一种用于治疗高苯丙氨酸血症的工程微生物及其用途的制作方法

1.本公开涉及基因工程领域，具体涉及一种工程微生物以及工程微生物组合物，包含该工程微生物或工程微生物组合物的组合物，使用所述工程微生物或工程微生物组合物或来缓解和/或治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症的方法，所述工程微生物或工程微生物组合物在制备用于缓解或治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症的药物或保健品中的用途。


背景技术：

2.高苯丙氨酸血症(hyperphenylalaninemia，hpa)是指由于苯丙氨酸代谢途径中的酶发生缺陷，例如苯丙氨酸羟化酶(pah)、四氢生物喋呤合成酶或二氢生物喋呤还原酶等产生突变，导致血液中苯丙氨酸(phe)水平过高的一类先天性苯丙氨酸代谢障碍疾病。其中苯丙酮尿症(phenylketonuria,pku)是由于苯丙氨酸代谢途径中苯丙氨酸羟化酶(pah)发生突变导致，使得苯丙氨酸不能转变成为酪氨酸，致使苯丙氨酸与α-酮戊二酸在血液与组织中堆积，并从尿中大量排出。健康人血液中苯丙氨酸的含量在100μm左右。通常认为人血液中的苯丙氨酸的含量在360μm～600μm以上，便会有苯丙酮尿症症状。在中国，苯丙酮尿症在新生儿中的发病率大概在1/11000，苯丙酮尿症患儿出生若不及时诊治，将会严重影响患儿的智力发育，引起癫痫和运动障碍等症状，并伴随黑色素合成障碍。
3.目前对于这种疾病的治疗主要是对食物的控制。苯丙酮尿症患者通过干预饮食或治疗，可以使血清苯丙氨酸水平保持在120-360μm范围内，可能有助于缓解与疾病相关的认知障碍。但这种治疗方式往往影响新生儿或青少年的成长，以及孕妇腹中胎儿的发育；饮食治疗需要长期、不间断的治疗，给病人和家庭造成极大的经济负担。除了控制饮食外，近些年出现的经批准的苯丙酮尿症治疗药物有盐酸沙丙蝶呤和苯丙氨酸解氨酶。然而，盐酸沙丙蝶呤不能作为一种单独的治疗方法，需要与控制饮食结合使用；苯丙氨酸解氨酶是最近被批准用于治疗成人苯丙酮尿症患者，依靠全身注射苯丙氨酸氨裂解酶(pal)，然而，该疗法常伴随严重的过敏反应和免疫介导的不良反应。科学家也在尝试基因疗法，将携带表达苯丙氨酸羟化酶基因(pah)的cdna重组腺病毒置于小鼠体内，以恢复肝脏pah活性，但目前主要存在转运效率低的问题，且基因治疗的研发成本高，治疗费用昂贵，对于大多数病人来说接受程度低。
4.当前临床治疗方法比如饮食控制、酶辅助因子、酶制剂都没有达到很好的临床效果，亟需新的治疗方法。在新药研发的尝试中，aav基因治疗由于显示出潜在的肝脏致癌毒性而部分公司暂停了临床试验，红细胞递送酶基因的方法显示出较低的表达水平而部分公司暂停了临床前研究。因此，本领域迫切需要开发得到一种新型有效的能够治疗或缓解苯丙氨酸代谢障碍相关疾病和/或病症的药物或保健品。


技术实现要素：

5.为了寻求更新更有效的能够治疗或缓解苯丙氨酸代谢障碍相关疾病和/或病症的
药物或保健品，本公开尝试使用工程微生物作为递送苯丙氨酸相关降解酶的载体，利用基因工程技术来改造出发微生物(例如肠道益生菌)，构建能够降解苯丙氨酸使之生成无毒害的中间代谢物、能够有效降低动物(包括人)体内苯丙氨酸水平的工程微生物。
6.根据本公开的一种实施方式，可以提供一种导入外源基因的工程微生物，其特征在于，所述外源基因包括：一种或更多种编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因；一种或更多种编码能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶的基因；一种或更多种编码能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶的基因；以及一种或更多种编码能够将苯丙氨酸转运至所述工程微生物体内的蛋白的基因。。
7.根据本公开的一种实施方式，可以提供一种工程微生物组合物，其包含多于一种工程微生物，所述多于一种工程微生物中的每一种彼此独立地包含以下基因中的任一种或更多种：
8.编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因；
9.编码能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶的基因；
10.编码能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶的基因；
11.其中所述工程微生物组合物包含编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因、编码能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶的基因以及编码能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶的基因。
12.根据本公开的一种实施方式，可以提供一种组合物，其包含根据本公开所述的工程微生物或工程微生物组合物和药学上、营养学上或生理学上可接受的载体。
13.根据本公开的一种实施方式，可以提供一种试剂盒，其包含根据本公开所述的工程微生物或根据本公开所述的工程微生物组合物或根据本公开所述的组合物。
14.根据本公开的一种实施方式，可以提供一种用于缓解和/或治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用根据本公开所述的工程微生物或根据本公开所述的工程微生物组合物或根据本公开所述的组合物或根据本公开所述的试剂盒。
15.根据本公开的一种实施方式，可以提供本公开所述的工程微生物或根据本公开所述的工程微生物组合物或根据本公开所述的组合物在制备用于缓解和/或治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症的药物或保健品中的用途。
附图说明
16.图1描绘了质粒pcbt003的图谱。
17.图2描绘了质粒pcbt001的图谱。
18.图3描绘了有氧条件下工程菌株ecn、cbt2001、cbt2002和cbt2003降解苯丙氨酸的体外检测结果。
19.图4描绘了厌氧条件下工程菌株ecn、cbt2001、cbt2002和cbt2003降解苯丙氨酸的体外检测结果。
20.图5描绘了工程菌株cbt209和cbt210降解苯丙氨酸的体外检测结果。
21.图6描绘了工程菌株cbt201降解苯丙氨酸的体外检测结果。
22.图7描绘了工程菌株cbt202降解苯丙氨酸的体外检测结果。
23.图8描绘了工程菌株cbt205和cbt206降解苯丙氨酸的体外检测结果。
24.图9描绘了工程菌株cbt207和cbt208降解苯丙氨酸的体外检测结果。
25.图10描绘了工程菌株cbt201、cbt205、cbt207和cbt211降解苯丙氨酸的体外检测结果。
26.图11描绘了工程菌株cbt-201、cbt-212、cbt-213、cbt-205和cbt-207体外降解苯丙氨酸的检测结果。
27.图12描绘了工程菌株cbt-201、cbt-201-aa、cbt-205、阴性对照组ecn和活性参照组synb1934体内降解苯丙氨酸的结果。
具体实施方式
28.除非另有说明或与上下文相矛盾，否则本文中使用的术语或表述应结合本文整体内容并且如本领域普通技术人员所理解的进行阅读。除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与由本领域的普通技术人员通常所理解的相同的意思。
29.本公开中所述“微生物”是指通常由单细胞组成的显微、亚显微或超微尺寸的生物体或微生物。微生物的例子包括但不限于细菌、病毒、寄生虫、真菌、某些藻类和原生动物。本公开中所述“工程微生物”是指经遗传修饰以表现出期望性能或特征的微生物。此外，在本公开中，术语“工程微生物”与“基因工程微生物”或“经遗传修饰的微生物”可互换使用。
30.本公开中所述“苯丙氨酸”用于指具有分子式c6h5ch2ch(nh2)cooh的氨基酸。苯丙氨酸是酪氨酸、多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素的前体。l-苯丙氨酸是必需氨基酸，主要存在于膳食蛋白中的苯丙氨酸形式；发现立体异构体d-苯丙氨酸在膳食蛋白中的含量较低；dl-苯丙氨酸是两种形式的组合。苯丙氨酸可以指l-苯丙氨酸，d-苯丙氨酸和dl-苯丙氨酸中的一种或多种。
31.除非上下文特意说明或有明显矛盾，否则本公开中提及“苯丙酮酸”时还旨在涵盖苯丙酮酸盐。除非上下文特意说明或有明显矛盾，否则本公开中使用的“苯丙酮酸脱羧酶”与“苯丙酮酸盐脱羧酶”具有相同含义。
32.本公开中所述“芳香族氨基酸转氨酶(aromatic amino acids transaminase)”指将苯丙氨酸转化或加工成苯丙酮酸的苯丙氨酸代谢酶。
33.本公开中所述“l-氨基酸脱氨酶(l-amino acid deaminase)”指将苯丙氨酸转化或加工成苯丙酮酸的苯丙氨酸代谢酶。
34.本公开中所述“苯丙氨酸脱氢酶(phenylalanine dehydrogenase)”指将苯丙氨酸转化或加工成苯丙酮酸的苯丙氨酸代谢酶。
35.本公开中所述“苯丙氨酸代谢酶”指能够降解或转化苯丙氨酸的酶。本领域已知的任何苯丙氨酸代谢酶均能够由工程微生物编码。苯丙氨酸代谢酶包括但不限于芳香族氨基酸转氨酶、苯丙氨酸脱氢酶和l-氨基酸脱氨酶等。
36.本公开中所述“苯丙氨酸代谢物”是指由于苯丙氨酸降解而产生的代谢物。代谢物能够通过以苯丙氨酸为底物的酶直接催化苯丙氨酸产生，或者代谢物能够通过作用于苯丙氨酸代谢物的代谢途径下游不同的酶间接产生。苯丙氨酸代谢物可以由编码苯丙氨酸代谢酶的工程微生物产生。
37.本公开中所述“苯丙酮酸脱羧酶(phenylpyruvate decarboxylase)”指将苯丙酮
酸转化或加工成苯乙醛的苯丙酮酸代谢酶。
38.本公开中所述“α-酮酸脱羧酶(α-keto acid decarboxylase)”指将苯丙酮酸转化或加工成苯乙醛的苯丙酮酸代谢酶。
39.本公开中所述“醛还原酶(aldehyde dehydrogenase)”指将苯乙醛转化或加工成苯乙醇的苯乙醛代谢酶。
40.本公开中所述“谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase)”指将谷氨酸或谷氨酸盐转化或加工成α-酮戊二酸或α-酮戊二酸盐的谷氨酸(盐)代谢酶。
41.本公开中所述“苯丙氨酸转运蛋白(phenylalanine transporter)”用于指能够将苯丙氨酸转运到细胞中的膜转运蛋白。在大肠杆菌中，苯丙氨酸转运蛋白基因编码负责苯丙氨酸转运的高亲和力苯丙氨酸特异性苯丙氨酸转运蛋白。苯丙氨酸转运蛋白可以由来源于细菌的苯丙氨酸转运蛋白基因编码，所述细菌包括但不限于乙酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus)，肠沙门氏菌(salmonellaenteritidis)和大肠杆菌(escherichia coli)。其它苯丙氨酸转运蛋白包括由arop基因编码的通用氨基酸转运蛋白，其能够以高亲和力转运包括苯丙氨酸在内的三种芳族氨基酸，并且被认为与苯丙氨酸转运蛋白一起负责大部分苯丙氨酸输入。另外，低水平的苯丙氨酸转运活性已经溯源于liv-i/ls系统的活性，liv-i/ls系统是由两种周质结合蛋白，liv-结合蛋白(liv-i系统)和ls-binding蛋白(ls系统)，以及膜组分livhmgf组成的支链氨基酸转运蛋白。
42.至少在一些实施方式中，本公开中的能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶、能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶、能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶、苯丙氨酸转运蛋白以及谷氨酸脱氢酶或其编码基因还包括上述酶、蛋白或其编码基因的功能等效物；所述“功能等效物”是指尽管氨基酸序列或多核苷酸序列或化学结构具有差异，但仍至少部分保留天然存在基因/酶的一种或多种生物功能的任何相关变异体。
43.本公开中所述“表达盒”是指能够在适当的宿主细胞中指导至少一种目的多核苷酸/编码基因的表达的核酸分子，至少在一些实施方式中，所述核酸分子还包含可操作地连接至目的多核苷酸/编码基因的启动子和/或其它调控元件。
44.本公开中所述“可操作地连接”指核酸序列以允许表达的核酸序列的方式(例如以顺式作用)连接至调节区域序列。调节区是可以指导目的基因转录的核酸，例如启动子，可选的还可以任选的包括增强子、响应元件、蛋白质识别位点、诱导元件、启动子控制元件、蛋白质结合序列、5'和3'非翻译区、转录起始位点、终止序列、聚腺苷酸化序列和/或内含子。
45.本公开中所述“启动子”是指可以控制编码序列转录的多核苷酸序列。启动子序列包括足以使rna聚合酶识别、结合和转录启动的特定序列。此外，启动子序列可以包括任选地在本公开提供的工程微生物中调节rna聚合酶的识别、结合和转录启动活性的序列。启动子可以影响与自身位于同一核酸分子上的基因或与自身位于不同核酸分子上的基因的转录。
46.本公开中所述“诱导型启动子”指可以通过外部刺激，如化学、光、激素、应激、厌氧条件或病原体，在一种或多种细胞类型中启动在其控制下的编码序列或基因的转录水平增加的受调控的启动子。诱导型启动子和变体是本领域中众所周知的，包括但不限于plteto1、galp1、pllaco1、pfnrs、pbad和pvan。
47.本公开中所述“直接诱导型启动子”是指与编码蛋白质或多肽的基因可操作地连
subtilis)、脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)、枯草拟杆菌(bacteroides subtili)、多形拟杆菌(bacteroides thetaiotaomicron)、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)、乳双歧杆菌(bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌(bifidobacterium longum)、丁酸梭菌(clostridium butyricum)、屎肠球菌(enterococcus faecium)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(lactobacillus casei)、约翰逊氏乳杆菌(lactobacillus johnsonii)、副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、罗伊乳杆菌(lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)、乳酸乳球菌(lactococcus lactis)和鲍氏酵母菌(saccharomyces boulardii)。天然致病性细菌能够被遗传工程化为提供降低或消除致病性。
55.本公开中所述“益生菌”用于指活的、非致病性微生物，例如细菌，其能够对含有适当量该微生物的宿主生物体赋予健康益处。宿主生物体可以是哺乳动物，特别地可以是人类。
56.本公开中所述“营养缺陷型”是指宿主细胞(例如微生物菌株)的生长需要特定代谢物的外部来源，所述代谢物由于获得性遗传缺陷而不能合成。如本文所用，术语“营养缺陷型相关基因”是指宿主细胞(例如微生物如细菌)生存所需的基因。营养缺陷型相关基因可以是微生物为生存或生长所必需的营养素生产所必需的，或者可以是检测环境中调节转录因子活性的信号所必需的，其中信号的缺失将导致细胞死亡。
57.如本文所用，术语“缓解”和“治疗”及其同义词指的是疾病、病症和/或状况的改善。“缓解”和“治疗”可以是至少一个可测量的物理参数的改善，该参数不一定是患者能够识别的。“缓解”和“治疗”也可以是物理上(例如，稳定可识别的症状)、生理学上(例如，稳定物理参数)或两者都抑制疾病、病症和/或状况的发展。“缓解”和“治疗”还可以是减缓疾病、病症和/或状况的发展或逆转。
58.在本文中使用时，术语“治疗”旨在涵盖“预防”。本文所用的“预防”及其同义词是指延迟特定疾病、病症和/或状况或与这些疾病、病症和/或状况相关的症状的发作或降低获得这些疾病、病症和/或状况的风险。
59.本公开中所述“药物组合物”指本公开所述的工程微生物或工程微生物组合物与其他成分如药学上可接受的载体和/或赋形剂的制剂。
60.本公开中所述“药学上可接受的载体”指用于工程微生物或工程微生物组合物的成药或给药的载体或稀释剂或佐剂，其本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的，包括但不限于碳酸氢钙、磷酸钙、多种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和表面活性剂，包括例如聚山梨醇酯20。
61.本公开中所述“生理上可接受的载体”指不会对生物体引起显著刺激并且不会消除所施用的工程微生物或工程微生物组合物的生物学活性和特性的载体或稀释剂或佐剂。
