方式进行注射，此次加强免疫的抗原总量均约为0.1mg。最后一次加强免疫10天后，鸡进行腹主动脉大采血，大量收集血清。将收集了血液的离心管室温静置过夜，使血块收缩。次日无菌操作将析出的血清的50ml离心管，4000g离心10min，取上清，分装1ml/管，标记为免疫后抗血清(共约51ml)，贮存于-20℃。
[0147]
4.13.4免疫后抗血清的elisa效价测定：用抗原包被液(cbs)分别将磷酸化抗原pser17-bsa和非磷酸化抗原ser17-bsa包被，加入至96孔酶标板中，每孔0.1ml，封盖酶标板，4℃过夜包被(12h以上)。包被完毕，弃去孔中的液体，1
×
pbst充分洗涤酶标板的各包被孔，弃去洗涤液，重复3次，每次洗涤后在滤纸上扣干残留液体。各包被孔内加入封闭缓冲液(0.25％bsa/pbst)，200μl/孔，37℃孵育2h，1
×
pbst洗涤滴定板3次，每次洗涤后在滤纸上扣干残留液体。用1
×
pbst将免疫后抗血清按1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、1:81000、1:243000、1:729000的比例稀释，以1
×
pbs缓冲液作为空白对照，分别加入至96孔酶标板，盖封酶标板，37℃孵育1h。弃去孔中液体，用1
×
pbst洗涤酶标板3次。加入用1
×
pbst按1:5000
稀释的hrp标记羊抗鸡igy二抗稀释液，100μl/孔，37℃孵育1h。盖封酶标板，37℃孵育1h。用1
×
pbst洗涤酶标板5次，扣干。加入临时配制的tmb显色液，100μl/孔，室温避光反应30min。加入2m h2so4终止反应，50μl/孔。酶标仪450nm测各孔od值。免疫pser17抗原后抗血清稀释度为1:1000、1:3000、1:9000的免疫后抗血清elisa检测值均在0.5以上。
[0148]
4.13.5磷酸化合成肽层析柱与非磷酸化合成肽层析柱的制备：用偶联缓冲液分别溶解ser17-bsa、pser17-bsa，溶解浓度均为1mg/ml。分别取7mg ser17-bsa、6mg pser17-bsa溶解液加入至5ml树脂，混匀后分别加入至层析柱室温混匀15分钟，将层析柱室温正置30分钟，分别取下层析柱上下两端的帽子，收集流出的液体，并用3倍体积树脂的偶联缓冲液冲洗柱子。盖上层析柱底端盖子，向偶联缓冲液中加入50mm l-cysteine
·
hcl，混匀后取等体积的缓冲液于层析柱，室温混匀15分钟后，静置30分钟。取下底端盖子，释放偶联缓冲液，用6倍体积的洗涕液(1m nacl)清洗层析柱，再用2倍体积储存缓冲液冲洗层析柱，盖上盖子，加入1倍体积的储存缓冲液，4度保存备用。
[0149]
4.13.6磷酸化抗体的纯化：取下层析柱底端盖子，释放储存缓冲液，加入10ml的结合缓冲液洗涕层析柱两次。将pser17抗血清与等体积pbs混匀稀释，加入至对应的磷酸化层析柱子，收集流出液，重复两次，得到pser17流出液，然后用10ml洗涕液清洗层析柱3次，最后用洗脱液洗脱层析柱得到对应的pser17磷酸化粗制抗体，溶于1
×
pbs。将收集的pser17磷酸化粗制抗体加入至对应的冲洗后的非磷酸化柱子，收集流出液，重复两次，保留底端最终流出液，得到对应的ser17磷酸化抗体，抗体溶于1
×
pbs，加入0.1％nan3备用。以elisa检测纯化后磷酸化抗体的效价及针对磷酸化目的抗原肽、非磷酸化合成肽的识别性。首先分别包被人工合成的磷酸化合成肽抗原-bsa(pser17-bsa)和非磷酸化合成肽抗原-bsa(ser17-bsa)，加入不同比例稀释的纯化后抗体ppc4
s17
孵育，洗涤后加入hrp标记羊抗鸡igy稀释液，孵育后洗涤，tmb显色，反应终止测定od450。结果如图16所示：ser17磷酸化抗体稀释度为1:9000时，针对磷酸化抗原的od450值大于0.75，针对非磷酸化抗原的od450值低于0.25且p/n值大于3，则纯化后ser17磷酸化抗体效价至少为1:9000以上。
[0150]
以下实施例为实验结果与分析说明：
[0151]
实施例1确定人pc4蛋白磷酸化位点ser17。
[0152]
首先蛋白质磷酸化位点数据库phosohositeplus(图1)的查找筛选人pc4蛋白中可能发生磷酸化的位点，随后通过磷酸化组学质谱分析(图2)，确证ser17是人pc4氨基酸序列中的一个磷酸化位点。
[0153]
