一种清除衰老细胞的核酸药物、药物组合物及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种清除衰老细胞的核酸药物、包括该核酸药物的药物组合物及其制备方法，用于制备治疗或预防例如肺纤维化或慢性阻塞性肺疾病(copd)等衰老相关疾病或病症的药物。


背景技术：

2.慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，copd，简称慢阻肺)是世界范围内主要的致死和致残性疾病之一，给社会带来了巨大的经济负担，但目前尚缺乏能够显著缓解疾病进展且安全有效的治疗药物。
3.细胞衰老是指细胞脱离正常的细胞周期，而进入不可逆的细胞周期阻滞状态。衰老细胞可通过分泌衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，sasp)影响组织微环境，诱导周围的正常细胞发生衰老，也可以自分泌的方式正向调节sasp信号转导从而促进衰老。
4.细胞衰老与慢阻肺关系密切。研究发现，copd患者的肺泡上皮细胞、气道上皮细胞和内皮细胞的dna损伤灶明显增多，且copd患者肺部来源的肺血管内皮细胞和气道上皮细胞均有衰老表现，包括sa-β-gal活性增强以及p21
cip1/waf1
和p16
ink4a
表达增高。成纤维细胞为间充质细胞，通过产生细胞外基质(extracellular matrix，ecm)参与组织稳态和疾病的发生发展。肺部损伤后，成纤维细胞被激活并在局部增殖，进而迁移到损伤部位，与此同时分化为肌成纤维细胞，从而获得收缩功能并产生ecm，从而参与组织修复。然而，copd患者来源的肺成纤维细胞存在迁移和收缩能力的下降，以及对转换生长因子-β1(tgf-β1)反应的减弱，且成纤维细胞功能的改变与肺功能和肺气肿严重程度相关。此外，中重度肺气肿患者原代肺成纤维细胞的sa-β-gal活性显著升高，提示肺气肿患者的肺成纤维细胞发生衰老。因此，肺成纤维细胞衰老可能在copd的发生和疾病进展中有重要作用，针对肺成纤维细胞的抗衰老药物有望成为治疗copd的新型药物。同时，肺纤维化中也观察到成纤维细胞表现出衰老表型。
5.近期，有利用一种可通过ap20187药物清除表达p16
ink4a
的衰老细胞的ink-attac转基因小鼠模型研究发现，清除衰老细胞可延长小鼠的寿命，并且能改善一些年龄相关性疾病，延缓癌症的发生。这进一步证实了年龄相关性疾病与细胞衰老的相关性，以及清除衰老细胞对衰老相关性疾病的改善作用。随后，多种衰老细胞清除剂得以研发，主要包括酪氨酸激酶抑制剂(达沙替尼)、bcl2家族抑制剂(abt-263、abt-737和a-1331852)、p53通路激活剂(foxo4-dri、ubx0101)、热休克蛋白家族抑制剂(geldanamycin、17-agg和17-dmag)和天然药物(槲皮素和非瑟酮)等。临床前研究已证明多种衰老细胞清除剂对阿尔兹海默症、骨关节炎、慢性肾病等年龄相关性疾病有治疗或改善作用，但在copd领域尚无相关报道。
6.利用衰老细胞的抗凋亡特点，合成靶向抑制抗凋亡基因的药物，可促进衰老细胞凋亡，并选择性清除衰老细胞，理论上能够延缓衰老相关疾病进展。
7.现有结果初步证实了清除衰老细胞策略在治疗衰老相关呼吸系统疾病中的可行性。然而，在临床应用之前仍面临诸多挑战：
8.(1)衰老细胞对机体存在有益作用，如抑制肿瘤、促进伤口愈合和组织再生等，而目前的衰老细胞清除剂通常无法区分生理性细胞衰老和病理性细胞衰老；
9.(2)衰老细胞清除剂在生物体内作用于非靶细胞将引起严重副作用，如abt-263引起的血小板减少是其临床应用的重要障碍；
10.(3)不同衰老诱导因素和不同组织来源的衰老细胞表达的抗凋亡基因有所不同。
11.因此，针对不同的组织细胞类型和衰老诱导因素设计衰老细胞清除剂是必要的。


技术实现要素：

12.鉴于此，本发明的目的在于提供一种清除衰老细胞的核酸药物、包括该核酸药物的药物组合物及其制备方法，所述药物组合物为负载包括foxo4 sirna单链的核酸分子的dna单链自组装形成的六螺旋纳米束药物制剂，通过将foxo4 sirna单链递送至肺成纤维细胞中，促进细胞凋亡而选择性清除烟雾暴露导致的衰老肺成纤维细胞，有望作为一种用于制备治疗或预防例如肺纤维化或copd等衰老相关疾病或病症的药物。
13.第一个方面，本发明提供一种清除衰老细胞的核酸药物，所述核酸药物包括抑制衰老细胞中抗凋亡基因foxo4表达的sirna序列，所述foxo4 sirna单链序列包括：