62.本公开中所述“与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症”包括但不限于：苯丙酮尿症(例如经典型或典型(classical or typical)苯丙酮尿症和非经典型(atypical)苯丙酮尿症)，轻度(mild)高苯丙氨酸血症，非苯丙酮尿症类的高苯丙氨酸血症，苯丙氨酸羟化
酶缺陷，辅因子缺陷，二氢蝶呤还原酶缺陷，四氢蝶呤合酶缺陷，segawa氏病和肝病。
63.本公开中所述“高苯丙氨酸血症”或“过量的苯丙氨酸”指体内苯丙氨酸浓度增加或异常高。在一些实施方式中，高苯丙氨酸血症的诊断信号是血液苯丙氨酸水平至少2mg/dl，至少4mg/dl，至少6mg/dl，至少8mg/dl，至少10mg/dl，至少12mg/dl，至少14mg/dl，至少16mg/dl，至少18mg/dl，至少20mg/dl或至少25mg/dl。
64.本公开中所述“高苯丙氨酸血症”包括但不限于苯丙酮尿症(例如经典型或典型(classical or typical)苯丙酮尿症和非经典型(atypical)苯丙酮尿症)，永久性轻度(mild)高苯丙氨酸血症，非苯丙酮尿症类的高苯丙氨酸血症，苯丙氨酸羟化酶缺陷，辅因子缺陷，二氢蝶呤还原酶缺陷，四氢蝶呤合酶缺陷，segawa氏病和肝病。
65.本公开中所述“苯丙氨酸代谢障碍相关疾病和/或病症”与“与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症”同义，包括：苯丙酮尿症(例如经典型或典型(classical or typical)苯丙酮尿症和非经典型(atypical)苯丙酮尿症)，永久性轻度(mild)高苯丙氨酸血症，非苯丙酮尿症类的高苯丙氨酸血症，苯丙氨酸羟化酶缺陷，辅因子缺陷，二氢蝶呤还原酶缺陷，四氢蝶呤合酶缺陷，segawa氏病和肝病。
66.工程微生物
67.本公开所述的工程微生物能够减少过量的苯丙氨酸。在一些实施方式中，工程微生物是细菌或酵母。在一些实施方式中，工程微生物是非致病性细菌。在一些实施方式中，工程微生物是共生菌。在一些实施方式中，工程微生物是真菌。在一些实施方式中，工程微生物是益生菌。在一些实施方式中，工程微生物是天然致病菌，其被修饰或突变以降低或消除致病性。在一些实施方式中，工程微生物是革兰氏阴性菌。在一些实施方式中，工程微生物是革兰氏阳性菌。在一些实施方式中，工程微生物选自包括但不限于拟杆菌属(bacteroides)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、梭菌属(clostridium)、埃希氏菌属(escherichia)、乳杆菌属(lactobacillus)和乳球菌属(lactococcus)。
68.在一些实施方式中，工程微生物是大肠杆菌(escherichia coli)。在一些实施方式中，工程微生物是大肠杆菌nissle1917(e.coli nissle)，一种“已演化为最佳表征的益生菌之一”的肠杆菌科(enterobacteriaceae)的革兰氏阴性细菌。该菌株的特征在于其完全无害，并且具有gras(generally recognized as safe，一般认为是安全的)状态。基因组测序证实，大肠杆菌nissle缺乏突出的毒力因子(例如，大肠杆菌α-溶血素、p-菌毛粘附素(p-fimbrial adhesin))。另外，已经显示大肠杆菌nissle不携带病原性粘附因子，不产生任何肠毒素或细胞毒素，不是侵入性的，而且不是尿道病原性的(uropathogenic)。早在1917年，大肠杆菌nissle被包装为药物胶囊(称为mutaflor)用于治疗用途。从那时起，大肠杆菌nissle已被用于体内治疗人类中的溃疡性结肠炎，用于体内治疗人类炎性肠病、克罗恩病和储袋炎(pouchitis)，并在体外抑制肠侵入性沙门氏菌属(salmonella)、军团菌属(legionella)、耶尔森氏菌属(yersinia)和志贺氏菌属(shigella)。普遍认为，大肠杆菌nissle作为治疗载体的安全性和实用性已得到令人信服地证实。
69.在本公开的一些实施方式中，工程微生物为营养缺陷型。在本公开的一些实施方式中，营养缺陷型为尿嘧啶、胸腺嘧啶、亮氨酸、组氨酸、色氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、腺嘌呤、非天然存在的氨基酸、二氨基丙烯酸营养缺陷型中的任何一种或其组合。在本公开的一些实施方式中，营养缺陷型为二氨基丙烯酸营养缺陷型和/或胸腺嘧啶营养缺陷型。在本公开
的一些实施方式中，当工程微生物存在于哺乳动物肠道时，营养缺陷型得到补充。在本公开的一些实施方式中，其中哺乳动物肠道是人肠道。在一些实施方式中，工程微生物包含至少一个营养缺陷型相关基因的失活或缺失。在一些实施方式中，所述营养缺陷型相关基因选自：thya、cyse、glna、ilvd、leub、lysa、sera、meta、glya、hisb、ilva、phea、proa、thrc、trpc、tyra、uraa、dapf、flhd、metb、metc、proab、yhbv、yagg、hemb、secd、secf、ribd、ribe、thil、dxs、ispa、dnax、adk、hemh、ipxh、cyss、fold、rplt、infc、thrs、nade、gapa、yeaz、asps、args、pgsa、yefla、metg、fole、yejm、gyra、nrda、nrdb、folc、accd、fabb、gltx、liga、zipa、dape、dapa、der、hiss、ispg、suhb、tada、acps、era、rnc、fisb、eno、pyrg、chpr、igt、pgk、yqgd、metk、yqgf、plsc、ygit、pare、ribb、cca、ygjd、tdcf、yral、yiha、ftsn、murl、murb、bira、sece、nusg、rplj、rpll、rpob、rpoc、ubia、plsb、lexa、dnab、ssb、alsk、gros、psd、orn、yjee、rpsr、chps、ppa、vals、yjgp、yjgq、dnac、ribf、ispa、isph、dapb、fola、imp、yabq、flsl、flsl、mure、murf、mray、murd、ftsw、murg、murc、ftsq、ftsa、ftsz、ipxc、secm、seca、can、folk、heml、yadr、dapd、map、rpsb、in/b、nusa、ftsh、obge、rpma、rplu、ispb、mura、yrbb、yrbk、yhbn、rpsl、rplm、degs、mred、mrec、mreb、accb、accc、yrdc、def、fint、rplq、rpoa、rpsd、rpsk、rpsm、entd、mrdb、mrda、nadd、hlepb、rpoe、pssa、yfio、rpls、trmd、rpsp、ffh、grpe、yfjb、csra、ispf、ispd、rplw、rpld、rplc、rpsj、fusa、rpsg、rpsl、trps、yr/f、asd、rpoh、ftsx、ftse、ftsy、frr、dxr、ispu、rfak、kdta、coad、rpmb、djp、dut、gmk、spot、gyrb、dnan、dnaa、rpmh、rnpa、yidc、tnab、glms、glmu、wzye、hemd、hemc、yigp、ubib、ubid、hemg、secy、rplo、rpmd、rpse、rplr、rplf、rpsh、rpsn、rple、rplx、rpln、rpsq、rpmc、rplp、rpsc、rplv、rpss、rplb、cdsa、yael、yaet、lpxd、fabz、ipxa、ipxb、dnae、acca、tils、pros、yaff、tsf、pyrh、ola、rlpb、leus、int、glns、flda、cyda、in/a、cydc、ftsk、lola、sers、rpsa、msba、ipxk、kdsb、mukf、muke、mukb、asns、faba、mvin、rne、yceq、fabd、fabg、acpp、tmk、holb、lolc、lold、lole、purb、ymflc、mine、mind、pth、rsa、ispe、lolb、hema、prfa、prmc、kdsa、topa、riba、fabi、racr、dica、yd b、tyrs、ribc、ydil、phet、phes、yhhq、bcsb、glyq、yibj和gpsa中的任何一个或其组合。
70.在本公开的一些实施方式中，所述工程微生物的鞭毛结构经过改造后出现功能缺陷或者丧失，使得所述工程微生物在肠道中的滞留时间增加，这将更有利于苯丙氨酸的体内代谢。在本公开的一些实施方式中，鞭毛结构的改造是通过部分或者全部鞭毛合成相关基因的突变或者缺失而实现的。在本公开的一些实施方式中，所述工程微生物为大肠杆菌，鞭毛合成相关基因为bsca和/或flic基因。
71.酶和外源基因
72.根据本公开的一种实施方式，可以提供一种导入外源基因的工程微生物，其中所述外源基因包括：一种或更多种编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因；一种或更多种编码能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶的基因；一种或更多种编码能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶的基因；以及一种或更多种编码能够将苯丙氨酸转运至所述工程微生物体内的蛋白的基因。在本公开的一些实施方式中，所述工程微生物能够在人和/或哺乳动物肠道内代谢苯丙氨酸。在本公开的一些实施方式中，外源基因整合在基因组中或者位于表达质粒上。
73.在本公开的一些实施方式中，所述编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基
因选自编码转氨酶的基因、编码脱氢酶的基因、编码脱氨酶的基因、及其功能等效物中的一种或多种，所述功能等效物至少保留相关酶的部分活性。
74.在本公开的一些实施方式中，所述编码脱氢酶的基因是编码苯丙氨酸脱氢酶的基因；在另一些实施方式中，所述能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶包括苯丙氨酸脱氢酶和转氨酶(例如芳香族氨基酸转氨酶)。本公开意外的发现，至少在一些实施方式中，使用苯丙氨酸脱氢酶相比转氨酶能够一定程度上赋予工程微生物更多的代谢优势。在本公开的一些实施方式中，所述编码苯丙氨酸脱氢酶的基因源自病毒、真菌和/或细菌。在本公开的一些实施方式中，所述编码苯丙氨酸脱氢酶的基因源自脲芽孢八叠球菌和/或芽孢杆菌，例如脲芽孢八叠球菌scrc-r04(sporosarcina ureae scrc-r04)、球形赖氨酸芽孢杆菌scrc-r79a(lysinibacillus sphaericus scrc-r79a)、栗褐芽胞杆菌(bacillus badius)、和/或芽孢杆菌slbn-3(bacillus sp.slbn-3)。在本公开的一些实施方式中，所述编码苯丙氨酸脱氢酶的基因选自芽孢杆菌slbn-3的phedh(phenylalanine dehydrogenase)。在本公开的一些实施方式中，所述苯丙氨酸脱氢酶具有如seq id no:6所示的氨基酸序列；或者编码所述苯丙氨酸脱氢酶的基因具有如seq id no:17所示的核苷酸序列。
75.在本公开的一些实施方式中，编码转氨酶的基因是编码芳香族氨基酸转氨酶的基因。在本公开的一些实施方式中，所述编码芳香族氨基酸转氨酶的基因源自病毒、真菌和/或细菌。在本公开的一些实施方式中，所述编码芳香族氨基酸转氨酶的基因源自大肠杆菌和/或酵母，例如大肠杆菌bl21(de3)(escherichia coli bl21(de3))和/或酿酒酵母s288c(saccharomyces cerevisiae s288c)。在本公开的一些实施方式中，所述编码芳香族氨基酸转氨酶的基因选自大肠杆菌bl21(de3)的tyrb(tyrosine aminotransferase)或酿酒酵母s288c的aro8(bifunctional 2-aminoadipate transaminase/aromatic-amino-acid:2-oxoglutarate transaminase)。在本公开的一些实施方式中，所述芳香族氨基酸转氨酶具有如seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列；或者编码所述芳香族氨基酸转氨酶的基因具有如seq id no:15或seq id no:90所示的核苷酸序列。
76.在本公开的一些实施方式中，所述工程微生物还包含编码谷氨酸脱氢酶的基因及其功能等效物中的一种或多种，所述功能等效物至少保留相关酶的部分活性，特别是当工程微生物中包含转氨酶(例如芳香族氨基酸转氨酶)时。谷氨酸脱氢酶可以将苯丙氨酸的转氨反应与苯乙醛的还原反应偶联起来，实现了辅因子的再生，为转氨反应提供了更多的α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid)，进一步提高了苯丙氨酸代谢速率。在本公开的一些实施方式中，所述编码谷氨酸脱氢酶的基因源自病毒、真菌和/或细菌。在本公开的一些实施方式中，所述编码谷氨酸脱氢酶的基因源自酵母和/或艰难梭菌，例如酿酒酵母s288c和/或艰难梭菌(clostridioides difficile)。在本公开的一些实施方式中，所述编码谷氨酸脱氢酶的基因选自酿酒酵母s288c的或艰难梭菌的gdh2(glutamate dehydrogenase(nad+))。在本公开的一些实施方式中，所述谷氨酸脱氢酶具有如seq id no:11或seq id no:12所示的氨基酸序列；或者编码所述谷氨酸脱氢酶的基因具有如seq id no:20或seq id no:97所示的核苷酸序列。
77.在本公开的一些实施方式中，所述编码脱氨酶的基因是编码l-氨基酸脱氨酶的基因。在本公开的一些实施方式中，所述编码l-氨基酸脱氨酶的基因源自病毒、真菌和/或细菌。在本公开的一些实施方式中，所述编码l-氨基酸脱氨酶的基因源自大肠杆菌、酵母、和/
或奇异变形杆菌，例如大肠杆菌bl21(de3)、酿酒酵母s288c、和/或奇异变形杆菌hi4320(proteus mirabilis hi4320)。在本公开的一些实施方式中，所述编码l-氨基酸脱氨酶的基因选自大肠杆菌bl21(de3)、酿酒酵母s288c、或奇异变形杆菌hi4320的laad(l-amino acid deaminase)。在本公开的一些实施方式中，所述l-氨基酸脱氨酶具有如seq id no:89所示的氨基酸序列，或者编码所述l-氨基酸脱氨酶的基因具有如seq id no:91所示的核苷酸序列。
78.在本公开的一些实施方式中，所述编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因包括以下组中的至少一项：(1)编码苯丙氨酸脱氢酶的基因；(2)编码芳香族氨基酸转氨酶的基因；(3)编码芳香族氨基酸转氨酶的基因和编码苯丙氨酸脱氢酶的基因；(4)编码芳香族氨基酸转氨酶的基因和编码l-氨基酸脱氨酶的基因；(5)编码苯丙氨酸脱氢酶的基因和编码l-氨基酸脱氨酶的基因；或(6)编码芳香族氨基酸转氨酶的基因、编码苯丙氨酸脱氢酶的基因和编码l-氨基酸脱氨酶的基因。
79.在本公开的一些实施方式中，所述编码能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶的基因选自编码苯丙酮酸脱羧酶的基因、编码α-酮酸脱羧酶的基因、及其功能等效物中的一种或多种，所述功能等效物至少保留相关酶的部分活性。在本公开的一些实施方式中，所述编码苯丙酮酸脱羧酶的基因源自病毒、真菌和/或细菌。在本公开的一些实施方式中，所述编码苯丙酮酸脱羧酶的基因源自酵母，例如酿酒酵母s288c。在本公开的一些实施方式中，所述编码苯丙酮酸脱羧酶的基因是酿酒酵母s288c的aro10(phenylpyruvate decarboxylase)。在本公开的一些实施方式中，所述苯丙酮酸脱羧酶具有如seq id no:7所示的氨基酸序列；或者编码所述苯丙酮酸脱羧酶的基因具有如seq id no:18所示的核苷酸序列。在本公开的一些实施方式中，所述编码α-酮酸脱羧酶的基因源自病毒、真菌和/或细菌。在本公开的一些实施方式中，所述编码α-酮酸脱羧酶的基因源自酵母和/或奇异变形杆菌，例如酿酒酵母s288c和/或奇异变形杆菌jn458(proteus mirabilis jn458)。在本公开的一些实施方式中，所述编码α-酮酸脱羧酶的基因选自酿酒酵母s288c的或奇异变形杆菌jn458的kdc(alpha-keto-acid decarboxylase)的至少一种。在本公开的一些实施方式中，所述α-酮酸脱羧酶具有如seq id no:8所示的序列；或者编码所述α-酮酸脱羧酶的基因具有如seq id no:95所示的核苷酸序列。
80.在本公开的一些实施方式中，所述编码能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶的基因选自编码醛还原酶的基因及其功能等效物中的一种或多种，所述功能等效物至少保留相关酶的部分活性。在本公开的一些实施方式中，所述编码醛还原酶的基因源自病毒、真菌和/或细菌。在本公开的一些实施方式中，所述编码醛还原酶的基因源自大肠杆菌和/或短乳杆菌，例如大肠杆菌str.k-12substr.mg1655和/或短乳杆菌(lactobacillus brevis)。在本公开的一些实施方式中，所述编码醛还原酶的基因选自大肠杆菌str.k-12substr.mg1655的yahk(nadph-dependent aldehyde reductase)或短乳杆菌的adh(alcohol dehydrogenase)。在本公开的一些实施方式中，所述醛还原酶具有如seq id no:9或seq id no:10所示的氨基酸序列；或者编码所述醛还原酶的基因具有如seq id no:19或seq id no:96所示的核苷酸序列。
