一种生物分子马达驱动超分子胶体马达及其制备方法

1.本发明涉及超分子胶体马达领域，具体涉及一种生物分子马达驱动超分子胶体马达(rbmsmotor)及其制备方法。


背景技术：

2.在生物体中，细胞通过协调成百上千蛋白质分子马达的运动和力量，在多个尺度上执行各种机械任务，如细胞内物质运输、细胞运动和肌肉收缩等。对生物分子马达f0f
1-atp合酶进行体外重组可以模拟细胞特定的结构和功能，有利于理解生命体进行复杂生物过程的物理化学机制。尽管已有研究报道了基于f0f
1-atp合酶功能化的重组聚电解质微胶囊仿细胞体系，被认为是研究细胞内部atp按需合成和调控的最佳模型，然而，从纳米级蛋白质马达出发设计活性仿生材料和机器，通过消耗能量来推动微米级组装体连续运动仍然面临巨大挑战。
3.化学驱动的胶体马达能够将周围环境中储存的化学能转化为机械运动。而且，化学自组装允许将各种天然或合成聚合物、酶、纳米颗粒和其他生物相容性和可降解的构建块纳入超分子组装，这可以赋予胶体马达细胞样的结构和功能。实际上，超分子胶体马达已被认为是细胞模拟模型的理想候选者之一，在生物医学应用中也具有巨大的潜力。然而，超分子胶体马达的发展目前受到化学燃料固有毒性、生物体内不可利用性和推进效率的限制。因此，设计一种由生物燃料驱动的运动蛋白集成超分子马达，这种马达可以从生物体中广泛获得，具有可控的自我驱动，这仍然是一个非常重要的挑战。


技术实现要素：

4.为解决上述存在的技术缺陷，本发明提供一种生物分子马达驱动超分子胶体马达及其制备方法，本发明的方法普适性强，所制备的超分子胶体马达可以利用体内常见的二磷酸腺苷和无机磷作为底物，增加了生物医学应用的可能性。
5.本发明提供了一种生物分子马达驱动超分子胶体马达，其是由嵌有旋转生物分子马达f0f
1-atp合酶的光合色素团囊泡和作为支撑骨架的中空多层聚电解质微胶囊组成的，所述聚电解质是由阳离子聚电解质层和阴离子聚电解质层组成。通过细胞破碎和低温超速离心的方法提取出嵌有旋转生物分子马达f0f
1-atp合酶的光合色素团囊泡；模板法辅助的层层自组装制备多层聚电解质微胶囊，去除模板得到中空多层聚电解质微胶囊；色素团囊泡组装在聚电解质微胶囊表面，得到f0f
1-atp合酶不对称分布的超分子胶体马达。本发明制备过程简单，制备的胶体马达生物相容性好，实现了以纳米级蛋白分子为动力引擎，通过高效的能量转换，推动了微米尺度的人工合成体系，为仿生微纳米马达的设计提供了新的思路，可在未来应用于细胞的能量代谢主动调控实现疾病的精准诊疗。
6.进一步地限定，中空多层聚电解质微胶囊的直径为3μm。
7.进一步地限定，光合色素团囊泡尺寸110
±
5nm，在紫外光到近红外光范围均有特征吸收峰。
8.进一步地限定，所述阳离子聚电解质为聚烯丙基胺盐酸盐，所述阴离子聚电解质为聚苯乙烯磺酸钠。
9.本发明还提供了一种生物分子马达驱动超分子胶体马达的制备方法，按以下步骤进行：
10.步骤一、提取光合色素团囊泡；
11.步骤二、利用模板法协助的层层自组装法将阳离子聚电解质和阴离子聚电解质交替组装到模板颗粒上，得到多层聚电解质微胶囊；
12.步骤三、将步骤三得到的多层聚电解质微胶囊用模板溶剂将模板颗粒溶解去除，得到中空多层聚电解质微胶囊；
13.步骤四、通过囊泡融合的方法，将步骤一中所述的光合色素团囊泡与步骤三所述的中空多层聚电解质微胶囊混合，最终获得生物分子马达驱动超分子胶体马达。
14.较佳的，步骤二中所述的模板粒子为3μm的二氧化硅颗粒。
15.较佳的，步骤二中所述的模板溶剂为3m氢氟酸。
16.较佳的，一种生物分子马达驱动超分子胶体马达的制备方法，包括以下步骤：