14.sifoxo4-1：正义链：5
’‑
ggctgccgcgatcatagac-3’，反义链：5
’‑
ggctggttagcgatctctgg-3’；
15.sifoxo4-2：正义链：5
’‑
cacuuaggcuuuguagcaaga-3’，反义链：5
’‑
ucuugcuacaaagccuaagug-3’；
16.sifoxo4-3：正义链：5
’‑
ccggcaaaagctcttggtg-3’，反义链：5
’‑
ggtccacatatcggcttcttca-3’。
17.fox家族成员为一类转录因子，包含从foxa到foxs的19个亚组。foxo4是foxo亚组的一员，在氧化应激、细胞周期、细胞凋亡和细胞稳态等多种细胞过程中起着重要作用。低水平的ros可活化foxo4，进而通过增强超氧化物歧化酶2和过氧化氢酶介导的应激抵抗，缓解ros的细胞毒性作用，抑制细胞凋亡。有证据表明，foxo4可以直接与衰老细胞dna损伤部位的p53结合，阻止p53的核排斥，进而抑制了p53依赖性凋亡通路，使衰老细胞发生凋亡抵抗。
18.核酸药物主要指具有遗传特性和药理活性的含核苷酸或脱氧核苷酸结构的化合物，包括小干扰rna(small interfering rna,sirna)、微小rna(microrna,mirna)、反义寡脱氧核苷酸【简称反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides)】、质粒dna(plasmid dna,pdna)。核酸药物分为rna药物和dna药物。sirna是人工合成的双链rna，是一种小rna分子(21～25个核苷酸)。在本发明中，本发明提供一种抑制衰老肺成纤维细胞中foxo4基因表达的sirna核酸药物，该foxo4基因为烟雾暴露所导致衰老的肺成纤维细胞中高表达的抗凋亡基因。
19.sirna核酸药物属于治疗性rna干扰分子的一种，基于疾病特异性的基因序列而研发，用于沉默病理性上调的基因。相比于传统的小分子和单克隆抗体药物，rna干扰药物通过碱基互补配对原则结合靶rna并执行功能，因此对靶基因具有高度选择性；且rna干扰分
子的设计与合成相对简单，不需要细胞表达系统，以及复杂的蛋白质纯化或重折叠方案，因此本发明的sirna核酸药物具有更短的开发时间和更低的生产成本。
20.第二个方面，本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如上所述的清除衰老细胞的核酸药物和生物相容性载体。
21.优选地，所述载体为用于递送所述清除衰老细胞的核酸药物的dna单链自组装形成的六螺旋纳米束。
22.在本发明中，本发明提供的一种抑制衰老肺成纤维细胞中foxo4基因表达的sirna核酸药物，易被细胞内外的核酸酶降解，需要构建一种递送载体将本发明的sirna核酸药物递送到肺成纤维细胞中。本发明的递送载体采用dna单链自组装形成的六螺旋纳米束，由dna单链经梯度退火得到。dna固定且稳定的碱基互补配对使其具有可编辑性，易被设计为大小和形状可预测的药物载体，并完成自组装。dna纳米结构具有结构稳定、生物可降解、非免疫原性的特点，因此适合于药物递送。
23.第三方面，本发明还提供如上所述的药物组合物的制备方法，包括如下步骤：
24.步骤(1)，载体的制备：将由如下表1所示的seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4的dna单链以一定摩尔比混合在10
×
te的缓冲液中，经梯度退火，得到dna单链自组装形成的六螺旋纳米束载体；
25.步骤(2)，药物组合物的制备：在步骤(1)得到的六螺旋纳米束载体中加入一定比例的如权利要求1所述的foxo4 sirna单链后，经37℃孵育，得到所述的药物组合物；
26.其中，
27.表1核酸六螺旋纳米束药物合成所需序列
[0028][0029]
优选地，步骤(1)中，所述的seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4的dna单链的混合摩尔比为1：3：3：3。
[0030]
优选地，步骤(1)中，所述梯度退火条件为：95℃5min
→
65℃15min
→
37℃15min
→
22℃30min
→
4℃保持；步骤(2)中，孵育的时间为10min以上，更优选地为15min。
[0031]
优选地，所述dna单链自组装形成的六螺旋纳米束载体和制备得到的药物组合物的粒径大小均为1-100nm。
[0032]