81.在本公开的一些实施方式中，所述编码能够将苯丙氨酸转运至所述工程微生物体内的蛋白的基因选自编码苯丙氨酸转运蛋白的基因及其功能等效物中的一种或更多种，所
述功能等效物至少保留相关酶的部分活性。在本公开的一些实施方式中，所述编码苯丙氨酸转运蛋白的基因源自病毒、真菌和/或细菌。在本公开的一些实施方式中，苯丙氨酸转运蛋白由来源于细菌的苯丙氨酸转运蛋白基因编码，所述细菌包括但不限于乙酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus)，肠沙门氏菌(salmonellaenteritidis)和大肠杆菌(escherichia coli)。在本公开的一些实施方式中，所述编码苯丙氨酸转运蛋白的基因源自大肠杆菌。在一些实施方式中，苯丙氨酸转运蛋白由来源于细菌的phep基因编码。在一些实施方式中，苯丙氨酸转运蛋白由来源于细菌的arop基因编码。在一些实施方式中，苯丙氨酸转运蛋白由来源于细菌的liv-结合蛋白和ls-结合蛋白以及livhmgf基因编码。在一些实施方式中，工程微生物包含至少一种以上类型的苯丙氨酸转运蛋白，所述苯丙氨酸转运蛋白选自phep、arop和liv-i/ls。在本公开的一些实施方式中，所述编码苯丙氨酸转运蛋白的基因是大肠杆菌的phep(phenylalanine:h(+)symporter)。在本公开的一些实施方式中，所述苯丙氨酸转运蛋白具有如seq id no:13所示的氨基酸序列；或者编码所述苯丙氨酸转运蛋白的基因具有如seq id no:21所示的核苷酸序列。
82.在本公开的一些实施方式中，所述编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因、所述编码能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶的基因、所述编码能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶的基因、所述编码谷氨酸脱氢酶的基因、和/或所述编码苯丙氨酸转运蛋白的基因中的任一个、两个、三个、四个、五个、六个、多个或全部可选地与一个或更多个相同或不同的启动子可操作地连接。在本公开的一些实施方式中，所述编码芳香族氨基酸转氨酶的基因和编码谷氨酸脱氢酶的基因共用同一启动子。在本公开的一些实施方式中，所述编码苯丙酮酸脱羧酶的基因和编码醛还原酶的基因共用同一启动子。在本公开的一些实施方式中，所述编码苯丙氨酸脱氢酶的基因和编码苯丙氨酸转运蛋白的基因共用同一启动子。在本公开的一些实施方式中，所述编码l-氨基酸脱氨酶的基因单独与启动子可操作地连接。在本公开的一些实施方式中，所述编码苯丙氨酸转运蛋白的基因单独与启动子可操作地连接。在本公开的一些实施方式中，所述启动子为内源启动子或外源启动子。在本公开的一些实施方式中，所述启动子为诱导型启动子或组成型启动子。在本公开的一些实施方式中，所述启动子为直接或间接诱导型启动子。在一些实施方式中，所述启动子为ph依赖性启动子。在一些实施方式中，启动子为氧水平依赖性启动子。在本公开的一些实施方式中，所述启动子由外源环境条件直接或间接诱导。在本公开的一些实施方式中，外源环境条件是指哺乳动物肠道中的外源环境条件。在本公开的一些实施方式中，哺乳动物肠道是指人肠道。在一些实施方式中，外源环境条件是指哺乳动物的上胃肠道。在一些实施方式中，外源环境条件是指哺乳动物的下胃肠道。在一些实施方式中，外源性环境条件是指哺乳动物的小肠。在一些实施方式中，外源环境条件是指低氧、微需氧或厌氧条件，例如哺乳动物肠道的环境。在一些实施方式中，外源环境条件是指在健康或疾病状态中哺乳动物肠道中存在的分子或代谢物。在一些实施方式中，外源环境条件是组织特异性或疾病特异性代谢产物或分子。在一些实施方式中，外源环境条件是低ph环境。在一些实施方式中，所述启动子选自pfnrs、fdhf、ptet、pbba、ptrc、pvan、或pbad中的至少一种。在本公开的一些实施方式中，所述pfnrs启动子的序列如seq id no.22所示。在本公开的一些实施方式中，所述fdhf启动子的序列如seq id no.24所示。在本公开的一些实施方式中，所述ptet启动子的序列如seq id no.100所示。在本公开的一些实施方式中，所述pbba启动子的序列如seq id no.98所示。在
本公开的一些实施方式中，所述ptrc启动子的序列如seq id no.99所示。在本公开的一些实施方式中，所述pvan启动子为香草酸(vanillic acid)诱导的启动子，序列如seq id no:101所示。在本公开的一些实施方式中，所述pbad启动子的序列如seq id no:102所示。已经知晓的是，香草酸启动子的活性可被抑制子表达盒vanram(其编码序列如seq id no:111所示)所抑制，通过添加香草酸可以解除上述抑制，从而使香草酸启动子表现出启动子的活性。通过这个机制，可以实现启动子的诱导调控，当工程微生物内源不存在vanram时，香草酸启动子就处于持续激活状态，此时，为了实现诱导性表达，就需要额外添加vanram。因此在本公开的一些实施方式中，当启动子是pvan启动子时，还可以在工程微生物基因组中同时转入能够表达一个或更多个拷贝的香草酸抑制子vanram的表达盒。
83.在本公开的一些实施方式中，所述编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因、所述编码能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶的基因、所述编码能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶的基因、所述编码谷氨酸脱氢酶的基因、和/或所述编码苯丙氨酸转运蛋白的基因位于一个或多个表达盒中。在本公开的一些实施方式中，所述表达盒以单拷贝、双拷贝、三拷贝、四拷贝或更多拷贝的形式存在。在一些实施方式中，所述表达盒存在于质粒上。在本公开的一些实施方式中，所述表达盒稳定整合在所述工程微生物的一个、两个、或多个相同或者不同的基因组位点中。在本公开的一些实施方式中，所述基因组位点选自yics位点、malpt位点、male位点、exo位点、rhtb/c位点、agai/rsml位点、arabd位点、yghx位点、ldha位点、araab位点、lacz位点、kefb位点、maeb位点、nth/tppb位点、和/或tkra位点中的至少一个。
84.在本公开的一些实施方式中，本公开的工程微生物包括第一表达盒和第二表达盒，其中第一表达盒包含第一启动子、以及与其可操作连接的所述编码芳香族氨基酸转氨酶的基因和所述编码谷氨酸脱氢酶的基因；第二表达盒包含第二启动子、以及与其可操作连接的所述编码苯丙酮酸脱羧酶的基因和编码醛还原酶的基因；所述第一或第二启动子是相同的或者不同的。在一些实施方式中，所述工程微生物还包含第三表达盒，所述第三表达盒包含可操作地连接至第三启动子的所述编码苯丙氨酸转运蛋白的基因，所述第三启动子可以与第一启动子和/或第二启动子相同，或者与第一启动子和第二启动子均不同。在本公开的一些实施方式中，所述第一表达盒以单拷贝或双拷贝的形式存在。在本公开的一些实施方式中，所述第二表达盒以单拷贝、双拷贝、三拷贝或四拷贝的形式存在。在本公开的一些实施方式中，所述第三表达盒以单拷贝的形式存在。在本公开的一些实施方式中，所述第一表达盒整合在在yghx位点和/或araab位点。在本公开的一些实施方式中，所述第二表达盒整合在ldha位点、lacz位点、yghx位点、yjcs位点和/或agai/rsml位点。在本公开的一些实施方式中，所述第三表达盒整合在kefb位点。
85.在本公开的一些实施方式中，本公开的工程微生物包含第四表达盒和第二表达盒，其中第四表达盒包含第四启动子、以及与其可操作连接的所述编码苯丙氨酸脱氢酶的基因和编码苯丙氨酸转运蛋白的基因；第二表达盒包含第二启动子、以及与其可操作连接的所述编码苯丙酮酸脱羧酶的基因和编码醛还原酶的基因；所述第四或第二启动子是相同的或者不同的。在一些实施方式中，所述工程微生物还包含第一表达盒，所述第一表达盒包含第一启动子、与其可操作连接的所述编码芳香族氨基酸转氨酶的基因和所述编码谷氨酸脱氢酶的基因；所述第一启动子可以与第四启动子和/或第二启动子相同，或者与第四启动
no:22中任一项所示)、pfnrs启动子(序列如seq id no:22所示)和pvan启动子(序列如seq id no:101所示)，双拷贝的第一表达盒分别使用pfnrs启动子(序列如seq id no:22所示)和pvan启动子(序列如seq id no:101所示)，第五表达盒中使用的启动子为pbad启动子(序列如seq id no:102所示)。
91.在本公开的一些实施方式中，本公开的工程微生物包括双拷贝的第四表达盒，所述第四表达盒整合在maeb和kefb位点；三拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒分别整合在yjcs、ldha和agai/rsml位点；双拷贝的第一表达盒，所述第一表达盒分别整合在yghx和araab位点；以及单拷贝的第五表达盒，所述第五表达盒整合在rhtb/c位点；其中，所述双拷贝的第四表达盒使用pfnrs启动子，三拷贝的第二表达盒分别使用pvan启动子、pvan启动子和pfnrs启动子(序列如seq id no:22所示)，双拷贝的第一表达盒使用pvan启动子(序列如seq id no:101所示)，第五表达盒使用的启动子为pbad启动子(序列如seq id no:102所示)。
92.在本公开的一些实施方式中，本公开的工程微生物包括单拷贝的第四表达盒，所述第四表达盒整合在kefb位点；四拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒分别整合在ldha、lacz、agai/rsml和yjcs；双拷贝的第一表达盒，所述第一表达盒分别整合在yghx和araab位点；以及单拷贝的第五表达盒，所述第五表达盒整合在rhtb/c位点；其中，所述第四、第二和第一表达盒中使用的启动子为pfnrs启动子(序列如seq id no:22所示)，第五表达盒中使用的启动子为pbad启动子(序列如seq id no:102所示)。
93.在本公开的一些实施方式中，本公开的工程微生物包括双拷贝的第四表达盒，所述第四表达盒整合在ldha和maeb位点；双拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒分别整合在yghx和lacz位点；以及单拷贝的第五表达盒，所述第五表达盒整合在rhtb/c位点；其中，所述第四和第二表达盒中使用的启动子为pfnrs启动子(序列如seq id no:22所示)，第五表达盒中使用的启动子为pbad启动子(序列如seq id no:102所示)。
94.在本公开的一些实施方式中，本公开的工程微生物包括单拷贝的第四表达盒，所述第四表达盒整合在ldha位点；以及单拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒整合在yghx位点；其中，所述第四和第二表达盒中使用的启动子为pfnrs启动子(序列如seq id no:22所示)。
95.在本公开的一些实施方式中，本公开的工程微生物包括单拷贝的第一表达盒，所述第一表达盒整合在yghx位点；单拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒整合在ldha位点；以及单拷贝的第三表达盒，所述第三表达盒整合在kefb位点；其中，所述第一、第二和第三表达盒中使用的启动子为pfnrs启动子(序列如seq id no:22所示)。
96.在本公开的一些实施方式中，本公开的工程微生物包括单拷贝的第一表达盒，所述第一表达盒整合在yghx位点；以及单拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒整合在ldha位点；其中，所述第一和第二表达盒中使用的启动子为pfnrs启动子(序列如seq id no:22所示)。
97.在本公开的一些实施方式中，本公开的工程微生物包括双拷贝的第一表达盒，所述第一表达盒分别整合在yghx和araab位点；以及双拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒整合在ldha和lacz位点；其中，所述第一和第二表达盒中使用的启动子为pfnrs启动子(序列如seq id no:22所示)。
98.在本公开的一些实施方式中，本公开的工程微生物包括双拷贝的第一表达盒，所述第一表达盒分别整合在yghx和araab位点；双拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒分别整合在ldha和lacz位点；以及单拷贝的第三表达盒，所述第三表达盒整合在kefb位点；其中，所述第一、第二和第三表达盒中使用的启动子为pfnrs启动子(序列如seq id no:22所示)。
99.组合物和试剂盒
100.根据本公开的一种实施方式，提供了一种工程微生物组合物，其包含多于一种工程微生物，所述多于一种工程微生物中的每一种彼此独立地包含以下基因中的任一种或更多种：编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因；编码能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶的基因；编码能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶的基因；编码能够将苯丙氨酸转运至所述工程微生物体内的蛋白的基因；其中所述工程微生物组合物包含编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因、编码能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶的基因、编码能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶的基因、以及编码能够将苯丙氨酸转运至所述工程微生物体内的蛋白的基因。在本公开的一些实施方式中，所述多于一种工程微生物中的每一种彼此独立地包含以下基因中的任一种或更多种：编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因；编码能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶的基因；编码能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶的基因；编码谷氨酸脱氢酶的基因；编码能够将苯丙氨酸转运至所述工程微生物体内的蛋白的基因；其中所述工程微生物组合物包含编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因、编码能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶的基因、编码能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶的基因、编码谷氨酸脱氢酶的基因以及编码能够将苯丙氨酸转运至所述工程微生物体内的蛋白的基因。
101.根据本公开的一种实施方式，提供了一种组合物，所述组合物包含本公开所述的工程微生物或工程微生物组合物和药学上、营养学上或生理学上可接受的载体。在本公开的一些实施方式中，所述的组合物为药物组合物，可用于治疗、缓解、管理、改善和/或预防与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症。
102.工程微生物可以约104到约10
13
个菌落形成单位(cfu)范围内的量存在于组合物中。举例来说，工程微生物的有效量可以是约105cfu到约10
13
cfu，优选地约106cfu到约10
13
cfu，优选地约107cfu到约10
12
cfu，更优选地约108cfu到约10
12
cfu的量。工程微生物可以是活细胞或可以是死细胞。
103.在本公开的一些实施方式中，所述组合物是可食用组合物。在本公开的一些实施方式中，所述组合物是益生菌组合物。在本公开的一些实施方式中，所述组合物是食品增补剂。在一些实施方式中，本文所公开的组合物可以经配制用于口服施用，并且可以是营养或滋养组合物，例如食品、食品增补剂、饲料或饲料增补剂，如乳制品，例如发酵乳制品，如酸奶或酸奶饮料。在此情况下，组合物可包含营养学上可接受的载剂，其可为适合的食物基。所属领域的技术人员知道可涵盖活或死微生物体且可呈现为食品增补剂(例如，丸剂、片剂等)或功能性食品(例如饮料、发酵酸奶等)的多种配方。本文所公开的组合物还可以在胶囊、丸剂、液体溶液中配制为药剂，例如配制为囊封的冻干细菌等。在一些实施方式中，所述的组合物是益生菌组合物。