17.步骤一、提取光合色素团囊泡；
18.a、将光和细菌类球红细菌以4000g的离心力离心10min收集起来，用ph8.0,10mm的tris-hcl缓冲液冲洗两次，再重新分散于20mltris-hcl缓冲液中；
19.b、将5mg脱氧核算核酸酶(dnase)和12mg无水硫酸镁(mgso4)加入a所得的悬浮溶液中，在冰浴中进行超声破碎，超声功率200w，超声时间20min；
20.c、将b所得溶液在4℃下以6000g的离心力离心10min收集，去沉淀，留上清液；
21.d、将c所得溶液在4℃下以140000g的离心力离心120min收集，去上清液，留沉淀，加入10mltris-hcl缓冲液得到悬浮液；
22.e、将d所得悬浮液加到20％(w/v),40％(w/v)和60％(w/v)蔗糖梯度的上层，在4℃下以110000g的离心力离心4h，取20％(w/v)和40％(w/v)之间的溶液；
23.f、用20mltris-hcl缓冲液将e所得的溶液在4℃下以140000g的离心力离心120min，洗两次，最终得到光合色素团囊泡悬浮液；
24.g、以3μm的二氧化硅(sio2)颗粒为模板，将模板加入到溶液i中，在振荡器上振荡15min后离心，弃去离心液，所得沉淀用0.5m的nacl溶液离心洗涤三次，加入到溶液ii中，在振荡器上振荡15min后离心，弃去离心液，所得沉淀用0.5m的nacl溶液离心洗涤三次，完成一层聚电解质双层的组装；所述溶液i为含有nacl的聚烯丙基胺盐酸盐溶液，其中nacl的浓度为0.5m，聚烯丙基胺盐酸盐的浓度为2mg/ml；溶液ii为含有nacl的聚苯乙烯磺酸钠溶液，其中nacl的浓度为0.5m，聚苯乙烯磺酸钠的浓度为2mg/ml；
25.h、重复步骤g组装5次，得到了组装在sio2颗粒模板上的多层聚电解质微胶囊；
26.i、去除模板：将步骤h组装后的多层聚电解质微胶囊加入到3m氢氟酸(hf)溶液中，振荡20min后离心分离，弃去离心液，所得沉淀用去离子水离心清洗三次，得到中空的聚电解质微胶囊；
27.j、将步骤f得到的色素团囊泡悬浮液加入步骤i制备的中空聚电解质微胶囊中，在ph6.5,10mm的tris-hcl缓冲液中共孵育，冰浴中振荡30min,然后用ph8.0,10mm的tris-hcl缓冲液冲洗三次，去除多余的光和色素团囊泡，最终得到生物分子马达驱动超分子胶体马
达。
28.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
29.本发明制备过程简单，重复性好，制备的超分子胶体马达由生物相容性较好的聚合物和天然生物膜组成，在生物体内常见的反应底物二磷酸腺苷和无机磷存在的条件下，可用光照引发光合磷酸化反应，实现由纳米尺寸的生物分子马达旋转合成能量atp并能够协同推动微米级的超分子胶体马达进行自主运动，可以通过调控光照的波长和强度，对超分子胶体马达的运动进行控制，在生物合成、药物装载、细胞能量代谢调控等生物医学领域具有广泛的应用前景。
30.为了能够更进一步了解本发明的特征及技术内容，请参阅以下有关本发明详细说明与附图，然而所附的附图仅提供参考和说明之用，并非用来对本发明加以限制。
附图说明
31.图1是本发明所述生物分子马达驱动超分子胶体马达的制备过程示意图；
32.图2是本发明所述生物分子马达驱动超分子胶体马达的原子力显微镜图；
33.图3是本发明所述生物分子马达驱动超分子胶体马达的激光共聚焦显微镜图；
34.图4是本发明所述生物分子马达驱动超分子胶体马达在不同波长光照下运动的均方位移数据图；