优选地，步骤(2)中，所述foxo4 sirna单链的加入量与所述dna单链自组装形成的六螺旋纳米束载体的摩尔比为1：6，即载药量为15.94％。
[0033]
第四个方面，本发明还提供如上所述药物组合物在制备治疗或预防衰老相关疾病
或病症的药物中的应用，所述衰老相关疾病或病症选自肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、囊性纤维化、肺气肿、支气管扩张和年龄相关肺功能丧失的肺疾病中的至少一种，优选地为肺纤维化或慢性阻塞性肺疾病，通过将foxo4 sirna单链递送至肺成纤维细胞中，促进细胞凋亡而选择性清除烟雾暴露导致的衰老肺成纤维细胞。
[0034]
优选地，所述应用包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如上所述的药物组合物，包括非注射给药途径和注射给药途径；其中，所述非注射给药途径选自口服、透皮、肺吸入、鼻黏膜和口腔黏膜中的至少一种，所述注射给药途径选自皮下注射、肌肉注射和静脉注射中的至少一种，更优选地为肺吸入式给药。
[0035]
第五个方面，本发明还提供一种用于治疗和预防copd的可吸入的衰老细胞清除剂，包括药学上可接受的活性成分和载体；其中，所述活性成分为如上所述的清除衰老细胞的核酸药物，所述载体为用于递送所述清除衰老细胞的核酸药物的dna单链自组装形成的六螺旋纳米束；所述衰老细胞清除剂的剂型为吸入制剂，给药方式为雾化吸入式给药。
[0036]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0037]
(1)本发明基于香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract，cse)诱导衰老的人肺成纤维细胞的真核转录组测序，寻找其特异性上调的抗凋亡靶基因，即foxo4，并在copd细胞和小鼠模型验证了foxo4在衰老的肺成纤维细胞中高表达。本发明为研发copd相关的衰老细胞清除剂寻找到了新的治疗靶点，靶向foxo4清除衰老肺成纤维细胞有望实现copd的精准治疗。
[0038]
(2)本发明提供了三组靶向foxo4的sirna分子(foxo4 sirna 1、foxo4 sirna 2和foxo4sirna 3)，通过实验验证了后两组可有效抑制foxo4基因的表达，可用于研发治疗或延缓copd进展的新型衰老细胞清除剂。
[0039]
(3)本发明提供了一种递送foxo4 sirna的核酸六螺旋束，由dna单链经梯度退火得到，利用dna纳米结构递送sirna，能够有效地降低其被细胞内外的核酸酶降解，且具有安全、高效、成本效益高的特点。
[0040]
(4)本发明还提供一种治疗copd的可吸入的衰老细胞清除剂。由于肺部与外界相通使得肺部局部给药成为可能，通过呼吸道给药可以使得药物最大程度地沉积在肺部，减少肝脏及肾脏的清除作用，降低用药剂量，对于sirna药物而言，也可避免在血液循环中经rna酶降解，最大限度地发挥药物疗效。此外，经呼吸道给药也能够减少因药物经血液循环作用于全身而引起的全身副作用。
附图说明
[0041]
图1为2.5％cse诱导hfl1细胞发生衰老的示意图。图中，a：sa-β-gal染色代表性图像；b：p21cip1/waf1和p16ink4a蛋白表达水平；c：il-8分泌水平；d：il-6分泌水平。***p《0.001。
[0042]
图2为hfl1细胞rna-seq测序差异分析火山图。
[0043]
图3为hfl1细胞中foxo4表达水平的示意图。图中，a：foxo4 mrna相对表达水平；b：foxo4蛋白表达水平。***p《0.001。
[0044]
图4为小鼠肺组织中的foxo4表达示意图。图中，a：foxo4蛋白表达水平；b：小鼠肺组织免疫组织化学染色，放大倍数：40倍；比例尺：40μm；c：小鼠肺组织的双重免疫荧光染
色；放大倍数：20倍；比例尺：200μm。
[0045]
图5为foxo4 sirna的鉴定的示意图。qrt-pcr检测阴性对照、sifoxo4-1、sifoxo4-2和sifoxo4-3(100nm)转染hfl1细胞24h后的foxo4 mrna表达水平，**p《0.01。
[0046]
图6为ssfoxo4-6hb的结构及合成示意图。
[0047]
图7为ssfoxo4-6hb的表征示意图。图中，a：非变性page表征；b：zetasizer激光粒度仪粒径测量与分析；c：原子力显微镜代表性图像。
[0048]