104.本文所公开的组合物可以被配制成单次施用或多次施用而对给定个体有效。举例来说，单次施用实质上有效降低施用组合物的哺乳动物个体的靶向疾病病状的监测症状。
105.在一些实施方式中，配制组合物以使得单一口服剂量含有至少约1
×
104、1
×
105、1
×
106、1
×
107、1
×
108、1
×
109、1
×
10
10
、1
×
10
11
、1
×
10
12
、1
×
10
13
cfu的工程微生物(例如，细菌实体和/或真菌实体)。在一些实施方式中，所述组合物中包含1
×
108–1×
10
12
cfu的本发明所述的工程微生物。
106.在一些配方中，按质量计，组合物含有至少约0.5％、1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或大于90％本公开的微生物。在一些配方中，按质量计，所施用的剂量不超过200、300、400、500、600、700、800、900毫克或1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8或1.9克的本技术提供的工程微生物。
107.用于本文所公开的组合物的生理学上可接受的载剂可包含例如生理学上可接受的液体、凝胶或固体载剂、水性媒剂、非水性媒剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、悬浮剂/分散剂、螯合剂(sequestering/chelating agent)、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质、所属领域中已知的其它组分或其各种组合。在一些实施方式中，本公开所述的组合物为液态制剂、固态制剂、半固态制剂。在一些实施方式中，所述的液态制剂选自下组：溶液制品或悬浮液制品。
108.为了进一步说明，水性媒剂可包含如氯化钠注射液、林格注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格注射液；非水性媒剂可包含如植物来源的不挥发性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油；抗微生物剂可为抑细菌或抑真菌浓度，和/或可以添加到在多剂量容器中的组合物中，所述容器包含苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂可以包含如氯化钠或右旋糖；缓冲剂可以包含如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂；抗氧化剂可以包含如硫酸氢钠；悬浮剂和分散剂可以包含如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；螯合剂可以包含如乙二胺四乙酸(edta)或乙二醇四乙酸(egta)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。适合的赋形剂可包含例如水、生理盐水、右旋糖、甘油或乙醇。适合的无毒辅助物质可包含例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂、稳定剂、溶解性增强剂或如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。
109.在一些实施方式中，本文所提供的组合物可为药物组合物。在一些实施方式中，本文所提供的组合物可以是食品增补剂。本文所提供的组合物除本文所提供的经遗传修饰的工程微生物之外可以包含药学上、营养学上(nutritionally/alimentarily)或生理学上可接受的载剂。优选形式将取决于预期施用模式和(治疗性)应用。载剂可以是适合于将本文提供的经遗传修饰的工程微生物递送到哺乳动物(例如人类)的胃肠道，优选地哺乳动物的肠粘膜屏障(更优选地结肠粘膜屏障)附近或内的任何相容性生理学上可接受的无毒物质。在一些实施方式中，所述药物组合物的剂型选自下组：粉末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、滴剂、舌下含片、或其组合。
110.组合物可为液体溶液、悬浮液、乳液、丸剂、胶囊、片剂、持续释放制剂或散剂。口服制剂可包含标准载剂，如药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
111.本公开的组合物可使用一种或更多种生理学上可接受的载体(包括赋形剂和辅剂)以常规方式来配制，该载体有利于将活性成分加工为用于药物使用的组合物。在一些实施方式中，将药物组合物经历压片、冻干、直接压制、常规混合、溶解、制粒、研磨、乳化、包
封、包埋或喷雾干燥以形成片剂、粒剂、纳米颗粒、纳米胶囊、微胶囊、微片剂、药丸、或粉末，其可以是肠溶包衣或未包衣的。适当的制剂取决于其施用途径。
112.本公开所述的工程微生物可以被配制为以任何合适的剂型(例如，用于口服施用的液体、胶囊、小药囊、硬胶囊、软胶囊、片剂、肠溶包衣片剂、悬浮粉剂、粒剂或基质持续释放制剂)和任何合适类型的施用(例如，口服、立即释放、脉冲释放、延迟释放或持续释放)的药物组合物。组合物可以每天、每周或每月一次或多次被施用。工程微生物可以被配制为包含一种或更多种药学上可接受的载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、表面活性剂、中性或阳离子脂质、脂质复合物、脂质体、渗透增强剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或剂的药物组合物。
113.本公开所述的工程微生物可以被口服施用并且被配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆体、悬浮液等。用于口服使用的药物组合物可以使用固体赋形剂制造，任选地研磨所得的混合物，和(如果需要)在添加合适的辅剂之后，加工颗粒的混合物，以获得片剂或糖衣丸芯。适合的赋形剂包括但不限于填充剂诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素组合物诸如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮(pvp)或聚乙二醇(peg)。还可添加崩解剂，诸如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐诸如藻酸钠。
114.片剂或胶囊可以与药学上可接受的赋形剂通过常规方法一起制备，所述药学上可接受的赋形剂诸如结合剂(例如，预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、淀粉、树胶、高岭土和黄蓍胶)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，钙、铝、锌、硬脂酸、聚乙二醇、月桂基硫酸钠、淀粉、苯甲酸钠、l-亮氨酸、硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，淀粉、马铃薯淀粉、羟基乙酸淀粉钠、糖类、纤维素衍生物、二氧化硅粉末)；或润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)。片剂可通过本领域熟知的方法包衣。可存在包衣壳，且常见的膜包括但不限于，聚丙交酯、聚乙醇酸、聚酸酐、其他可生物降解聚合物、藻酸盐-聚赖氨酸-藻酸盐(alginate-polylysine-alginate)(apa)、藻酸盐-聚亚甲基-共-胍-藻酸盐(a-pmcg-a)、羟基甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯(hydroxymethyl acrylate-methyl methacrylate)(hema-mma)、多层hema-mma-maa、聚丙烯腈氯乙烯(polyacrylonitrilevinylchloride)(pan-pvc)、丙烯腈/甲代烯丙基磺酸钠(acrylonitrile/sodium methallylsulfonate)(an-69)、聚乙二醇/聚五甲基环五硅氧烷/聚二甲基硅氧烷(peg/pd5/pdms)、聚n,n-二甲基丙烯酰胺(pdmaam)、硅质包封物、硫酸纤维素/藻酸钠/聚亚甲基-共-胍(cs/a/pmcg)、邻苯二甲酸乙酸纤维素、藻酸钙、k-卡拉胶-槐豆胶凝胶珠、结冷胶(gellan)-黄原胶珠、聚(丙交酯-共-乙交酯)、卡拉胶、淀粉聚酸酐、淀粉聚甲基丙烯酸酯、聚氨基酸和肠溶包衣聚合物。
115.用于口服施用的液体制剂可以采用溶液、糖浆剂、悬浮液或在使用之前用水或其他合适的媒介物构成的干燥产品的形式。此类液体制剂可以与药学上可接受的剂通过常规方法一起制备：所述药学上可接受的剂诸如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆剂、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分级的植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。制剂还可以适当地包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于口服施用的制剂可以适
当地被配制用于本公开所述的工程微生物的缓慢释放、控制释放或持续释放。
116.在一些实施方式中，本公开所述的工程微生物可以例如与惰性稀释剂或可同化的可食用载体一起口服施用。化合物也可以被封闭在硬壳或软壳明胶胶囊中，压制为片剂，或直接掺入到受试者的饮食中。对于口服治疗施用，化合物可以与赋形剂混合并以可摄入片剂、含服片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、薄饼等形式使用。为了通过除了肠胃外施用以外的方式施用本公开的化合物，可能需要将化合物用材料包衣或将化合物与材料共同施用，以防止其失活。
117.在一些实施方式中，组合物被配制为经由纳米颗粒、纳米胶囊、微胶囊或微片剂(其被肠溶包衣或未包衣)用于肠内施用、空肠内施用、十二指肠内施用、回肠内施用、胃分流施用或结肠内施用。本公开的药物组合物也可以使用例如常规栓剂基质诸如可可脂或其他甘油酯被配制为直肠组合物诸如栓剂或保留灌肠剂。组合物可以是在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳状液，并且可以包含悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
118.在一些实施方式中，本公开提供呈单一剂型的药学上可接受的组合物。单一剂型可以呈液体或固体形式。单一剂型可以被直接施用至患者而不经修改，或者可以在施用之前被稀释或重构。在某些实施方式中，单一剂型可以以推注形式被施用，例如单次注射、单次口服剂量，包括包含多个片剂、胶囊、丸剂等的口服剂量。在替代实施方式中，单一剂型可以例如通过输注在一定时间段内被施用。
119.本公开的药物组合物的单一剂型可以通过以下来制备：将药物组合物分配为较小的等分试样、分配到单剂量容器、分配为单剂量液体形式或单剂量固体形式，诸如片剂、粒剂、纳米颗粒、纳米胶囊、微胶囊、微片剂、小药丸或粉末，其可以是肠溶包衣或未包衣的。呈固体形式的单一剂量可以在施用至患者之前通过加入液体(通常是无菌水或盐水溶液)来重构。
120.可以调整剂量方案以提供治疗响应。例如，可以在一次施用单次推注，可以在预定时间段内施用几个分开的剂量，或者可以如治疗情况所指示的降低或增加剂量。剂量的规格由活性化合物的独特特征和待实现的具体治疗效果决定。剂量值可以随着待缓解的状况的类型和严重程度而变化。对于任何特定的受试者，可以根据个体需要和治疗临床医师的专业判断随时间调整具体的剂量方案。
121.在另一个实施方式中，组合物可以在受控释放或持续释放系统中递送。在一个实施方式中，可以使用泵来实现受控或持续释放。在另一个实施方式中，可以使用聚合物材料来实现本公开内容的疗法的受控或持续释放。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括但不限于，聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(plg)、聚酸酐、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(pla)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)和聚原酸酯。用于持续释放制剂中的聚合物可以是惰性的，不含可浸出(leachable)的杂质，在储存时是稳定的、无菌的和可生物降解的。在一些实施方式中，控制释放或持续释放系统可以被置于预防或治疗靶附近，因此仅需要全身剂量的一部分。可使用本领域技术人员已知的任何合适的技术。
122.剂量可以取决于几个因素，包括疾病的严重程度和响应性、施用途径、治疗时间(几天至几个月至几年)、以及到改善疾病的时间。
123.在另一方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含本公开所述的工程微生物或本公开所述的工程微生物组合物或本公开所述的组合物。
124.必要时，所述试剂盒可进一步包含各种常规药物试剂盒组分中的一种或多种，例如具有一种或多种药学上可接受的载剂的容器、额外容器等，如对所属领域的技术人员将显而易见。试剂盒中还可以包含作为插页或标签的说明书，指示应施用的组分的量、施用指南和/或混合组分的指南。
125.治疗方法和用途
126.本公开所述的工程微生物包含编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因、编码能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶的基因、编码能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶的基因、编码谷氨酸脱氢酶的基因、和/或编码苯丙氨酸转运蛋白的基因中的一种或多种，其能够缓解和/或治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症。
127.本公开构建的工程微生物能够有效地降解苯丙氨酸和/或苯丙酮酸，实验证明，该工程微生物有效降解了苯丙酮尿症小鼠pah
r408
w的体内苯丙氨酸和苯丙氨酸代谢物，显示出良好的应用前景。
128.本公开提供了一种用于缓解和/或治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用根据本公开所述的工程微生物或根据本公开所述的工程微生物组合物或根据本公开所述的组合物或根据本公开所述的试剂盒。
129.根据本公开的一种实施方式，可以提供本公开所述的工程微生物或根据本公开所述的工程微生物组合物在制备用于缓解和/或治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症的药物或保健品中的用途。
130.在本公开的一些实施方式中，所述与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症包括但不限于：苯丙酮尿症(例如经典型或典型(classical or typical)苯丙酮尿症和非经典型(atypical)苯丙酮尿症)，永久性轻度(mild)高苯丙氨酸血症，非苯丙酮尿症类的高苯丙氨酸血症，苯丙氨酸羟化酶缺陷，辅因子缺陷，二氢蝶呤还原酶缺陷，四氢蝶呤合酶缺陷，segawa氏病和肝病。
131.实施例
132.以下，说明本技术的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本技术，而不能理解为对本技术的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
133.表1：实施例中所用酶、启动子和表达盒的具体序列信息
134.[0135][0136]
表2基因编辑中插入位点对应的sgrna序列信息
[0137]
[0138][0139]
实施例1：细菌基因编辑的方案
[0140]
1.1sgrna设计
[0141]
在目标整合位点序列的两条链上寻找连接ngg pam序列的20bp序列(n20ngg)并且针对ecn基因组进行blast处理。选择独特的20bp序列作为目标整合位点的sgrna。选择sgrna上游和下游的300-500bp序列作为左同源臂(lha)和右同源臂(rha)。
[0142]
1.2sgrna质粒构建
[0143]
将sgrna序列添加到grna骨架反向引物的5’端，通过pcr扩增并用限制性内切酶psti和spei进行酶切，将酶切后的pcr产物片段与同样酶切的质粒pcbt003(seq id no：84，质粒图谱如图1所示)连接，形成pcbt003_sgrna质粒。
[0144]
1.3供体基因片段的制备
[0145]
待整合到ecn基因组的目标基因由金斯瑞(genescript)在克隆质粒(例如puc57)上合成。目标基因以合成的质粒为模板进行扩增，所选整合位点的lha和rha以ecn的基因组为模板扩增。用于扩增这些片段的pcr引物彼此具有15-20bp的同源序列，因此它们可以通过重叠pcr连接起来，得到的包含lha-目标基因-rha的pcr产物用作供体基因片段。