35.图5是本发明所述生物分子马达驱动超分子胶体马达在不同波长照射下的atp产量和atp合成速率。
具体实施方式
36.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
37.实施例1
38.本实施例中生物分子马达驱动超分子胶体马达的制备过程如图1所示，包括以下步骤：
39.步骤一、提取光合色素团囊泡；
40.a、将光和细菌类球红细菌以4000g的离心力离心10min收集起来，用ph8.0,10mm的tris-hcl缓冲液冲洗两次，再重新分散于20mltris-hcl缓冲液中；
41.b、将5mg脱氧核算核酸酶(dnase)和12mg无水硫酸镁(mgso4)加入步骤a所得的悬浮溶液中，在冰浴中进行超声破碎，超声功率200w，超声时间20min；
42.c、将步骤b所得溶液在4℃下以6000g的离心力离心10min收集，去沉淀，留上清液；
43.d、将步骤c所得溶液在4℃下以140000g的离心力离心120min收集，去上清液，留沉淀，加入10mltris-hcl缓冲液得到悬浮液；
44.e、将步骤d所得悬浮液加到20％(w/v),40％(w/v)和60％(w/v)蔗糖梯度的上层，在4℃下以110000g的离心力离心4h，取20％(w/v)和40％(w/v)之间的溶液；
45.f、用20mltris-hcl缓冲液将步骤e所得的溶液在4℃下以140000g的离心力离心120min，洗两次，最终得到光合色素团囊泡悬浮液；
46.步骤二、利用模板法协助的层层自组装法将阳离子聚电解质和阴离子聚电解质交
替组装到模板粒子上，得到多层聚电解质微胶囊；
47.g、以3μm的二氧化硅(sio2)颗粒为模板，将模板加入到溶液i中，在振荡器上振荡15min后离心，弃去离心液，所得沉淀用0.5m的nacl溶液离心洗涤三次，加入到溶液ii中，在振荡器上振荡15min后离心，弃去离心液，所得沉淀用0.5m的nacl溶液离心洗涤三次，完成一层聚电解质双层的组装；所述溶液i为含有nacl的聚烯丙基胺盐酸盐溶液，其中nacl的浓度为0.5m，聚烯丙基胺盐酸盐的浓度为2mg/ml；溶液ii为含有nacl的聚苯乙烯磺酸钠溶液，其中nacl的浓度为0.5m，聚苯乙烯磺酸钠的浓度为2mg/ml；
48.h、重复步骤g组装5次，得到了组装在sio2颗粒模板上的多层聚电解质微胶囊；
49.步骤三、将步骤三得到的多层聚电解质微胶囊用模板溶剂将模板颗粒溶解去除，得到中空多层聚电解质微胶囊；
50.i、去除模板：将步骤h组装后的多层聚电解质微胶囊加入到3m氢氟酸(hf)溶液中，振荡20min后离心分离，弃去离心液，所得沉淀用去离子水离心清洗三次，得到中空的聚电解质微胶囊；
51.步骤四、通过囊泡融合的方法，将步骤一中所述的光合色素团囊泡与步骤三所述的中空多层聚电解质微胶囊混合，最终获得生物分子马达驱动超分子胶体马达。
52.j、将步骤f得到的色素团囊泡悬浮液加入步骤i制备的中空聚电解质微胶囊中，在ph6.5,10mm的tris-hcl缓冲液中共孵育，冰浴中振荡30min,然后用ph8.0,10mm的tris-hcl缓冲液冲洗三次，去除多余的光和色素团囊泡，最终得到生物分子马达驱动超分子胶体马达。
53.将上述制备的产物进行表征，具体见图2-3。图2为超分子胶体马达的原子力显微镜照片和其局部放大图，插图为所选区域的高度分布图。如图2a所示，胶体马达干态时为典型的微胶囊塌陷状，膜厚为55nm，直径为3μm。而且其表面凸起的高度对应atp合酶的f1端为11nm(图2b)，表明含有atp合酶的色素团囊泡成功的组装在胶体马达表面。所得的超分子胶体马达的激光共聚焦扫描照片和3d的荧光强度分布图如图3所示，其表面为来自光合色素团囊泡的绿色荧光，且分布在胶体马达表面，证明该胶体马达保留了微胶囊的中空结构，色素团囊泡包覆在了微胶囊的表面。荧光强度的不对称分布表明了生物分子马达atp合酶在超分子胶体马达表面的不对称分布。