图8为cse致衰老的hfl1细胞对ssfoxo4-6hb-cy5的摄取的示意图。图中，a：激光共聚焦显微镜观察摄取能力；放大倍数：80倍；比例尺：20μm；b：流式细胞术检测摄取能力，***p《0.001。
[0049]
图9为ssfoxo4-6hb在cse致衰老的hfl1细胞中敲低foxo4的能力的示意图。图中，a：阴性对照、纳米载体、sifoxo4-2裸连和ssfoxo4-6hb转染24h后的foxo4 mrna的相对表达水平，*p《0.05；b：阴性对照、纳米载体、sifoxo4-2裸连和ssfoxo4-6hb转染36h后foxo4蛋白表达水平；c：100nm ssfoxo4-6hb转染不同时间后foxo4蛋白表达水平；d：不同浓度ssfoxo4-6hb转染36h后foxo4蛋白表达水平。
[0050]
图10为ssfoxo4-6hb选择性清除cse致衰老的hfl1细胞的示意图。图中，a：ssfoxo4-6hb对抗凋亡蛋白表达水平的影响；b：bcl2/bax蛋白表达比值的半定量分析，*在2.5％cse 7d组别中，与nc组比较，p《0.05；^在同一转染组别中，2.5％ cse 0d vs 7d，p《0.05；c：calcein/pi染色代表性图像；放大倍数：10倍；比例尺：100μm。
具体实施方式
[0051]
本发明提供一种清除衰老细胞的核酸药物，所述核酸药物包括抑制衰老细胞中抗凋亡基因foxo4表达的sirna序列，所述foxo4 sirna单链序列包括：
[0052]
sifoxo4-1：正义链：5
’‑
ggctgccgcgatcatagac-3’，反义链：5
’‑
ggctggttagcgatctctgg-3’；
[0053]
sifoxo4-2：正义链：5
’‑
cacuuaggcuuuguagcaaga-3’，反义链：5
’‑
ucuugcuacaaagccuaagug-3’；
[0054]
sifoxo4-3：正义链：5
’‑
ccggcaaaagctcttggtg-3’，反义链：5
’‑
ggtccacatatcggcttcttca-3’。
[0055]
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如上所述的清除衰老细胞的核酸药物和生物相容性载体。
[0056]
其中，所述生物相容性载体为用于递送所述清除衰老细胞的核酸药物的dna单链自组装形成的六螺旋纳米束。
[0057]
本发明还提供如上所述药物组合物在制备治疗或预防衰老相关疾病或病症的药物中的应用，所述衰老相关疾病或病症选自肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、囊性纤维化、肺气肿、支气管扩张和年龄相关肺功能丧失的肺疾病中的至少一种，优选地为肺纤维化或慢性阻塞性肺疾病，通过将foxo4 sirna单链递送至肺成纤维细胞中，促进细胞凋亡而选择性清除烟雾暴露导致的衰老肺成纤维细胞。
[0058]
所述应用包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如上所述的药物组合物，包括非注射给药途径和注射给药途径；其中，所述非注射给药途径选自口服、透皮、肺吸入、鼻黏
膜和口腔黏膜中的至少一种，所述注射给药途径选自皮下注射、肌肉注射和静脉注射中的至少一种，更优选地为肺吸入式给药。
[0059]
本发明还提供一种用于治疗和预防copd的可吸入的衰老细胞清除剂，包括药学上可接受的活性成分和载体；其中，所述活性成分为如上所述的清除衰老细胞的核酸药物，所述载体为为用于递送所述清除衰老细胞的核酸药物的dna单链自组装形成的六螺旋纳米束；所述衰老细胞清除剂的剂型为吸入制剂，给药方式为雾化吸入式给药。
[0060]
给药以及药物组合物
[0061]
一般来说，本发明的药物组合物可以在有效量下，通过任何可接受的用于其他类似用途的给药方式进行给药。举例来说，本发明的药物组合物可以口服、非肠道给药、透皮给药、局部给药、直肠给药或鼻内给药。
[0062]
当用作药物时，本发明通常以药物组合物的形式给药。这些组合物可用制药学领域熟知的方法进行制备，这些组合物包含至少一种活性化合物。在配制本发明提供的组合物时，有效成分通常与赋形剂混合，被赋形剂稀释或被以胶囊，小袋，纸或其他形式的容器包裹。当所述赋形剂作为稀释剂时，可以是固体，半固体，或液体物质，可作为有效成分的运载体、载体或媒介。由此，所述组合物可以是药片、药丸、粉末、锭剂、小袋、胶囊、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆、喷雾(作为固体或在液体介质里)，软膏，软和硬的明胶胶囊，栓剂，无菌注射溶液，和无菌包装粉末的形式。