[0146]
1.4供体质粒pcbt003-目标基因-sgrna制备
[0147]
将从1.2中获得的表达整合位点的sgrna的pcbt003_sgrna质粒、从1.3中获得的包含lha-目标基因-rha的pcr产物，使用multis一步克隆试剂盒进行连接，转化进top10感受态细胞中，用氨苄青霉素抗性平板(100μg/ml)筛选，挑取转化子进行菌落pcr验证及测序，选出测序正确的pcbt003-目标基因-sgrna重组质粒。
[0148]
1.5ecn/pcbt001电转感受态细胞的制备
[0149]
将pcbt001质粒(表达cas9蛋白的质粒，seq id no.85，质粒图谱如图2所示)电转化进大肠杆菌ecn化学感受态细胞中，在含盐酸壮观霉素和链霉素(50μg/ml)的lb固体平板上进行筛选，获得ecn/pcbt001转化子。
[0150]
挑取ecn/pcbt001单菌落于含壮观霉素和链霉素(50μg/ml)的lb液体培养基，30℃220rpm过夜培养。次日，菌液按1:100接种量(v/v)接入30ml lb液体培养基，在菌浓od600为
0.2时，添加终浓度为1mm的iptg进行诱导，继续培养2-3h至od值为0.6-0.8，制备电转感受态细胞。
[0151]
1.6电转
[0152]
将pcbt003-目的基因-sgrna质粒电转入ecn/pcbt001感受态细胞中(电转化条件：2.5kv，200ω，25μf)，涂布于氨苄青霉素(50μg/ml)、壮观霉素和链霉素(50μg/ml)lb平板上，培养1d，挑取在抗性平板上生长的单菌落。
[0153]
1.7pcbt003-目标基因-sgrna质粒和pcbt001质粒的消除
[0154]
挑取已成功整合目标基因表达盒的单菌落接种于添加壮观霉素和链霉素(50μg/ml)的lb液体培养基中，加入10mm的l-阿拉伯糖在30℃下诱导20-24h，涂布壮观霉素和链霉素(50μg/ml)lb平板；将长出的单菌落分别点于氨苄青霉素以及壮观霉素和链霉素(50μg/ml)平板，观察菌株生长情况。在氨苄青霉素抗性平板上不能生长，在壮观霉素和链霉素平板上生长的菌落即为pcbt003-目的基因-sgrna消除的菌株。
[0155]
挑取pcbt003-目标基因-sgrna质粒消除的菌落，接种于lb试管中，42℃培养24h，梯度稀释，涂布lb平板，过夜培养。次日挑取单菌落，划线于壮观霉素和链霉素抗性平板，观察菌落生长情况。在壮观霉素和链霉素平板上不能生长的菌落即为pcbt001质粒消除的菌株。
[0156]
实施例2：营养缺陷型菌株的构建方案
[0157]
通过crispr/cas9技术敲除thya基因，实现ecn菌株中thya基因的缺失。以构建ecn_δthya菌株为例，具体构建方案为，按照实施例1的构建方案，首先构建包含供体基因片段thya-ha和靶向thya位点的sgrna的重组质粒pcbt003-thya-ha-sgrna(thya-ha-sgrna的序列如seq id no:131所示)，然后将其与表达cas9蛋白的pcbt001质粒共同电转感受态ecn菌株，并去除多余的质粒后，获得营养缺陷型ecn_δthya菌株。
[0158]
thya-ha-sgrna的序列(seq id no:131)：
[0159]
[0160][0161]
大写无下划线部分为左同源臂，大写加下划线部分为右同源臂，大写加框部分为sgrna序列。
[0162]
实施例3：鞭毛基因的敲除方案
[0163]
为了延长菌株在肠道中的滞留时间，利用crispr/cas9基因编辑系统，敲除鞭毛系统的关键基因flic及黏附相关基因(纤维素合酶基因)bsca。以构建ecn_δthyaδbscaδflic为例，具体构建方案为，首先制备感受态的ecn_δthya菌株，然后分别构建包含供体片段以及靶向flic或bsca的sgrna的重组质粒pcbt003-flic-ha-sgrna/pcbt003-bsca-ha-sgrna(flic-ha-sgrna的序列seq id no:132所示，bsca-ha-sgrna的序列如seq id no:133所示)，与表达cas9蛋白的pcbt001质粒共同电转ecn菌株并去除多余的质粒后，获得营养缺陷型ecn_δthyaδbscaδflic菌株。
[0164]
flic-ha-sgrna的序列(seq id no:132)：
[0165]
[0166][0167][0168]
大写无下划线部分为左同源臂，大写加下划线部分为右同源臂，大写加框部分为
sgrna序列。
[0169]
bsca-ha-sgrna的序列(seq id no:133)：
[0170]
[0171][0172]
大写无下划线部分为左同源臂，大写加下划线部分为右同源臂，大写加框部分为sgrna序列。
[0173]
实施例4：降解苯丙氨酸的工程菌株的构建
[0174]
以ecn为底盘菌或者以实施例2或3构建的已敲除鞭毛基因和/或营养缺陷型的菌株为底盘菌，敲入能够将苯丙氨酸转化为无毒副作用的产物的相关基因，从而得到能够降解苯丙氨酸的工程菌株。
[0175]
构建过程中使用表达盒的序列如下所示：vanram抑制子(seq id no:103)，pfnrs-tyrb-gdh2(seq id no:104)，pfnrs-aro10-yahk(seq id no:105)，pfnrs-phedh-phep(seq id no:106)，pvan-tyrb-gdh2(seq id no:107)，pvan-aro10-yahk(seq id no:108)，pvan-phedh-phep(seq id no:109)，pbad-laad(seq id no:110)。
[0176]
目标基因表达盒在ecn中可选的插入位点选自：yics位点、malpt位点、maeb位点、nth/tppb位点、tkra位点、male位点、exo位点、rhtb/c位点、agai/rsml位点、arabd位点、yghx位点、ldha位点、araab位点、lacz位点和/或kefb位点中的一个或更多个。
[0177]
4.1降解苯丙氨酸的工程菌株cbt2001的构建
[0178]
对菌株e.coli nissle1917(ecn)基因组进行改造，包括如下步骤：
[0179]
4.1.1yghx位点敲入pfnrs-tyrb-gdh2表达盒
[0180]
(1)pcbt003-yghx-sgrna质粒的构建
[0181]
构建目的：将pcbt003质粒中的原靶位点x的序列“catcgccgcagcggtttcag”替换为新的含有靶位点x的n20序列“cgtatatcgaagatgtgacg”(yghx)，从而构建出含有“cgtatatcgaagatgtgacg”的pcbt003质粒(pcbt003-yghx-sgrna)。
[0182]
构建方法：
[0183]
1)设计引物yghx-sgrna-f(psti)：seq id no.25
[0184]5’‑
ctgcaggaattcaaaaaaagcaccgactcggtg-3’(加粗小写字体为psti酶切位点序列，其他序列为pcbt003质粒上的序列)
[0185]
2)设计引物yghx-sgrna-r(spei)：seq id no.26
[0186]5’‑
actagtcgtatatcgaagatgtgacggttttagagctagaaatagc aagtta-3’(加粗小写字体为spei酶切位点序列，加粗大写字体为yg hx位点的n20序列，其他序列为pcbt003质粒
上的序列)
[0187]
3)利用引物yghx-sgrna-f(seq id no.25)和yghx-sgrna-r(seq id no.26)从pcbt003质粒(seq id no.84)dna模板中pcr扩增含有靶位点x(yghx)的n20序列片段，将所得的片段使用限制性内切酶psti和spei酶切，纯化回收pcr产物(121bp)。使用psti酶和spei酶切pcbt003质粒，将胶回收的酶切片段(3123bp)与纯化回收的pcr产物连接，构建出含有靶位点x(yghx)序列的pcbt003质粒(pcbt003-yghx-sgrna)，然后转化至e.coli top10感受态细胞。用氨苄青霉素抗性平板(100μg/ml)筛选，挑取转化子摇菌培养，抽提质粒，利用引物pcbt003-seq-r(seq id no.27)进行测序。分别选出测序正确的sgrna质粒：pcbt003-yghx-sgrna。
[0188]
(2)电转质粒pcbt003-pfnrs-tyrb-gdh2-yghx-sgrna制备：
[0189]
使用限制性内切酶psti和xbai酶切前述得到的pcbt003-yghx-sgrna质粒，对酶切的大片段(质粒骨架)进行胶回收。利用扩增引物yghx-lh-f(seq id no.30)和yghx-lh-r1(seq id no.31)和yghx-rh-f1(seq id no.32)和yghx-rh-r(seq id no.33)从菌株e.coli nissle1917基因组模板中扩增yghx位点的上游同源臂片段和下游同源臂片段，纯化pcr产物。以puc-fnrs-tyrb-gdh2质粒(seq id no.86)(金斯瑞合成)为模板，以fnrs-tyrb-f1(seq id no.28)和gdh2-r1(seq id no.29)为引物，pcr扩增获得pfnrs-tyrb-gdh2片段，约5260bp；将胶回收的酶切片段(质粒骨架)、纯化回收的上下游同源臂pcr产物和pfnrs-tyrb-gdh2片段，使用multis一步克隆试剂盒进行连接，转化进top10感受态细胞中，用氨苄青霉素抗性平板(100μg/ml)筛选，挑取转化子进行菌落pcr验证及测序，选出测序正确的pcbt003-pfnrs-tyrb-gdh2-yghx-sgrna重组质粒。
[0190]
(3)电转感受态细胞制备方法：
[0191]
挑取ecn单菌落于5ml lb液体培养基，37℃220rpm过夜培养。次日，菌液按1:100接种量接入30ml lb液体培养基，振荡培养2-3h至od值为0.6-0.8，将菌液倒入预冷的离心管中，冰浴15-20min；6000rpm，4℃离心7min，弃上清，加入20ml10％预冷甘油，均匀悬浮菌体；离心，弃上清，重复三次；弃上清，加入300μl 10％预冷甘油，将菌体悬浮均匀，按每管100μl分装于离心管中。
[0192]
将pcbt001质粒(seq id no.85)电转化进大肠杆菌ecn化学感受态细胞中，在含盐酸壮观霉素(50μg/ml)的lb固体平板上进行筛选，获得ecn/pcbt001转化子。
[0193]
挑取ecn/pcbt001单菌落于含壮观霉素(50μg/ml)的lb液体培养基，30℃220rpm过夜培养。次日，菌液按1:100接种量(v/v)接入30ml lb液体培养基，在菌浓od600为0.2时，添加终浓度为1mm的iptg进行诱导，继续培养2-3h至od值为0.6-0.8，制备电转感受态细胞。
[0194]
(4)电转：
[0195]
将pcbt003-pfnrs-tyrb-gdh2-yghx-sgrna质粒电转入ecn/pcbt001感受态细胞中(电转化条件：2.5kv，200ω，25μf)，涂布于氨苄青霉素(50μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)lb平板上，培养1d。挑取在抗性平板上生长的单菌落，利用引物yghx-verify-f(seq id no.34)和yghx-verify-r(seq id no.35)通过菌落pcr的方法验证基因的整合情况，阳性片段约6662bp；
[0196]
(5)pcbt003-pfnrs-tyrb-gdh2-yghx-sgrna质粒消除：
[0197]
挑取已成功整合pfnrs-tyrb-gdh2表达盒的单菌落接种于添加壮观霉素(50μg/
ml)的lb液体培养基中，加入10mm的l-阿拉伯糖诱导20-24h，涂布壮观霉素lb平板；将长出的单菌落分别点于氨苄青霉素和壮观霉素平板，观察菌株生长情况。在氨苄青霉素抗性平板上不能生长，在壮观霉素抗性平板上生长的菌落即为pcbt003-pfnrs-tyrb-gdh2-yghx-sgrna消除的菌株，获得ecn_δyghx::pfnrs-tyrb-gdh2/pcbt001。
[0198]
4.1.2ldha位点敲入pfnrs-aro10-yahk表达盒
[0199]
(1)pcbt003-ldha-sgrna质粒的构建
[0200]
利用引物ldha-sgrna-f(seq id no.36)和ldha-sgrna-r(seq id no.37)从pcbt003质粒模板中pcr扩增含有靶位点x(ldha)的n20序列片段，使用限制性内切酶psti和spei酶切，纯化回收pcr产物。
[0201]
使用psti和spei酶切pcbt003质粒，将胶回收的酶切片段(约3123bp)与纯化回收的pcr产物连接、转化至e.coli top10感受态细胞。在氨苄青霉素抗性平板(100μg/ml)筛选，获取pcbt003-ldha-sgrna质粒。
[0202]
(2)电转质粒pcbt003-pfnrs-aro10-yahk-ldha-sgrna制备：
[0203]
使用限制性内切酶psti和xbai酶切pcbt003-ldha-sgrna质粒，对酶切的大片段(质粒骨架)进行胶回收。
[0204]
利用扩增引物ldha-lh-f(seq id no.40)和ldha-lh-r1(seq id no.41)和ldha-rh-f1(seq id no.42)和ldha-rh-r(seq id no.43)从ecn基因组模板中扩增ldha位点的上游同源臂片段和下游同源臂片段，分别约500bp。
[0205]
以puc-fnrs-aro10-yahk质粒(seq id no.87)(金斯瑞合成)为模板，以fnrs-aro10-f1(seq id no.38)和yahk-r1(seq id no.39)为引物，pcr扩增获得pfnrs-aro10-yahk片段，约4779bp。
[0206]
将胶回收的酶切片段(质粒骨架)、纯化回收的上下游同源臂pcr产物和pfnrs-aro10-yahk片段，使用multis一步克隆试剂盒进行连接，转化进top10感受态细胞中，用氨苄青霉素抗性平板(100μg/ml)筛选，获得pcbt003-pfnrs-tyrb-gdh2-ldha-sgrna重组质粒。
[0207]
(3)参考4.1.1(3)方法制备ecn_δyghx::pfnrs-tyrb-gdh2/pcbt001电转感受态细胞。
[0208]
(4)参考4.1.1(4)方法将pcbt003-pfnrs-aro10-yahk-ldha-sgrna质粒电转入ecn_δyghx::pfnrs-tyrb-gdh2/pcbt001感受态细胞，转化子利用ldha-verify-f(seq id no.44)和ldha-verify-r(seq id no.45)进行菌落pcr验证
[0209]
(5)参考4.1.1(5)方法将消除辅助质粒，获得ecn_δyghx::pfnrs-tyrb-gdh2_δldha::pfnrs-aro10-yahk/pcbt001。
[0210]
(6)pcbt001质粒的消除
[0211]
挑取pcbt003-pfnrs-tyrb-gdh2-kefb-sgrna质粒消除的菌落，接种于lb试管中，42℃培养24h，梯度稀释，涂布lb平板，过夜培养。次日挑取单菌落，划线于壮观霉素抗性平板，观察菌落生长情况。在壮观霉素平板上不能生长的菌落即为pcbt001质粒消除的菌株ecn_δyghx::pfnrs-tyrb-gdh2_δldha::pfnrs-aro10-yahk，命名为cbt2001。
[0212]
通过上述实施例，最后得到工程菌cbt2001，其为大肠杆菌nissle1917衍生菌，在基因组上分别整合单拷贝芳香族氨基酸转氨酶基因tyrb、谷氨酸脱氢酶基因gdh2、醛还原
酶基因yahk和苯丙酮酸脱羧酶基因aro10。
[0213]
工程菌cbt2001的基因型：nissle_δyghx::pfnrs-tyrb-gdh2_δldha::pfnrs-aro10-yahk。
[0214]
4.2降解苯丙氨酸的工程菌株cbt2002的构建
[0215]
4.2.1araab位点敲入pfnrs-tyrb-gdh2
[0216]
(1)pcbt003-araab-sgrna质粒的构建
[0217]
利用引物araab-sgrna-f(seq id no.46)和araab-sgrna-r(seq id no.47)从pcbt003质粒模板中pcr扩增含有靶位点x(araab)的n20序列片段，使用限制性内切酶psti和spei酶切，纯化回收pcr产物。
[0218]
使用psti和spei酶切pcbt003质粒，将胶回收的酶切片段(约3123bp)与纯化回收的pcr产物连接、转化至e.coli top10感受态细胞。在氨苄青霉素抗性平板(100μg/ml)筛选，获取pcbt003-araab-sgrna质粒。
[0219]
(2)电转质粒pcbt003-pfnrs-tyrb-gdh2-araab-sgrna制备：
[0220]
使用限制性内切酶psti和xbai酶切pcbt003-araab-sgrna质粒，对酶切的大片段(质粒骨架)进行胶回收。
[0221]
利用扩增引物araab-lh-f(seq id no.50)和araab-lh-r(seq id no.51)和araab-rh-f(seq id no.52)和araab-rh-r(seq id no.53)从ecn基因组模板中扩增araab位点的上游同源臂片段和下游同源臂片段，分别约500bp。