54.实施例2
55.将实施例1中所得的生物分子马达驱动超分子胶体马达置于1mmadp、5mmnah2po4、2.5mm柠檬酸盐和5mmmgcl2的tris-hcl缓冲液中，tris-hcl缓冲液的浓度为10mm，ph为8.0。用1w/cm2、不同波长365nm、488nm、543nm以及850nm的led光进行照射，在光学显微镜下观察其运动，通过分析运动行为，计算得到均方位移数据图如图4所示。在无不同波长光照下，胶体马达的均方位移与时间间隔的函数曲线呈现出抛物线形状，区别于布朗运动，且在近红外光照射下，斜率最大，说明胶体马达运动能力最强。
56.实施例3
57.取3ml实施例1中所得的生物分子马达驱动超分子胶体马达与3ml反应缓冲液混合，反应缓冲液为tris-hcl缓冲液，ph为8.0，浓度为20mm，含有5mm柠檬酸盐，2mmadp、10mmnah2po4和10mmmgcl2，最终得到超分子胶体马达的浓度为光密度值为10，用1w/cm2、不同波长365nm、488nm、543nm以及850nm的led光进行照射5min，通过高效液相色谱仪检测atp
含量，并计算atp的产出速率，如图5所示。在不同波长光照下，均检测到atp的产出，且在850nm波长光照下，atp含量最高位1.82μm，相应的atp产出速率最快为0.36μmmin-1
。表明超分子胶体马达具有光合磷酸化活性，且组装在胶体马达上的生物分子马达atp合酶的活性依赖于光照波长。
58.本发明制备过程简单，制备的超分子胶体马达生物相容性好，能在光照下进行光合磷酸化反应，通过生物分子马达驱动超分子胶体马达协同运转实现能量atp的产出及超分子胶体马达的自驱动，在生物合成、药物装载、细胞能量代谢调控等生物医学领域具有广泛的应用前景。
59.以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行需对改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种生物分子马达驱动超分子胶体马达，其特征在于，其包括嵌有旋转生物分子马达f0f
1-atp合酶的光合色素团囊泡、作为支撑骨架的中空多层聚电解质微胶囊，所述聚电解质是由阳离子聚电解质层和阴离子聚电解质层组成。2.根据权利要求1所述的生物分子马达驱动超分子胶体马达，其特征在于，所述光合色素团囊泡提取自光合细菌类球红细菌的内膜，光合色素团囊泡尺寸110nm
±
5nm，在紫外光到近红外光范围均有特征吸收峰。3.根据权利要求1所述的生物分子马达驱动超分子胶体马达，其特征在于，所述阳离子聚电解质为聚烯丙基胺盐酸盐，所述阴离子聚电解质为聚苯乙烯磺酸钠。4.根据权利要求1所述的生物分子马达驱动超分子胶体马达，其特征在于，所述聚电解质微胶囊是由5个聚电解质双层组装而成的。5.如权利要求1-4任意一项所述的生物分子马达驱动超分子胶体马达的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：步骤一、提取光合色素团囊泡；步骤二、利用模板法协助的层层自组装法将阳离子聚电解质和阴离子聚电解质交替组装到模板颗粒上，得到多层聚电解质微胶囊；步骤三、将步骤二得到的多层聚电解质微胶囊用模板溶剂将模板颗粒溶解去除，得到中空多层聚电解质微胶囊；步骤四、通过囊泡融合的方法，将步骤一中所述的光合色素团囊泡与步骤三所述的中空多层聚电解质微胶囊混合，最终获得生物分子马达驱动超分子胶体马达。