[0063]
一些典型的赋形剂包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。另外还可以包括润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油)、浸润剂、乳化和悬浊剂、防腐剂(如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)、甜味剂和增味剂。本发明的药物组合物可以通过具体赋形方式在对病人进行给药之后达到药物活性成分的快速、持续或延时释放，这也是本领域中广泛应用的方法。
[0064]
活性成分，即本发明中的核酸药物，在药物构成和单位剂型中的数量可根据具体应用情况、特定化合物的活性和预期浓度进行改变或有较大调整。
[0065]“治疗”意味着对哺乳动物体内疾病的任何治疗，包括：(1)防止疾病，即造成临床疾病的症状不发展；(2)抑制疾病，即阻止临床症状的发展；(3)减轻疾病，即造成临床症状的消退。
[0066]
实施例
[0067]
以下结合具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
[0068]
实施例1：衰老细胞的构建
[0069]
本发明以cse连续处理hfl1细胞，构建copd相关肺成纤维细胞衰老细胞模型。将1支去过滤嘴香烟连接到负压抽吸装置后点燃，香烟烟雾被抽提并溶于5ml无血清dmem培养基中，调ph至7.4，再用0.22μm微孔滤器过滤，得到cse原液。cse原液用含血清的细胞培养基稀释成不同浓度，其浓度以百分比表达，计算公式：(cse原液体积ml
÷
总体积ml)
×
100％。以2.5％cse连续处理hfl1细胞(中国科学院干细胞库)7天得到本发明所述的衰老肺成纤维细胞。
[0070]
以细胞衰老β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染色试剂盒(碧云天)检测2.5％ cse连续处理7天的hfl1细胞中是否存在的衰老细胞群。结果如图1-a所示，2.5％ cse处理7天后的hfl1细胞的蓝绿色染色相比于未经cse处理组明显增加，表明经由2.5％ cse处理7天后的hfl1细胞的sa-β-gal活性增高。western blotting结果显示2.5％ cse处理7天后，hfl1细胞的衰老相关p21
cip1/waf1
和p16
ink4a
蛋白的表达水平相较于未经cse处理组均明显上升(图1-b)。以流式液相多重蛋白定量技术(human inflammatory cytokines kit，bd bioscience)检测sasp分泌水平，结果如图1-c所示，2.5％ cse连续处理7天后，hfl1细胞分泌的il-8和il-6较未经cse处理组均显著上升。上述结果均提示2.5％ cse持续处理7天可诱导hfl1细胞发生衰老。
[0071]
实施例2:抗凋亡靶点的确定
[0072]
(1)hfl1细胞的rna-seq结果
[0073]
为明确cse致衰老的hfl1细胞上调的抗凋亡基因，本发明对2.5％ cse连续处理7天的hfl1细胞和未经cse处理的对照组hfl1细胞进行rna-seq测序，rna提取、文库制备、illumina测序和数据预处理由碧云天公司完成。利用r 4.2.2软件deseq2包对所得数据样本进行差异分析，以|log2foldchange|》1为差异表达的标准，矫正p值(padj)《0.05为显著性标准，共得到2329个衰老组上调的基因，以及1963个衰老组下调的基因，以火山图表示差异分析结果(图2)。与已有的衰老细胞清除剂比对后发现，多数既往的抗凋亡靶点未在cse诱导衰老的hfl1细胞中上调，仅foxo4的表达水平在cse诱导衰老的hfl1细胞中显著上调。
[0074]
(2)衰老hfl1细胞中foxo4的表达情况
[0075]
为进一步考察cse致衰老的hfl1细胞中的foxo4表达水平，分别利用qrt-pcr和western blotting法检测foxo4的mrna和蛋白表达水平。结果如图3所示，cse致衰老的hfl1细胞相比于对照组的foxo4 mrna表达水平显著上升，且foxo4蛋白表达水平同样明显升高。
[0076]
(3)copd小鼠模型中foxo4的表达水平
[0077]