[0222]
以puc-fnrs-tyrb-gdh2质粒(seq id no.86)(金斯瑞合成)为模板，以fnrs-tyrb-f2(seq id no.48)和gdh2-r2(seq id no.49)为引物，pcr扩增获得pfnrs-tyrb-gdh2片段，约4779bp。将胶回收的酶切片段(质粒骨架)、纯化回收的上下游同源臂pcr产物和pfnrs-tyrb-gdh2片段，使用multis一步克隆试剂盒进行连接，转化进top10感受态细胞中，用氨苄青霉素抗性平板(100μg/ml)筛选，获得pcbt003-pfnrs-tyrb-gdh2-araab-sgrna重组质粒。
[0223]
(3)参考4.1.1(3)方法制备ecn_δyghx::pfnrs-tyrb-gdh2_δldha::pfnrs-aro10-yahk/pcbt001电转感受态细胞。
[0224]
(4)参考4.1.1(4)方法将pcbt003-pfnrs-tyrb-gdh2-araab-sgrna质粒电转入ecn_δyghx::pfnrs-tyrb-gdh2_δldha::pfnrs-aro10-yahk/pcbt001感受态细胞，转化子利用araab-verify-f(seq id no.54)和araab-verify-r(seq id no.55)进行菌落pcr验证
[0225]
(5)参考4.1.1(5)方法将消除辅助质粒，获得ecn_δyghx::pfnrs-tyrb-gdh2_δldha::pfnrs-aro10-yahk_δaraab::pfnrs-tyrb-gdh2。
[0226]
4.2.2lacz位点敲入pfnrs-aro10-yahk
[0227]
(1)pcbt003-lacz-sgrna质粒的构建
[0228]
利用引物lacz-sgrna-f(seq id no.56)和lacz-sgrna-r(seq id no.57)从pcbt003质粒模板中pcr扩增含有靶位点x(lacz)的n20序列片段，使用限制性内切酶psti和spei酶切，纯化回收pcr产物。使用psti和spei酶切pcbt003质粒，将胶回收的酶切片段(约3123bp)与纯化回收的pcr产物连接、转化至e.coli top10感受态细胞。在氨苄青霉素抗性平板(100μg/ml)筛选，获取pcbt003-lacz-sgrna质粒。
[0229]
(2)电转质粒pcbt003-pfnrs-aro10-yahk-lacz-sgrna制备：
[0230]
使用限制性内切酶psti和xbai酶切pcbt003-lacz-sgrna质粒，对酶切的大片段(质粒骨架)进行胶回收。
[0231]
利用扩增引物lacz-lh-f(seq id no.60)和lacz-lh-r(seq id no.61)和lacz-rh-f(seq id no.62)和lacz-rh-r(seq id no.63)从ecn基因组模板中扩增lacz位点的上游同源臂片段和下游同源臂片段，分别约500bp。
[0232]
以puc-fnrs-aro10-yahk质粒(seq id no.87)(金斯瑞合成)为模板，以fnrs-aro10-f2(seq id no.58)和yahk-r2(seq id no.59)为引物，pcr扩增获得pfnrs-aro10-yahk片段，约4819bp。将胶回收的酶切片段(质粒骨架)、纯化回收的上下游同源臂pcr产物和pfnrs-aro10-yahk片段，使用multis一步克隆试剂盒进行连接，转化进top10感受态细胞中，用氨苄青霉素抗性平板(100μg/ml)筛选，获得pcbt003-pfnrs-aro10-yahk-lacz-sgrna重组质粒。
[0233]
(3)参考4.1.1(3)方法制备ecn_δyghx::pfnrs-tyrb-gdh2_δldha::pfnrs-aro10-yahk_δaraab::pfnrs-tyrb-gdh2/pcbt001电转感受态细胞。
[0234]
(4)参考4.1.1(4)方法将pcbt003-pfnrs-tyrb-gdh2-araab-sgrna质粒电转入ecn_δyghx::pfnrs-tyrb-gdh2_δldha::pfnrs-aro10-yahk_δaraab::pfnrs-tyrb-gdh2感受态细胞，转化子利用lacz-verify-f(seq id no.64)和lacz-verify-r(seq id no.65)进行菌落pcr验证。
[0235]
(5)参考4.1.1(5)方法将消除辅助质粒，获得ecn_δyghx::pfnrs-tyrb-gdh2_δldha::pfnrs-aro10-yahk_δaraab::pfnrs-tyrb-gdh2_δlacz::pfnrs-aro10-yahk/pcbt001。
[0236]
(6)参考4.1.2(6)方法将消除辅助质粒pcbt001，获得ecn_δyghx::pfnrs-tyrb-gdh2_δldha::pfnrs-aro10-yahk_δaraab::pfnrs-tyrb-gdh2_δlacz::pfnrs-aro10-yahk，命名为cbt2002。
[0237]
通过上述实施例最后得到工程菌cbt2002，其为cbt2001衍生菌，通过在cbt2001基因组上再分别整合一个拷贝的芳香族氨基酸转氨酶基因、谷氨酸脱氢酶基因、醛还原酶基因和苯丙酮酸脱羧酶基因。
[0238]
工程菌cbt2002的基因型：
[0239]
ecn_δyghx::pfnrs-tyrb-gdh2_δldha::pfnrs-aro10-yahk_δaraab::pfnrs-tyrb-gdh2_δlacz::pfnrs-aro10-yahk
[0240]
4.3降解苯丙氨酸的工程菌株cbt2003的构建
[0241]
4.3.1kefb位点敲入pfnrs-phep
[0242]
(1)pcbt003-kefb-sgrna质粒的构建
[0243]
利用引物kefb-sgrna-f(seq id no.66)和kefb-sgrna-r(seq id no.67)从pcbt003质粒模板中pcr扩增含有靶位点x(kefb)的n20序列片段，使用限制性内切酶psti和spei酶切，纯化回收pcr产物。
[0244]
使用psti和spei酶切pcbt003质粒，将胶回收的酶切片段(约3123bp)与纯化回收的pcr产物连接、转化至e.coli top10感受态细胞。在氨苄青霉素抗性平板(100μg/ml)筛选，获取pcbt003-kefb-sgrna质粒。
[0245]
(2)电转质粒pcbt003-pfnrs-phep-kefb-sgrna制备：
[0246]
使用限制性内切酶psti和xbai酶切pcbt003-kefb-sgrna质粒，对酶切的大片段(质粒骨架)进行胶回收。利用扩增引物kefb-lh-f(seq id no.70)和kefb-lh-r(seq id no.71)和kefb-rh-f(seq id no.72)和kefb-rh-r(seq id no.73)从ecn基因组模板中扩增kefb位点的上游同源臂片段和下游同源臂片段，分别约500bp。
[0247]
以puc-fnrs-phep质粒(金斯瑞合成)为模板，以fnrs-phep-f(seq id no.68)和phep-r(seq id no.78)为引物，pcr扩增获得pfnrs-phep片段，约1406bp。将胶回收的酶切片段(质粒骨架)、纯化回收的上下游同源臂pcr产物和pfnrs-phep片段，使用multis一步克隆试剂盒进行连接，转化进top10感受态细胞中，用氨苄青霉素抗性平板(100μg/ml)筛选，获得pcbt003-pfnrs-phep-kefb-sgrna重组质粒。
[0248]
(3)参考4.1.1(3)方法制备ecn_δyghx::pfnrs-tyrb-gdh2_δldha::pfnrs-aro10-yahk_δaraab::pfnrs-tyrb-gdh2_δlacz::pfnrs-aro10-yahk/pcbt001电转感受态细胞。
[0249]
(4)参考4.1.1(4)方法将pcbt003-pfnrs-phep-kefb-sgrna质粒电转入ecn_δyghx::pfnrs-tyrb-gdh2_δldha::pfnrs-aro10-yahk_δaraab::pfnrs-tyrb-gdh2_δlacz::pfnrs-aro10-yahk/pcbt001感受态细胞，转化子利用kefb-verify-f(seq id no.74)和kefb-verify-r(seq id no.75)进行菌落pcr验证。
[0250]
(5)参考4.1.1(5)方法将消除辅助质粒pcbt003-pfnrs-phep-kefb-sgrna，获得ecn_δyghx::pfnrs-tyrb-gdh2_δldha::pfnrs-aro10-yahk_δaraab::pfnrs-tyrb-gdh2_δlacz::pfnrs-aro10-yahk_δkefb::pfnrs-phep/pcbt001。
[0251]
(6)参考4.1.2(6)方法将消除辅助质粒pcbt001，获得ecn_δyghx::pfnrs-tyrb-gdh2-tphep_δldha::pfnrs-aro10-yahk_δaraab::pfnrs-tyrb-gdh2_δlacz::pfnrs-aro10-yahk_δkefb::pfnrs-phep，命名为cbt2003。
[0252]
通过上述实施例最后得到的是工程菌cbt2003，其为cbt2002的衍生菌，在cbt2002的基因组进一步整合了单拷贝的苯丙氨酸转运蛋白基因，以强化菌株对苯丙氨酸的摄取。
[0253]
工程菌cbt2003的基因型：
[0254]
ecn_δyghx::pfnrs-tyrb-gdh2_δldha::pfnrs-aro10-yahk_δaraab::pfnrs-tyrb-gdh2-_δlacz::pfnrs-aro10-yahk_δkefb::pfnrs-phep
[0255]
4.4cbt-201菌株及衍生菌株的构建(启动子为pfnrs)
[0256]
该工程菌株在底盘细菌基因组不同选定位点处中导入2个拷贝的苯丙氨酸转氨酶tyrb、单拷贝的苯丙氨酸脱氢酶phedh(来自芽孢杆菌slbn-3，genbank:tqj42029.1)和单拷贝的l-氨基酸脱氨酶(laad)，从而将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸；导入2个拷贝的苯丙酮酸脱羧酶aro10，用于将上一步生成的苯丙酮酸转化为苯乙醛，醛还原酶yahk进一步将苯乙醛转化为苯乙醇，谷氨酸脱氢酶gdh用于与tyrb在氨基代谢上配合发挥作用；苯丙氨酸转运蛋白phep用于将菌体外的苯丙氨酸转入工程菌内。在具体构建过程中，部分基因前后串联，利用同一个启动子调控转录，从而实现对基因表达量的控制。表达盒中选用的启动子为pfnrs。
[0257]
具体构建过程和菌株结构如下：
[0258]
4.4.1在yghx和araab位点敲入pfnrs-tyrb-gdh2表达盒
[0259]
pfnrs-tyrb-gdh2表达盒(seq id no：104)由金斯瑞(genescript)合成，靶向yghx和araab的sgrna序列见表2。按照实施例1和4的方法，分别将sgrna序列和表达盒依次接入
pcbt003载体，从而获得重组质粒pcbt003-pfnrs-tyrb-gdh2-yghx-sgrna和pcbt003-pfnrs-tyrb-gdh2-araab-sgrna；随后将上述重组质粒分别与表达cas9蛋白的pcbt001质粒共同电转底盘细菌ecnδthya并去除多余质粒后，得到重组菌ecnδthyaδyghx::pfnrs-tyrb-gdh2δaraab::pfnrs-tyrb-gdh2。
[0260]
4.4.2在ldha和lacz位点敲入pfnrs-aro10-yahk
[0261]
pfnrs-aro10-yahk表达盒(seq id no：105)由金斯瑞(genescript)合成，靶向ldha和lacz的sgrna序列见表2。按照实施例1和4的方法，分别将sgrna序列和表达盒pfnrs-aro10-yahk依次接入pcbt003载体，从而获得重组质粒pcbt003-pfnrs-aro10-yahk-ldha-sgrna和pcbt003-pfnrs-aro10-yahk-lacz-sgrna；随后将上述重组质粒分别与表达cas9蛋白的pcbt001质粒共同电转入上一步获得的工程菌并去除多余质粒后，得到重组菌ecnδthyaδyghx::pfnrs-tyrb-gdh2δldha::pfnrs-aro10-yahkδaraab::pfnrs-tyrb-gdh2δlacz::pfnrs-aro10-yahk。
[0262]
4.4.3在kefb位点敲入pfnrs_phedh_phep
[0263]
pfnrs_phedh_phep表达盒(seq id no：106)由金斯瑞(genescript)合成，其中经密码子优化后的phedh基因序列如seq id no:17所示，靶向kefb的sgrna序列见表2。按照实施例1和4的方法，将sgrna序列和表达盒依次接入pcbt003载体，从而获得重组质粒pcbt003-pfnrs_phedh_phep-kefb-sgrna；随后将上述重组质粒与表达cas9蛋白的pcbt001质粒共同电转入上一步获得的工程菌并去除多余质粒后，得到重组菌ecnδthyaδyghx::pfnrs-tyrb-gdh2δldha::pfnrs-aro10-yahkδaraab::pfnrs-tyrb-gdh2δlacz::pfnrs-aro10-yahkδkefb::pfnrs-phedh-phep。
[0264]
4.4.4在rhtb/c位点敲入pbad_laad
[0265]
pbad_laad表达盒(seq id no：110)由金斯瑞(genescript)合成，靶向rhtb/c的sgrna序列见表2。按照实施例1和4的方法，将sgrna序列和表达盒依次接入pcbt003载体，从而获得重组质粒pcbt003-pbad_laad-rhtb/c-sgrna；随后将上述重组质粒与表达cas9蛋白的pcbt001质粒共同电转入上一步获得的工程菌并去除多余质粒后，得到重组菌ecnδthyaδyghx::pfnrs-tyrb-gdh2δldha::pfnrs-aro10-yahkδaraab::pfnrs-tyrb-gdh2δlacz::pfnrs-aro10-yahkδkefb::pfnrs-phedh-phepδrhtb/c::pbad_laad，即cbt-201菌株。
[0266]
cbt-201-aa的构建
[0267]
在cbt-201菌株的基础上，进一步添加了两个拷贝的pfnrs-aro10-yahk表达盒，得到了菌株cbt-201-aa，基因型如下：
[0268]
ecnδthyaδyghx::pfnrs-tyrb-gdh2δldha::pfnrs-aro10-yahkδaraab::pfnrs-tyrb-gdh2δlacz::pfnrs-aro10-yahkδkefb::pfnrs-phedh-phepδagai/rsml::pfnrs-aro10-yahkδyjcs::pfnrs-aro10-yahkδrhtb/c::pbad_laad
[0269]
cbt-203菌株的构建
[0270]
按照cbt-201菌株的构建方法，在底盘细菌ecnδthyaδbscaδflic的基因组上，转入与cbt-201菌株相同拷贝数的相同的酶，得到cbt-203菌株，基因型如下：
[0271]
ecnδthyaδbscaδflicδyghx::pfnrs-tyrb-gdh2δldha::pfnrs-aro10-yahkδaraab::pfnrs-tyrb-gdh2δlacz::pfnrs-aro10-yahkδkefb::pfnrs-phedh-phepδ
lacz::pfnrs-aro10-yahkδlacz::pfnrs-aro10-yahkδrhtb/c::pbad_laad
[0272]
4.5cbt-202、cbt-209、cbt-210菌株的构建：
[0273]
参照cbt-201菌株的构建过程，构建工程菌株cbt-202、cbt-209、cbt-210，上述菌株的基因型如下：
[0274]
cbt-202的基因型：ecnδthyaδldha::pfnrs-phedh-phepδyghx::pfnrs-aro10-yahkδmaeb::pfnrs-phedh-phepδlacz::pfnrs-aro10-yahkδrhtb/c::pbad_laad
[0275]
cbt-209的基因型：ecnδthyaδldha::pfnrs-phedh-phepδyghx::pfnrs-aro10-yahk
[0276]
cbt-210的基因型：ecnδthyaδyghx::pfnrs-tyrb-gdh2δldha::pfnrs-aro10-yahk
△
kefb::pfnrs-phep
[0277]
4.6cbt-206菌株的构建(启动子为pvan)：
[0278]
cbt-206菌株的所有表达盒中选用的启动子为pvan。具体构建过程和菌株结构如下：
[0279]
4.6.1在yghx和araab位点敲入pvan-tyrb-gdh2表达盒
[0280]