通过序列比对显示，ser17在人、鼠、猩猩、猕猴、牛、鸡和非洲爪蟾都是高度保守(图3)。接着构建pc4不被磷酸化的突变体pc4
s17a
，pc4类磷酸化突变体pc4
s17e
，在huh7细胞中转染野生型和突变型pc4，结果表明pc4 s17a
突变体，而不是野生型pc4(pc4
wt
)或pc4
s17e
突变体，消除了pc4的磷酸化(图4)。这些结果最终确定人pc4蛋白特异性磷酸化位点ser17。
[0154]
实施例2ck2磷酸激酶磷酸化pc4的ser17位点，而pp2a磷酸水解酶去除pc4蛋白ser17位点的磷酸化修饰。
[0155]
为了进一步研究介导pc4的ser17位点发生磷酸化作用的磷酸激酶和磷酸水解酶，本发明分析ck2磷酸激酶能催化pc4的ser17位点发生磷酸化，相反，pp2a磷酸水解酶能去除pc4的ser17位点上的磷酸化修饰。为了验证这一分析，本发明利用pc4，ck2和pp2a纯化蛋白，通过体外磷酸激酶实验证明活化的ck2磷酸激酶确实能够在体外磷酸化pc4蛋白，而
pp2a能有效阻断了ck2介导的pc4的磷酸化，表明pc4是ck2和pp2a的真实底物(图5)。进一步体外构建和纯化pc4
s17a
突变体蛋白，通过co-ip、磷酸激酶、sirna特异性敲低ck2等实验方法证明，与野生型pc4
wt
相比，pc4
s17a
突变体阻碍ck2介导pc4磷酸化修饰(图6)。同理，敲低ck2后，pc4蛋白ser17位点的磷酸化水平(野生型pc4
wt
和pc4
s17e
突变体)显著降低(图4)。这些结果证明了pc4的ser17位点可以被ck2磷酸化。
[0156]
另一方面，在huh7细胞中进行细胞周期同步化观察到，与ck2结合结果相反，pc4蛋白与pp2a结合后，pc4蛋白的磷酸修饰消失(图7)。与配对的正常组织相比，肿瘤组织中的pc4蛋白与pp2a高度结合，pc4蛋白的磷酸化水平降低(图8)。这些结果提示pp2a会擦除pc4的ser17位点上的磷酸化修饰。
[0157]
实施例3pc4的ser17磷酸化使pc4与rna结合能力下降，进而干扰pc4对细胞周期相关rna的代谢调控。
[0158]
本课题组数据表明，pc4是一种非经典型的rna结合蛋白，可直接与细胞周期相关基因的mrna结合，随之控制其mrna的稳定性和蛋白表达水平。因此，pc4蛋白在细胞周期进程的协调控制中发挥着重要作用。为了研究pc4的ser17磷酸化是否会影响其与rna结合的能力，我们首先构建不同的带flag标签的pc4突变载体(flag-pc4
wt
、flag-pc4
s17a
、flag-pc4
s19a
和flag-pc4
s17a/s19a
)。再进行体内rip-qpcr实验，结果显示与flag-pc4
wt
和flag-pc4
s179a
相比，flag-pc4
s17a
突变与rna结合能力显著提高(图9)。通过体外emsa实验，结果显示与pc4
wt
蛋白相比，pc4
s17a
突变蛋白与rna结合能力升高(图10)，提示pc4的ser17磷酸化是一个pc4与rna的结合的“关闭”开关。
[0159]
接着，在huh7细胞内敲低内源性pc4同时分别外源稳定表达pc4
wt
、pc4
s17a
和pc4
s17e
，通过检测细胞周期相关的mrna稳定性、mrna表达水平和蛋白表达水平证明，与pc4
wt
相比，pc4
s17a
突变显著升高下游基因mrna的稳定性，mrna水平和蛋白表达水平，而pc4
s17e
突变则抑制下游mrna的稳定性和表达水平(图11-13)。这些结果证实ser17磷酸化对pc4介导下游靶基因mrna稳定性调控至关重要。
[0160]
实施例4ser17磷酸化的pc4能抑制肿瘤细胞的细胞周期运转、细胞生长和恶性进展。
[0161]
本发明评估pc4的ser17磷酸化在肿瘤恶性进程中发挥的作用。
[0162]
首先，通过cck8和edu实验，检测在内源性敲低pc4后稳转pc4
wt
，pc4
s17a
和pc4
s17e
对huh7细胞的增殖能力，实验结果显示pc4
s17a
突变体，而不是野生型pc4
wt
或pc4
s17e
突变体，显著提高huh7细胞的增殖效率；pc4
s17e
突变抑制肿瘤细胞增殖(图14-15)。
[0163]
通过transwel实验发现，表达pc4
s17a
突变体的细胞与表达pc4
wt
或pc4
s17e
突变体细胞相比，具有更高的侵袭能力和转移能力；pc4
s17e
突变抑制肿瘤细胞侵袭和迁移能力(图16)。
[0164]