使用c57bl/6小鼠(6周龄，20-25g，雄性)，在spf级动物实验室饲养小鼠，适应性饲养1周，采用烟雾暴露的方法建立copd小鼠动物模型。将小鼠放入烟雾暴露系统中，逐个点燃香烟，将烟雾引入至烟雾暴露系统中，使小鼠充分暴露于香烟烟雾，20支/次/天，30min/次，每周5天，共持续暴露6月。
[0078]
将对照组小鼠(6月龄)和copd小鼠分别处死，切除肺脏，提取肺组织总蛋白，western blotting检测结果发现，copd小鼠肺组织中的衰老相关p21
cip1/waf1
蛋白表达水平明显上升(图4-a)，表明烟雾暴露6个月使小鼠肺组织发生衰老。此外，copd小鼠肺组织的foxo4蛋白表达水平同样比未吸烟的小鼠明显升高(图4-a)。免疫组织化学检测小鼠肺组织的foxo4表达水平，同样显示copd小鼠肺组织的foxo4蛋白表达水平明显升高(图4-b)。
[0079]
利用foxo4和vimentin的免疫荧光双重染色观察foxo4在copd小鼠肺部的定位。结果如图4-c所示，copd小鼠肺部的foxo4红色荧光强度较对照组显著，且主要聚集在上皮下的间质部位。此外，foxo4红色荧光与vimentin绿色荧光重叠，提示foxo4定位于copd小鼠的肺组织间质部位。
[0080]
实施例3:sirna的设计与验证
[0081]
本发明涉及的foxo4 sirna(ssfoxo4)和阴性对照均由北京梓熙生物科技有限公司合成，相关序列如表2所示。
[0082]
表2foxo4 sirna序列
[0083][0084]
为考察foxo4 sirna的敲除效果，本实施例在hfl1细胞中用lipofectamine 3000(invitrogen)转染试剂辅助转染。根据说明书，分别转染100nm的阴性对照、sifoxo4-1、sifoxo4-2、sifoxo4-3，转染24小时后，通过qrt-pcr检测foxo4的mrna表达水平。检测结果如图5所示，sifoxo4-1、sifoxo4-2和sifoxo4-3均可降低hfl1细胞的foxo4 mrna表达水平，其中sifoxo4-2的敲低效果更显著。
[0085]
实施例4:核酸六螺旋束纳米药物的合成
[0086]
本实施例提供了一种递送foxo4 sirna的核酸六螺旋束(six-helix bundle，6hb)纳米药物。用sequin软件设计合成四条dna单链，foxo4 sirna单链购自梓熙生物科技有限公司，其序列如表1所示。将序列号为seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4的四条dna单链以一定比例混合，然后加入10
×
te缓冲液(含125mm mg
2+
)，混合均匀后，经梯度退火得到六螺旋束结构。将foxo4sirna单链与上述六螺旋束混合均匀后，经恒温静置孵育得到核酸六螺旋束纳米药物(图6)。
[0087]
具体步骤如下：
[0088]
a)称取7.44g四乙酸二钠盐，48.44g三羟甲基氨基甲烷，26.8g四水醋酸镁，加入57.1ml乙酸，以生物超纯水定容至1000ml，以0.22μm无菌无酶滤头过滤，得到10
×
te缓冲液；
[0089]
b)将序列号为seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4的四条dna单链以摩尔质量1:3:3:3比例混合，加入5ul步骤(a)中所述10
×
te缓冲液，以生物超纯水定容至50ul，混合均匀后，经95℃5min
→
65℃15min
→
37℃15min
→
22℃
[0090]
30min梯度退火，得到核酸六螺旋束载体；
[0091]
c)将0.2nmol foxo4sirna单链加入步骤(b)中所述六螺旋束，混合均匀后，经37℃
[0092]
孵育15min，得到核酸六螺旋束纳米药物(ssfoxo4-6hb)。
[0093]
实施例5:ssfoxo4-6hb的表征
[0094]
按表3配制6％聚丙烯酰胺凝胶，将合成好的核酸六螺旋束以10:1的比例加入上样缓冲液(50％甘油)，充分混匀离心，转移至泳道，以1
×
te作为缓冲液，120v恒压电泳60min后，将凝胶放入0.01％ stains-all染液中浸泡30min，用扫描仪将图像扫描保存。结果如图7-a所示，第9泳道的单一清晰条带说明成功合成核酸六螺旋束纳米药物。以zetasizer激光粒度仪(图7-b)和原子力显微镜(图7-c)观察六螺旋束纳米颗粒的分布情况，发现六螺旋束