pvan-tyrb-gdh2表达盒(seq id no：107)由金斯瑞(genescript)合成，靶向yghx和araab的sgrna序列见表2。按照实施例1和4的方法，分别将sgrna序列和表达盒(pvan-tyrb-gdh2表达盒和如seq id no：103所示的vanram表达盒)依次接入pcbt003载体，从而获得重组质粒pcbt003-pvan-tyrb-gdh2-yghx-sgrna和pcbt003-pvan-tyrb-gdh2-araab-sgrna；随后将上述重组质粒分别与表达cas9蛋白的pcbt001质粒共同电转底盘细菌ecnδthyaδbscaδflic并去除多余质粒后，得到重组菌ecnδthyaδbscaδflicδyghx::pvan-tyrb-gdh2δaraab::pvan-tyrb-gdh2。
[0281]
4.6.2在ldha、agai/rsml和yjcs位点敲入pvan-aro10-yahk pfnrs-aro10-yahk表达盒(seq id no：108)由金斯瑞(genescript)合成，靶向ldha、agai/rsml和yjcs的sgrna序列见表2。按照实施例1和4的方法，分别将sgrna序列和表达盒(pvan-aro10-yahk表达盒和如seq id no：103所示的vanram表达盒)依次接入pcbt003载体，从而获得重组质粒pcbt003-pvan-aro10-yahk-ldha-sgrna、pcbt003-pvan-aro10-yahk-agai/rsml-sgrna和pcbt003-pvan-aro10-yahk-yjcs-sgrna；随后将上述重组质粒分别与表达cas9蛋白的pcbt001质粒共同电转入上一步获得的工程菌并去除多余质粒后，得到重组菌ecnδthyaδbscaδflicδyghx::pvan-tyrb-gdh2δyjcs::pvan-aro10-yahkδaraab::pvan-tyrb-gdh2δldha::pvan-aro10-yahkδagai/rsml::pvan-aro10-yahk。
[0282]
4.6.3在nth/tppb位点敲入pvan_phedh_phep
[0283]
pvan_phedh_phep表达盒(seq id no：109)由金斯瑞(genescript)合成，靶向nth/tppb的sgrna序列见表2。按照实施例1和4的方法，将sgrna序列和表达盒(pvan_phedh_phep表达盒和如seq id no：103所示的vanram表达盒)依次接入pcbt003载体，从而获得重组质粒pcbt003-pvan_phedh_phep-nth/tppb-sgrna；随后将上述重组质粒与表达cas9蛋白的pcbt001质粒共同电转入上一步获得的工程菌并去除多余质粒后，得到重组菌ecnδthyaδbscaδflicδyghx::pvan-tyrb-gdh2δyjcs::pvan-aro10-yahkδaraab::pvan-tyrb-gdh2δldha::pvan-aro10-yahkδnth/tppb::pvan-phedh-phepδagai/rsml::pvan-aro10-yahk。
[0284]
4.6.4在rhtb/c位点敲入pbad_laad
[0285]
pbad_laad表达盒(seq id no：110)由金斯瑞(genescript)合成，靶向rhtb/c的sgrna序列见表2。按照实施例1的方法，将sgrna序列和表达盒(pbad_laad表达盒和如seq id no：103所示的vanram表达盒)依次接入pcbt003载体，从而获得重组质粒pcbt003-pbad_laad-rhtb/c-sgrna；随后将上述重组质粒与表达cas9蛋白的pcbt001质粒共同电转入上一步获得的工程菌并去除多余质粒后，得到重组菌ecnδthyaδbscaδflicδyghx::pvan-tyrb-gdh2δyjcs::pvan-aro10-yahkδaraab::pvan-tyrb-gdh2δldha::pvan-aro10-yahkδnth/tppb::pvan-phedh-phepδagai/rsml::pvan-aro10-yahkδrhtb/c::pbad_laad，即cbt-206菌株。
[0286]
4.7cbt-205、cbt-207、cbt-208菌株的构建：
[0287]
参照cbt-206菌株的构建过程，cbt-205、cbt-207、cbt-208菌株的基因型如下：
[0288]
cbt-205菌株的基因型：ecnδthyaδyghx::pvan-tyrb-gdh2δyjcs::pvan-aro10-yahkδaraab::pvan-tyrb-gdh2δldha::pvan-aro10-yahkδnth/tppb::pvan-phedh-phepδagai/rsml::pvan-aro10-yahkδrhtb/c::pbad_laad
[0289]
cbt-207菌株的基因型：ecnδthyaδyghx::pvan-tyrb-gdh2δyjcs::pvan-aro10-yahkδaraab::pvan-tyrb-gdh2δldha::pvan-aro10-yahkδnth/tppb::pvan-phedh-phepδagai/rsml::pvan-aro10-yahkδtkra::pvan-phedh-phepδrhtb/c::pbad_laad
[0290]
cbt-208菌株的基因型：ecnδthyaδbscaδflicδyghx::pvan-tyrb-gdh2δyjcs::pvan-aro10-yahkδaraab::pvan-tyrb-gdh2δldha::pvan-aro10-yahkδnth/tppb::pvan-phedh-phepδagai/rsml::pvan-aro10-yahkδtkra::pvan-phedh-phepδrhtb/c::pbad_laad
[0291]
4.8cbt-212、cbt-213菌株的构建(启动子为pvan和pfnrs)
[0292]
参考实施例4.4和4.6的构建方法，构建了启动子为pvan和pfnrs的菌株cbt-212、cbt-213，其基因型信息如下：
[0293]
cbt-212菌株的基因型：ecnδthyaδyghx::pvan-tyrb-gdh2δyjcs::pvan-aro10-yahkδaraab::pfnrs-tyrb-gdh2δlacz::pfnrs-aro10-yahkδmaeb::pfnrs-phedh-phepδagai/rsml::pfnrs-aro10-yahkδrhtb/c::pbad_laad
[0294]
cbt-213菌株的基因型：ecnδthyaδyghx::pvan-tyrb-gdh2δyjcs::pvan-aro10-yahkδaraab::pvan-tyrb-gdh2δldha::pvan-aro10-yahkδmaeb::pfnrs-phedh-phepδagai/rsml::pfnrs-aro10-yahkδkefb::pfnrs-phedh-phepδrhtb/c::pbad_laad
[0295]
实施例5：工程菌体外降解苯丙氨酸的能力检测方法
[0296]
5.1苯丙氨酸和苯乙醇的hplc检测方法
[0297]
色谱柱athena c18液相色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)；柱温35℃；以0.1％磷酸水(v/v)和甲醇为流动相，进行梯度洗脱；采用紫外检测器，检测波长254nm，进样量10μl。
[0298]
5.2体外活性检测方法
[0299]
分别接甘油菌ecn以及各工程菌于5ml lb培养基中，37℃过夜培养。次日，以1％(v/v)的接种量分别转接菌液于200ml lb培养基中，37℃，220rpm培养5.5h；测定od
600
，4000g离心8min，收集菌体，用pbs缓冲液(含4mm苯丙氨酸)重悬菌体，将菌浓od
600
调至2或
0.5；分别取10ml菌悬液于14ml摇菌管中，定位t＝0h，放于37℃，220rpm培养3h，取样1ml。12000rpm，离心10min，收集上清样品进行hplc检测。
[0300]
实施例6转入了苯丙氨酸降解通路的工程菌能够有效降解苯丙氨酸
[0301]
本实施例使用实施例5中的方法测试了cbt2001/cbt2002和cbt2003在体外降解苯丙氨酸的能力。其中cbt2001是益生菌大肠杆菌nissle1917基因组上整合单拷贝的本公开中苯丙氨酸代谢通路基因的工程菌(包括单拷贝的芳香族氨基酸转氨酶基因tyrb、谷氨酸脱氢酶基因gdh2、醛还原酶基因yahk和苯丙酮酸脱羧酶基因aro10)，cbt2002中则整合了双拷贝的cbt2001中苯丙氨酸代谢通路基因，cbt2003则为了强化菌株对环境中苯丙氨酸的摄取，在cbt2002中进一步整合了单拷贝的苯丙氨酸转运蛋白基因。
[0302]
在有氧催化条件下，cbt2001、cbt2002和cbt2003工程菌株均能够降解苯丙氨酸生成苯乙醇，各个菌株降解苯丙氨酸的体外检测结果见表3和图3。
[0303]
表3菌株代谢苯丙氨酸产生苯乙醇的最大生成速率
[0304]
菌株苯乙醇最大生成速率(μmol/h/109个细胞)cbt20013.27
±
0.07cbt20024.41
±
0.15cbt20036.29
±
0.09
[0305]
在厌氧催化条件下，工程菌株降解苯丙氨酸生成苯乙醇，各个菌株降解苯丙氨酸的体外检测结果见表4和图4。
[0306]
表4菌株代谢苯丙氨酸产生苯乙醇的最大生成速率
[0307]
菌株苯乙醇最大生成速率(μmol/h/109个细胞)cbt20011.88
±
0.06cbt20022.43
±
0.04cbt20033.76
±
0.07
[0308]
从图3和图4可知，在有氧催化条件和厌氧催化条件下，原始菌株ecn均不能降解苯丙氨酸生成苯乙醇；而工程菌株cbt2001，cbt2002和cbt2003均有苯乙醇生成，表明本公开的工程菌能按照工程菌代谢通路的设计，降解苯丙氨酸并生成苯乙醇。并且从各菌株代谢能力的对比看，整合两拷贝相关代谢通路基因的cbt2002的代谢能力强于单拷贝的cbt2001，而能促进苯丙氨酸摄取的苯丙氨酸转运蛋白的加入使得cbt2003具有了更强的苯丙氨酸代谢能力。
[0309]
实施例7苯丙氨酸代谢工程菌的优化
[0310]
7.1苯丙氨酸脱氢酶具有更好的代谢活性
[0311]
本实施例构建了利用苯丙氨酸脱氢酶替代芳香族氨基酸转氨酶基因tyrb的工程菌cbt-209，其中，苯丙氨酸脱氢酶是唯一直接转化苯丙氨酸的代谢酶。由于不再发生tyrb的转氨作用，因此也无需加入用于偶联苯丙氨酸的转氨反应与苯乙醛的还原反应谷氨酸脱氢酶。具体而言，cbt-209菌株包含了单拷贝的苯丙氨酸脱氢酶(phedh)、苯丙酮酸脱羧酶(aro10)、醛还原酶yahk以及苯丙氨酸转运蛋白(phep)。
[0312]
作为比较，本实施例还构建了cbt-210工程菌株，其包含了单拷贝的芳香族氨基酸转氨酶(tyrb)、苯丙酮酸脱羧酶(aro10)、谷氨酸脱氢酶(gdh2)、醛还原酶yahk以及苯丙氨酸转运蛋白(phep)，其中苯丙氨酸转氨酶(tyrb)是唯一直接转化苯丙氨酸的酶。通过使用
实施例5中的方法比较其体外代谢能力，结果如图5所示(比较cbt-209和cbt-210)，申请人意外的发现，cbt-209菌株不但表现出了有效的苯丙氨酸降解能力，其效率甚至优于通过芳香族氨基酸转氨酶降解苯丙氨酸的cbt-210菌株。这个发现进一步丰富了工程菌在第一步苯丙氨酸代谢中酶的选择。后续发明人考虑到工程菌用于体内治疗时面临环境和条件的复杂性，构建了同时包含苯丙氨酸转氨酶(tyrb)和苯丙氨酸脱氢酶(phedh)的工程菌(如实施例4的4.4至4.8构建的多个工程菌)，以便充分利用苯丙氨酸代谢通路中不同代谢酶的优势，提高工程菌株的苯丙氨酸降解效果。
[0313]
7.2l-氨基酸脱氨酶(laad)的加入进一步提高苯丙氨酸代谢效果
[0314]
除了苯丙氨酸转氨酶(tyrb)和苯丙氨酸脱氢酶(phedh)的工程菌，为了进一步提高苯丙氨酸代谢效果，发明人进一步在工程菌的基因组中整合了单拷贝的l-氨基酸脱氨酶(laad)，并使用实施例5中的方法进行检测。结果如图6至图9所示，cbt-201、cbt-202、cbt-205、cbt-206、cbt-207和cbt-208菌株在不用阿拉伯糖(ara)诱导laad表达的情况下，已经能够较为高效的降解苯丙氨酸，这表明利用苯丙氨酸脱氢酶和/或苯丙氨酸转氨酶能够实现较好的代谢效果，然而通过阿拉伯糖的诱导表达苯丙氨酸脱氨酶laad后，菌株展现了更强的苯丙氨酸代谢能力。
[0315]
7.3敲除鞭毛相关基因不会影响工程菌对苯丙氨酸的代谢能力
[0316]
鞭毛与大肠杆菌的运动相关，已有研究表明通过敲除大肠杆菌的鞭毛合成/结构相关基因，会使得大肠杆菌的鞭毛结构出现缺陷，进而影响其运动能力，并提高大肠杆菌在体内的停留时间(zachary j.s.mays,todd c.chappell,and nikhil u.nair acs synthetic biology 2020 9(2),356-367.doi:10.1021/acssynbio.9b00356)。因此敲除工程菌基因组中鞭毛相关基因预期将是一种延长苯丙氨酸代谢工程菌在患者肠道的滞留时间，从而增强苯丙氨酸降解持续性的有效手段。于是本实施例使用实施例5中的方法测试了在体外环境下鞭毛相关基因的敲除是否对工程菌降解苯丙氨酸的能力产生不利影响。结果如图8和图9所示，cbt-205菌株和cbt-207菌株均是鞭毛功能正常的工程菌，而cbt-206菌株和cbt-208菌株均敲除了鞭毛相关基因bsca和flic，从结果可以看出(分别比较图8中的cbt-205和cbt-206，以及图9中的cbt-207和cbt-208)，鞭毛相关基因的敲除并不会影响菌株的功能和活性。
[0317]
7.4pvan启动子相比于pfnrs启动子能赋予工程菌更强的代谢活性
[0318]
本实施例使用实施例5中的方法测试了pvan启动子相比于pfnrs启动子对工程菌代谢能力的影响。cbt-201和cbt-211转入的酶和拷贝数量均相同，区别仅在于cbt-201的所有表达盒/拷贝均使用了pfnrs启动子，而cbt-211的所有表达盒/拷贝均使用了pvan启动子，结果如图10所示(即最上面的两条曲线)，cbt-211的活性要高于cbt-201。此外从图11中也可以看出，cbt-205和cbt-212同样转入相同的酶和表达盒拷贝数，其中cbt-205使用了6个pvan启动子，cbt-212使用了2个pvan启动子和4个pfnrs启动子，结果全部使用pvan启动子的cbt-205的活性高于同时使用pvan和pfnrs启动子的cbt-212(比较cbt-205和cbt-212)；同样的现象也发生在cbt-207和cbt-213菌株中(同样参见图11，比较cbt-207和cbt-213)。上述结果显示，pfnrs启动子已经表现出令人满意的活性，而pvan启动子相比于pfnrs启动子能赋予工程菌更强的体外代谢活性。
[0319]
7.5增加特定表达盒的拷贝数可以改善菌株的代谢活性
[0320]
本实施例使用实施例5中的方法测试了不同表达盒的拷贝数对工程菌代谢能力的影响。cbt-205和cbt-207均使用了更优的pvan启动子，cbt-207在cbt-205的基础上增加了一个拷贝的phedh表达盒，从图10可以看出(比较cbt-207和cbt-205)，cbt-207较cbt-205的代谢效率具有大幅提升。
[0321]
对比例1：构建苯丙氨酸代谢工程菌synb1934
[0322]
synlogic公司正在开发中的同样以ecn为底盘菌所构建的苯丙氨酸代谢工程菌synb1934目前正处于临床iii期研究阶段，根据此前报道的数据，sybn1934在动物和人体中均获得了良好的代谢活性。本对比例即根据synlogic公布的方法(例如，isabella,v.m.,b.n.ha,m.j.castillo,d.j.lubkowicz,s.e.rowe,y.a.millet,c.l.anderson,n.li,a.b.fisher,k.a.west,p.j.reeder,m.m.momin,c.g.bergeron,s.e.guilmain,p.f.miller,c.b.kurtz and d.falb(2018)."development of a synthetic live bacterial therapeutic for the human metabolic disease phenylketonuria."nat biotechnol 36(9):857-864.和adolfsen,k.j.,i.callihan,c.e.monahan,p.j.greisen,j.spoonamore,m.momin,l.e.fitch,m.j.castillo,l.weng,l.renaud,c.j.weile,j.h.konieczka,t.mirabella,a.abin-fuentes,a.g.lawrence and v.m.isabella(2021)."improvement of a synthetic live bacterial therapeutic for phenylketonuria with biosensor-enabled enzyme engineering."nat commun 12(1):6215.)，构建获得synb1934，作为本公开的活性参照，以比较本公开工程菌与synb1934的代谢活性。synb1934的基因型信息如下：