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤二中模板为二氧化硅(sio2)颗粒；步骤三中模板溶剂为氢氟酸(hf)溶液。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，提取光合色素团囊泡是按下述步骤进行的：a、将光和细菌类球红细菌以4000g的离心力离心10min收集起来，用ph8.0、10mm的tris-hcl缓冲液冲洗两次，再重新分散于20mltris-hcl缓冲液中；b、将5mg脱氧核算核酸酶(dnase)和12mg无水硫酸镁(mgso4)加入步骤a所得的悬浮溶液中，在冰浴中进行超声破碎，超声功率200w，超声时间20min；c、将步骤b所得溶液在4℃下以6000g的离心力离心10min收集，去沉淀，留上清液；d、将步骤c所得溶液在4℃下以140000g的离心力离心120min收集，去上清液，留沉淀，加入10mltris-hcl缓冲液得到悬浮液；e、将步骤d所得悬浮液加到20％(w/v),40％(w/v)和60％(w/v)蔗糖梯度的上层，在4℃下以110000g的离心力离心4h，取20％(w/v)和40％(w/v)之间的溶液；f、用20mltris-hcl缓冲液将e所得的溶液在4℃下以140000g的离心力离心120min，洗两次，最终得到光合色素团囊泡悬浮液。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤二中以3μm的二氧化硅(sio2)颗粒为模板，将模板加入到溶液i中，在振荡器上振荡15min后离心，弃去离心液，所得沉淀用0.5m的nacl溶液离心洗涤三次，加入到溶液ii中，在振荡器上振荡15min后离心，弃去离心液，所得沉淀用0.5m的nacl溶液离心洗涤三次，完成一层聚电解质双层的组装；所述溶液i为含有nacl的聚烯丙基胺盐酸盐溶液，其中nacl的浓度为0.5m，聚烯丙基胺盐酸盐的浓度
为2mg/ml；溶液ii为含有nacl的聚苯乙烯磺酸钠溶液，其中nacl的浓度为0.5m，聚苯乙烯磺酸钠的浓度为2mg/ml；重复上述操作多次，得到了组装在sio2颗粒模板上的多层聚电解质微胶囊。9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤三中将组装后的多层聚电解质微胶囊加入到3m氢氟酸(hf)溶液中，振荡20min后离心分离，弃去离心液，所得沉淀用去离子水离心清洗三次，得到中空聚电解质微胶囊。10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤四中将光合色素团囊泡悬浮液加入中空聚电解质微胶囊中，在ph6.5,10mm的tris-hcl缓冲液中共孵育，冰浴中振荡30min,然后用ph8.0,10mm的tris-hcl缓冲液冲洗三次，去除多余的光和色素团囊泡。

技术总结
本发明公开了一种生物分子马达驱动超分子胶体马达(RBMSmotor)及其制备方法，属于超分子胶体马达领域。本发明的胶体马达是由天然光合色素团囊泡和多层聚电解质中空微胶囊组成的，其制备方法是：一、通过细胞破碎和低温超速离心的方法提取出嵌有旋转生物分子马达F0F


技术研发人员：贺强 吴英杰 刘君 杨玲
受保护的技术使用者：哈尔滨工业大学
技术研发日：2023.04.17
技术公布日：2023/10/8