6hb转染2.5％ cse处理0天和7天的hfl1细胞，转染36h后，采用western blotting检测抗凋亡蛋白表达水平。结果显示，2.5％ cse连续处理7天后，与0天相比，hfl1细胞的bclxl蛋白表达水平(图10-a)和bcl2/bax蛋白表达比值明显升高(图10-b)，提示cse诱导衰老的hfl1细胞存在凋亡抵抗。在2.5％ cse处理7天的hfl1细胞中，sifoxo4和ssfoxo4-6hb均可显著降低bclxl蛋白的表达水平和bcl2/bax蛋白表达比值(p《0.05)，表明sifoxo4和ssfoxo4-6hb均可改善衰老的hfl1细胞的抗凋亡特性。对于未经cse处理的hfl1细胞，sifoxo4和ssfoxo4-6hb对bcl2/bax蛋白表达比值无明显影响，提示sifoxo4和ssfoxo4-6hb可以选择性地促进cse诱导衰老的hfl1细胞发生凋亡，而对未经cse处理的hfl1细胞无显著影响。
[0107]
采用calcein/pi染色试剂盒(碧云天)检测细胞活性，活细胞经calcein染色后呈绿色，而发生凋亡的细胞经pi染色后呈红色。首先以0nm和100nm ssfoxo4-6hb转染2.5％ cse处理0天和7天的hfl1细胞，转染64h后进行calcein/pi染色并观察。在cse诱导衰老的hfl1细胞中，与未经ssfoxo4-6hb处理组比，经100nm ssfoxo4-6hb转染64h后，可观察到红色细胞增多，提示ssfoxo4-6hb可促使cse诱导衰老的hfl1细胞发生凋亡。而在未经cse处理的hfl1细胞中，不论是否经100nm ssfoxo4-6hb转染，均未见明显的红色凋亡细胞(图10-c)，提示ssfoxo4-6hb可选择性地清除cse诱导衰老的hfl1细胞，而对未发生衰老的hfl1细胞无明显影响。
[0108]
实施例9:治疗copd的可吸入的衰老细胞清除剂
[0109]
将实施例4的核酸六螺旋束纳米药物作为衰老细胞清除剂以阳离子脂质体包被后用于治疗copd，通过雾化给药，具体如下：
[0110]
(1)将上述阳离子脂质体包被的核酸六螺旋束纳米药物加入雾化装置内并打开电源；
[0111]
(2)患者保持坐位，手持雾化器与地面保持垂直，调整呼吸，将装置喷嘴部分放在上下牙齿之间，双唇完全包住喷嘴吸入药物；
[0112]
(3)衰老细胞清除剂经雾化吸入进入呼吸道，通过气道上皮渗漏作用到达肺成纤维细胞，通过内吞作用进入细胞后释放foxo4 sirna，发挥清除衰老的肺成纤维细胞的作用。
[0113]
施用实施例:
[0114]
foxo4sirna和ssfoxo4-6hb在体外以转染试剂辅助转染。将hfl1细胞以5
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105个细胞/孔的密度接种在6孔板上，过夜培养，当细胞汇合度达70％～90％后，借助lipofectamine 3000(invitrogen)转染试剂辅助转染。具体步骤如下：
[0115]
(1)以opti-mem培养基将foxo4sirna或ssfoxo4-6hb稀释为125ul，混合均匀；
[0116]
(2)以opti-mem培养基将3.75ul的lipofectamine 3000稀释为125ul，混合均匀；
[0117]
(3)将步骤(1)和步骤(2)的混合液以1:1比例混合均匀后，室温孵育10～15min；
[0118]
(4)将步骤(3)的混合液加入已更换新鲜opti-mem培养基的hfl1细胞中(总体积2ml/孔)，培养6～8h后，更换新鲜的完全培养基；
[0119]
(5)每天换液，并根据后续实验需求决定转染后细胞培养时长。
[0120]
ssfoxo4-6hb用于治疗copd时首先以阳离子脂质体包被，而后通过雾化给药，具体如下：(1)将上述阳离子脂质体包被的核酸六螺旋束纳米药物加入雾化装置内并打开电源；
[0121]
(2)患者保持坐位，手持雾化器与地面保持垂直，调整呼吸，将装置喷嘴部分放在
上下牙齿之间，双唇完全包住喷嘴吸入药物；
[0122]
衰老细胞清除剂经雾化吸入进入呼吸道，通过气道上皮渗漏作用到达肺成纤维细胞，通过内吞作用进入细胞后释放foxo4 sirna，发挥清除衰老的肺成纤维细胞的作用。
[0123]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种清除衰老细胞的核酸药物，其特征在于，所述核酸药物包括抑制衰老细胞中抗凋亡基因foxo4表达的sirna序列，所述foxo4 sirna单链序列包括：sifoxo4-1：正义链：5