[0323]
ecnδrhtbc::ptac-phepδaradc::para-laadδ05580::ptac-stla1934δmalek::ptac-stla1934δagai::ptac-stla1934δyics/nepi::ptac-stlaδdapa
[0324]
实施例8：ecn和工程菌株的体内活性实验
[0325]
苯丙酮尿症小鼠pah ko(简称pku小鼠)由江苏集萃药康生物科技股份有限公司提供。新生苯丙酮尿症小鼠，用无苯丙氨酸(phe-free)饲料喂养，含苯丙氨酸(0.2g/l)的饮用水作为苯丙氨酸补给。8周龄以上的小鼠可用于检测工程菌降解苯丙氨酸的能力。动物实验开始前2小时(t＝-2h)，停止含苯丙氨酸饮用水补给，更换为普通饮用水，采血清检测血液中苯丙氨酸浓度。在实验开始时(t＝0)，小鼠皮下注射0.05mg/g(bw)苯丙氨酸溶液(5mg/ml)，在皮下注射苯丙氨酸后1、2及3小时灌胃200μl(5
×
10
10
cfu/只小鼠)益生菌ecn或工程菌(工程菌包括本公开的工程菌cbt-201、cbt-201-aa及cbt-205以及对比例1中构建的synb1934作为活性参照)，每组5只小鼠，在注射苯丙氨酸第4小时后，采血清检测血液中苯丙氨酸的浓度。
[0326]
小鼠血液中苯丙氨酸浓度的变化如图12所示，灌胃所有选定工程菌的小鼠血液中苯丙氨酸浓度增长值均明显低于灌胃ecn的小鼠，说明工程菌能够有效的控制血清苯丙氨酸浓度。相比灌胃ecn的小鼠，灌胃cbt-201工程菌的小鼠血液中苯丙氨酸降低幅度高达55％，其苯丙氨酸降解能力比作为活性参照的synb1934工程菌还要高出约50％(synb1934工程菌能够达到37％的苯丙氨酸浓度降低)。此外，cbt-201-aa和cbt-205的苯丙氨酸浓度降低幅度分别达到了44％和53.1％，也均显著高于synb1934工程菌，由此可见，本公开构建的工程菌在体内展现了极强的苯丙氨酸代谢活性。此外，cbt-201-aa与cbt-201相比，增加了两个拷贝的pfnrs-aro10-yahk表达盒，但是苯丙氨酸浓度的降低幅度反而略有下降，这
也表明了转入工程菌的苯丙氨酸代谢通路中相关酶的拷贝数/表达量并非越多越好。
[0327]
综上所述，本公开所构建的工程菌在体外和体内均有效降解了苯丙氨酸，能够用于治疗苯丙酮尿症。本公开构建的工程菌能够有效地降解苯丙氨酸和/或苯丙酮酸，实验证明，该工程菌有效降解了pku小鼠的体内苯丙氨酸和苯丙氨酸代谢物，显示出良好的应用前景。
[0328]
以上所述仅为本公开的实施例，并非因此限制本公开的保护范围；凡是利用本公开说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本公开的保护范围内。

技术特征：
amino-acid:2-oxoglutarate transaminase)，优选地，所述芳香族氨基酸转氨酶具有如seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列，或者编码所述芳香族氨基酸转氨酶的基因具有如seq id no:15或seq id no:90所示的核苷酸序列；所述编码l-氨基酸脱氨酶的基因选自大肠杆菌bl21(de3)、酿酒酵母s288c、或奇异变形杆菌hi4320(proteus mirabilis hi4320)的laad(l-amino acid deaminase)，优选地，所述l-氨基酸脱氨酶具有如seq id no:89所示的氨基酸序列，或者编码所述l-氨基酸脱氨酶的基因具有如seq id no:91所示的核苷酸序列；所述编码苯丙酮酸脱羧酶的基因是酿酒酵母s288c的aro10(phenylpyruvate decarboxylase)，优选地，所述苯丙酮酸脱羧酶具有如seq id no:7所示的氨基酸序列，或者编码所述苯丙酮酸脱羧酶的基因具有如seq id no:18所示的核苷酸序列；所述编码α-酮酸脱羧酶的基因选自酿酒酵母s288c的或奇异变形杆菌jn458(proteus mirabilis jn458)的kdc(alpha-keto-acid decarboxylase)，优选地，所述α-酮酸脱羧酶具有如seq id no:8所示的序列，或者编码所述α-酮酸脱羧酶的基因具有如seq id no:95所示的核苷酸序列；所述编码醛还原酶的基因选自大肠杆菌str.k-12substr.mg1655的yahk(nadph-dependent aldehyde reductase)或短乳杆菌(lactobacillus brevis)的adh(alcohol dehydrogenase)，优选地，所述醛还原酶具有如seq id no:9或seq id no:10所示的氨基酸序列，或者编码所述醛还原酶的基因具有如seq id no:19或seq id no:96所示的核苷酸序列；所述编码苯丙氨酸转运蛋白的基因是大肠杆菌的phep(phenylalanine:h(+)symporter)，优选地，所述苯丙氨酸转运蛋白具有如seq id no:13所示的氨基酸序列，或者编码所述苯丙氨酸转运蛋白的基因具有如seq id no:21所示的核苷酸序列；和/或所述编码谷氨酸脱氢酶的基因选自酿酒酵母s288c的或艰难梭菌(clostridioides difficile)的gdh2(glutamate dehydrogenase(nad+))，优选地，所述谷氨酸脱氢酶具有如seq id no:11或seq id no:12所示的氨基酸序列，或者编码所述谷氨酸脱氢酶的基因具有如seq id no:20或seq id no:97所示的核苷酸序列。7.根据权利要求3至6中任一项所述的工程微生物，其中所述编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因、所述编码能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶的基因、所述编码能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶的基因、所述编码能够将苯丙氨酸转运至所述工程微生物体内的蛋白的基因、和/或所述编码谷氨酸脱氢酶的基因位于一个或多个表达盒中；优选地，所述表达盒存在于质粒上或者稳定整合在所述工程微生物的一个、两个、或多个相同或者不同的基因组位点中。8.根据权利要求7所述的工程微生物，其中所述工程微生物包含第一表达盒、第二表达盒和可选的第三表达盒，其中第一表达盒包含第一启动子、以及与其可操作连接的所述编码芳香族氨基酸转氨酶的基因和所述编码谷氨酸脱氢酶的基因；第二表达盒包含第二启动子、以及与其可操作连接的所述编码苯丙酮酸脱羧酶的基因和编码醛还原酶的基因；第三表达盒包含可操作地连接至第三启动子的所述编码苯丙氨酸转运蛋白的基因；其中所述第一、第二或第三启动子是相同的或者不同的；或者所述工程微生物包含第四表达盒、第二表达盒、可选的第一表达盒和可选的第五表达
盒，其中第四表达盒包含第四启动子、以及与其可操作连接的所述编码苯丙氨酸脱氢酶的基因和编码苯丙氨酸转运蛋白的基因；第二表达盒包含第二启动子、以及与其可操作连接的所述编码苯丙酮酸脱羧酶的基因和编码醛还原酶的基因；第一表达盒包含第一启动子、以及与其可操作连接的所述编码芳香族氨基酸转氨酶的基因和所述编码谷氨酸脱氢酶的基因；第五表达盒包含第五启动子、与其可操作连接的所述编码l-氨基酸脱氨酶的基因；其中所述第四、第二、第一或第五启动子是相同的或者不同的；优选地，所述启动子为诱导型或组成型启动子，更优选地，所述第一启动子、第二启动子、第三启动子、第四启动子的全部或者部分选自pfnrs启动子(例如，核苷酸序列如seq id no.22所示)和/或pvan启动子(例如，核苷酸序列如seq id no:101所示)中的至少一个，所述第五启动子pbad启动子(例如，核苷酸序列如seq id no:102所示)；进一步优选地，所述第一表达盒以单拷贝或双拷贝的形式存在，优选整合在yghx位点和/或araab位点；所述第二表达盒以单拷贝、双拷贝、三拷贝或四拷贝的形式存在，优选整合在ldha位点、lacz位点、yghx位点、yjcs位点和/或agai/rsml位点；所述第三表达盒以单拷贝的形式存在，优选整合在kefb位点；所述第四表达盒以单拷贝或双拷贝的形式存在，优选整合在kefb位点、ldha位点、nth/tppb位点、maeb位点和/或tkra位点；和/或所述第五表达盒以单拷贝的形式存在，优选整合在rhtb/c位点。9.如前述权利要求中任一项所述的工程微生物，所述工程微生物包含：1)单拷贝的第四表达盒，所述第四表达盒整合在kefb位点；双拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒分别整合在ldha和lacz位点；双拷贝的第一表达盒，所述第一表达盒分别整合在yghx和araab位点；以及单拷贝的第五表达盒，所述第五表达盒整合在rhtb/c位点；其中，所述第四、第二和第一表达盒中使用的启动子为pfnrs启动子，第五表达盒中使用的启动子为pbad启动子；2)单拷贝的第四表达盒，所述第四表达盒整合在nth/tppb位点；三拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒分别整合在yjcs、ldha和agai/rsml位点；双拷贝的第一表达盒，所述第一表达盒分别整合在yghx和araab位点；以及单拷贝的第五表达盒，所述第五表达盒整合在rhtb/c位点；其中，所述第四、第二和第一表达盒中使用的启动子为pvan启动子，第五表达盒中使用的启动子为pbad启动子；3)双拷贝的第四表达盒，所述第四表达盒分别整合在nth/tppb和tkra位点；三拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒分别整合在yjcs、ldha和agai/rsml位点；双拷贝的第一表达盒，所述第一表达盒分别整合在yghx和araab位点；以及单拷贝的第五表达盒，所述第五表达盒整合在rhtb/c位点；其中，所述第四、第二和第一表达盒中使用的启动子为pvan启动子，第五表达盒中使用的启动子为pbad启动子；4)单拷贝的第四表达盒，所述第四表达盒整合在maeb位点；三拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒分别整合在yjcs、lacz和agai/rsml位点；双拷贝的第一表达盒，所述第一表达盒分别整合在yghx和araab位点；以及单拷贝的第五表达盒，所述第五表达盒整合在rhtb/c位点；其中，所述单拷贝的第四表达盒使用pfnrs启动子，三拷贝的第二表达盒分别使用pfnrs启动子、pfnrs启动子和pvan启动子，双拷贝的第一表达盒分别使用pfnrs启动子和
pvan启动子，第五表达盒中使用的启动子为pbad启动子；5)双拷贝的第四表达盒，所述第四表达盒整合在maeb和kefb位点；三拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒分别整合在yjcs、ldha和agai/rsml位点；双拷贝的第一表达盒，所述第一表达盒分别整合在yghx和araab位点；以及单拷贝的第五表达盒，所述第五表达盒整合在rhtb/c位点；其中，所述双拷贝的第四表达盒使用pfnrs启动子，三拷贝的第二表达盒分别使用pvan启动子、pvan启动子和pfnrs启动子，双拷贝的第一表达盒使用pvan启动子，第五表达盒使用的启动子为pbad启动子；6)单拷贝的第四表达盒，所述第四表达盒整合在kefb位点；四拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒分别整合在ldha、lacz、agai/rsml和yjcs位点；双拷贝的第一表达盒，所述第一表达盒分别整合在yghx和araab位点；以及单拷贝的第五表达盒，所述第五表达盒整合在rhtb/c位点；其中，所述第四、第二和第一表达盒中使用的启动子为pfnrs启动子，第五表达盒中使用的启动子为pbad启动子；7)双拷贝的第四表达盒，所述第四表达盒整合在ldha和maeb位点；双拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒分别整合在yghx和lacz位点；以及单拷贝的第五表达盒，所述第五表达盒整合在rhtb/c位点；其中，所述第四和第二表达盒中使用的启动子为pfnrs启动子，第五表达盒中使用的启动子为pbad启动子；8)单拷贝的第四表达盒，所述第四表达盒整合在ldha位点；以及单拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒整合在yghx位点；其中，所述第四和第二表达盒中使用的启动子为pfnrs启动子；9)单拷贝的第一表达盒，所述第一表达盒整合在yghx位点；单拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒整合在ldha位点；以及单拷贝的第三表达盒，所述第三表达盒整合在kefb位点；其中，所述第一、第二和第三表达盒中使用的启动子为pfnrs启动子；10)单拷贝的第一表达盒，所述第一表达盒整合在yghx位点；以及单拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒整合在ldha位点；其中，所述第一和第二表达盒中使用的启动子为pfnrs启动子；11)双拷贝的第一表达盒，所述第一表达盒分别整合在yghx和araab位点；以及双拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒整合在ldha和lacz位点；其中，所述第一和第二表达盒中使用的启动子为pfnrs启动子；或12)双拷贝的第一表达盒，所述第一表达盒分别整合在yghx和araab位点；双拷贝的第二表达盒，所述第二表达盒分别整合在ldha和lacz位点；以及单拷贝的第三表达盒，所述第三表达盒整合在kefb位点；其中，所述第一、第二和第三表达盒中使用的启动子为pfnrs启动子。10.根据前述权利要求中任一项所述的工程微生物，其中所述工程微生物为细菌或酵母；优选地，所述工程微生物为益生菌，还优选地，所述工程微生物选自拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、埃希氏菌属、乳杆菌属和乳球菌属中的至少一种；更优选地，所述工程微生物为大肠杆菌，例如大肠杆菌菌株nissle1917。11.根据前述权利要求中任一项所述的工程微生物，其中所述工程微生物为营养缺陷型，例如所述营养缺陷型为二氨基丙烯酸营养缺陷型和/或胸腺嘧啶营养缺陷型。12.根据前述权利要求中任一项所述的工程微生物，其中所述工程微生物的鞭毛功能
有缺陷或者丧失；例如，所述工程微生物的鞭毛合成相关基因具有突变或者缺失；优选地，所述工程微生物的鞭毛合成相关基因bsca和/或flic基因具有突变或者缺失。13.一种组合物，其包含如权利要求1-12中任一项所述的工程微生物和药学上、营养学上或生理学上可接受的载体；优选地，所述的组合物为药物组合物或可食用组合物(例如益生菌组合物或食品增补剂)；还优选地，所述组合物被配制用于口服施用；更优选地，所述组合物为液态制剂、固态制剂或半固态制剂液态制剂；进一步优选地，所述组合物的剂型选自下组：粉末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、滴剂，或舌下含片；更进一步优选地，所述组合物被配制为经由纳米颗粒、纳米胶囊、微胶囊或微片剂(其被肠溶包衣或未包衣)用于肠内施用、空肠内施用、十二指肠内施用、回肠内施用、胃分流施用或结肠内施用。14.权利要求1-12中任一项所述的工程微生物或如权利要求13所述的组合物在制备用于缓解和/或治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症的药物或保健品中的用途；优选地，所述与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症包括：苯丙酮尿症(例如经典型或典型(classical or typical)苯丙酮尿症和非经典型(atypical)苯丙酮尿症)，永久性轻度(mild)高苯丙氨酸血症，非苯丙酮尿症类的高苯丙氨酸血症，苯丙氨酸羟化酶缺陷，辅因子缺陷，二氢蝶呤还原酶缺陷，四氢蝶呤合酶缺陷，segawa氏病和肝病。

技术总结
本公开提供了一种工程微生物，其包含编码芳香族氨基酸转氨酶的基因、编码苯丙氨酸脱氢酶的基因、编码苯丙酮酸脱羧酶的基因、编码醛还原酶的基因、编码谷氨酸脱氢酶的基因和编码苯丙氨酸转运蛋白的基因中的一种或多种或其功能等效物。本公开还涉及包含所述基因中的一种或多种或其功能等效物的工程微生物组合物；包含所述工程微生物或工程微生物组合物的组合物；使用所述工程微生物或工程微生物组合物或组合物来缓解和/或治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症的方法；以及所述工程微生物或工程微生物组合物或组合物在制备用于治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症的药物或保健品中的用途。物或保健品中的用途。物或保健品中的用途。


技术研发人员：向斌 孙婉菊 刘翠翠 朱丽
受保护的技术使用者：和度生物技术（上海）有限公司
技术研发日：2023.02.14
技术公布日：2023/10/8