为了进一步确定ser17磷酸化介导pc4的功能，本发明构建huh7细胞荷瘤小鼠模型，结果表明对比野生型pc4
wt
，表达pc4
s17e
突变体的肿瘤生长更慢(图17)。
[0165]
接着，本发明研究pc4的ser17磷酸化是否通过调控细胞周期运转进而影响肿瘤细胞的恶性进展。根据本课题组前期实验数据表明，过表达pc4能加快肿瘤细胞的细胞周期g1到s期的转换。于是本发明利用h2b-gfp系统追踪细胞周期变化过程，结果发现对比野生型pc4
wt
，pc4
s17e
突变体使细胞显著抑制细胞周期运转(图18)，与其抑制瘤细胞生长作用一致。
[0166]
综合上述实验结果表明，pc4的ser17磷酸化修饰能显著抑制肿瘤的恶性表型转化，提示pc4的ser17可作为关键的靶点应用于肿瘤靶向药物的开发。
[0167]
实施例5制备针对pc4的ser17磷酸化位点的特异性合成肽(抗原肽)
[0168]
为了进一步研究pc4的ser17磷酸化(以下简称ppc4
s17
)对肿瘤细胞生长调控的功能，本发明制备了一种特异性ppc4
s17
的抗原肽。首先分析该位点的抗原性和同源性，设计相应的抗原肽序列，以人pc4蛋白ser17位点为中心，n端ssgsd，c端dsev，设计的合成肽(抗原肽)序列cssgsdsdsev，在氨基酸ser17上添加磷酸化基团，肽段序列为：cssgsd-psdsev。
[0169]
采用多肽合成技术合成设计好的ppc4
s17
抗原肽(简称：pser17)，并与载体蛋白血蓝蛋白(klh)偶联，作为免疫原制备磷酸化抗体；与载体蛋白牛血清白蛋白(bsa)偶联用作亲和纯化的填料进行亲和纯化(pser17-bsa)。与之相对应，分别合成非磷酸化修饰pc4
s17
抗原肽与载体蛋白牛血清白蛋白(bsa)偶联用作亲和分离的填料(ser17-bsa)，所有合成肽都经hplc的纯化。
[0170]
实施例6制备特异性识别pc4的ser17磷酸化位点的多克隆抗体
[0171]
为了进一步研究ppc4
s17
为对肿瘤细胞生长调控的功能，本发明制备了一种特异性识别ppc4
s17
的多克隆抗体。首先用ppc4
s17
抗原肽-klh偶联全抗原与佐剂联合免疫spf级鸡，采用经胸大肌肌肉注射，腰部两侧进行皮内注射，多点注射抗原乳状液。免疫次数包括1次引发注射、3～4次加强注射和最后一次抗原直接注射，以elisa测定抗血清针对目的合成肽的效价；接着采用合成肽偶联牛血清白蛋白(bsa)亲和层析法进行抗体亲和分离-亲和纯化循环纯化技术纯化获得纯化的抗ser17磷酸化抗体，命名为ppc4
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抗体，接着以elisa检测纯化后抗体效价以及针对磷酸化目的抗原肽、非磷酸化合成肽的识别性(图19)，然后以dot blot点杂交实验进行抗体鉴定(图20)。
[0172]
实施例7pc4蛋白ser17位点磷酸化抗体在肿瘤中的应用
[0173]
为了进一步验证在细胞中，ppc4
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抗体可特异性识别pc4蛋白ser17磷酸化修饰的位点，本发明在huh7细胞中分别过表达重组载体flag-pc4
wt
，flag-pc4
s17a
或flag-pc4
s17e
。24h后提取细胞蛋白，在免疫沉淀flag产物中，p-pc4-s17抗体能识别ser17位点处于磷酸状态的pc4蛋白，而不能识别ser17位点非磷酸化状态的pc4蛋白(图21)，证明该磷酸化抗体特异性良好。
[0174]
进一步利用p-pc4-s17抗体，通过免疫组化和wb(western blot)检测肝癌细胞/组织中ppc4
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的水平。与配对的正常细胞/组织，肿瘤细胞/组织中的ppc4
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显著降低(图22)，提示pc4的ser17磷酸化在肿瘤发生发展过程中的发挥重要作用。
[0175]
综上所述，pc4蛋白ser17位点磷酸化修饰抑制肿瘤细胞生长；制备特异性识别ppc4
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的抗体在实际应用中能够应用于wb、elisa、免疫组化等免疫学实验中检测人pc4蛋白的转录后磷酸化修饰情况，从而探讨人pc4蛋白磷酸化修饰在肿瘤相关疾病中的意义。