’‑
ggctgccgcgatcatagac-3’，反义链：5
’‑
ggctggttagcgatctctgg-3’；sifoxo4-2：正义链：5
’‑
cacuuaggcuuuguagcaaga-3’，反义链：5
’‑
ucuugcuacaaagccuaagug-3’；sifoxo4-3：正义链：5
’‑
ccggcaaaagctcttggtg-3’，反义链：5
’‑
ggtccacatatcggcttcttca-3’。2.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的清除衰老细胞的核酸药物和生物相容性载体。3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述载体为用于递送所述清除衰老细胞的核酸药物的dna单链自组装形成的六螺旋纳米束。4.如权利要求2或3所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤(1)，载体的制备：将由如下所示的seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4的dna单链以一定摩尔比混合在10
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te的缓冲液中，经梯度退火，得到dna单链自组装形成的六螺旋纳米束载体；步骤(2)，药物组合物的制备：在步骤(1)得到的六螺旋纳米束载体中加入一定比例的如权利要求1所述的foxo4 sirna单链后，经37℃孵育，得到所述的药物组合物。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4的dna单链的混合摩尔比为1：3：3：3。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述梯度退火条件为：95℃5min
→
65℃15min
→
37℃15min
→
22℃30min
→
4℃保持；步骤(2)中，孵育的时间为10min以上，优选地为15min。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述dna单链自组装形成的六螺旋纳米束载体和制备得到的药物组合物的粒径大小均为1-100nm。8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述foxo4 sirna单链的加入量与所述dna单链自组装形成的六螺旋纳米束载体的摩尔比为1:6，即载药量为15.94％。9.如权利要求2或3所述的药物组合物在制备治疗或预防衰老相关疾病或病症的药物中的应用，其特征在于，所述衰老相关疾病或病症选自肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病(copd)、哮喘、囊性纤维化、肺气肿、支气管扩张和年龄相关肺功能丧失的肺疾病中的至少一种，优选地为肺纤维化或慢性阻塞性肺疾病，通过将foxo4 sirna单链递送至肺成纤维细胞中，促进细胞凋亡而选择性清除烟雾暴露导致的衰老肺成纤维细胞。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如权利要求2或3所述的药物组合物，包括非注射给药途径和注射给药途径；其中，所述非注射给药途径选自口服、透皮、肺吸入、鼻黏膜和口腔黏膜中的至少一种，所述注射给药途径选自皮下注射、肌肉注射和静脉注射中的至少一种，优选地为肺吸入式给药。11.一种用于治疗和预防copd的可吸入的衰老细胞清除剂，其特征在于，包括药学上可接受的活性成分和载体；其中，所述活性成分为如权利要求1所述的清除衰老细胞的核酸药物，所述载体为用于递送所述清除衰老细胞的核酸药物的dna单链自组装形成的六螺旋纳
米束；所述衰老细胞清除剂的剂型为吸入制剂，给药方式为雾化吸入式给药。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种清除衰老细胞的核酸药物、包括该核酸药物的药物组合物及其制备方法，用于制备治疗或预防例如肺纤维化或慢性阻塞性肺疾病(COPD)等衰老相关疾病或病症的药物。关疾病或病症的药物。关疾病或病症的药物。


技术研发人员：张静 韩姚嫔 吴奕星 华剑兰
受保护的技术使用者：复旦大学附属中山医院
技术研发日：2023.04.18
技术公布日：2023/10/8