[0176]
pc4是一种rna结合蛋白(rbp)，在小鼠胚胎早期胚胎发育、干细胞分化/重编程、肿瘤发生和代谢中具有重要的作用。本课题组前期的证据显示在肿瘤细胞中，pc4蛋白能在不同的细胞周期阶段(cell cycle phase)结合特异性的细胞周期相关的rna，通过影响rna的稳定性或降解，加快细胞周期g1期到s期的转换同时确保细胞分裂m期有序进行，进而促进肿瘤细胞快速增殖于分裂，推动肿瘤的恶性进程，促进肝癌细胞的增殖、迁移和转移。然而，pc4蛋白上特定的磷酸化修饰是否影响pc4作为rbp参与细胞周期的调控尚未十分清楚。本
发明首次研究得出，ck2磷酸激酶磷酸化pc4的ser17位点，抑制pc4与rna结合，进而阻碍pc4对rna的稳定性调控，最终导致肿瘤细胞生长受限。而pp2a磷酸酶能去除pc4的ser17位点磷酸化修饰，逆转肿瘤生长抑制的局面(图23)。本发明发现pc4
s17a
突变体阻断了s17的磷酸化，不仅是pc4与下游靶基因结合增强，而且在一定程度上促进肿瘤细胞周期g1期到s期的转换，增加肿瘤细胞的增殖、生长、侵袭和迁移能力。相反，模仿s17构成性的磷酸化的pc4
s17e
突变则抑制pc4与rna结合以及肿瘤细胞的恶性表型。更重要的是，在多种人类恶性肿瘤中，ppc4
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的水平显著降低，这种磷酸化水平的降低与肿瘤恶性表型成负相关。综上所述，本发明提供了rna结合蛋白pc4 ser17位点磷酸化位点，即ck2激酶与pc4相互作用并磷酸化pc4的ser17位点，抑制肿瘤的发生、发展和转移。特别地，本发明制备针对该位点磷酸化的多克隆抗体，一方面有助于探究pc4蛋白的ser17位磷酸化修饰对于特定生物学事件如细胞增殖影响和在肿瘤等疾病发生发展过程中的作用；另一方面将抗体与药物链接开展肿瘤靶向治疗、将抗体与放射性标记物链接进行放射性免疫显像来协助肿瘤的诊断。
[0177]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.pc4蛋白ser17位点在作为肿瘤诊断靶点中的应用。2.pc4蛋白ser17位点磷酸化水平在作为肿瘤诊断指标中的应用。3.检测pc4蛋白ser17位点磷酸化水平的试剂在制备肿瘤诊断产品中的应用。4.pc4蛋白ser17位点在作为肿瘤治疗靶点或肿瘤细胞增殖调控靶点中的应用，或作为靶点在筛选、开发和/或设计预防和/或治疗肿瘤产品中的应用。5.能够激活/促进pc4蛋白ser17位点磷酸化的试剂在制备肿瘤治疗产品中的应用。6.ck2磷酸激酶在作为或制备能够激活/促进pc4蛋白ser17位点磷酸化的产品中的应用，或ck2磷酸激酶在制备肿瘤治疗产品中的应用。7.一种磷酸化修饰ppc4
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抗原肽，其特征在于，序列为：cssgsd-psdsev。8.权利要求7所述抗原肽在制备特异性识别pc4蛋白ser17磷酸化位点的抗体中的应用。9.一种特异性识别pc4蛋白ser17磷酸化位点的抗体，其特征在于，由权利要求7所述抗原肽作为免疫原制备得到。10.权利要求7所述抗原肽或权利要求9所述抗体在作为或制备肿瘤检测/诊断/筛查、治疗或预后判定产品中的应用。

技术总结
本发明公开了人PC4蛋白Ser17位点的磷酸化在肿瘤细胞增殖调控中的应用。具体包括PC4蛋白Ser17位点在作为肿瘤诊断靶点或治疗靶点中的应用。本发明研究得到，RNA结合蛋白PC4的第17位丝氨酸残基(Ser)发生磷酸化修饰，该位点磷酸化水平在肿瘤细胞中显著降低，并且该位点磷酸化会减弱PC4与RNA结合能力，进而抑制了肿瘤细胞的细胞周期进展和细胞增殖。因此针对PC4蛋白Ser17位点开发治疗肿瘤的诊断产品和靶向药物具有较大的临床应用价值。另外，本发明针对人PC4蛋白Ser 17位点磷酸化，制备了特异性的抗原肽和抗体，可应用于调控肿瘤细胞增殖或生长，可作为或用于开发临床肿瘤疾病的诊断与治疗产品。断与治疗产品。断与治疗产品。


技术研发人员：史春梦 罗鹏 潘绮湄
受保护的技术使用者：中国人民解放军陆军军医大学
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/10/8